ES2183256T5 - Dispositivo para la deteccion de reacciones de amplificacion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UN INSTRUMENTO PARA CONTROLAR UNA REACCION DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS, QUE INCLUYE UN PRODUCTOR DE CICLOS TERMICO QUE PRESENTA UN SOPORTE ADAPTADO PARA ACOGER UNO O MAS VOLUMENES DE REACCION DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS; Y UN SISTEMA OPTICO ADAPTADO PARA SER ACOPLADO DE FORMA OPTICA A UNO O MAS VOLUMENES DE REACCION DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS ACOGIDOS POR EL SOPORTE.
Description
Dispositivo para la detección de reacciones de
amplificación de ácidos nucléicos.
La presente invención se refiere a un
instrumento para monitorizar reacciones de amplificación de ácidos
nucleicos y, en particular, a un instrumento para llevar a cabo
métodos de detección de un ácido nucleico diana en una muestra y
para monitorizar el incremento de un ADN de doble hebra durante la
amplificación de un ácido nucleico diana en una muestra.
Los nuevos métodos para la amplificación y
detección simultáneas de ácido nucleico incrementan la velocidad y
la precisión de los métodos de detección previos y eliminan la
necesidad de procesar la muestra después de la amplificación. En
una realización preferida, el método proporciona una modificación de
la reacción en cadena de la polimerasa y utiliza agentes cuya
fluorescencia es incrementada después de unirse a ADN de doble
hebra. Los métodos proporcionados en la presente tienen numerosas
aplicaciones, particularmente en los campos de biología molecular,
diagnóstico médico y ciencias forenses.
Los métodos de detección de ácidos nucleicos
descritos ofrecen las ventajas de velocidad y simplicidad sobre los
métodos previos para detectar ácidos nucleicos amplificados. Las
técnicas de detección de ácidos nucleicos en general son
particularmente útiles en los ensayos de diagnóstico médico. Por
ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.358.535 describe un método para
detectar patógenos depositando una muestra (por ejemplo, sangre,
células, saliva, etc.) sobre un filtro, lisando las células y
fijando el ADN mediante desnaturalización química y calentamiento.
Posteriormente, se añaden sondas de ADN marcadas y se deja que
hibriden con el ADN de la muestra fijado. Una hibridación indica la
presencia de ADN del patógeno.
La detección de ácidos nucleicos utilizando
sondas oligonucleotídicas se ha convertido en un método estándar
para la detección de dianas específicas. Se han descrito numerosas
modificaciones del método, incluyendo el cultivo de las células u
organismos diana in situ sobre el filtro, incrementando la
cantidad de ácido nucleico diana disponible para la detección.
Generalmente, estos métodos requieren que la muestra de ADN esté
unida no covalentemente a un soporte sólido tal como nitrocelulosa
o nailon y posteriormente que hibride con una sonda marcada
especifica de la diana.
La sensibilidad y la especificidad de los
métodos de detección de ácidos nucleicos fue mejorada enormemente
por la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La
PCR es un proceso para amplificar ácidos nucleicos e implica la
utilización de dos cebadores oligonucleotídicos, un agente para la
polimerización, un molde de ácido nucleico diana y ciclos sucesivos
de desnaturalización del ácido nucleico e hibridación y extensión
de los cebadores para producir un número grande de copias de un
segmento de un ácido nucleico particular. Con este método,
segmentos de ADN genómico de una sola copia pueden ser amplificados
más de 10 millones de veces con una especificidad y una fidelidad
muy elevadas. Los métodos de PCR están descritos en la Patente de
EE.UU. Nº 4.683.202.
Métodos para detectar productos de PCR están
descritos particularmente en la Patente de EE.UU. Nº 4.683.195.
Esos métodos requieren una sonda oligonucleotídica capaz de hibridar
con el ácido nucleico diana amplificado. EP Nº 237.362 describe
también un método de detección basado en PCR denominado
"transferencia de manchas inversa", en el cual la sonda, en
lugar del ADN amplificado, está fijada a la membrana. De acuerdo con
el método, la diana, en lugar de la sonda, es marcada para
hibridación. Estos métodos requieren etapas separadas de
amplificación, captura y detección y requieren generalmente varias
horas para ser completados. En el método de transferencia de manchas
inversa, se prefieren reactivos específicos de la diana que sean
estables durante su almacenamiento.
Métodos alternativos para detectar ácidos
nucleicos amplificados describen la amplificación y el marcaje
simultáneos de un ácido nucleico diana. Los métodos requieren que
al menos un cebador de la amplificación esté marcado. El cebador de
la amplificación puede estar marcado con, por ejemplo, un
radioisótopo para la detección directa del producto amplificado o
marcado con un reactivo adecuado para capturar el producto sobre un
soporte sólido para su detección posterior.
Otros medios de detección incluyen la
utilización de hibridación de polimorfismos de la longitud de
fragmentos, de sondas oligonucleotídicas alelo específicas (ASO)
(Saiki y col., 1986, Nature 324:163), o la secuenciación
directa mediante el método didesoxi utilizando ADN amplificado en
lugar de ADN clonado. El método de polimorfismo de la longitud de
fragmentos detecta inserciones y deleciones entre cebadores de PCR,
teniendo como resultado productos de PCR de longitudes diferentes,
detectables mediante clasificación por tamaños. Los métodos ASO son
útiles para detectar variaciones de secuencias alélicas. En un
ejemplo de hibridación con ASO, el ADN amplificado es fijado a un
filtro de nailon mediante, por ejemplo, irradiación UV en una serie
de "transferencias de manchas", y se deja posteriormente
hibridar con una sonda oligonucleotídica bajo condiciones rigurosas.
La sonda puede estar marcada con, por ejemplo, peroxidasa de rábano
picante (HRP) y es detectada por la presencia de un precipitado
azul después del tratamiento con reactivos de oxidación
adecuados.
Se conoce además un método de ensayo alternativo
para detectar ácidos nucleicos amplificados. El proceso emplea la
actividad nucleasa 5' a 3' de una polimerasa de ácido nucleico para
cortar oligonucleótidos hibridados marcados de dúplex hibridados y
liberar fragmentos oligonucleotídicos marcados para su detección. El
método es adecuado para detectar productos de PCR y requiere un par
de cebadores y una sonda oligonucleotídica marcada que tenga un
extremo 3'-OH bloqueado para impedir la extensión
por la polimerasa.
Debido a la enorme amplificación posible con el
proceso de PCR, pequeños niveles de contaminación de ADN procedentes
de muestras con niveles elevados de ADN, moldes control positivo, o
de amplificaciones previas, pueden tener como resultado un producto
de PCR incluso en ausencia de ADN molde añadido expresamente.
Higuchi y Kwok, 1989, Nature 339:237-238 y
Kwok y Orrego, en Innis y col., 1990, PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications, Academic Press, Inc., San Diego, CA,
describen métodos y precauciones particulares para practicar la PCR
con un mínimo de contaminación cruzada. Como la posibilidad de
introducir ADN contaminante en una muestra incrementará a medida
que aumenta el número de etapas de manipulación requeridas para la
preparación, procesamiento y análisis de la muestra, seria
preferible minimizar la manipulación de la muestra, particularmente
una vez que se ha completado la reacción de amplificación.
Se han descrito varios agentes para marcar
ácidos nucleicos, sondas o dianas, con el fin de facilitar la
detección del ácido nucleico diana. Las marcas adecuadas pueden
proporcionar señales detectables por fluorescencia, radioactividad,
colorimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo o
actividad enzimática e incluyen, por ejemplo, fluoróforos,
cromóforos, isótopos radioactivos (particularmente ^{32}P y
^{125}I) reactivos electrón-densos, enzimas y
ligandos que tengan parejas de unión especifica.
El marcaje se consigue mediante varios medios,
tal como la modificación química de un cebador o de una sonda para
incorporar una marca o la utilización de agentes polimerizantes para
incorporar un nucleósido trifosfato modificado en un producto de
extensión. Los agentes intercalantes se unen no covalentemente a las
bases superpuestas de los ácidos nucleicos, y como resultado la
fluorescencia del agente aumenta o se desplaza hacia una longitud
de onda diferente. Por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.582.789
describe varios restos intercalantes que incluyen psoralén.
Los colorantes fluorescentes son adecuados para
detectar ácidos nucleicos. Por ejemplo, el bromuro de etidio es un
agente intercalante que presenta una fluorescencia incrementada
cuando se une a ADN de doble hebra, más que cuando está libre en
solución (Sharp y col., 1973, Biochemistry 12:3055). El
bromuro de etidio puede ser utilizado para detectar ácidos
nucleicos de hebra sencilla y de doble hebra, aunque la afinidad del
bromuro de etidio por ácido nucleico de hebra sencilla es
relativamente baja. El bromuro de etidio se utiliza rutinariamente
para detectar ácidos nucleicos después de una electroforesis en gel.
Después del fraccionamiento por tamaños en una matriz de gel
apropiada, por ejemplo agarosa o acrilamida, el gel es embebido en
una solución diluida de bromuro de etidio. El ADN es visualizado
posteriormente examinando el gel bajo luz UV (Maniatis y col., 1982
eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring
Harbor Laboratory).
Se han descrito métodos alternativos basados en
fluorescencia para detectar ADN. Por ejemplo, Morrison y col.,
1989, Anal. Biochem. 183:231-244, describen
un método con dos sondas para detectar ADN diana. Una sonda está
marcada con fluoresceína, la otra sonda, complementaria a la
primera, está marcada con un amortiguador de la emisión de
fluoresceína. Se deja que las sondas hibriden con ADN
desnaturalizado que contiene la secuencia diana, y se determina el
nivel de fluorescencia. La fluorescencia aumenta hasta el punto de
que la sonda con fluoresceína se une al ADN complementario no
marcado, en lugar de a la sonda complementaria de amortiguación.
Mabuchi y col., 1990, Nucl. Acids Res.
18(24):7461-7462, describen un método para
detectar fragmentos de ADN basado en el contenido de AT del
segmento de ácido nucleico. Se utilizan dos fluorocromos para teñir
ADN fraccionado por tamaños en un gel de agarosa. Se utilizan las
propiedades de unión selectiva de los diferentes fluorocromos para
las regiones ricas en AT con el fin de distinguir los fragmentos de
ADN sometidos a electroforesis.
La Patente de EE.UU. Nº 4.257.774 describe la
unión directa de intercalantes fluorescentes al ADN, por ejemplo
sales de etidio, daunomicina, mepacrina y naranja de acridina, así
como
4'6-diamidino-a-fenilindol
para cuantificar el ADN. Se utiliza polarización de fluorescencia
para la caracterización de compuestos no fluorescentes que se unen
al ADN que compiten con los colorantes que se unen al ADN.
Oser y Valet, 1990, Angew. Chem. Int. Engl.
29(10):1167, describen un esquema de detección de ácidos
nucleicos que requiere dos sondas oligonucleotídicas
complementarias a sitios adyacentes en una diana. Las sondas están
marcadas diferencialmente con un salicilato o con un ligando DTPA
que lleva un emisor de fluorescencia, Tb^{III}. La hibridación de
ambas sondas a la diana proporciona una proximidad estérica de las
dos marcas, teniendo como resultado un incremento medible de la
fluorescencia de Tb^{III}. Las sondas modificadas son preparadas
específicamente para cada diana que va a ser detectada.
EP Nº 070.685 describe la utilización de sondas
polinucleotídicas marcadas con fluorescencia en ensayos de
hibridación de polinucleótidos. De acuerdo con el método, las sondas
son preparadas uniendo restos de un
absorbente-emisor particular a los extremos 3' y 5'
de fragmentos de ácido nucleico. Los fragmentos son capaces de
hibridar en posiciones adyacentes sobre un ADN diana, de tal manera
que, si se hibridan ambos fragmentos, la proximidad de los restos
absorbente y emisor tiene como resultado una fluorescencia del
emisor detectable.
De acuerdo con estos métodos, el colorante
fluorescente es introducido en el ADN diana después de que se hayan
completado todas las reacciones de polimerización del ácido nucleico
in vitro. Los efectos inhibidores de los agentes
intercalantes sobre las polimerasas de ácidos nucleicos han sido
descritos en numerosas publicaciones (por ejemplo, Kornberg, 1974,
DNA Synthesis, W.H. Freman y Co., San Francisco; Richardson, 1973,
J. Mol. Biol. 78:703-714).
\newpage
Los colorantes que se unen al ADN son útiles
como antibióticos debido a los efectos inhibidores sobre los
procesos de replicación del ácido nucleico que resultan de la unión
del agente al molde. EP Nº 169.787 describe la utilización de
agentes intercalantes para bloquear la replicación del virus de la
influenza o del virus herpes. Kornberg (supra) describe
varios agentes que se unen al ADN, intercalantes o no intercalantes,
y describe cómo cada compuesto inhibe la replicación del ácido
nucleico. En la página 227, Kornberg describe específicamente que el
bromuro de etidio inhibe la replicación del ADN.
Un aparato para la amplificación y detección
simultáneas de ácidos nucleicos diana proporcionaría ventajas sobre
los métodos anteriores de detección. Tal aparato minimizaría los
problemas de contaminación de la muestra inherentes a cualquier
proceso que implique una serie de etapas de manipulación para
discernir un resultado positivo o negativo de un ensayo. Eliminando
las etapas de manipulación y procesamiento de la muestra, un
aparato para la amplificación y detección simultáneas de ácidos
nucleicos diana incrementaría la velocidad y la precisión de los
métodos actuales de diagnóstico. La presente invención aborda y
resuelve estas necesidades.
La presente invención proporciona un aparato
para monitorizar una reacción de amplificación de un ácido nucleico
a lo largo de múltiples ciclos térmicos, que comprende:
(a) un ciclador térmico capaz de calentar y
enfriar alternativamente, en un recipiente de reacción, una mezcla
de una reacción de amplificación que contiene un ácido nucleico
diana, reactivos para la amplificación del ácido nucleico y un
agente detectable que se une al ácido nucleico; y
(b) un sistema opcional que incluye un detector
operable para detectar una señal óptica relacionada con la cantidad
de ácido nucleico amplificado en la mezcla de reacción a lo largo de
un periodo de múltiples ciclos, sin abrir el recipiente de reacción
una vez que se ha iniciado la reacción de amplificación.
El instrumento de acuerdo con la invención es
adecuado para la realización de un método para detectar un ácido
nucleico diana en una muestra, método que comprende las etapas de:
(a) provisión de una mezcla para una reacción de amplificación que
contiene una muestra, un agente que se une a ADN, donde dicho agente
se caracteriza porque proporciona una señal detectable cuando está
unido a un ácido nucleico de doble hebra, señal que es distinguible
de la señal proporcionada por dicho agente cuando no está unido, y
reactivos para la amplificación; (b) determinación de la cantidad
de señal producida por la mezcla de la etapa (a); (c) tratamiento de
dicha mezcla bajo condiciones para amplificar el ácido nucleico
diana; (d) determinación de la cantidad de dicha señal producida por
la mezcla de la etapa (c); y (e) determinación de si ha tenido lugar
la amplificación.
La invención es particularmente adecuada para la
práctica de métodos de amplificación por PCR en los que un
incremento neto de ADN de doble hebra tiene como resultado un cambio
de la potencia de la señal o del tipo de señal. En una realización
preferida, el agente que se une a ADN es un colorante fluorescente
que se une a ADN, tal como bromuro de etidio, y la señal es
fluorescencia.
La Figura 1 demuestra la fluorescencia
incrementada de la mezcla de PCR debido a la amplificación de un ADN
diana especifico en presencia de bromuro de etidio. El experimento
está descrito con detalle en el Ejemplo II.
La Figura 2 demuestra la especificidad de diana
del presente método de detección e ilustra algunos de los aspectos
cuantitativos de la invención. Los detalles del experimento se
proporcionan en el Ejemplo IV.
La Figura 3 demuestra la utilización de la
presente invención para cribado genético. El experimento está
descrito con detalle en el Ejemplo V.
Las Figuras 4A y 4B se refieren al ensayo
homogéneo cuantitativo descrito en el Ejemplo VII. La Figura 4A
demuestra que el incremento de la fluorescencia en las muestras
positivas es mayor de dos desviaciones estándar de la media de las
muestras negativas. La Figura 4B describe gráficamente un método de
sustracción del fondo para medir fluorescencia.
Las Figuras 5A y 5B demuestran los resultados de
un sistema de amplificación y detección homogéneo, automatizado, en
linea, de acuerdo con la presente invención según se demuestra en el
Ejemplo VIII. La Figura 5A muestra un registro impreso de
fluorescencia procedente de una PCR que no contiene ADN diana y
sirve como control negativo. La Figura 5B es un registro impreso de
fluorescencia procedente de una PCR que contiene la diana apropiada
y muestra la monitorización continua de la PCR y el incremento
concurrente del producto de la PCR.
La presente invención proporciona métodos
mejorados para detectar ácidos nucleicos y es especialmente adecuada
para ser utilizada junto con procesos de amplificación. Los métodos
mejorados no requieren ni una sonda oligonucleotídica ni un cebador
para la amplificación marcado. Los métodos permiten la
monitorización de la acumulación de producto mientras transcurre la
reacción de amplificación. La invención permite también la
cuantificación específica de la diana. Estos métodos son adecuados
para ser utilizados en formatos automatizados.
Los métodos descritos ofrecen grandes mejoras
sobre los métodos anteriores para detectar ácidos nucleicos
amplificados. De acuerdo con la invención, los ácidos nucleicos
amplificados son detectados sin abrir el recipiente de reacción una
vez que se ha iniciado la reacción de amplificación, y sin ninguna
etapa adicional de tratamiento o manipulación después de la
reacción. Antes de la presente invención, los métodos de detección
de ácidos nucleicos requerían un tercer reactivo oligonucleotídico
como sonda, o una serie de etapas de manipulación y de larga
duración para la detección de la diana, por ejemplo, la captura del
producto sobre un soporte sólido, etapas que se realizan después de
la amplificación. En algunos procedimientos se requieren etapas de
captura y de hibridación de las sondas. La presente invención
elimina la necesidad de utilizar un reactivo sonda hibridante o un
procedimiento de captura para detectar la diana amplificada. En un
escenario clínico, los métodos de la invención ofrecen velocidad,
simplicidad y una oportunidad disminuida de contaminación cruzada
entre las muestras, particularmente entre muestras amplificadas y
no amplificadas. Además, los presentes métodos ofrecen medios para
la detección, monitorización y cuantificación automatizadas de los
productos de amplificación durante el proceso de amplificación y
una vez que se ha completado la reacción de amplificación.
Los presentes métodos requieren un agente
detectable capaz de unirse a ADN de doble hebra. El agente de unión
detectable puede ser un colorante fluorescente u otro cromóforo, un
enzima o un agente capaz de producir una señal, directa o
indirectamente, cuando está unido a ADN de doble hebra. El agente
puede caracterizarse también por unirse a ADN de hebra sencilla o a
ARN. Solamente es necesario que el agente sea capaz de producir una
señal detectable cuando está unido a un ácido nucleico de doble
hebra que sea distinguible de la señal producida cuando el mismo
agente está en solución o unido a un ácido nucleico de hebra
sencilla.
En una realización, el agente que se une a ADN
es un agente intercalante. Según se utiliza en la presente, un
agente intercalante es un agente o resto capaz de insertarse no
covalentemente entre pares de bases superpuestos en la doble hélice
del ácido nucleico. Los agentes intercalantes, tales como el bromuro
de etidio, fluorescen más intensamente cuando están intercalados en
ADN de doble hebra que cuando están unidos a ADN de hebra sencilla,
a ARN, o están en solución. Otros agentes intercalantes presentan un
cambio en el espectro de fluorescencia cuando se unen a ADN de
doble hebra. Por ejemplo, la actinomicina D fluoresce roja cuando se
une a ácidos nucleicos de hebra sencilla y verde cuando se une a un
molde de doble hebra. Si la señal detectable aumenta, disminuye o
es desplazada, como es el caso con actinomicina D, cualquier agente
intercalante que proporcione una señal detectable que sea
distinguible cuando el agente está unido a ADN de doble hebra o no
está unido, es adecuado para practicar la invención descrita. Por
ejemplo, se ha descrito la interacción entre ADN y otro psoralén
fotorreactivo,
4-aminometil-4-5'-8-trimetilpsoralén
(AMT) (Johnson y col., 1981, Photochem. & Photobiol.
33:785-791). De acuerdo con la referencia, la
absorción a longitudes de onda largas y la fluorescencia, disminuyen
ambas después de la intercalación de AMT en la hélice de ADN.
Son también adecuados agentes que se unen al ADN
no intercalantes. Por ejemplo, Hoechst 33258 (Searle y Embrey,
1990, Nuc. Acids Res. 18(13):3753-3762)
presenta una fluorescencia alterada con una cantidad creciente de
la diana. Hoechst 33258 es un miembro de una clase de compuestos que
se unen al ADN referidos comúnmente como "agentes que se unen a
las hendiduras". Este grupo incluye fármacos como la distamicina,
netropsina y otros. Estos compuestos reconocen y se unen a la
hendidura menor del ADN dúplex.
De acuerdo con la presente invención, un agente
que se une al ADN produce una señal detectable directamente o
indirectamente. La señal es detectable directamente, tal como por
fluorescencia o absorbancia, o indirectamente a través de un resto
de una marca sustituida o de un ligando de unión unido al agente que
se une al ADN. Para la detección indirecta es adecuado cualquier
resto o ligando que sea afectado de manera detectable por la
proximidad a ADN de doble hebra.
De acuerdo con la invención, el agente de unión
detectable está presente en la reacción de amplificación durante el
proceso de amplificación. Cuando transcurre la amplificación, el
agente produce una señal detectable. Ni el agente ni la señal
impiden que tenga lugar la amplificación. En consecuencia, el agente
puede ser añadido a la mezcla de reacción antes de la amplificación
o mientras transcurre la reacción. Por ejemplo, el agente es
incluido en un tampón de amplificación que contiene reactivos
apropiados tales como sales y agentes tamponantes. De esta manera,
no es necesario añadir separadamente el agente de unión a la
reacción de amplificación. Para la práctica de la presente
invención es adecuado cualquier agente de unión a ADN, siempre que
en presencia de ese agente un incremento neto de la cantidad de ADN
de doble hebra presente se refleje en un cambio de la intensidad de
la señal que sea detectable directamente o indirectamente. En una
realización preferida, la señal detectable es fluorescencia.
El término "ensayo de detección homogéneo"
es utilizado en la presente especificación para describir la
invención reivindicada. Para facilitar su comprensión, se
proporciona la definición siguiente. Un ensayo de detección
homogéneo se refiere a un método de amplificación y detección
acopladas, en el que el proceso de amplificación genera una señal
detectable y se minimiza o elimina la necesidad de tratamiento y
manipulación posterior de la muestra para detectar el producto
amplificado.
El presente ensayo homogéneo es adecuado para
ser utilizado junto con sondas oligonucleotídicas. Por ejemplo, en
una realización la utilización de una sonda oligonucleotídica,
específica para detectar una secuencia diana particular, está
incluida en la reacción de amplificación además del agente de unión
al ADN de la presente invención. La sonda, marcada con un
amortiguador y un fluoróforo, hibrida con el ácido nucleico diana
amplificado. En presencia de un agente para la polimerización capaz
de actividad nucleolítica 5' a 3', el fluoróforo y el amortiguador,
cuando están unidos a la diana, son separados por la degradación de
la sonda con la polimerasa. La fluorescencia de la sonda no unida
es detectablemente distinta de la fluorescencia de la sonda unida e
hidrolizada posteriormente. De este modo, la fluorescencia del
agente de unión a ADN hace posible detectar que ha tenido lugar la
amplificación, y la fluorescencia de la sonda hibridada indica la
amplificación específica de la diana. Siempre que la amplificación
sea detectable sin abrir el recipiente de reacción, o sin etapas
posteriores de procesamiento una vez que se ha iniciado la
amplificación, el método está dentro de la presente definición de un
ensayo homogéneo.
El término "sistema de reacción de
amplificación" se refiere a cualquier medio in vitro para
multiplicar las copias de una secuencia de ácido nucleico diana.
Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, PCR, reacción en
cadena de la ligasa de ADN (LCR), Q ARN replicasa y sistemas de
amplificación basados en la transcripción de ARN (TAS y 3SR).
El término "amplificación", que se refiere
típicamente a un incremento exponencial del ácido nucleico diana,
está siendo utilizado en la presente para describir incrementos
lineales y exponenciales del número de una secuencia de ácido
nucleico diana seleccionada.
El término "mezcla de reacción de
amplificación" se refiere a una solución acuosa que contiene los
diferentes reactivos utilizados para amplificar un ácido nucleico
diana. Estos incluyen enzimas, tampones acuosos, sales, cebadores
de la amplificación, ácido nucleico diana y nucleósidos trifosfato.
Dependiendo del contexto, la mezcla puede ser una mezcla de reacción
de amplificación completa o incompleta.
Los sistemas descritos posteriormente son
practicados de manera rutinaria por los expertos en la técnica
relevante. Han sido descritos con detalle por otras personas y
están resumidos a continuación. Esta invención no está limitada a
ningún sistema de amplificación particular. A medida que se
desarrollen otros sistemas, esos sistemas pueden beneficiarse de la
práctica de esta invención. Un estudio reciente de sistemas de
amplificación fue publicado en Bio/Technology
8:290-293, Abril de 1990. Los cuatro sistemas
siguientes se describen a continuación con el fin de proporcionar
una comprensión de la amplitud de la presente invención.
La amplificación de ADN por PCR está descrita en
las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.683.195 y 4.683.202. Métodos para
amplificar y detectar ácidos nucleicos por PCR utilizando un enzima
termoestable están descritos en la Patente de EE.UU. Nº
4.965.188.
La amplificación de ADN por PCR implica ciclos
repetidos de desnaturalización del ADN por calor, hibridación de
dos cebadores oligonucleotídicos a secuencias que flanquean el
segmento de ADN que va a ser amplificado, y extensión de los
cebadores hibridados con ADN polimerasa. Los cebadores se hibridan a
hebras opuestas de la secuencia diana y están orientados de tal
manera que la síntesis de ADN por la polimerasa transcurre a través
de la región entre los cebadores, duplicando eficazmente la cantidad
del segmento de ADN. Además, como los productos de extensión son
también complementarios y capaces de unirse a los cebadores, cada
ciclo sucesivo duplica esencialmente la cantidad de ADN sintetizada
en el ciclo previo. Esto tiene como resultado la acumulación
exponencial del fragmento diana específico, en una proporción de
2^{n} aproximadamente por ciclo, donde n es el número de
ciclos.
En la realización descrita, se prefiere la ADN
polimerasa Taq aunque no es éste un aspecto esencial de la
invención. La polimerasa Taq, una polimerasa termoestable, es activa
a temperaturas elevadas. Métodos para la preparación de Taq están
descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.889.818. Sin embargo, pueden
utilizarse también en PCR otras ADN polimerasas termoestables
aisladas de otras especies de Thermus o de especies que no
son de Thermus (por ejemplo, Thermus thermphilus o
Thermotoga maritima,) así como ADN polimerasas no
termoestables tales como la ADN polimerasa de T4, ADN polimerasa de
T7, ADN polimerasa I de E. coli o el fragmento Klenow de
E. coli.
Según se utiliza en la presente, el término
"cebador" se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como
punto de inicio de la síntesis de ADN cuando está hibridado a un
molde de ácido nucleico bajo condiciones en las que se inicia la
síntesis de un producto de extensión del cebador, esto es, en
presencia de cuatro nucleótidos trifosfato diferentes y una ADN
polimerasa en un tampón apropiado ("tampón" incluye pH, fuerza
iónica, cofactores, etc.) y a una temperatura adecuada.
Los
nucleósidos-5'-trifosfato utilizados
en el proceso de extensión, típicamente dATP, dCTP, dGTP y dTTP,
están presentes en una concentración total que oscila típicamente
desde 400 \muM a 4,0 mM durante la reacción de extensión, aunque
preferiblemente la concentración está entre 500 \muM y 1,5 mM.
La elección de los cebadores para ser utilizados
en PCR determina la especificidad de la reacción de amplificación.
Los cebadores utilizados en la presente invención son
oligonucleótidos, normalmente desoxirribonucleótidos de varios
nucleótidos de longitud, que pueden ser extendidos de una manera
especifica del molde por la reacción en cadena de la polimerasa. El
cebador es suficientemente largo para cebar la síntesis de los
productos de extensión en presencia del agente de polimerización y
contiene típicamente 10-30 nucleótidos, aunque ese
número exacto no es critico para la aplicación del método con
éxito. Las moléculas de cebadores cortas requieren generalmente
temperaturas más bajas para formar complejos hibridos con el molde
suficientemente estables.
Pueden prepararse oligonucleótidos sintéticos
utilizando el método del triéster de Matteucci y col., 1981, J. Am.
Chem. Soc. 103:3185-3191. Alternativamente,
puede preferirse la síntesis automatizada en, por ejemplo, un
sintetizador de ADN Biosearch 8700 que utiliza la química de las
cianoetil fosforamiditas.
\newpage
Para que tenga lugar la extensión del cebador,
este cebador debe hibridarse al molde de ácido nucleico. No todos
los nucleótidos del cebador deben de hibridarse al molde para que
tenga lugar la extensión. La secuencia del cebador no necesita
reflejar la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, un fragmento de
nucleótidos no complementarios puede unirse al extremo 5' del
cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementaria
al molde. Alternativamente, bases no complementarias pueden ser
intercaladas en el cebador, con la condición de que la secuencia de
cebador tenga complementariedad suficiente con el molde para que
tenga lugar la hibridación y permita la síntesis de una hebra de ADN
complementaria.
Los sistemas de amplificación tales como la PCR
requieren un ácido nucleico diana en un tampón compatible con los
enzimas utilizados para amplificar la diana. El ácido nucleico diana
puede ser aislado de una variedad de materiales biológicos,
incluyendo tejidos, fluidos corporales, heces, esputo, saliva,
células vegetales, cultivos bacterianos y similares.
En general, el ácido nucleico de la muestra será
una secuencia de ADN, muy comúnmente ADN genómico. Sin embargo, la
presente invención puede ser también practicada con otros ácidos
nucleicos tales como ARN mensajero, ARN ribosómico, ARN vírico o
ADN clonado. Las muestras adecuadas de ácido nucleico incluyen ADN o
ARN de hebra sencilla o de doble hebra para utilización en la
presente invención. Aquellas personas expertas en la técnica
reconocerán que cualquiera que sea la naturaleza del ácido nucleico,
el ácido nucleico puede ser amplificado sencillamente realizando
modificaciones apropiadas y bien reconocidas del método que esté
siendo utilizado.
Para amplificar una secuencia de ácido nucleico
diana en una muestra, la secuencia debe ser accesible a los
componentes del sistema de amplificación. En general, esta
accesibilidad es asegurada aislando los ácidos nucleicos de una
muestra biológica bruta. Se conocen en el oficio una variedad de
técnicas para extraer ácidos nucleicos de muestras biológicas, por
ejemplo, las descritas en Maniatis y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982;
Arrand, Preparation of Nucleic Acid Probes, en pp.
18-30, Nucleic Acid Hybridation: A Practical
Approach, Ed. Hames and Higgins, IRL Press, 1985; o en PCR
Protocols, Capítulos 18-20, Innis y col. ed.,
Academic Press, 1990.
El proceso de PCR se lleva a cabo muy
habitualmente como un proceso automatizado con un enzima
termoestable. En este proceso, la mezcla de reacción es sometida a
ciclos a través de un rango de temperaturas desnaturalizantes, un
rango de temperaturas para la hibridación de los cebadores y un
rango de temperaturas para la extensión. Una máquina adaptada
específicamente para ser utilizada con un enzima termoestable está
descrita de forma más completa en EP Nº 236.069, y está disponible
comercialmente.
La LCR está descrita en la Publicación de
Patente PCT Nº WO 89/09835. El proceso implica la utilización de
ligasa para unir segmentos oligonucleotídicos que se hibridan al
ácido nucleico diana. La LCR tiene como resultado la amplificación
de una molécula diana original y puede proporcionar millones de
copias del ADN producto. Por consiguiente, la LCR tiene como
resultado un incremento neto del ADN de doble hebra. Los presentes
métodos de detección son aplicables a LCR, así como a PCR. La LCR
requiere una sonda oligonucleotídica para detectar el ADN producto.
Cuando se utiliza junto con los métodos descritos para detectar los
productos de amplificación, la etapa de la sonda es innecesaria, y
el resultado de la LCR es detectable inmediatamente.
Otro esquema de amplificación aprovecha la
utilización de la replicasa del bacteriófago Q\beta de ARN. En
este esquema de amplificación, un genoma del bacteriófago
recombinante modificado con una secuencia especifica para la
secuencia diana, es hibridado inicialmente con el ácido nucleico a
analizar. Después del enriquecimiento de los dúplex formados entre
la sonda del bacteriófago y el ácido nucleico de una muestra, se
añade replicasa de Q\beta, la cual, después de reconocer el
genoma recombinante retenido, comienza a producir un gran número de
copias.
El sistema Q\beta no requiere secuencias
cebadoras y no hay etapa de desnaturalización por calor como con
los sistemas de amplificación PCR y LCR. La reacción tiene lugar a
una temperatura, típicamente 37ºC. El molde preferido es un
sustrato de la replicasa de Q\beta, ARN de la variante media 1. Se
consigue un incremento muy grande de los moldes mediante la
utilización de este sistema. Una revisión de este sistema de
amplificación puede encontrarse en la Solicitud de Patente
Internacional Nº de Publicación WO 87/06270 y en Lizardi y col.,
1988, Bio/Technology 6:1197-1202.
El sistema 3SR es una variación de un sistema de
amplificación basado en la transcripción in vitro. Un sistema
de amplificación basado en la transcripción (TAS) implica la
utilización de cebadores que codifican un promotor para producir
copias de ADN de una hebra diana y la producción de copias de ARN a
partir de las copias de ADN con una ARN polimerasa. Ver, por
ejemplo, el Ejemplo 9B de la Patente de EE.UU. Nº 4.683.202 y EP Nº
310.229. El sistema 3SR es un sistema que utiliza tres enzimas para
llevar a cabo una replicación isotérmica de los ácidos nucleicos
diana.
El sistema comienza con una diana de ARN de
hebra sencilla a la que se une un cebador de ADN ARN de T7. Por
extensión del cebador con transcriptasa inversa se forma un ADNc, y
el tratamiento con ARNasa H libera el ADNc del heterodúplex. Se une
un segundo cebador al ADNc y se forma un ADNc de doble hebra
mediante tratamiento con ADN polimerasa (esto es, transcriptasa
inversa). Uno o ambos cebadores codifica un promotor, esto es, el
promotor para la ARN polimerasa de T7, de tal manera que el ADNc de
doble hebra es un molde de transcripción para la ARN polimerasa de
T7.
\newpage
Los ADNcs competentes para la transcripción
producen copias de ARN antisentido de la diana original. Los
transcritos son convertidos posteriormente por la transcriptasa
inversa en ADNc de doble hebra que contiene promotores de doble
hebra, opcionalmente en ambos extremos en una orientación de
repetición invertida. Estos ADNs pueden producir ARNs que pueden
volver a entrar en el ciclo. Una descripción más completa del
sistema 3SR puede encontrarse en Guatelli y col., 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1874-1878 y EP Nº 329.822.
El sistema TAS está también descrito por Gingeras y col., en Innis y
col. eds., 1990, PCR Protocols, Academic Press, San Diego.
Las realizaciones de la invención ejemplificadas
en la presente describen el proceso para detectar ácidos nucleicos
amplificados junto con PCR. Por consiguiente, cuando se utiliza en
un método basado en PCR, el agente de unión a ADN está
caracterizado como un agente que no impedirá la hibridación de los
cebadores, la extensión de los cebadores a lo largo de un molde
complementario ni la separación de las hebras de un dúplex de
ADN.
En el proceso descrito en la presente, se
proporciona una muestra que contiene, o es sospechosa de contener,
una secuencia oligonucleotídica particular de interés, el "ácido
nucleico diana". La diana puede ser ARN o ADN o un hibrido
ARN/ADN. La diana puede ser de hebra sencilla o de doble hebra. La
preparación de la diana se llevará a cabo de una manera apropiada
para el proceso de amplificación particular que vaya a ser aplicado.
Por ejemplo, en un método de PCR en el que el ácido nucleico diana
es ARN de hebra sencilla, tal como ARNm, la diana puede ser
transcrita primeramente de manera inversa a ADNc, antes de la
amplificación.
Los métodos para transcribir ARN de manera
inversa a ADNc son bien conocidos y están descritos en Maniatis y
col., supra. Alternativamente, los métodos preferidos para la
transcripción inversa utilizan ADN polimerasas termoactivas. La
presente especificación describe que los agentes intercalantes no
impiden la actividad ADN polimerasa. Por consiguiente, el presente
método proporciona un ensayo de detección homogéneo de dianas de ARN
así como de dianas de ADN.
En otra realización de la presente invención, se
utilizan cebadores anidados (Mullis y col., 1986, Cold Spring
Harbor Symposium on Quantitative Biology 51:263). Este método
puede ser preferido cuando la cantidad de ácido nucleico en una
muestra es extremadamente limitada, por ejemplo, cuando se utilizan
muestras de archivo incluidas en parafina. Cuando se utilizan
cebadores anidados, el ácido nucleico es amplificado primeramente
con un conjunto de cebadores externo. Esta reacción de
amplificación está seguida por una segunda ronda de ciclos de
amplificación utilizando un conjunto de cebadores interno. Los
Ejemplos VI y VII describen modificaciones de métodos con cebadores
anidados que proporcionan resultados superiores sin necesitar la
manipulación adicional de la muestra requerida por la utilización
de cebadores anidados en rondas sucesivas de ciclos de
amplificación.
De acuerdo con la presente invención, la
producción de productos de amplificación puede ser monitorizada
mientras transcurre la reacción. Puede utilizarse un aparato para
detectar la señal generada por el agente de unión, con el fin de
detectar, medir y cuantificar la señal antes, durante y después de
la amplificación. Por supuesto, el tipo de señal particular puede
dictar la elección del método de detección. Por ejemplo, en una
realización preferida de la invención, se utilizan colorantes
fluorescentes que se unen al ADN para marcar los productos de la
PCR. Los colorantes se intercalan en, o se unen a, los productos de
PCR de doble hebra y, por consiguiente, la fluorescencia resultante
aumenta a medida que se eleva la cantidad de ADN de doble hebra. La
cantidad de fluorescencia puede ser cuantificada mediante medición
utilizando un espectrofluorímetro con o sin apertura del recipiente
de la PCR. Los Ejemplos VII y VIII demuestran este aspecto de la
invención.
En el Ejemplo VIII la fluorescencia de la
muestra control positivo estaba muy por encima de las medidas del
fondo. Como la producción de la señal fue medida sin tener que abrir
el tubo de reacción, este método de detección es fácilmente
adaptable a un formato automatizado en el que la señal es
monitorizada a lo largo de todo el proceso de amplificación. El
Ejemplo VIII muestra un método de detección de PCR en línea,
automatizado: se utilizó un cable de fibra óptica para introducir
luz de excitación directamente en un tubo de PCR en un bloque de
calentamiento/enfriamiento. Se utilizó la misma fibra óptica para
hacer volver de nuevo las emisiones fluorescentes al
espectrofluorímetro, en el que se leyó el valor.
En los métodos preferidos para PCR, la reacción
de amplificación se lleva a cabo como un proceso automatizado. Un
termociclador actualmente disponible utiliza un bloque calefactor
capaz de contener hasta 48 tubos de reacción. Por consiguiente,
pueden llevarse a cabo 48 reacciones de amplificación
simultáneamente. La presente invención permite la detección de los
productos de PCR en las 48 muestras, sin manipular las muestras,
abrir los tubos o interrumpir la reacción de los ciclos. Un sistema
óptico adecuado lleva la luz de excitación desde la fuente al tubo
de reacción y mide la luz de emisión de cada tubo. Por ejemplo,
múltiples cables de fibra óptica leen simultáneamente todos los
tubos de PCR que experimentan la termociclación. Sin embargo, se
necesita solamente un único fluorímetro para leer la fluorescencia
de los tubos de reacción, ya que cada fibra óptica puede ser leída
rápidamente una a la vez, por ejemplo, durante el marco de tiempo
del mantenimiento de una temperatura determinada de la PCR.
Alternativamente, será obvio para una persona experta en la técnica
que tal sistema de detección no está limitado necesariamente a una
máquina termocicladora particular o a un número de recipientes de
reacción. Sin embargo, la descripción del termociclador de 48
pocillos sirve para demostrar este aspecto de la presente
invención.
Siempre que los pocillos, o tubos, de reacción
estén cerrados herméticamente a la luz para impedir que fuentes de
luz externas influyan sobre la detección de la fluorescencia,
cualquier sobreplaca, tapón de tubo o tapa de aparato que contenga
o pueda ser unido a una sonda de fibra óptica es adecuado. En la
realización de la invención en el Ejemplo VIII, las tapas de los
tubos de reacción fueron retiradas para acomodar la fibra óptica.
Sin embargo, la utilización de un recipiente de reacción que tenga
una tapa clara o translúcida elimina la necesidad de insertar el
cable en el tubo. Será obvio que son deseables los tubos de reacción
capaces de acomodar un cable de fibra óptica, sin que el cable
entre en contacto físicamente con los componentes de la reacción de
amplificación. En un espectrofluorímetro capaz de calentar y enfriar
una superficie o un recipiente, no se requiere una fibra óptica. La
fibra óptica es solamente necesaria cuando el termociclador y el
espectrofluorímetro están instalados independientemente.
Un esquema de detección análogo es adecuado en
un formato de microvaloración de 96 pocillos. Este tipo de formato
es frecuentemente deseable en los laboratorios clínicos para un
cribado de muestras a gran escala, por ejemplo, para un análisis
genético tal como la selección por anemia de células falciformes o
por el virus del SIDA en procedimientos de cribado de bancos de
sangre. La presente invención es adecuada para este tipo de
análisis y elimina la necesidad de los numerosos procedimientos de
lavado y extracción que se requieren con procedimientos de ensayo
"en pocillos" conocidos tales como los formatos de tipo ELISA u
otros métodos basados en la densidad óptica (Kolber y col., 1988, J.
of Immun. Meth. 108:255-264; Huschtscha y
col., 1989, In Vitro Cell and Dev. Biol.
25(1):105-108; Voller y col., 1979, The
Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech Labs, Alexandria,
VA.).
Los presentes métodos de detección permiten
también la medida de fluorescencia directa utilizando un aparato
similar a un lector de placas de ELISA, pero diseñado para excitar y
medir fluorescencia. Por ejemplo, la máquina CytoFluor^{TM} 2300
fabricada por Millipore es adecuada en tal método. Es apropiada para
"leer" la placa de microvaloración antes y después de los
ciclos térmicos para determinar la fluorescencia de fondo.
Alternativamente, un aparato que proporcione una determinación
continua de fluorescencia es útil para monitorizar el incremento del
producto de PCR durante la reacción de amplificación.
En otra realización de la invención, después de
la amplificación, el tamaño del producto amplificado es determinado
sin la utilización de una sonda o de métodos de fraccionamiento por
tamaño tales como HPLC o electroforesis en gel. La invención es
particularmente útil para determinar si ha tenido lugar la
amplificación y distinguir simultáneamente el producto diana
amplificado de, por ejemplo, ADN del cebador-dímero
y ADN de alto peso molecular.
En una realización preferida de la invención, el
agente de unión detectable es un colorante fluorescente
intercalante. Los presentes ejemplos describen que en la mezcla de
la reacción de amplificación se incluye bromuro de etidio. El
bromuro de etidio, igual que otros colorantes que se unen al ADN,
tales como acridinas, proflavina, naranja de acridina, acriflavina,
fluorocoumarina, elipticina, daunomicina, cloroquina, distamicina D,
cromomicina, homidio, mitramicina, polipiridilos de rutenio y
antramicina, presenta emisiones de fluorescencia alteradas cuando
está unido a ADN de doble hebra. En una reacción de amplificación,
se genera una gran cantidad de ADN de doble hebra a partir de un
molde inicial. Por consiguiente, cuando esto ocurre en presencia de
un colorante fluorescente intercalante, tiene como resultado un
incremento neto de la fluorescencia dependiente de ADN. La
especificidad de la diana de la PCR y la utilización de controles
positivos y negativos apropiados asegura que un incremento
detectable de la fluorescencia es debido a la presencia del ácido
nucleico diana amplificado.
La presente especificación incluye varios
ejemplos que demuestran varios aspectos del ensayo de detección
homogéneo. Las realizaciones particulares describen que el bromuro
de etidio está presente en la PCR a una concentración de 0,53 a
1,27 \muM, aunque es también adecuada una concentración de 0,08
\muM (0,03 \mug/ml) a 40,6 \muM (16 \mug/ml); sin embargo,
se prefiere una concentración de bromuro de etidio en la mezcla de
PCR en el rango de 0,15 \muM (0,06 \mug/ml) a 20,3 \muM (8
\mug/ml). Será fácilmente obvio para aquellas personas con
experiencia habitual en la técnica cómo determinar una concentración
adecuada de agentes de unión a ADN alternativos mediante ajuste
empírico. Una concentración adecuada de agente es cualquier cantidad
que proporcione una señal que sea distinguible cuando haya tenido
lugar un incremento neto de ADN de doble hebra en una reacción de
amplificación. Por consiguiente, la concentración preferida de
agente incluida en la mezcla de reacción de amplificación puede
variar dependiendo de la cantidad de ADN de doble hebra no diana
(esto es, ADN genómico de fondo), del número de copias y de la
cantidad de la diana, de la cantidad y de la fluorescencia de los
cebadores de la amplificación y del agente particular utilizado. Por
ejemplo, puede ser apropiada una curva estándar que utilice una
cantidad conocida de la diana y varíe la cantidad de agentes de
unión. El colorante fluorescente es añadido a la mezcla de PCR antes
de comenzar los ciclos de temperatura. Un colorante fluorescente
adecuado no impide que tenga lugar la reacción de amplificación.
Será obvio para una persona con experiencia habitual en la técnica
el determinar la idoneidad de cualquier colorante nuevo en el
método. El Ejemplo I demuestra que la amplificación por PCR tiene
lugar en presencia de cantidades detectables de bromuro de
etidio.
El espectro de emisión del bromuro de etidio
tiene el pico a 650 nm para el bromuro de etidio no unido y a 611
nm cuando el agente está unido a ADN de doble hebra. Sin embargo,
como los espectros de emisión del bromuro de etidio unido y no
unido tienen picos distintos, emitiendo el etidio unido a una
longitud de onda más baja, la discriminación entre el etidio unido
y no unido es incrementada detectando la emisión a una longitud de
onda distinta de la de los picos que sea inferior a la del pico para
el etidio unido. En la realización descrita en el Ejemplo VII, la
emisión de fluorescencia de la muestra fue detectada a 570 nm. En el
Ejemplo VIII, la longitud de onda de excitación fue fijada a 500 nm
y la detección de la emisión fue fijada a 570 nm.
No es esencial que la longitud de onda de
detección o excitación sea optimizada para la práctica de la
invención. Por ejemplo, en el Ejemplo II, una caja de luz UV con
una longitud de onda de excitación a 300 nm y detección por
fotografía a través de un filtro rojo, es adecuada. Un
espectrofluorímetro, dependiendo de las características de la
máquina particular utilizada, ofrece la oportunidad de fijar la
longitud de onda de excitación y emisión, así como la amplitud de
banda. Será obvio para una persona con experiencia habitual en la
técnica cómo determinar las posiciones de las longitudes de onda y
de la amplitud de banda para un agente de unión a ADN particular a
detectar. Por tanto, aunque cada agente tenga un espectro de
fluorescencia discreto, un amplio rango de longitudes de onda de
detección es adecuado para practicar la invención, según se
ejemplifica en la presente. Se encuentran una directrices generales
en, por ejemplo, The Merck Index, eds. Budavari y col., 1989, Merck
Co. Inc. Rahway, NJ, en el que se describen en cada entrada las
longitudes de onda de emisión máximas para agentes fluorescentes
particulares unidos y no unidos a ADN helicoidal. De manera similar,
el Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, Catálogo, 1990, de
Haugland, es una referencia adecuada para describir agentes de unión
a ADN útiles en la presente invención.
En general, se prefiere, pero no es esencial,
que la ADN polimerasa sea añadida a la mezcla de reacción de PCR
después de que se hayan añadido el cebador y el molde.
Alternativamente, por ejemplo, el enzima y el cebador son añadidos
al final o el tampón de PCR o el molde más el tampón son añadidos al
final. Es generalmente deseable que al menos un componente que sea
esencial para la polimerización no esté presente hasta el momento en
el que estén presentes ambos, el cebador y el molde, y el enzima
pueda unirse a, y extender, el sustrato cebador/molde deseado.
Los métodos para reducir los efectos de la
contaminación cruzada de las reacciones de amplificación requieren
la introducción de bases no convencionales en el producto
amplificado y la exposición de la contaminación a un tratamiento
enzimático y/o fisicoquimico que haga eficazmente que el producto
sea incapaz de servir como molde para amplificaciones posteriores.
El ensayo de detección homogéneo descrito en la presente es adecuado
junto con métodos de esterilización. Estos métodos incrementan la
precisión y la fiabilidad de los resultados de la amplificación
eliminando etapas, y minimizando de este modo la manipulación del
producto, lo cual reduce la contaminación. El método de
esterilización proporciona una garantía adicional de la eliminación
de la contaminación con el molde.
Preferiblemente, el agente que se une a ADN es
estable durante su almacenamiento y puede ser incluido como un
componente en un tampón reactivo para PCR. Por tanto, la invención
proporciona nuevos reactivos adecuados para comercialización en un
formato de kit. Tal reactivo puede contener una solución del agente
de unión a ADN en un kit para detectar ácidos nucleicos por PCR.
Alternativamente, el reactivo podría contener un agente de unión a
ADN así como otros componentes del tampón de PCR tales como
Tris-HCl, KCl y MgCl_{2}, cada uno en una
concentración apropiada para llevar a cabo la PCR. En una
realización, un kit incluye un tampón que contiene bromuro de
etidio a una concentración adecuada para proporcionar, en una
reacción de amplificación, una concentración final de bromuro de
etidio en el rango de 0,15 \muM a 20,3 \muM. El tampón puede
contener adicionalmente cualquiera de, o todos, los reactivos
siguientes: Tris-HCl, pH 8,0-8,3;
KCl y MgCl_{2} cada uno en la concentración apropiada para la
amplificación por PCR. Se prevé también que los kits para detectar
ácidos nucleicos amplificados incluyan cualquiera de los siguientes:
un agente para polimerización, dNTPs, cebadores apropiados y un
molde control positivo.
La Patente de EE.UU. Nº 4.683.202 describe
métodos para preparar y utilizar cebadores para PCR que tengan
secuencias no complementarias añadidas al extremo 5'. Estas
"colas" son útiles para crear sitios de restricción
particulares o para otros fines, ya que durante la PCR la secuencia
de la cola no complementaria se incorpora al producto de PCR de
doble hebra. Secuencias de colas particulares proporcionan dianas de
unión para colorantes específicos. Por ejemplo, Hoechst 33258
(Searle y Embrey, 1990, Nuc. Acids Res.
18:3753-3762) se une preferencialmente a
pares de bases A-T. Un cebador de PCR sintetizado
con una larga cola 5' rica en A-T, proporciona un
producto de PCR relativamente rico en A-T en
comparación con el ADN genómico. Utilizando Hoechst 33358 el
producto de PCR rico en A-T tiene una fluorescencia
incrementada con relación al ADN genómico y, por consiguiente, es
útil para incrementar la potencia de la señal en presencia de ADN
genómico.
De manera similar, DAPI forma un complejo
fluorescente con ADN rico en A-T (Kapuseinski y
Szer, 1979, Nuc. Acids Res. 6(112):3519). En contraste, la
Actinomicina D forma un complejo fluorescente con ADN rico en
G-C (Jain y Sobell, 1972, J. Mol. Biol.
68:21). Por tanto, la presente invención es adecuada para
monitorizar la cantidad de dos ácidos nucleicos diana distintos en
un recipiente de reacción, mediante la inclusión de dos
fluorocromos en la mezcla de reacción durante la amplificación.
Solamente es necesario que un fluorocromo tenga especificidad de
secuencia y que esa secuencia esté incluida en la cola (esto es, en
el extremo 5') de un cebador para uno de los dos ácidos nucleicos
diana. El espectro de emisión de cada fluorocromo se determina
separadamente durante y/o después de la amplificación con un
espectrofluorímetro. Por tanto, la invención es particularmente
útil para comparaciones cuantitativas de dos dianas de ácido
nucleico diferentes en la misma muestra y como tal puede ser útil
para determinar el grado de, por ejemplo, una infección o una
enfermedad si una diana es una secuencia presente en todas las
células y la otra está presente en un patógeno.
Agentes similares con propiedades de unión
distintas permiten métodos de PCR múltiples para detectar varias
dianas en una muestra sin abrir nunca el recipiente de reacción una
vez que se ha iniciado la reacción de amplificación. Los colorantes
fluorescentes que se unen al ADN pueden tener cada uno diferentes
espectros de emisión y excitación. En un entorno clínico,
colorantes de unión a ADN diferentes que tienen diferentes
especificidades de secuencia de ADN son útiles para indicar la
presencia de distintas dianas.
La presente invención es adecuada junto con
métodos que utilizan un estándar interno para determinar la cantidad
relativa de una diana o para cuantificar con precisión la cantidad
de diana presente antes de la amplificación.
\newpage
En otra realización, la presente invención
proporciona un medio para determinar la integridad de una muestra
de ADN. Por ejemplo, los análisis forenses implican a menudo
muestras que contienen una diana parcialmente degradada, tal como
una muestra de archivo. La capacidad para monitorizar la generación
de un producto de PCR, demostrada en el Ejemplo VIII, permite la
comparación del perfil de amplificación de una muestra de ADN con
respecto a un producto de PCR pequeño y a un producto de PCR grande,
en reacciones separadas. Si no hay degradación, la monitorización
del incremento de ADN de doble hebra muestra que ambas reacciones
alcanzan una meseta en el mismo ciclo aproximadamente. Si hay
degradación, el producto pequeño alcanzará la meseta antes que el
fragmento grande debido a la presencia de más moléculas diana
intactas.
Será obvio para aquellas personas con
experiencia habitual en la técnica que el ensayo de detección
homogéneo proporcionado en la presente es adecuado para una amplia
variedad de aplicaciones, incluyendo, por ejemplo, cribado
genético, identificación humana forense, detección de patógenos y
cuantificación, monitorización medioambiental o marcaje y rastreo de
materiales con ácido nucleico.
En una realización, la señal detectable es
fluorescencia. La fluorescencia es adecuada para ser utilizada en
métodos cualitativos así como cuantitativos. La detección
cualitativa puede realizarse sencillamente y rápidamente mediante
inspección visual de los tubos de reacción por exposición a luz UV.
Este tipo de ensayo rápido, altamente sensible, es deseable como un
método de selección rápido por la presencia de un patógeno o de una
secuencia génica particular causante de, o asociada con, un estado
de enfermedad. La presente invención proporciona medios para
rebajar costes mediante una preselección más/menos por la presencia
de cualquier miembro de un grupo de dianas. Las amplificaciones de
muchas de tales dianas diferentes permitiría esto si puede esperarse
que la mayoría de las muestras sean negativas, por ejemplo, la
monitorización medioambiental para sistemas de detección de
patógenos. La PCR múltiple es un proceso para incluir varios pares
de cebadores distintos en una reacción de amplificación (Gibbs y
col., 1989, en PCR Technology, ed. Erlich, Stockton Press, NY). Un
ensayo de detección homogéneo que utiliza múltiples pares de
cebadores para analizar un amplio rango de dianas potenciales, es
seguido posteriormente por procedimientos de tipificación más
complejos solamente en las muestras positivas. Esta preselección
ahorra el coste de la realización del procedimiento de tipificación
más complejo en las muestras negativas y/o de la realización de
ensayos repetidos en muestras negativas.
Los presentes métodos para la detección
homogénea de ácidos nucleicos diana son también adecuados para la
cuantificación de una diana particular. Ya se realicen los métodos
de manera automatizada o manualmente, la cuantificación puede ser
llevada a cabo mediante varios medios. Por ejemplo, una dilución
seriada de la muestra, en paralelo con una dilución seriada de un
estándar conocido, proporciona una serie de moldes que, después de
la PCR y de la detección de la señal, son adecuados para cuantificar
la cantidad de material de partida en la muestra conocida. De
manera similar, como la fluorescencia puede ser determinada entre
ciclos durante el curso de una PCR, pueden determinarse fácilmente
la fase exponencial de la PCR y el ciclo en el cual el nivel de
producto alcanza la fase de meseta. Cuanto más ADN diana esté
presente al inicio de la PCR, antes alcanzará la meseta la
reacción, esto es, el punto en el que comienza a disminuir la tasa
de acumulación del producto. Como el número de ciclos necesarios
para alcanzar la meseta está relacionado directamente con la
cantidad de diana presente en la muestra, la monitorización de la
fluorescencia mientras está transcurriendo la PCR sirve para
cuantificar pequeñas cantidades de ADN.
La invención es adecuada para detectar ácidos
nucleicos amplificados en presencia de ADN genómico de doble hebra.
Niveles de fondo de ADN tan elevados como 0,5 g o más no ocultarán
un resultado positivo de un ensayo. El ácido nucleico diana puede
ser un segmento clonado, una secuencia de repetición, tal como un
gen de múltiples copias o una repetición en tándem, un gen de una
única copia o un agente infeccioso presente en una concentración
tan baja como una copia por 70.000 células. El molde de partida es
ARN o ADN porque la PCR proporciona un incremento neto de ácido
nucleico de doble hebra partiendo de cualquier ácido nucleico
molde.
El ácido nucleico diana puede ser una secuencia
rara, tal como una única copia de ADN del virus del SIDA en un
fondo de ADN genómico humano de más de 70.000 células. En tal caso,
los procedimientos para incrementar la especificidad sirven para
asegurar que la amplificación proporcione una ganancia neta de ADN
de doble hebra solamente en respuesta a la presencia de la
secuencia diana, y que la ganancia neta sea detectable en presencia
de un fondo elevado de ADN genómico. La Patente de EE.UU. Nº
4.683.195 demuestra la utilización de cebadores anidados para
disminuir el fondo en la amplificación de genes de una sola
copia.
El procedimiento para la amplificación anidada
de la Patente de EE.UU. Nº 4.683.195 requiere un primer par de
cebadores para amplificar una secuencia diana y un segundo par de
cebadores para amplificar un subsegmento del producto de PCR
formado de la primera reacción de amplificación. Después de la
primera PCR, la mezcla de reacción es diluida 10 veces para reducir
la concentración del primer par de cebadores, y el segundo par de
cebadores es introducido en la mezcla de reacción. Sin embargo, como
una ventaja particular de la presente invención radica en la
eliminación de etapas, no son deseables las etapas adicionales de
parar una reacción de amplificación para diluir la muestra y añadir
un segundo par de cebadores.
Para abordar esta cuestión, se proporcionan
procedimientos de amplificación anidada modificados. Los presentes
métodos con cebadores anidados están muy mejorados sobre los
procedimientos anteriores con cebadores anidados para amplificar
ácidos nucleicos. Estos métodos proporcionan una especificidad
incrementada y son aplicables en cualquier esquema de amplificación
basado en PCR. Sin embargo, en la presente descripción, estos
procedimientos son descritos utilizados en un ensayo homogéneo.
En un método con cebadores anidados modificado,
se incluye en una reacción de PCR un tercer cebador, interno a un
par de cebadores de PCR flanqueantes, para amplificar un segmento
diana particular. El tercer cebador tiene una temperatura de
hibridación/fusión, cuando está hibridado a su hebra diana
complementaria, que es inferior a la del cebador flanqueante. Esta
propiedad puede ser impartida al cebador por una longitud más corta
y/o un menor contenido de G-C. Durante los primeros
15-20 ciclos de PCR, la temperatura durante la fase
de extensión de cada ciclo de PCR es mantenida suficientemente
elevada, esto es a 65ºC aproximadamente, para impedir que el
cebador corto se hibride específicamente e inicie la amplificación.
Los cebadores flanqueantes se hibridan suficientemente, de tal
manera que la PCR procede normalmente a la elevada temperatura de
extensión. Sin embargo, el cebador que flanquea al tercer cebador
está presente a una baja concentración. En el método, antes de la
meseta de amplificación, cuando el suministro del cebador limitante
está casi agotado, la temperatura de hibridación es disminuida
hasta 42ºC aproximadamente. A esta temperatura, el tercer cebador
"entra" y procede a la amplificación de la diana durante los
más o menos 15 ciclos restantes.
En un método alternativo para la amplificación
con cebadores anidados, se elimina la necesidad de una baja
concentración de un cebador. El cebador flanqueante es sintetizado
con una cola rica en G-C. Como la secuencia de la
cola del cebador no complementaria se incorpora al producto de la
PCR después de dos ciclos de amplificación, la cola de
G-C sirve para elevar la temperatura necesaria para
desnaturalizar el producto de PCR debido a la termoestabilidad
incrementada de los pares G-C frente a los pares
A-T (Myers y col., 1989, en PCR Technology, ed.
Erlich, Stockton Press, New York). La diferencia resultante de la
temperatura de desnaturalización entre el producto de PCR anidado y
flanqueante es aprovechada posteriormente para interrumpir
eficazmente la amplificación del cebador flanqueante con la cola.
Una vez que el producto de PCR se ha formado a partir de los
cebadores flanqueantes, se disminuye la temperatura de
desnaturalización, esto es, desde 96ºC hasta 86ºC, de tal manera
que la temperatura es demasiado baja para la amplificación del
producto de PCR flanqueante, pero es lo suficientemente elevada
para permitir la amplificación del producto de PCR anidado. La
temperatura de hibridación puede ser también manipulada, igual que
en el método de "entrada", para iniciar la síntesis del cebador
anidado cuando se desee.
Será obvio para una persona con experiencia
habitual en la técnica el determinar empíricamente las temperaturas
apropiadas de desnaturalización e hibridación y programar en
consecuencia un termociclador. Este método del "cebador que se
retira" proporciona un medio para incluir altas concentraciones
del cebador flanqueante con el fin de mantener la eficacia de la
PCR, y permite que la amplificación iniciada por ese cebador sea
terminada durante la reacción cuando se desee. Este método
particular para la amplificación con cebadores anidados está
demostrado en los Ejemplos VI y VII.
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar
diferentes aspectos de la presente invención. Las secuencias de los
cebadores utilizados están enumeradas al final del Ejemplo VIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra la capacidad de la PCR
para proceder en presencia de bromuro de etidio.
Se llevaron a cabo dos PCRs según sigue. Cada
100 \mul de PCR contenían: 50 ng de ADN humano;
Tris-HCl 10 mM, pH 8; KCl 50 mM; MgCl_{2} 4 mM;
250 \muM de cada dNTP; 2,5 unidades de polimerasa Taq
(Perkin-Elmer Cetus Instruments, Norwalk,
Conneticut); 20 picomoles de cada cebador GH26 (SEC ID Nº: 1) y GH27
(SEC ID Nº 2). El ADN humano fue purificado a partir de una linea
de células B humanas. El ADN fue preparado de acuerdo con el método
descrito por Maniatis (supra). Se añadió una capa sobrepuesta
de aceite a cada reacción para impedir la evaporación.
Las dos PCRs se llevaron a cabo bajo condiciones
idénticas excepto en que en una reacción se incluyó bromuro de
etidio (Sigma) 0,15 \muM. Un termociclador adquirido a
Perkin-Elmer Cetus Instruments fue programado con
los parámetros de ciclación siguientes: desnaturalizar a 96ºC,
mantenidos durante 1 minuto; hibridar a 55ºC, mantenidos durante 1
minuto; extender a 72ºC, mantenidos durante 1 minuto. Este perfil se
repitió durante 32 ciclos. Después de la amplificación se
analizaron 5 \mul de cada PCR mediante electroforesis en gel
utilizando un gel de agarosa NuSieve al 3% (FMC). El gel fue teñido
con bromuro de etidio mediante métodos estándar y se comparó la
cantidad de producto de PCR producido en las dos reacciones. Los
resultados demostraban que la cantidad de ADN amplificado producida
en presencia de bromuro de etidio era indistinguible de la cantidad
de producto de PCR producida en ausencia del colorante.
Adicionalmente, la especificidad de la PCR, medida por la capacidad
para producir fragmentos de ADN del tamaño esperado, no fue
alterada.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo muestra que la especificidad de la
PCR es suficiente para la detección homogénea de ácidos nucleicos
diana basada en fluorescencia. El experimento descrito en el Ejemplo
I fue ampliado para determinar si la fluorescencia del bromuro de
etidio especifica de la diana era visible fácilmente utilizando
condiciones estándar de PCR. Por tanto, se prepararon cinco mezclas
de reacción de 100 \mul que contenían Tris-HCl 10
mM, pH 8; KCl 50 mM; MgCl_{2} 2,5 mM; bromuro de etidio 1,27
\muM; 150 \muM de cada dNTP; 2,5 unidades de polimerasa Taq. Se
incluyeron los cebadores y el ADN diana según se describe a
continuación. El par de cebadores GH15 (SEC ID Nº: 3) y GH16 (SEC
ID Nº: 4) son específicos para amplificar ADN diana DQ\alpha y no
amplifican ADN diana DR\beta1. El ADN DQ\alpha diana fue
preparado mediante amplificación del gen DQ\alpha humano según se
describió en el Ejemplo I. Después de la amplificación, el producto
de PCR DQ\alpha fue diluido para proporcionar \sim2 x 10^{7}
copias (5 pg) de ADN amplificado por amplificación. El producto
DQ\alpha fue utilizado como control positivo. El ADN diana
DR\beta1 fue preparado utilizando el par de cebadores GH46 (SEC
ID Nº: 5) y GH50 (SEC ID Nº: 6) para amplificar el gen DR\beta1 en
una PCR utilizando ADN genómico humano. El producto de la PCR fue
diluido para proporcionar \sim2 x 10^{7} copias de ADN
DR\beta1 y se utilizó en la Reacción 4, siguiente, como control
negativo. Las cinco mezclas de reacción contenían cebadores y diana
según sigue:
Reacción 1 - Sin cebadores + diana
DQ\alpha
Reacción 2 - Cebadores + diana DQ\alpha
Reacción 3 - Cebadores + diana DQ\alpha
Reacción 4 - Cebadores + diana DR\beta1
Reacción 5 - Cebadores + sin diana
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se incluyeron cebadores, se añadieron 10
pmoles de cada uno de GH15 (SEC ID Nº: 3) y GH16 (SEC ID Nº: 4).
Las mezclas de Reacción 1 y 2 no fueron sometidas a ciclos de
amplificación. Las Reacciones N^{os} 3, 4 y 5 fueron sometidas a
20 ciclos de amplificación. Los parámetros de los ciclos fueron
94ºC, mantenidos durante 1 minuto; 45ºC, mantenidos durante 1
minuto; y 72ºC, mantenidos durante 1 minuto.
Los tubos de reacción fueron colocados
posteriormente en una caja de luz UV (300 nm) y fotografiados con
exposiciones de dos segundos y medio segundo. Los resultados,
mostrados en la Figura 1, demostraban la fluorescencia incrementada
en la Reacción Nº 3 debido a la amplificación del ADN diana
específico. Las Reacciones N^{os} 1 y 2 indicaban el nivel de
fluorescencia presente antes de que tuviera lugar alguna
amplificación. Las Reacciones N^{os} 4 y 5 demostraban que la
fluorescencia no incrementa visiblemente en una reacción a no ser
que, para el par de cebadores particulares presente en la reacción,
esté también presente un molde apropiado. Las diferentes
exposiciones fotográficas, según se muestra en la Figura 1,
demuestran las diferencias relativas de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la capacidad del presente método de
ensayo homogéneo para detectar una diana especifica en presencia de
ADN de doble hebra no diana. Este ejemplo demuestra la detección de
una secuencia de ADN especifica en un fondo de ADN genómico. Se
prepararon veinte mezclas de 100 \mul de PCR según sigue. Cada una
contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8; KCl 50 mM;
MgCl_{2} 2 mM; 2,9 unidades de polimerasa Taq; 180 \muM de cada
dNTP; bromuro de etidio 1,27 \muM; 15 picomoles de RH191 (SEC ID
Nº: 7) y 15 picomoles de RH192 (SEC ID Nº: 8). Los cebadores RH191
(SEC ID Nº: 7) y RH192 (SEC ID Nº: 8) derivan de los cebadores y1.1
e y1.2, que están descritos en Kogan y col., 1987, N. Engl. J. Med.
317:985-990. Estos cebadores son específicos
para una secuencia humana especifica de hombres que está presente
en varios miles de copias por célula masculina humana. Se prepararon
quince mezclas de reacción de PCR según sigue. La muestra de ADN
fue preparada a partir de sangre humana extraída de un hombre o de
una mujer según se especifica para cada reacción. El ADN fue
preparado de acuerdo con Maniatis, supra.
- Reacciones N^{os} 1-5:
- contenían 2 ng de ADN masculino humano
- Reacciones N^{os} 6-10:
- no contenían ADN
- Reacciones N^{os} 11-15:
- contenían 60 ng de ADN femenino humano
- Reacciones N^{os} 16-20:
- contenían 60 ng de ADN masculino humano
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones fueron todas colocadas en un
termociclador de Perkin-Elmer Cetus Instruments
programado para ciclos de 94º durante 1 minuto; 60ºC durante 1
minuto, para el número de ciclos indicado. Según se indica a
continuación, se retiraron tubos del termociclador a diferentes
ciclos para proporcionar la variación de la PCR a lo largo del
tiempo para cada molde. Específicamente, para cada conjunto de cinco
tubos, se realizaron 0, 17, 21, 25 y 29 ciclos de amplificación. El
producto de la PCR fue detectado exponiendo los tubos a luz UV según
se describió anteriormente.
Por fotografía y por inspección visual, los
Tubos N^{os} 6-15 no presentaban un incremento de
fluorescencia. Los Tubos N^{os} 1 y 2, las muestras de ADN
masculino de 0 y 17 ciclos, tampoco presentaban un incremento de
fluorescencia por detección visual. Solamente las reacciones de ADN
masculino de 21, 25 y 29 ciclos fluorescían bajo luz UV, y la
cantidad de fluorescencia aumentaba al incrementar el número de
ciclos. Los resultados con los Tubos N^{os} 16-20
fueron similares, excepto en que se observó un incremento de la
fluorescencia hacia los 17 ciclos. Esto es consistente con la
presencia de más copias de la secuencia de ADN diana presentes en la
muestra antes de la amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la medida cuantitativa de la fluorescencia
de bromuro de etidio específica de la diana, se abrieron las
reacciones del Ejemplo III y se transfirió su contenido a un
espectrofluorímetro (SPEX Fluorolog-2, adquirido a
Spex, Edison, NJ) que fue utilizado para obtener un valor de
fluorescencia cuantitativo para cada reacción. Los resultados
mostrados en la Figura 2 demuestran no solamente la especificidad de
la diana del método de detección, sino que ilustran también los
aspectos cuantitativos de la invención. El efecto de una diana
incrementada en la muestra es observable comparando la variación de
la fluorescencia a lo largo del tiempo entre los moldes masculinos
de 2 ng y 60 ng. A mayor cantidad de ADN diana en la muestra, antes
obtiene la reacción un incremento de fluorescencia medible y
alcanza finalmente un nivel meseta de fluorescencia. El momento
exacto en el que la fluorescencia de la reacción comienza a
aumentar de manera medible, es efectivamente una medida cuantitativa
de la cantidad de diana que estaba presente antes de la
amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra la idoneidad del ensayo
homogéneo no sólo para detectar un gen de una sola copia entre el
ADN genómico humano total, sino también para discriminar entre dos
alelos de ese gen con una sola copia presente en la muestra que
difieren en un único nucleótido. (Métodos para la detección
especifica de alelos están descritos con detalle en la Publicación
de Patente Europea Nº 237.362, que se incorpora a la presente por
referencia).
El gen particular que va a ser detectado es el
gen de la \beta-globina. Un cambio de un solo par
de bases muta un alelo de la \beta-globina de
tipo salvaje a un alelo de células falciformes. En este ejemplo, se
utilizaron los cebadores siguientes: RH187 (SEC ID Nº: 9), RH188
(SEC ID Nº: 10) y RH189 (SEC ID Nº: 11). El par de cebadores
RH187/RH188 (SEC ID Nº: 9/SEC ID Nº: 10) amplificaba específicamente
el alelo de tipo salvaje. El par de cebadores RH187/RH189 (SEC ID
Nº: 9/SEC ID Nº: 11) amplificaba el alelo de células falciformes
(estos cebadores derivan de BGP2, H\beta14A y H\beta14S
descritos en Wu y col., 1989, PNAS (USA)
86:2757-27 60. Se prepararon seis PCRs según
sigue: Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; KCl 50 mM; dNTPs 748
\muM en total; 2,9 unidades de polimerasa Taq; 10 pmoles de cada
cebador; MgCl_{2} 1,5 \muM; bromuro de etidio 1,27 \muM y 50
ng de ADN humano molde según sigue: un par de reacciones contenía
ADN humano homozigoto para el alelo falciforme (SS); un par de
reacciones contenía ADN de tipo salvaje (AA); y un par contenía ADN
heterozigoto, esto es, un alelo de tipo salvaje y un alelo de
células falciformes (AS).
Para cada par de reacciones, un tubo contenía
cebadores específicos para el alelo de la globina falciforme y un
tubo contenía cebadores para la secuencia de tipo salvaje. La única
diferencia entre los conjuntos de cebadores son los nucleótidos 3'
de uno de los pares de cebadores, que coinciden con la secuencia
diana de células falciformes o con la secuencia diana de tipo
salvaje. La temperatura de hibridación de los cebadores durante la
PCR se establece de tal manera que la amplificación tendrá lugar
solamente si este nucleótido 3' se aparea con el molde. Los
parámetros de los ciclos fueron: 94ºC durante 60 segundos, 55ºC
durante 60 segundos.
La reacción se realizó por triplicado y después
de 30 ciclos de PCR, los tubos fueron colocados bajo una fuente de
luz UV y fotografiados. Las fotografías se muestran en la Figura 3.
Los resultados fueron según sigue:
Un "+" indica que la fluorescencia era
fácilmente visible bajo luz UV, y cuando se midieron en un
espectrofluorímetro los tubos "+" tenían una fluorescencia
aproximadamente tres veces mayor que las reacciones "-". Las
PCRs señaladas como "-" no cambiaron significativamente su
fluorescencia como resultado de la reacción de amplificación.
Alícuotas de cada reacción fueron analizadas por
electroforesis en gel. Cada reacción "+" presentaba un
fragmento de ADN discreto específico. Las reacciones "-" no
tenían tal fragmento de ADN por análisis en gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñó un ensayo de detección para demostrar
la idoneidad de la presente invención para detectar una secuencia
diana rara en un fondo de ADN de 70.000 células humanas
aproximadamente. Se diseñó un procedimiento con cebadores anidados
modificado, según se describió brevemente en la sección
"Descripción Detallada" como un procedimiento de
"retirada" de los cebadores, para incrementar la especificidad
de la PCR. Este ensayo fue realizado según sigue: en los
recipientes de reacción de PCR 1 a 8 se alicuotaron 50 microlitros
de solución, conteniendo cada alícuota KCl 50 mM;
Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; MgCl_{2} 2,5 mM; dNTPs 600
\muM en total; 1,25 unidades de ADN polimerasa Taq (PECI);
bromuro de etidio 1,27 \muM; 0,5 \mug de ADN de una linea
celular humana; el par de cebadores RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH176
(SEC ID Nº: 13), cada cebador a 0,2 \muM; y el cebador anidado
RH182 (SEC ID Nº: 14) también a 0,2 \muM. Se utilizó una gota de
aceite mineral para cubrir las ocho soluciones con el fin de
impedir la evaporación. El cebador RH176 (SEC ID Nº: 13) lleva una
"cola" 5' no homóloga (a la secuencia diana) rica en
G-C, que eleva la temperatura de desnaturalización
necesaria para amplificar el producto de PCR producido utilizando
este cebador.
Las Reacciones 1-4 se realizaron
con soluciones que estaban a temperatura ambiente y que incluían los
tres cebadores antes de que comenzaran los ciclos de temperatura.
Las reacciones 5-8 se realizaron con la adición de
los tres cebadores pospuesta hasta que estas reacciones fueron
equilibradas a una temperatura de 72ºC antes de comenzar los ciclos
de temperatura. Por esta razón, las Reacciones 5-8
son referidas como reacciones a las que se había dado un "inicio
caliente". Las Reacciones 2-4 y
6-8 contenían también un ADN diana control positivo
(adquirido a PECI) que contenía secuencias del VIH a las que eran
homólogos RH171 (SEC ID Nº: 12), RH176 (SEC ID Nº: 13) y la porción
3' de RH182 (SEC ID Nº: 14). Este ADN fue diluido de tal manera que
cada reacción que lo contenía tenia, de promedio, cuatro copias de
la secuencia del VIH. Como este número medio de copias es pequeño,
el número real de copias en una reacción dada puede variar
considerablemente. Como no se añadió ADN de VIH diana a las
Reacciones 1 y 5, estas reacciones sirvieron como controles
negativos.
Las ocho reacciones fueron todas sometidas a
ciclos térmicos según sigue: desnaturalización a 96ºC, mantenidos
durante 1 minuto; hibridación a 64ºC, mantenidos durante 1 minuto.
Este perfil fue repetido durante 29 ciclos, durante los cuales el
par de cebadores flanqueantes, RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH176 (SEC ID
Nº: 13), se hibridaban eficazmente y fueron utilizados en la
amplificación, mientras que el cebador anidado RH182 (SEC ID Nº:
14), que no se hibrida eficazmente a 64ºC, no fue utilizado en la
amplificación eficaz. Esto fue seguido por desnaturalización a
96ºC, mantenidos durante 1 minuto; hibridación a 52ºC, mantenidos
durante 1 minuto. Este perfil fue repetido durante 2 ciclos,
durante los cuales los tres cebadores se hibridaron eficazmente y
fueron extendidos en una amplificación, de tal manera que se
produjeron productos utilizando RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH176 (SEC
ID Nº: 13), o bien RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH182 (SEC ID Nº: 14).
Como la utilización de un tercer cebador anidado incrementa la
especificidad del producto, los productos producidos utilizando
RH171 (SEC ID Nº: 12) y RH182 (SEC ID Nº: 14) era más probable que
fueran específicos del VIH. Estos ciclos fueron seguidos por
desnaturalización a 8 6ºC, mantenidos durante 1 minuto; hibridación
a 52ºC, mantenidos durante 1 minuto. Este perfil fue repetido 18
veces, durante las cuales, los productos que incluían el cebador
rico en GC RH176 (SEC ID Nº: 13), especifico y no especifico del
VIH, no se desnaturalizaban eficazmente a 86ºC y, por tanto, no se
amplificaban eficazmente, mientras que las secuencias del VIH
amplificadas producidas utilizando el cebador anidado RH182 (SEC ID
Nº: 14) y RH171 (SEC ID Nº: 12) se desnaturalizaban y amplificaban
eficazmente.
Las ocho reacciones fueron analizadas, cuando se
completaron, mediante electroforesis en gel. Se demostró que las
Reacciones 2-4 y 5-8 contenían un
producto del tamaño esperado (200 pb aproximadamente) como banda
predominante en el gel. Las Reacciones 1 y 5, los controles
negativos, no contenían tal producto. Sin embargo, pudo observarse
que las Reacciones 2-4, a las que no se dio un
"inicio caliente", contenían fragmentos de ADN de otro tamaño
distinto del esperado. Estos otros fragmentos de ADN fueron también
visibles en la Reacción 1, indicando que no derivan de secuencias
del VIH. Estos otros fragmentos de ADN no fueron visibles en las
Reacciones 5-8, indicando que la utilización del
"inicio caliente" había incrementado la especificidad de estas
reacciones.
Se realizaron ocho reacciones adicionales según
se describió anteriormente, excepto en que a todas se les dio un
"inicio caliente" según se describió anteriormente. El ADN
control positivo fue diluido en estas ocho reacciones, numeradas de
1 a 8, de tal manera que de promedio, cada una contenía la mitad de
una molécula diana de VIH. Como una molécula no puede ser dividida,
esto significa que algunas reacciones contendrían una molécula
diana y algunas no. Si este experimento se repitiera muchas veces,
la fracción de reacciones que contienen una diana variaría
considerablemente, pero la media sería la mitad aproximadamente.
Aquéllas que contienen una molécula diana es muy probable que
contengan una única molécula diana. Después de la finalización de
las reacciones, las ocho fueron todas analizadas mediante
electroforesis en gel. El resultado fue que dos de las ocho
reacciones, las Reacciones números 1 y 8, presentaban un fragmento
de ADN del tamaño esperado (200 pb aproximadamente) como banda
predominante en el gel, sin ninguna otra banda visible que migrara
en el gel excepto una banda correspondiente a los cebadores. Las
Reacciones 2-6 no presentaban tales bandas ni
ninguna otra banda de fragmentos de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección cuantitiva del producto de PCR
se utilizó un espectrofluorímetro Spex Fluorolog-2
(Spex, Edison, NJ) para cuantificar el incremento neto de la
fluorescencia generada en respuesta a lo que se espera que sea una
sola diana de VIH en presencia de ADN genómico. El
espectrofluorímetro fue utilizado de acuerdo con las
especificaciones del fabricante según se describe en el Ejemplo
VIII. Las reacciones de PCR descritas en el Ejemplo VI, en las que
el ADN control positivo fue diluido entre ocho reacciones para que
contuviera media molécula diana del VIH por reacción, fueron
analizadas para determinar su fluorescencia. Veinte microlitros de
cada reacción completada se añadieron a 100 \mul de
Tris-HCl 10 mM, pH 8; EDTA 0,1 mM; bromuro de etidio
1,27 \muM. La fluorescencia de estas soluciones fue medida a 570
nm. La Figura 4A demuestra gráficamente el incremento significativo
de la fluorescencia de las dos muestras positivas en comparación con
las dos muestras negativas. En la figura, las lineas discontinuas
señalan los valores de fluorescencia a dos desviaciones estándar de
distancia de la media de las muestras negativas. Las muestras
PCR-positivas están ambas por encima de esta
linea.
Los resultados se muestran también en la Figura
4B utilizando un método de sustracción del fondo. La fluorescencia
hasta la segunda desviación estándar por debajo de la media fue
sustraída de los valores detectados. La sustracción del fondo se
realiza preferiblemente midiendo la fluorescencia de cada muestra al
comienzo de los ciclos de PCR (preferiblemente después de la
desnaturalización inicial, que reduce la proporción de ADN genómico
de doble hebra) y sustrayendo ese valor de la fluorescencia de la
muestra al final de los ciclos de PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento siguiente demuestra la idoneidad
del presente método para monitorizar una reacción de PCR y detectar
el incremento neto de ADN de doble hebra debido a la amplificación.
El aparato permite la detección en línea del producto de PCR.
El aparato fue montado según sigue: un
fluorímetro Spex Fluorolog-2 con un accesorio de
fibra óptica (Catálogo de Spex Nº 1950) fue fijado para emitir una
luz de excitación a 500 nm con una amplitud de banda de \sim3,4
nm. Se utilizó un filtro de corte a 435 nm GG para excluir la luz
de segundo orden (adquirido a Melles Grist, Inc.). La luz de
emisión fue detectada a 570 nm con una amplitud de banda de
\sim13,6 nm. Se utilizó un filtro 0G530 (corte a 530 nm) para
eliminar la luz de excitación.
Se prepararon dos reacciones de PCR según se
describió en el Ejemplo III utilizando los cebadores RH191 (SEC ID
Nº: 7) y RH192 (SEC ID Nº: 8). Un tubo de reacción contenía 60 ng de
ADN masculino humano, el otro no contenía ADN diana. Las reacciones
fueron preparadas en tubos de polipropileno de 0,5 ml; sin embargo,
el extremo superior de los tubos fue cortado para fijar el cable de
fibra óptica. La fibra óptica fue pegada al extremo superior del
tubo de reacción con epoxi. Como este aparato tenía una fibra
óptica, solamente se llevó a cabo una PCR a la vez. La luz de
emisión fue recogida a través de la capa superpuesta de aceite del
tubo. Se construyó una "cubierta" negra alrededor del tubo y
la reacción fue colocada en el termociclador. El termociclador fue
programado para ciclos entre 94ºC y 50ºC durante 1 minuto cada uno,
durante 30 ciclos, seguido por incubación continua a 25ºC. El
fluorímetro y el termociclador fueron puestos en marcha
simultáneamente. Los parámetros del fluorímetro fueron: barrido
basado en el tiempo con un tiempo de integración de 5 segundos; se
calculó la relación de la señal de emisión con la de la luz de
excitación para controlar los cambios de la intensidad de la
fuente.
La Figura 5A muestra los resultados de la
reacción de PCR que no contenía ADN. La Figura 5A muestra que el
termociclador comenzó a 25ºC, la fluorescencia cayó cuando la
temperatura aumento a 94ºC y la fluorescencia aumentó de nuevo
cuando la temperatura disminuyó a 50ºC. Este patrón fue repetido
para los ciclos restantes hasta que el termociclador alcanzó de
nuevo los 25ºC y la fluorescencia volvió al valor de partida
aproximado.
La Figura 5B demuestra el perfil de
fluorescencia de una reacción de PCR que contenía el ADN diana
apropiado. La intensidad de la fluorescencia a 50ºC muestra un
incremento dependiente del ciclo que refleja un incremento de la
cantidad de ADN de doble hebra. Cuando el termociclador volvió a los
25ºC, una vez que se completaron los 30 ciclos, la fluorescencia
aumentó hasta un valor final más de tres veces mayor que el valor de
fluorescencia inicial a 25ºC.
Después de la amplificación, una alícuota de
cada mezcla de reacción fue analizada mediante electroforesis en
gel de agarosa. El análisis del gel demostró que no había producto
de PCR visible en la calle que contenía una muestra del control
negativo. La muestra del control positivo de PCR sometida a
electroforesis mostró una clara y única banda a \sim150 pares de
bases. El tamaño pronosticado del producto de PCR era de 154 pb.
Por tanto, el método en linea proporcionó un
rápido análisis de la presencia o ausencia de ADN diana sin la
necesidad de sondas o de etapas posteriores de procesamiento.
Además, la detección continua de fluorescencia a lo largo de toda
la amplificación proporciona un perfil de amplificación que refleja
la cantidad de diana presente al comienzo. Si el ADN diana es, por
ejemplo, una secuencia humana repetida presente en millones de
copias por célula (por ejemplo, secuencias "Alu"; Nelson y
Caskey en PCR Technology, ed. Erlich, 1989, Stockton Press, NY),
este método de cuantificación podría ser utilizado para medir
rápidamente y de manera sencilla cantidades subcelulares de ADN, lo
cual es actualmente difícil de realizar sin utilizar
radioisótopos.
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCTGCAGG TGTAAACTTG TACCAG
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGGATCCG GTAGCAGCGG TAGAGTTG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGTAAACTT GTACCAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTAGCAGCG GTAGAG
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGATCCTT CGTGTCCCCA CAGCACG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCCCCAACC CCGTAGTTGT GTCTGCA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCACTTTAT TCCAGGCCTG T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGAATGGAA TGGGAACGAA TGG
\hfill23
\newpage
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATAGACCAA TAGGCAGAG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCTGACTC CTGA
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCTGACTC CTGT
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGGCCAGA TGAGAGAACC AAGGGG
\hfill26
\newpage
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGCAGGG CGGCGGGGGC GGGGCCGAAC CGGTCTACAT AGTCTCTAAA GGG
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
- INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTCCCTGTC TTATGTC
\hfill17
Claims (10)
1. Un aparato para monitorizar una reacción en
cadena de polimerasa (RCP) para una amplificación de un ácido
nucleico a lo largo de múltiples ciclos térmicos, que comprende:
(a) un termociclador para efectuar un
procedimiento automatizado de (RCP), dicho termociclador será capaz
de calentar y enfriar alternativamente, en un recipiente de
reacción, una mezcla de reacción de amplificación (RCP) que contiene
un ADN diana, reactivos para dicha amplificación del ácido nucleico
y un agente de unión al ácido nucleico detectable, y
(b) un sistema óptico que incluye un detector
operable para detectar una señal óptica relacionada con la cantidad
de ácido nucleico amplificado en la mezcla de reacción a lo largo de
un periodo de múltiples ciclos, sin abrir el recipiente de reacción
una vez que se ha iniciado la reacción de amplificación.
2. El aparato de la reivindicación 1, en el que
el termociclador es capaz de calentar y enfriar alternativamente una
pluralidad de recipientes de reacción, conteniendo cada uno dicha
mezcla de reacción de amplificación.
3. El aparato de la reivindicación 1 ó 2, en el
que el detector, para detectar la señal óptica, es operable para
tomar muestras de valores de la señal óptica a lo largo de múltiples
ciclos térmicos.
4. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el detector es operable para
detectar una señal óptica de fluorescencia.
5. El aparato de la reivindicación 4, en el que
el detector es operable para detectar una señal óptica de
fluorescencia a una longitud de onda de, o alrededor de, 570 nm.
6. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el sistema óptico incluye un
cable de fibra óptica.
7. El aparato de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que contiene además un recipiente de
reacción adaptado para contener dicha mezcla de reacción de
amplificación que contiene un ADN diana, reactivos para dicha
amplificación del ácido nucleico y un agente de unión al ácido
nucleico detectable.
8. El aparato de la reivindicación 7, que
contiene una pluralidad de recipientes de reacción, adaptado cada
uno para contener dicha mezcla de reacción de amplificación.
9. El aparato de la reivindicación 7 u 8, en el
que el (los) recipiente(s) de reacción incluye(n) un
tapón claro o translúcido acoplado ópticamente al detector.
10. La utilización de un aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes para monitorizar una
reacción en cadena de polimerasa para una amplificación de un ácido
nucleico a lo largo de múltiples ciclos térmicos.
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