CN1063790C - Rna循环逆转录反应方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物工程技术领域，是一种循环逆转录反应方法。其过程为对待扩增的RNA模板加热变性后，将RT引物结合到RNA链上，由逆转录催化酶催化RT引物延伸合成cDNA，形成RNA-DNA杂合双链，重复变性-复性-延伸，循环反应几十次，随后根据需要可偶联PCR扩增或直接用于cDNA文库克隆。本发明可有效提高RNA分析和检测灵敏度，技术设计简单易行，操作简便，成本低。本发明可应用在一切RT应用领域。特别适应于RNA相关的临床检测和分析。

Description

   RNA循环逆转录反应方法

本发明属生物工程技术领域，是一种逆转录(Reverse Transcription，RT)反应方法，可由一份RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)模板循环逆转录得到多倍份的cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互补DNA)的反应方法。

现行的RT方法，只能得到与RNA模板相同拷贝数的cDNA产物。要有效分离低丰度mRNA的cDNA克隆，必须先采取一些非常复杂的方法进行富集。由于样品来源往往稀少而珍贵，富集工作不仅繁琐，而且很不经济。另一方面，常规RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链反应)扩增有时也难以对这样微量的RNA样品进行检测。虽然采用NP-PCR的方法(Nested Primers-PCR，巢式PCR)，能够进一步提高检测的灵敏度。然而，其缺点也是很明显的：首先从技术基础上看，由于需要使用了4-5个特异引物(包括逆转录引物和外内引物对)，不仅增加了引物设计上的难度，而且不能应用于包含随机引物的PCR扩增如差异展示PCR(Difference Display PCR，DD-PCR)；再者，由于PCR扩增量呈指数增加，连续2重PCR扩增使得对RNA进行定量分析很困难；第三，操作需要进行1-2次转移，繁琐易导致发生污染；最后，成本较高，接近普通RT-PCR的2倍。

本发明的目的在于提供一种操作简便，且能大量提高cDNA产物量的逆转录反应方法。本发明是由一份RNA模板循环逆转录得到多倍份的cDNA的反应方法，具体是将反应体系置于热循环仪上进行如下步骤的循环反应：

1．变性，即对待扩增的RNA模板加热变性，温度条件：89～95℃，保温定时间(5～120秒)；

2．复性，即RT引物(用于RT过程中，与RNA链结合并能引导cDNA合成的DNA寡核苷酸)与RNA链上的互补序列结合复性，温度条件：55～68℃，保温一定时间(5～90秒)

3．延伸，即逆转录酶催化RT引物延伸合成cDNA，形成RNA-DNA杂合双链，温度条件：60～70℃，保温一定时间(60～180秒)；

杂合双链变性解链后，RT引物再结合到RNA链上，由逆转录酶第二次催化引物延伸合成cDNA，如此，利用RNA模板，可以反复进行cDNA合成，因而，称之为循环逆转录(Cycle Reverse Transcription，CRT)。每一次变性-复性-延伸的过程，就是一次循环逆转录的循环。由于逆转录是单个逆转录引物的单向延伸过程，循环逆转录导致的cDNA的量增加呈线性增长。因此，循环逆转录过程可以很方便地用于对RNA的定量PCR分析。为了方便操作，循环逆转录使用(但不限定)在高温下具有逆转录催化活性的DNA聚合酶，如：FD酶、Tth酶等，并且根据需要，可以偶联PCR反应。

本发明提出的CRT反应体系(20μl)如下：

Tris-HCl pH 7.9-9.1，10-50mmol/L；(NH₄)₂SO₄5.0-25mmol/L；MnCl₂1.0-5.0mmol/L；dNTP0.2-2.0mmol/L；DTT0.5-5.0mmol/L；明胶0.05-0.5mg/ml；RT引物0.5-2.0μmol/L；FD酶(或Tth酶)0.5-3U；RNA模板。

上述体系混匀后，以液蜡封住液面，在热循环仪上设置上述温度程序，进行CRT反应。如需继续进行PCR扩增，则只需再向该体系中加入终浓度为0.2-2.0μmol/L的一对PCR引物，继续在热循环仪上进行PCR反应。结果检测同一般的PCR结果检测方法。

本发明的优点

CRT包含变性过程，可以破坏RNA的二级和三级结构，有利于RT的进行。CRT反复利用RNA模板合成cDNA，提高了RT对RNA模板的利用效率，在不增加成本花费的情况下，使得cDNA产物量增加几十倍。这样，有利于对低丰度RNA的检测和分析，有利于研究低表达的基因和发现新基因。

CRT可以如同普通RT一样直接偶联PCR，能够有效地提高RT-PCR对RNA检测的灵敏度。与提高RT-PCR灵敏度的常用方法NP-PCR比较，更具有以下优点：

1．技术设计简单易行。NP-PCR由于需要使用多重特异引物，技术设计要求高；而CRT-PCR不需要多重特异引物，技术设计要求比较简单。

2．应用范围广。CRT-PCR可以应用在一切RT-PCR领域，包括象DD-PCR这样包含随机引物扩增的RT-PCR，而NP-PCR不能。

3．便于定量PCR分析。循环逆转录是线性增加过程，通过控制循环数即可得到模板浓度梯度，便于应用定量PCR分析RNA。而NP-PCR连续2重PCR扩增使得对RNA进行定量分析很困难；

4．操作简便，结果可靠。CRT-PCR整个反应可以在一管中完成，无须进行转移，减少了污染发生的机会，结果可靠。而NP-PCR操作需要进行1-2次转移，易导致发生污染而造成假阳性。

5．成本低。CRT-PCR的成本与普通RT-PCR几乎完全相同，只有NP-PCR的成本的一半。

CRT可以在几乎所有的RT应用领域替代普通RT。如克隆cDNA文库，RT-PCR等。

图1为CRT基本原理示意图

实施例

HCV(Hepatitis C Virus，丙型肝炎病毒)RNA的检测

采用一步法制备HCV RNA(具体方法略)。

20μl反应体系中含有Tris-HCl pH8.3，25mmol/L；(NH₄)₂SO₄15mmol/L；MnCl₂2.0mmol/L；dNTP0.5mmol/L；DTT1mmol/L；明胶0.1mg/ml；逆转录引物1.25μmol/L；FD酶2U；以及未定量的HCV RNA。混匀后，以液蜡封住液面，在热循环仪上设置反应程序：92℃30s，65℃30s，65℃90s，进行40个循环反应；然后，向该体系中加入一对PCR引物(终浓度为0.5μmol/L)，继续在热循环仪上进行35个循环的PCR，反应程序是：94℃30s，55℃40s，72℃60s，结果检测采用凝胶电泳EB染色法，在紫外灯下成功地观察到257bp特异扩增带。同时采用普通的RT-PCR以及NP-PCR对照，CRT-PCR的阳性率(88％)与NP-PCR(91％)相当，明显高于普通的RT-PCR(72％)(PCR阳性率=PCR阳性/ELISA阳性)。

α-珠蛋白基因mRNA的定量分析

从外周血制备总RNA(具体方法略)。

设置10个反应管，每管均为20μl反应体系，同样含有：Tris-HCl pH8.3，30mmol/L；(NH₄)₂SO₄15mmol/L；MnCl₂2.0mmol/L；dNTP0.5mmol/L；DTT1mmol/L；明胶0.1mg/ml；逆转录引物1.0μmol/L；FD酶2U；以及RNA模板1μl。混匀后，以液蜡封住液面，在热循环仪上设置反应程序：94℃30s，55℃40s，68℃120s，分别进行4，8，12，16，20，24，28，32，36，40个循环反应；然后，向体系中加入预先混好的PCR补充试剂(含一对PCR引物，终浓度为0.5μmol/L；内参照DNA模板0.01pg，约420个分子)，继续在热循环仪上进行30个循环的PCR，反应程序是：94℃30s，55℃40s，72℃60s，结果检测和分析在凝胶扫描成相分析系统下进行。结果发现经过24个循环逆转录的cDNA扩增量与内参照DNA扩增量相当。因此，样品中α-珠蛋白基因mRNA的含量约为17分子/μl。

Claims (2)

1、一种RNA循环逆转录反应方法，其特征在于，反应物在热循环仪上进行热变性、复性、延伸3个步骤的循环反应过程，每个循环过程控制各步骤的温度和时间参数为：

变性，温度条件：89-95℃，保温时间：5-120秒：

复性，温度条件：55-68℃，保温时间：5-90秒；

延伸，温度条件：60-70℃，保温时间：60-180秒。

2、根据权利要求1的所述RNA循环逆转录反应方法，其特征在于逆转录反应物组份为：

Tris-HCl pH7.9-9.1，15-50mmol/L；(NH₄)₂SO₄5-25mmol/L；MnCl₂1.0-5.0mmol/L；dNTP0.5mmol/L；DTT1mmol/L；明胶0.1mg/ml；RT引物1.25μmol/L；FD酶0.5-3U；RNA模板。

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