CN112852949A

CN112852949A - 一种哈萨克族eh的分子标记及其引物对和应用

Info

Publication number: CN112852949A
Application number: CN202110203088.7A
Authority: CN
Inventors: 胡云华; 何佳; 马儒林; 郭恒; 郭淑霞
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2021-02-23
Filing date: 2021-02-23
Publication date: 2021-05-28

Abstract

本发明公开了一种哈萨克族EH的分子标记及其引物对和应用，属于人群分子遗传学领域，所述分子标记为SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第26位的多态性位点rs5923C/T；所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；所述分子标记或所述引物对可用于制备检测哈萨克族原发性高血压的PCR检测试剂盒。与现有技术相比，本发明具有操作简单、费用低、精确度高等优点，可利用仪器设备进行自动化检测，可以实现哈萨克族EH的预示和鉴定，为哈萨克族EH的临床早期诊断、早期治疗及进一步的基因治疗提供可靠的理论依据。

Description

一种哈萨克族EH的分子标记及其引物对和应用

技术领域

本发明涉及人群分子遗传学领域，特别是涉及一种哈萨克族EH的分子标记及其引物对和应用。

背景技术

原发性高血压(essential hypertension，EH)是心血管疾病的重要危险因素之一，主要表现为体循环动脉压升高，引起机体代谢异常，长期处于高血压状态，患者的心脏、肾脏和脑等靶器官均会受到不同程度的损害。有研究数据显示，我国EH患病率呈明显增长趋势，2012年全国成人的EH患病率高达25.2％。2005年美国高血压学会提出，高血压是一个有许多病引起的处于不断进展状态的心血管综合症，可导致心脏和血管功能与结构的改变。因此，EH治疗的主要目的是最大限度的降低心血管的死亡和病残的总危险。

新疆是多民族聚集的地区，其中哈萨克族人口位居新疆第三，且前期调查显示哈萨克族高血压患病高达36.5％，高于全国平均水平25.2％(2012年)。大多数EH见于中老年，起病隐匿，进展缓慢，病程长达十多年乃至数十年，初期很少有症状，约半数患者因体检或因其他疾病就医时测量血压后，才偶然发现血压增高，不少病人一旦知道患有高血压后，反而会产生各种各样神经症样症状，诸如头晕、头胀、失眠、健忘、耳鸣、乏力、多梦、易激动等，30％-50％的EH患者因头痛、头胀或心悸而就医，也有不少病人直到出现高血压的严重并发症和靶器官功能性或器性损害，出现相应临床表现才就医。导致病情延误，错过了最佳的预防疾病和治疗疾病的阶段，并需要终身服药，给家庭和社会带来巨大的经济负担。

因此，如何能从分子遗传学角度早期发现并诊断EH，及时有效早期预防控制EH，避免高血压的严重并发症和靶器官功能性或器性损害，成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明目的是提供一种哈萨克族EH的分子标记及其引物对和应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种哈萨克族原发性高血压的分子标记，所述分子标记为SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的第26位的多态性位点rs5923C/T。

进一步地，所述多态性位点rs5923C/T，其C等位基因负向调控LCAT基因的表达水平，从而降低哈萨克族原发性高血压的发病风险。

本发明提供一种用于扩增所述哈萨克族原发性高血压的分子标记的引物对，所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种哈萨克族原发性高血压的分子标记的筛选方法，具体步骤包括：

(1)用所述引物对对目的样品进行PCR扩增；

(2)用延伸引物对步骤(1)获得的扩增产物进行延伸；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(3)将步骤(2)获得的延伸产物经测序后，从而确定样品中哈萨克族原发性高血压的分子标记，所述分子标记为SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第26位的多态性位点rs5923C/T。

本发明还提供一种所述哈萨克族原发性高血压的分子标记、所述用于扩增所述哈萨克族原发性高血压的分子标记的引物对在制备检测哈萨克族原发性高血压检测产品中的应用。

进一步地，所述产品为Southern印迹法、DNA序列分析、PCR或原位杂交检测突变的产品。

进一步地，所述产品为PCR检测试剂盒。

本发明公开了以下技术效果：

本发明具有操作简单、费用低、精确度高等优点，可利用仪器设备进行自动化检测。使用本发明的分子标记对哈萨克族EH进行判定时，可以从疾病的分子遗传学角度及三级预防原则取得一定进展。利用本发明，可以对哈萨克族人群EH进行早期的判断，不仅为EH的早期发现提供一种有效的分子标记手段，同时为EH患者的三级预防节省时间。本发明可以有效的应用于哈萨克族人群分子遗传学领域，实现哈萨克族EH的预示和鉴定，为EH的临床早期诊断、早期治疗及进一步的基因治疗提供可靠的理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为哈萨克族EH组样本1的rs5923位点CT基因型；

图2为哈萨克族EH组样本2的rs5923位点CT基因型；

图3为哈萨克族EH组样本3的rs5923位点CT基因型；

图4为哈萨克族血压正常对照组样本1的rs5923位点CC基因型；

图5为哈萨克族血压正常对照组样本2的rs5923位点CC基因型；

图6为哈萨克族血压正常对照组样本3的rs5923位点CC基因型。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

研究对象：哈萨克族研究对象来源于新疆伊犁地区新源县那拉提镇，调查时间2011年05月至2012年11月，样本库5692人；所有研究对象均来自采用分层整群抽样的方法对年龄在18岁及以上的常住居民(居住时间大于半年且排除长期外出、流动的人口)进行调查所建的数据库。

实施例1rs5923位点与哈萨克族EH相关

一、鉴定各个研究对象基于各个多态性位点的基因型

各个研究对象分别进行如下操作：

1、选择北京TIANGEN血液基因组DNA提取系统提取哈萨克族人群血压正常者(正常对照组)和哈萨克族人群原发性高血压者(EH病例组)DNA，每组分别取3个样品，具体为哈萨克族EH组样本1、样本2、样本3以及哈萨克族血压正常对照组样本1、样本2、样本3。

1.1具体的提取方法

(1)每个样本提取500μL的血液，向每个样品的血液中加入1250μL细胞裂解液CL(溶解红细胞)，颠倒混匀5次，为方便与离心机配套使用，将细胞裂解液CL分成两份，重复裂解两次。

(2)12000rpm离心1min。倒弃上清，将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2min，确保沉淀在管中。

(3)按照表1配置缓冲液FG与蛋白酶K的混合液。

表1 500μL血液所需各种缓冲液用量

(4)加入250μL缓冲液FG与蛋白酶K的混合液后，立即在涡旋震荡仪上混匀至溶液无团缺。

(5)65℃水浴10min，其间颠倒混匀数次，直至溶液的颜色从红色变为黄绿色。变为黄绿色后加入250μL异丙醇，颠倒充分混匀至出现丝状或簇状基因组DNA。

(6)12000rpm离心5min，倒弃上清。

(7)加入250μL 70％乙醇，涡旋振荡5s，12000rpm离心2min，弃上清。

(8)重复一次步骤7。

(9)将离心管倒置在干净的吸水纸上停留至少5min，确保沉淀在管中。

(10)空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净。

(11)加入200μL缓冲液TB，低速涡旋5s，65℃加热10min～1h溶解DNA。

1.2 DNA的纯度、浓度测定

采用NanoDrop分光光度计检测所有的DNA浓度及纯度，确保其浓度≥50ng/μL，纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～2.0之间，同时OD₂₆₀/OD₂₃₀比值大于2.0，浓度符合要求的DNA再用0.7％的琼脂糖凝胶电泳进行质检。质检合格的DNA以无菌双蒸水稀释，将浓度调整到10～30ng/μL，于-80℃冰箱低温保存备用。

2、检测研究对象基于rs5923位点的基因型，具体步骤如下：

(1)以步骤1得到的基因组DNA为模板，根据哈萨克族人群LCAT基因rs5923位点，利用Primer5.0设计一对引物进行PCR扩增，所述哈萨克族两组LCAT基因的rs5923位点PCR扩增反应体系相同。

PCR所用引物：

上游引物(如SEQ ID NO.1所示)为：

5’-ACCTACATCTACGACCACGGC-3’；

下游引物(如SEQ ID NO.2所示)为：

5’-CATTGATGTGCTCCAGGGTCAG-3’。

PCR扩增反应体系(15μL)如表2所示。

表2 PCR扩增反应体系

PCR扩增反应程序为：

94℃预变性3min，以60℃为起始温度，每个循环降低0.5℃直至55℃作为退火温度，以94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s且进行35个循环，72℃延伸3min，完成整个PCR循环反应。

(2)PCR产物的纯化

取3μL步骤(1)PCR扩增后的得到的PCR产物，用ExoI和FastAP纯化。

PCR产物纯化反应体系(7μL)为：

步骤(1)所述PCR产物3μL，ExoⅠ溶液0.2μL，FastAP溶液0.8μL，ExoⅠbuffer溶液0.7μL，加高压灭菌去离子水至7μL。

PCR产物的纯化过程为：

37℃，15min；80℃，15min，纯化后进行延伸反应。

PCR产物延伸反应体系(6.0μL)为：

已纯化的PCR产物2μL，SNaPshot Mix试剂1μL，混合延伸引物(10μmol)0.2μL/条，共1.8μL，加高压灭菌去离子水至6μL。

LCAT基因rs5923位点延伸引物序列如下表3所示：

表3 LCAT基因rs5923位点延伸引物序列

PCR产物延伸反应程序为：

96℃PCR预变性1min，96℃PCR变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s进行30个循环，完成整个延伸反应。

3、与哈萨克族EH的相关性分析

延伸产物检测：取1μL延伸反应产物，加9μL上样缓冲液loading buffer，95℃变性3min，立即冰水浴，在ABI 3730XL测序仪检测。

经ABI 3730测序仪跑胶后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，确定该样本的基因型。经SNapShot检测方法得出SNP分型结果，利用Peak Scanner Softwarev1.0阅图，结果显示：所述SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第26位为多态性位点rs5923C/T，基因型分型有两种CT和CC,当第一个峰型高于第二个，且第一峰高为第二峰高的2倍及以上时，为CT基因型(见图1至图3)；当两个峰型高度趋近一致时，为CC基因型(见图4至图6)；根据研究分组，利用SPSS 20.0分析哈萨克族正常对照组和EH组间基因型的差异；结果显示，EH组rs5923位点CT基因型频率明显高于正常对照组，且两组间基因型的差异具有统计学意义(P<0.05)，CC基因型频率明显低于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，可以认为CT基因型是哈萨克族EH的危险性因素，即当哈萨克族人群LCAT基因rs5923位点检测结果为CT或CC基因突变为CT基因时，预示该检测者会发生EH，即CT基因型可以作为早期预示和鉴定哈萨克族EH的分子标记物。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 石河子大学

<120> 一种哈萨克族EH的分子标记及其引物对和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acctacatct acgaccacgg c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cattgatgtg ctccagggtc ag 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgccagcca cagcctgtgc ac 22

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)

<223> y=t或c

<400> 4

gggccgccag ccacagcctg tgcacytgct gcccctgcac gggatacagc a 51

Claims

1.一种哈萨克族原发性高血压的分子标记，其特征在于，所述分子标记为SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的第26位的多态性位点rs5923C/T。

2.根据权利要求1所述的哈萨克族原发性高血压的分子标记，其特征在于，所述多态性位点rs5923C/T，其C等位基因负向调控LCAT基因的表达水平。

3.一种用于扩增权利要求1-2任一项所述哈萨克族原发性高血压的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示。

4.一种权利要求1-2任一项所述哈萨克族原发性高血压的分子标记的筛选方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)用权利要求3所述引物对对目的样品进行PCR扩增；

5.一种权利要求1-2任一项所述哈萨克族原发性高血压的分子标记、权利要求3所述用于扩增所述哈萨克族原发性高血压的分子标记的引物对在制备检测哈萨克族原发性高血压检测产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为Southern印迹法、DNA序列分析、PCR或原位杂交检测突变的产品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为PCR检测试剂盒。