JPH10201464A - 核酸増幅反応モニター装置 - Google Patents
核酸増幅反応モニター装置Info
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- JPH10201464A JPH10201464A JP10021236A JP2123698A JPH10201464A JP H10201464 A JPH10201464 A JP H10201464A JP 10021236 A JP10021236 A JP 10021236A JP 2123698 A JP2123698 A JP 2123698A JP H10201464 A JPH10201464 A JP H10201464A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
等の増幅方法を使用する改良された核酸検出装置を提供
する。更に、本発明は特に速度と精度とを向上するため
の核酸増幅と検出とを同時に行う装置を提供する。 【解決手段】 1又は複数の核酸増幅反応体積を収容す
るための支持体を有する熱循環器、及び前記支持体に収
容される前記1又は複数の核酸増幅反応体積に光学的に
連係される光学系を有する、核酸増幅反応モニター装
置。
等の増幅方法を使用する改良された核酸検出装置を提供
する。更に、本発明は特に速度と精度とを向上するため
の核酸増幅と検出とを同時に行う装置を提供する。 【解決手段】 1又は複数の核酸増幅反応体積を収容す
るための支持体を有する熱循環器、及び前記支持体に収
容される前記1又は複数の核酸増幅反応体積に光学的に
連係される光学系を有する、核酸増幅反応モニター装
置。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の標的核酸
の検出、および試料中の標的核酸増幅の間の二重鎖核酸
増大の監視のための装置を提供するものである。
の検出、および試料中の標的核酸増幅の間の二重鎖核酸
増大の監視のための装置を提供するものである。
【0002】
【従来の技術】同時的核酸増幅および検出の新規方法
は、従前の検出方法の速度および精度を向上させ、また
増幅に引続く試料処理の必要性を除去する。好ましい実
施態様において、該方法はポリメラーゼ連鎖反応の変更
を与え、また螢光が二重鎖核酸との結合によって増大す
る試剤を使用する。ここにおいて該方法は、特に分子生
物学、医学的診断および法科学の分野において多くの応
用を有する。
は、従前の検出方法の速度および精度を向上させ、また
増幅に引続く試料処理の必要性を除去する。好ましい実
施態様において、該方法はポリメラーゼ連鎖反応の変更
を与え、また螢光が二重鎖核酸との結合によって増大す
る試剤を使用する。ここにおいて該方法は、特に分子生
物学、医学的診断および法科学の分野において多くの応
用を有する。
【0003】開示される核酸検出方法は、増幅核酸の検
出に関する従来方法より、速度および単純性の優位性を
提供する。一般に核酸検出技術は、医学的診断用アッセ
イに実務的に有用である。例えば、米国特許第4,35
8,535号は、フィルタ上に試料(例えば、血液、細
胞、唾液等)をスポッティングし、細胞を溶解し、およ
びDNAを化学的変性および加熱により固定することに
より病原を検出する方法を開示している。そして標識D
NAプローブを添加し、固定した試料DNAとハイブリ
ッドさせる。ハイブリダイゼーションは、病原DNAの
存在を示している。
出に関する従来方法より、速度および単純性の優位性を
提供する。一般に核酸検出技術は、医学的診断用アッセ
イに実務的に有用である。例えば、米国特許第4,35
8,535号は、フィルタ上に試料(例えば、血液、細
胞、唾液等)をスポッティングし、細胞を溶解し、およ
びDNAを化学的変性および加熱により固定することに
より病原を検出する方法を開示している。そして標識D
NAプローブを添加し、固定した試料DNAとハイブリ
ッドさせる。ハイブリダイゼーションは、病原DNAの
存在を示している。
【0004】オリゴヌクレオチドプローブを使用する核
酸検出は、特異的な標的検出の標準方法になっている。
標的細胞または有機体のフィルタ上のその位置における
培養、検出に利用可能な標的核酸量の増大を含む多くの
修飾方法が記述されている。一般的に、これらの方法
は、DNA試料がニトロセルロースまたはナイロン等の
固体担体上に非共有的に結合され、次いで標識された標
的−特異性プローブにハイブリッドすることを必要とす
る。
酸検出は、特異的な標的検出の標準方法になっている。
標的細胞または有機体のフィルタ上のその位置における
培養、検出に利用可能な標的核酸量の増大を含む多くの
修飾方法が記述されている。一般的に、これらの方法
は、DNA試料がニトロセルロースまたはナイロン等の
固体担体上に非共有的に結合され、次いで標識された標
的−特異性プローブにハイブリッドすることを必要とす
る。
【0005】核酸検出方法の感度および特異性は、ポリ
メラーゼ連鎖反応(PCR)の発明によって大きく改善
された。PCRは、核酸の増幅方法であり、2種類のオ
リゴヌクレオチドプライマ、重合試薬、標的核酸テンプ
レート、ならびに核酸の変性、アニーリングおよびプラ
イマの伸長の連続的サイクルの使用を含み、特定の核酸
断片の多数の複写物を生成する。この方法により、ゲノ
ムDNAの単一複写物が、一千万倍以上に、極めて高い
特異性および忠実度をもって増幅され得る。PCR法
は、米国特許第4,683,202号に開示されてい
る。
メラーゼ連鎖反応(PCR)の発明によって大きく改善
された。PCRは、核酸の増幅方法であり、2種類のオ
リゴヌクレオチドプライマ、重合試薬、標的核酸テンプ
レート、ならびに核酸の変性、アニーリングおよびプラ
イマの伸長の連続的サイクルの使用を含み、特定の核酸
断片の多数の複写物を生成する。この方法により、ゲノ
ムDNAの単一複写物が、一千万倍以上に、極めて高い
特異性および忠実度をもって増幅され得る。PCR法
は、米国特許第4,683,202号に開示されてい
る。
【0006】PCR生成物の検出方法は、特に米国特許
第4,683,195号に記述されている。これらの方
法は、増幅標的核酸にハイブリッド可能なオリゴヌクレ
オチドプローブを必要とする。EP第237,362号
もまた“逆ドットブロット”と称されるPCRに基づく
検出方法を記述するもので、ここにおいて増幅DNAに
代えてプローブが膜に固定される。該方法に従うと、プ
ローブではなく標的がハイブリダイゼーションのために
標識される。これらの方法は、増幅、捕捉および検出の
別個の工程を必要とし、一般に完了するに数時間を要す
る。該逆ドットブロット法において、保存安定性の標的
特異性試薬が好ましい。
第4,683,195号に記述されている。これらの方
法は、増幅標的核酸にハイブリッド可能なオリゴヌクレ
オチドプローブを必要とする。EP第237,362号
もまた“逆ドットブロット”と称されるPCRに基づく
検出方法を記述するもので、ここにおいて増幅DNAに
代えてプローブが膜に固定される。該方法に従うと、プ
ローブではなく標的がハイブリダイゼーションのために
標識される。これらの方法は、増幅、捕捉および検出の
別個の工程を必要とし、一般に完了するに数時間を要す
る。該逆ドットブロット法において、保存安定性の標的
特異性試薬が好ましい。
【0007】増幅核酸検出のための別法は、標的核酸の
同時的増幅および標識を記述している。該方法は、少な
くとも1種の増幅プライマが標識されていることを必要
とする。該増幅プライマは、例えば増幅生成物の直接検
出のための放射同位体により標識されるか、または引続
く検出のために生成物を固体担体上に捕捉するに適した
試薬により標識され得る。
同時的増幅および標識を記述している。該方法は、少な
くとも1種の増幅プライマが標識されていることを必要
とする。該増幅プライマは、例えば増幅生成物の直接検
出のための放射同位体により標識されるか、または引続
く検出のために生成物を固体担体上に捕捉するに適した
試薬により標識され得る。
【0008】検出の別の手段は、クローン化DNAでは
なく増幅DNAを使用する断片長多形性ハイブリダイゼ
ーション、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(AS
O)プローブ(Saiki らの、1986, Nature, 324 : 16
3)、またはジテオキシ法による直接配列決定の使用を含
む。断片長多形性方法は、大きさ決定により検出可能
な、異なる長さのPCR生成物を生じるPCRプライマ
の間の挿入および削除を検出する。ASO法は、対立遺
伝子変異の検出に有用である。ASOハイブリダイゼー
ションの例において、増幅DNAが、例えば、UV照射
により“ドットブロット”の一連としてナイロンフィル
タに固定され、次いで厳密条件下でオリゴヌクレオチド
プローブとハイブリッドされる。該プローブは、例えば
西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)により標識さ
れ、適当な酸化剤を用いた処理の後、青色沈澱の存在に
より検出される。
なく増幅DNAを使用する断片長多形性ハイブリダイゼ
ーション、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(AS
O)プローブ(Saiki らの、1986, Nature, 324 : 16
3)、またはジテオキシ法による直接配列決定の使用を含
む。断片長多形性方法は、大きさ決定により検出可能
な、異なる長さのPCR生成物を生じるPCRプライマ
の間の挿入および削除を検出する。ASO法は、対立遺
伝子変異の検出に有用である。ASOハイブリダイゼー
ションの例において、増幅DNAが、例えば、UV照射
により“ドットブロット”の一連としてナイロンフィル
タに固定され、次いで厳密条件下でオリゴヌクレオチド
プローブとハイブリッドされる。該プローブは、例えば
西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)により標識さ
れ、適当な酸化剤を用いた処理の後、青色沈澱の存在に
より検出される。
【0009】増幅核酸の検出のための別のアッセイ方法
について更に知られている。該方法は、核酸ポリメラー
ゼの、ハイブリッド二重体由来のアニール化標識オリゴ
ヌクレオチドを切断する5′−3′ヌクレアーゼ活性を
使用し、検出のためにオリゴヌクレオチド断片を放出さ
せるものである。該方法は、PCR生成物の検出に好適
であり、プライマ対およびポリメラーゼによる伸長を阻
害するためのブロックされた3′−OH末端を有する標
識オリゴヌクレオチドプローブを必要とする。
について更に知られている。該方法は、核酸ポリメラー
ゼの、ハイブリッド二重体由来のアニール化標識オリゴ
ヌクレオチドを切断する5′−3′ヌクレアーゼ活性を
使用し、検出のためにオリゴヌクレオチド断片を放出さ
せるものである。該方法は、PCR生成物の検出に好適
であり、プライマ対およびポリメラーゼによる伸長を阻
害するためのブロックされた3′−OH末端を有する標
識オリゴヌクレオチドプローブを必要とする。
【0010】PCR法により可能な多数の応用によれ
ば、高水準DNA、正の対照テンプレートを有する試料
由来、または先行増幅物由来のDNAの少量物が、作為
的にテンプレートDNAを添加しない場合にもPCR生
成物を生じ得る。Higuchi およびKwokの1989, Nature 3
39 : 237-238ならびにKwokおよびOrrego, Innis らの1
990、PCRプロトコール:方法および応用のガイ
ド、Academic Press, Inc., San Diego, CA は、最小の
交差夾雑物をもったPCRを実施するための特定の方法
および予防策を記述している。試料の調製、処理および
分析に要する操作工程の数が増大するに従って、夾雑D
NAが試料に混入する可能性が増大するため、試料操
作、特に増幅反応完了後の操作を最小にすることが好ま
しい。
ば、高水準DNA、正の対照テンプレートを有する試料
由来、または先行増幅物由来のDNAの少量物が、作為
的にテンプレートDNAを添加しない場合にもPCR生
成物を生じ得る。Higuchi およびKwokの1989, Nature 3
39 : 237-238ならびにKwokおよびOrrego, Innis らの1
990、PCRプロトコール:方法および応用のガイ
ド、Academic Press, Inc., San Diego, CA は、最小の
交差夾雑物をもったPCRを実施するための特定の方法
および予防策を記述している。試料の調製、処理および
分析に要する操作工程の数が増大するに従って、夾雑D
NAが試料に混入する可能性が増大するため、試料操
作、特に増幅反応完了後の操作を最小にすることが好ま
しい。
【0011】標的核酸の検出を容易にするために、プロ
ーブまたは標的のいずれかの核酸の標識のために、多く
の試薬が記述されている。好ましい標識は、螢光、放射
能、色測定、X線回析または吸収、磁性または酵素活性
により検出可能な信号を与えるもので、例えば螢光物
質、色素、放射性同位体(特に32Pまたは 125I)、電
子高密度試薬、酵素、および特異的結合相手を有するリ
ガンド等を含む。
ーブまたは標的のいずれかの核酸の標識のために、多く
の試薬が記述されている。好ましい標識は、螢光、放射
能、色測定、X線回析または吸収、磁性または酵素活性
により検出可能な信号を与えるもので、例えば螢光物
質、色素、放射性同位体(特に32Pまたは 125I)、電
子高密度試薬、酵素、および特異的結合相手を有するリ
ガンド等を含む。
【0012】標識付けは、プライマまたはプローブへの
標識導入のための化学的修飾、または伸長生成物への修
飾ヌクレオシド三リン酸導入のため重合化試剤の使用
等、多くの手段で達成される。挿入試剤は、核酸の多数
の塩基に非共有的に結合し、結果として該試剤の螢光が
増大するか、あるいは異なる波長に変位する。例えば、
米国特許第4,582,789号は、ソラーレン類(p
soralens)を含む数種の挿入試剤を記述してい
る。
標識導入のための化学的修飾、または伸長生成物への修
飾ヌクレオシド三リン酸導入のため重合化試剤の使用
等、多くの手段で達成される。挿入試剤は、核酸の多数
の塩基に非共有的に結合し、結果として該試剤の螢光が
増大するか、あるいは異なる波長に変位する。例えば、
米国特許第4,582,789号は、ソラーレン類(p
soralens)を含む数種の挿入試剤を記述してい
る。
【0013】螢光染料は、核酸検出に好適である。例え
ば、エチジウムブロマイドは、二重鎖核酸に結合した場
合に、遊離の溶液状態にある場合よりも螢光の増大を示
す挿入試剤である(Sharp ら、1973, Biochemistry 12
: 3055)。エチジウムブロマイドは、その単鎖核酸に
対する親和性は比較的低いものではあるが、単鎖および
二重鎖核酸の両者の検出に使用可能である。エチジウム
ブロマイドは、ゲル電気泳動後に、核酸検出のために通
常に使用されている。例えばアガロースまたはアクリル
アミド等の適当なゲル上での大きさ分画後、該ゲルは、
エチジウムブロマイドの希釈溶液中に浸漬される。次い
で、DNAがUV光下でゲルを試験して可視化される
(Maniatisらの1982年編、Molecular Cloning : A Labo
ratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Labora
tory)。
ば、エチジウムブロマイドは、二重鎖核酸に結合した場
合に、遊離の溶液状態にある場合よりも螢光の増大を示
す挿入試剤である(Sharp ら、1973, Biochemistry 12
: 3055)。エチジウムブロマイドは、その単鎖核酸に
対する親和性は比較的低いものではあるが、単鎖および
二重鎖核酸の両者の検出に使用可能である。エチジウム
ブロマイドは、ゲル電気泳動後に、核酸検出のために通
常に使用されている。例えばアガロースまたはアクリル
アミド等の適当なゲル上での大きさ分画後、該ゲルは、
エチジウムブロマイドの希釈溶液中に浸漬される。次い
で、DNAがUV光下でゲルを試験して可視化される
(Maniatisらの1982年編、Molecular Cloning : A Labo
ratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Labora
tory)。
【0014】DNA検出のための螢光に基づく別法が記
述されている。例えばMorrisonらの1989, Anal. Bioche
m., 183 : 231-244 は、標的DNA検出のための2プロ
ーブ法を記述している。一方のプローブはフルオレセイ
ンにより標識され、第一のものに相補的な他方のプロー
ブは、フルオレセインの消去剤により標識される。該プ
ローブ類は、標的配列を含む変性DNAにアニール化さ
れ、螢光の量が測定される。螢光は、相補的消去性プロ
ーブよりむしろ非標識相補的DNAに対してフルオレセ
インプローブが結合する限り増大する。
述されている。例えばMorrisonらの1989, Anal. Bioche
m., 183 : 231-244 は、標的DNA検出のための2プロ
ーブ法を記述している。一方のプローブはフルオレセイ
ンにより標識され、第一のものに相補的な他方のプロー
ブは、フルオレセインの消去剤により標識される。該プ
ローブ類は、標的配列を含む変性DNAにアニール化さ
れ、螢光の量が測定される。螢光は、相補的消去性プロ
ーブよりむしろ非標識相補的DNAに対してフルオレセ
インプローブが結合する限り増大する。
【0015】Mabuchi らの1990, Nucl. Acids Res. 18
(24) : 7461-7162は、核酸分節のAT含有量に基づくD
NA断片の検出方法を記述している。2種類の螢光色素
が、アガロースゲル中で大きさ分画されたDNAの染色
に使用される。AT富有領域に対する異なる螢光色素の
選択的結合特性が、電気泳動されたDNA断片の識別に
使用される。
(24) : 7461-7162は、核酸分節のAT含有量に基づくD
NA断片の検出方法を記述している。2種類の螢光色素
が、アガロースゲル中で大きさ分画されたDNAの染色
に使用される。AT富有領域に対する異なる螢光色素の
選択的結合特性が、電気泳動されたDNA断片の識別に
使用される。
【0016】米国特許第4,257,774号は、DN
A定量のための螢光性挿入試剤、例えばエチジウム塩、
ダウノマイシン、メパクリンおよびアクリジンオレン
ジ、ならびに4′6−ジアミジノ−α−フェニルインド
ール等のDNAへの直接結合を記述している。螢光分極
が、DNA結合色素により完全になる非螢光性DNA結
合化合物の特徴付けに使用される。
A定量のための螢光性挿入試剤、例えばエチジウム塩、
ダウノマイシン、メパクリンおよびアクリジンオレン
ジ、ならびに4′6−ジアミジノ−α−フェニルインド
ール等のDNAへの直接結合を記述している。螢光分極
が、DNA結合色素により完全になる非螢光性DNA結
合化合物の特徴付けに使用される。
【0017】OserおよびValet の1990, Angew. Chem. I
nt. Engl. 29 (10) : 1167は、標的の隣接部位に相補的
な2種類のオリゴヌクレオチドプローブを必要とする核
酸検出スキームを記述している。該プローブ類は、螢光
輻射体、TbIII を保持するサリチレートまたはDTP
Aリガンドのいずれかにより、異なって標識される。両
プローブの標的へのハイブリダイゼーションは、Tb
III 螢光の測定可能な増大を生じる2種類の標識の立体
的近接を与える。該修飾プローブは、検出されるべき各
標的に対して特異的に調製される。
nt. Engl. 29 (10) : 1167は、標的の隣接部位に相補的
な2種類のオリゴヌクレオチドプローブを必要とする核
酸検出スキームを記述している。該プローブ類は、螢光
輻射体、TbIII を保持するサリチレートまたはDTP
Aリガンドのいずれかにより、異なって標識される。両
プローブの標的へのハイブリダイゼーションは、Tb
III 螢光の測定可能な増大を生じる2種類の標識の立体
的近接を与える。該修飾プローブは、検出されるべき各
標的に対して特異的に調製される。
【0018】EP第070,685号は、ポリヌクレオ
チドハイブリダイゼーションアッセイにおける螢光標識
ポリヌクレオチドプローブを記述している。該方法によ
ると、プローブ類は、核酸断片の3′および5′末端
に、特定の吸収−輻射残基を付加することにより調製さ
れる。該断片は、標的DNA上の隣接位置にハイブリッ
ド可能であり、両断片がハイブリッドした場合には、吸
収体と輻射体との近接が、検出可能な輻射体螢光を生じ
る。
チドハイブリダイゼーションアッセイにおける螢光標識
ポリヌクレオチドプローブを記述している。該方法によ
ると、プローブ類は、核酸断片の3′および5′末端
に、特定の吸収−輻射残基を付加することにより調製さ
れる。該断片は、標的DNA上の隣接位置にハイブリッ
ド可能であり、両断片がハイブリッドした場合には、吸
収体と輻射体との近接が、検出可能な輻射体螢光を生じ
る。
【0019】これらの方法によれば、インビトロにおけ
る核酸重合反応が完結した後に、標的DNAに螢光染料
が導入される。核酸ポリメラーゼに対する挿入試剤の阻
害効果が、多くの文献中に記述されている(例えば、Ko
rnbergの1974, DNA Synthesis, W. H. Freman and Co.,
San Francisco ; Richardson の1973, J. Mol. Biol.
78 : 703-714)。
る核酸重合反応が完結した後に、標的DNAに螢光染料
が導入される。核酸ポリメラーゼに対する挿入試剤の阻
害効果が、多くの文献中に記述されている(例えば、Ko
rnbergの1974, DNA Synthesis, W. H. Freman and Co.,
San Francisco ; Richardson の1973, J. Mol. Biol.
78 : 703-714)。
【0020】DNA結合性染料は、該試剤のテンプレー
トへの結合に帰因する核酸複写工程に対する阻害効果故
に、抗生物質として有用である。EP第169,787
号は、インフルエンザまたはヘルペスウイルスの複写阻
害のための挿入試剤の使用を記述している。Kornberg
(前出文献)は、挿入剤および非挿入剤の両者について
多くのDNA結合性試剤を記述し、また各化合物がいか
にして核酸複写を阻害するか記述している。227頁に
は、KornbergはエチジウムブロマイドがDNA複写を阻
害することが特に記述されている。
トへの結合に帰因する核酸複写工程に対する阻害効果故
に、抗生物質として有用である。EP第169,787
号は、インフルエンザまたはヘルペスウイルスの複写阻
害のための挿入試剤の使用を記述している。Kornberg
(前出文献)は、挿入剤および非挿入剤の両者について
多くのDNA結合性試剤を記述し、また各化合物がいか
にして核酸複写を阻害するか記述している。227頁に
は、KornbergはエチジウムブロマイドがDNA複写を阻
害することが特に記述されている。
【0021】
【発明が解決しようとする課題】標的核酸の同時的増幅
および検出方法は、先行する検出方法に対して優位点を
与える。このような方法は、正または負の試験結果を識
別するための一連の操作工程を含むいずれの方法におい
ても、固有の試料夾雑の問題を最小にするであろう。試
料の操作および処理工程を削減することにより、標的核
酸の同時的増幅および検出方法は、現状の診断方法の速
度および精度を増大させるであろう。本発明は、これら
の必要性に向けられ、これらを解決するものである。
および検出方法は、先行する検出方法に対して優位点を
与える。このような方法は、正または負の試験結果を識
別するための一連の操作工程を含むいずれの方法におい
ても、固有の試料夾雑の問題を最小にするであろう。試
料の操作および処理工程を削減することにより、標的核
酸の同時的増幅および検出方法は、現状の診断方法の速
度および精度を増大させるであろう。本発明は、これら
の必要性に向けられ、これらを解決するものである。
【0022】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の標的
核酸の検出方法を提供するものである。該方法は、
(a)前記試料と、DNA結合試剤であって、二重鎖核
酸に結合した場合に検出可能な信号を与え、該信号は、
該試剤が未結合の場合に該試剤により与えられる信号と
区別可能であることをもって特徴付けられるDNA結合
試剤と、増幅用試薬とを含んでなる増幅反応混合物を与
え;(b)工程(a)の混合物により生じる前記信号の
量を測定し;(c)前記混合物を前記標的核酸の増幅条
件下で処理し;(d)工程(c)の混合物により生じる
前記信号の量を測定し;および(e)増幅の生起の有無
を測定する工程を含んでなる。
核酸の検出方法を提供するものである。該方法は、
(a)前記試料と、DNA結合試剤であって、二重鎖核
酸に結合した場合に検出可能な信号を与え、該信号は、
該試剤が未結合の場合に該試剤により与えられる信号と
区別可能であることをもって特徴付けられるDNA結合
試剤と、増幅用試薬とを含んでなる増幅反応混合物を与
え;(b)工程(a)の混合物により生じる前記信号の
量を測定し;(c)前記混合物を前記標的核酸の増幅条
件下で処理し;(d)工程(c)の混合物により生じる
前記信号の量を測定し;および(e)増幅の生起の有無
を測定する工程を含んでなる。
【0023】本発明は、二重鎖核酸の正身の増大が、信
号の強度または型の変化を生じるPCR増幅方法の実施
において特に好適である。好ましい実施態様において、
DNA結合試剤は螢光性DNA結合性試剤、例えばエチ
ジウムブロマイドであり、また信号は螢光である。
号の強度または型の変化を生じるPCR増幅方法の実施
において特に好適である。好ましい実施態様において、
DNA結合試剤は螢光性DNA結合性試剤、例えばエチ
ジウムブロマイドであり、また信号は螢光である。
【0024】図1は、エチジウムブロマイドの存在下に
おいて特定標的DNAの増幅によるPCR混合物の螢光
増大を例示している。実験は、例IIに詳細に記述され
る。
おいて特定標的DNAの増幅によるPCR混合物の螢光
増大を例示している。実験は、例IIに詳細に記述され
る。
【0025】図2は、本検出方法の標的特異性を示すも
ので、本発明の定量的側面を例示している。実験の詳細
は、例IVに与えられる。
ので、本発明の定量的側面を例示している。実験の詳細
は、例IVに与えられる。
【0026】図3は、本発明の遺伝子スクリーニングへ
の使用を示している。実験は、例Vに詳細に記述され
る。
の使用を示している。実験は、例Vに詳細に記述され
る。
【0027】図4Aおよび4Bは、例VII に記述される
定量的均質的アッセイに関する。図4Aは、正の試料中
の螢光増大が、負の試料の平均からの標準偏差の2倍よ
り大きいことを示している。図4Bは、螢光測定のため
の背景控除方法をグラフ的に表わしている。
定量的均質的アッセイに関する。図4Aは、正の試料中
の螢光増大が、負の試料の平均からの標準偏差の2倍よ
り大きいことを示している。図4Bは、螢光測定のため
の背景控除方法をグラフ的に表わしている。
【0028】図5および6は、例VIIIに例示される本発
明によるオンライン、自動化均質的増幅および検出系の
結果を示す。図5は、標的DNAを含まず、負の対照と
なるPCRからの螢光のプリントアウトを示す。図6
は、適切な標的を含むPCRからの螢光のプリントアウ
トであり、PCRの連続的監視およびPCR生成物の同
時的増大を示している。
明によるオンライン、自動化均質的増幅および検出系の
結果を示す。図5は、標的DNAを含まず、負の対照と
なるPCRからの螢光のプリントアウトを示す。図6
は、適切な標的を含むPCRからの螢光のプリントアウ
トであり、PCRの連続的監視およびPCR生成物の同
時的増大を示している。
【0029】本発明は、核酸検出の改良方法を提供する
もので、増幅工程と共に使用するために特に適してい
る。該改良方法は、オリゴヌクレオチドプローブおよび
標識増幅プライマのいずれをも必要としない。該方法
は、増幅反応進行中において生成物蓄積の監視を可能と
する。本発明は、また標的特異的定量をも許容する。こ
れらの方法は、自動化様式において使用するために適し
ている。
もので、増幅工程と共に使用するために特に適してい
る。該改良方法は、オリゴヌクレオチドプローブおよび
標識増幅プライマのいずれをも必要としない。該方法
は、増幅反応進行中において生成物蓄積の監視を可能と
する。本発明は、また標的特異的定量をも許容する。こ
れらの方法は、自動化様式において使用するために適し
ている。
【0030】開示される方法は、増幅核酸検出のための
従来方法に対し、大きい改良を提供する。本発明によれ
ば、増幅された核酸が、一旦、増幅反応が開始された後
は反応容器を開くことなく検出され、また反応に引続く
付加的な処理または操作工程も要さない。本発明以前に
あっては、核酸検出方法は、プローブとして第3のオリ
ゴヌクレオチド試薬を必要とし、あるいは増幅後に行な
われる工程である生成物の固体担体への捕捉等の煩雑で
時間を要する標的検出の一連の工程を要していた。ある
方法においては、捕捉およびプローブのハイブリダイゼ
ーション工程の両者が必要とされる。本発明は、ハイブ
リッドプローブ試薬の使用の必要性、あるいは増幅標的
検出のための捕捉処理の必要性を除去する。臨床的設定
において、本発明の方法は、迅速性、簡便性、および試
料間、特に増幅および非増幅試料の間の交差夾雑の可能
性減少を提供する。更に、本方法は増幅工程中、および
増幅反応完了後の増幅生成物の自動的検出、監視および
定量手段を提供する。
従来方法に対し、大きい改良を提供する。本発明によれ
ば、増幅された核酸が、一旦、増幅反応が開始された後
は反応容器を開くことなく検出され、また反応に引続く
付加的な処理または操作工程も要さない。本発明以前に
あっては、核酸検出方法は、プローブとして第3のオリ
ゴヌクレオチド試薬を必要とし、あるいは増幅後に行な
われる工程である生成物の固体担体への捕捉等の煩雑で
時間を要する標的検出の一連の工程を要していた。ある
方法においては、捕捉およびプローブのハイブリダイゼ
ーション工程の両者が必要とされる。本発明は、ハイブ
リッドプローブ試薬の使用の必要性、あるいは増幅標的
検出のための捕捉処理の必要性を除去する。臨床的設定
において、本発明の方法は、迅速性、簡便性、および試
料間、特に増幅および非増幅試料の間の交差夾雑の可能
性減少を提供する。更に、本方法は増幅工程中、および
増幅反応完了後の増幅生成物の自動的検出、監視および
定量手段を提供する。
【0031】本発明方法は、二重鎖DNAに結合可能で
ある検出可能な試剤を必要とする。該検出可能な結合試
剤は、螢光染料または他の着色料、酵素、あるいは二重
鎖DNAに結合した場合に直接または間接的に信号を生
成可能な試剤であってよい。該試剤は、単鎖DNAまた
はRNAに結合することによっても特徴付けられる。該
試剤は、二重鎖核酸に結合した場合に、同試剤が溶液
中、または単鎖核酸と結合した場合に生成される信号と
は区別される検出可能な信号を生成可能であることのみ
が必要である。
ある検出可能な試剤を必要とする。該検出可能な結合試
剤は、螢光染料または他の着色料、酵素、あるいは二重
鎖DNAに結合した場合に直接または間接的に信号を生
成可能な試剤であってよい。該試剤は、単鎖DNAまた
はRNAに結合することによっても特徴付けられる。該
試剤は、二重鎖核酸に結合した場合に、同試剤が溶液
中、または単鎖核酸と結合した場合に生成される信号と
は区別される検出可能な信号を生成可能であることのみ
が必要である。
【0032】一実施態様において、DNA結合試剤は、
挿入試剤である。ここにおいて使用されるように、挿入
試剤は、核酸二重ヘリックス中の多数の塩基間に非共有
的に挿入可能な試剤または残基である。エチジウムブロ
マイド等の挿入試剤は、二重鎖DNA中に挿入された場
合に、単鎖DNAまたはRNAと結合した場合または溶
液中にある場合に比較してより高強度で螢光を生じる。
他の挿入試剤は、二重鎖DNAに結合した場合に螢光ス
ペクトルに変化を示す。例えば、アクチノマイシンD
は、単鎖核酸に結合した場合に赤色、また二重鎖テンプ
レートに結合した場合に緑色の螢光を生じる。アクチノ
マイシンDの場合と同様に、検出可能な信号が増大、減
少あるいは変位のいずれを生じるにしても、該試剤が二
重鎖核酸に結合または未結合の場合に区別可能である検
出可能な信号を与える任意の挿入試剤が、開示される発
明の実施に適している。例えば、DNAと他の光反応性
ソラーレン、4−アミノメチル−4−5′8−トリメチ
ルソラーレン(AMT)との間の相互作用が記述されて
いる(Johnsonらの、1981, Photochem. & Photobiol.,33
: 785-791)。この文献によれば、AMTのDNAヘリ
ックスの挿入によって長波長における吸収および螢光の
両者ともに減少する。
挿入試剤である。ここにおいて使用されるように、挿入
試剤は、核酸二重ヘリックス中の多数の塩基間に非共有
的に挿入可能な試剤または残基である。エチジウムブロ
マイド等の挿入試剤は、二重鎖DNA中に挿入された場
合に、単鎖DNAまたはRNAと結合した場合または溶
液中にある場合に比較してより高強度で螢光を生じる。
他の挿入試剤は、二重鎖DNAに結合した場合に螢光ス
ペクトルに変化を示す。例えば、アクチノマイシンD
は、単鎖核酸に結合した場合に赤色、また二重鎖テンプ
レートに結合した場合に緑色の螢光を生じる。アクチノ
マイシンDの場合と同様に、検出可能な信号が増大、減
少あるいは変位のいずれを生じるにしても、該試剤が二
重鎖核酸に結合または未結合の場合に区別可能である検
出可能な信号を与える任意の挿入試剤が、開示される発
明の実施に適している。例えば、DNAと他の光反応性
ソラーレン、4−アミノメチル−4−5′8−トリメチ
ルソラーレン(AMT)との間の相互作用が記述されて
いる(Johnsonらの、1981, Photochem. & Photobiol.,33
: 785-791)。この文献によれば、AMTのDNAヘリ
ックスの挿入によって長波長における吸収および螢光の
両者ともに減少する。
【0033】非−挿入的DNA結合試剤も適している。
例えば、Hoechst 33258 (Searle &Embrey, 1990, Nuc.
Acids Res. 18 (13) : 3753-3762)は、標的量の増大と
共に螢光変化を示す。Hoechst 33258は、
通常、グループ結合剤と称されるDNA−結合性化合物
の分類の一員である。この群は、ジスタマイシン、ネト
ロプシンおよびその他の薬剤を含む。これらの化合物
は、二重DNAの小溝を認識して結合する。
例えば、Hoechst 33258 (Searle &Embrey, 1990, Nuc.
Acids Res. 18 (13) : 3753-3762)は、標的量の増大と
共に螢光変化を示す。Hoechst 33258は、
通常、グループ結合剤と称されるDNA−結合性化合物
の分類の一員である。この群は、ジスタマイシン、ネト
ロプシンおよびその他の薬剤を含む。これらの化合物
は、二重DNAの小溝を認識して結合する。
【0034】本発明によると、DNA結合試剤は、直接
または間接的に検出可能な信号を生成する。該信号は、
螢光または吸収等により直接に検出可能であるか、ある
いは該DNA結合試剤に付加される置換標識残基または
結合性リガンドを介して間接的に検出可能である。間接
的検出のために、二重鎖DNAへの近接によって検出可
能な影響を受けるいずれの残基またはリガンドも適して
いる。
または間接的に検出可能な信号を生成する。該信号は、
螢光または吸収等により直接に検出可能であるか、ある
いは該DNA結合試剤に付加される置換標識残基または
結合性リガンドを介して間接的に検出可能である。間接
的検出のために、二重鎖DNAへの近接によって検出可
能な影響を受けるいずれの残基またはリガンドも適して
いる。
【0035】本発明によれば、検出可能な結合試剤は、
増幅工程の間、増幅反応物中に存在する。増幅が進行す
るに従って、該試剤は検出可能な信号を生成する。試剤
および信号のいずれも、増幅の進行を妨げない。従っ
て、該試剤は、増幅に先立って、または反応進行中に反
応混合物に添加され得る。例えば、該試剤は、塩類およ
び緩衝剤等の適当な試薬類を含む増幅用緩衝剤中に含ま
れる。このような方法において、該結合試剤を増幅反応
物中に、別個に添加する必要はない。本発明の実施のた
めに、該試剤の存在下、二重鎖核酸の量の正身の増大
が、直接または間接的に検出可能な信号強度の変化に反
映される限り、任意のDNA結合試剤も適している。好
ましい実施態様において、検出可能な信号は、螢光であ
る。
増幅工程の間、増幅反応物中に存在する。増幅が進行す
るに従って、該試剤は検出可能な信号を生成する。試剤
および信号のいずれも、増幅の進行を妨げない。従っ
て、該試剤は、増幅に先立って、または反応進行中に反
応混合物に添加され得る。例えば、該試剤は、塩類およ
び緩衝剤等の適当な試薬類を含む増幅用緩衝剤中に含ま
れる。このような方法において、該結合試剤を増幅反応
物中に、別個に添加する必要はない。本発明の実施のた
めに、該試剤の存在下、二重鎖核酸の量の正身の増大
が、直接または間接的に検出可能な信号強度の変化に反
映される限り、任意のDNA結合試剤も適している。好
ましい実施態様において、検出可能な信号は、螢光であ
る。
【0036】本願明細書において、クレームされる発明
の記述のために“均質的検出アッセイ”なる用語が使用
される。理解を容易にするために、以下の定義が与えら
れる。均質的検出アッセイは、組合わされた増幅および
検出方法を指し、ここにおいて該増幅方法は検出可能な
信号を生成し、かつ増幅生成物検出のための引続く試料
処理および操作の必要性を最小にするか、または除去す
る。
の記述のために“均質的検出アッセイ”なる用語が使用
される。理解を容易にするために、以下の定義が与えら
れる。均質的検出アッセイは、組合わされた増幅および
検出方法を指し、ここにおいて該増幅方法は検出可能な
信号を生成し、かつ増幅生成物検出のための引続く試料
処理および操作の必要性を最小にするか、または除去す
る。
【0037】本均質的アッセイは、オリゴヌクレオチド
プローブとの組合せにおいて使用するために適してい
る。例えば、一実施態様において特定標的配列の検出に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブの使用が、本発明
のDNA結合試剤に加えて増幅反応中に含まれる。消去
物質および螢光物質により標識されたプローブは、増幅
された標的核酸にハイブリッドする。5′から3′へ核
酸分解的活性を生じ得る重合試剤の存在下において、螢
光物質と消去物質とは標的に結合した場合にポリメラー
ゼによるプローブの分解によって分離される。非結合プ
ローブの螢光は、結合し、次いで加水分解されたプロー
ブの螢光とは検出可能に区別される。従って、DNA結
合試剤の螢光は、増幅の生起を検出可能であり、ハイブ
リッドプローブの螢光は、標的特異的増幅を示してい
る。一旦増幅開始後に、反応容器を開くことなく、ある
いは更に処理工程を要さずに増幅の検出可能である限
り、該方法は均質的アッセイの現定義の範囲内にある。
プローブとの組合せにおいて使用するために適してい
る。例えば、一実施態様において特定標的配列の検出に
特異的なオリゴヌクレオチドプローブの使用が、本発明
のDNA結合試剤に加えて増幅反応中に含まれる。消去
物質および螢光物質により標識されたプローブは、増幅
された標的核酸にハイブリッドする。5′から3′へ核
酸分解的活性を生じ得る重合試剤の存在下において、螢
光物質と消去物質とは標的に結合した場合にポリメラー
ゼによるプローブの分解によって分離される。非結合プ
ローブの螢光は、結合し、次いで加水分解されたプロー
ブの螢光とは検出可能に区別される。従って、DNA結
合試剤の螢光は、増幅の生起を検出可能であり、ハイブ
リッドプローブの螢光は、標的特異的増幅を示してい
る。一旦増幅開始後に、反応容器を開くことなく、ある
いは更に処理工程を要さずに増幅の検出可能である限
り、該方法は均質的アッセイの現定義の範囲内にある。
【0038】“増幅反応系”なる用語は、核酸標的配列
の複写物を増大させるための任意のインビトロにおける
手段を指す。かかる方法は、PCRに限定されることな
く、DNAリガーゼ連鎖反応(LCR),Q RNAレ
プリカーゼおよびRNA転写に基づく増幅系(TASお
よび3SR)を含む。
の複写物を増大させるための任意のインビトロにおける
手段を指す。かかる方法は、PCRに限定されることな
く、DNAリガーゼ連鎖反応(LCR),Q RNAレ
プリカーゼおよびRNA転写に基づく増幅系(TASお
よび3SR)を含む。
【0039】典型的には標的核酸の指数的増大を指す
“増大”なる用語は、ここにおいては核酸の選択標的配
列の数の線形的および指数的増大の両者を記述してい
る。
“増大”なる用語は、ここにおいては核酸の選択標的配
列の数の線形的および指数的増大の両者を記述してい
る。
【0040】“増幅反応混合物”なる用語は、標的核酸
を増幅するために使用される種々の試薬類を含む水溶液
を示す。これらは、酵素、水性緩衝剤、塩類、増幅プラ
イマ、標的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。
情況に依存して該混合物は、完全または不完全増幅反応
混合物のいずれかであってよい。
を増幅するために使用される種々の試薬類を含む水溶液
を示す。これらは、酵素、水性緩衝剤、塩類、増幅プラ
イマ、標的核酸、およびヌクレオシド三リン酸を含む。
情況に依存して該混合物は、完全または不完全増幅反応
混合物のいずれかであってよい。
【0041】以下に記述される系は、関連技術の熟練者
によって定型的に実施される。それらは、他者によって
詳細に記述されており、以下のように要約される。他の
系が開発されているように、これらの系はこの発明の実
施において有益であろう。増幅系の最近の概説は、Bio/
Technology 8 : 290-293, 1990年4月に発行されてい
る。本発明の範囲の理解を与えるために、以下の4種の
系が記述される。
によって定型的に実施される。それらは、他者によって
詳細に記述されており、以下のように要約される。他の
系が開発されているように、これらの系はこの発明の実
施において有益であろう。増幅系の最近の概説は、Bio/
Technology 8 : 290-293, 1990年4月に発行されてい
る。本発明の範囲の理解を与えるために、以下の4種の
系が記述される。
【0042】PCRによるDNAの増幅は、米国特許第
4,683,195号および第4,683,202号に
開示されている。熱安定性酵素を使用するPCRによる
核酸の増幅および検出は、米国特許第4,965,18
8号に開示されている。
4,683,195号および第4,683,202号に
開示されている。熱安定性酵素を使用するPCRによる
核酸の増幅および検出は、米国特許第4,965,18
8号に開示されている。
【0043】DNAのPCR増幅は、DNAの熱変性、
増幅されるべきDNA分節の両側部にあたる断片に対す
る2種類のオリゴヌクレオチドプライマのアニーリン
グ、およびアニール化プライマのDNAポリメラーゼに
よる伸長の反復サイクルを含む。該プライマ類は、標的
配列の反対の鎖にハイブリッドし、ポリメラーゼによる
DNA合成が、プライマ間の領域にわたって進行し、D
NA分節の量が効果的に倍増するように配向する。更に
は、伸長生成物が、プライマと相補的であって結合可能
であることから、継続する各サイクルは、前のサイクル
で合成されるDNAの量を、基本的には倍増する。この
ことは、特定標的断片を、nをサイクル数としてサイク
ルあたり約2nの割合で指数的に蓄積する。
増幅されるべきDNA分節の両側部にあたる断片に対す
る2種類のオリゴヌクレオチドプライマのアニーリン
グ、およびアニール化プライマのDNAポリメラーゼに
よる伸長の反復サイクルを含む。該プライマ類は、標的
配列の反対の鎖にハイブリッドし、ポリメラーゼによる
DNA合成が、プライマ間の領域にわたって進行し、D
NA分節の量が効果的に倍増するように配向する。更に
は、伸長生成物が、プライマと相補的であって結合可能
であることから、継続する各サイクルは、前のサイクル
で合成されるDNAの量を、基本的には倍増する。この
ことは、特定標的断片を、nをサイクル数としてサイク
ルあたり約2nの割合で指数的に蓄積する。
【0044】開示される実施態様において、発明に本質
的ではないが、Taq DNAポリメラーゼが好まし
い。熱安定性ポリメラーゼであるTaqポリメラーゼ
は、高温において活性である。Taqの調製方法は、米
国特許第4,889,818号に開示されている。しか
しながら、他のThermus種または非Thermu
s種(例えばThermus thermopilus またはThermotoga m
aritima)から単離される熱安定性DNAポリメラーゼ
も、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラ
ーゼ、E.coli DNAポリメラーゼI、または
E.coliのクレナウ断片等の非−熱安定性DNAポ
リメラーゼに加えてPCRにおいて使用され得る。
的ではないが、Taq DNAポリメラーゼが好まし
い。熱安定性ポリメラーゼであるTaqポリメラーゼ
は、高温において活性である。Taqの調製方法は、米
国特許第4,889,818号に開示されている。しか
しながら、他のThermus種または非Thermu
s種(例えばThermus thermopilus またはThermotoga m
aritima)から単離される熱安定性DNAポリメラーゼ
も、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラ
ーゼ、E.coli DNAポリメラーゼI、または
E.coliのクレナウ断片等の非−熱安定性DNAポ
リメラーゼに加えてPCRにおいて使用され得る。
【0045】ここに使用されるように、“プライマ”な
る用語は、プライマ伸長生成物の合成が開始される条
件、すなわち4種のヌクレオチド三リン酸およびDNA
ポリメラーゼが適切な緩衝溶液(“緩衝溶液”は、pH、
イオン強度、補助因子等を含む)中に存在し、かつ適当
な温度において、核酸テンプレートにアニールした場合
にDNA合成が開始される点として作用することができ
るオリゴヌクレオチドを指す。
る用語は、プライマ伸長生成物の合成が開始される条
件、すなわち4種のヌクレオチド三リン酸およびDNA
ポリメラーゼが適切な緩衝溶液(“緩衝溶液”は、pH、
イオン強度、補助因子等を含む)中に存在し、かつ適当
な温度において、核酸テンプレートにアニールした場合
にDNA合成が開始される点として作用することができ
るオリゴヌクレオチドを指す。
【0046】伸長工程に使用されるヌクレオシド−5′
−三リン酸、典型的にはdATP,dCTP,dGTP
およびdTTPは、伸長反応の間において典型的には4
00μM〜4.0mMの範囲の全濃度をもって存在し、好
ましくは500μM〜1.5mMの間の濃度で存在する。
−三リン酸、典型的にはdATP,dCTP,dGTP
およびdTTPは、伸長反応の間において典型的には4
00μM〜4.0mMの範囲の全濃度をもって存在し、好
ましくは500μM〜1.5mMの間の濃度で存在する。
【0047】PCRにおいて使用するプライマ類の選択
は、増幅反応の特異性を決定する。本発明において使用
されるプライマは、オリゴヌクレオチドであって、通常
はポリメラーゼ連鎖反応によってテンプレート特異的な
様式で伸長され得る、数個のヌクレオチド長のデオキシ
リボヌクレオチドである。該プライマは、重合用試剤の
存在下、伸長生成物の合成を開示させるに充分な長さで
あって、典型的には10−30個のヌクレオチドを含む
が、正確な個数は該方法の成功裏の応用に臨界的なもの
ではない。短いプライマ分子は、一般的にはテンプレー
トとの安定なハイブリッド複合体を形成するために、よ
り低温度を必要とする。
は、増幅反応の特異性を決定する。本発明において使用
されるプライマは、オリゴヌクレオチドであって、通常
はポリメラーゼ連鎖反応によってテンプレート特異的な
様式で伸長され得る、数個のヌクレオチド長のデオキシ
リボヌクレオチドである。該プライマは、重合用試剤の
存在下、伸長生成物の合成を開示させるに充分な長さで
あって、典型的には10−30個のヌクレオチドを含む
が、正確な個数は該方法の成功裏の応用に臨界的なもの
ではない。短いプライマ分子は、一般的にはテンプレー
トとの安定なハイブリッド複合体を形成するために、よ
り低温度を必要とする。
【0048】合成オリゴヌクレオチドは、Matteucci ら
の1981, J. Am. Chem, Soc. 103 :3185-3191 のトリエ
ステル法を使用して調製され得る。別法として、例えば
Biosearch 8700 DNA合成装置上でシアノエチルホス
ホルアミダイト化学を用いる自動化合成が好ましいであ
ろう。
の1981, J. Am. Chem, Soc. 103 :3185-3191 のトリエ
ステル法を使用して調製され得る。別法として、例えば
Biosearch 8700 DNA合成装置上でシアノエチルホス
ホルアミダイト化学を用いる自動化合成が好ましいであ
ろう。
【0049】プライマ伸長を生起させるために、このプ
ライマは核酸テンプレートにアニールされなければなら
ない。伸長を起させるために、すべてのプライマのヌク
レオチドがテンプレートにアニールする必要はない。該
プライマ配列は、テンプレートの正確な配列を反映する
必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプラ
イマの5′末端に結合させ、プライマ配列の残る部分が
テンプレートに相補的であってもよい。別法として、非
相補的塩基を、該プライマがテンプレートに対してアニ
ールするに充分な相補性を有し、相補的DNA鎖の合成
を許容する限りにおいて該プライマ中に散在させること
ができる。
ライマは核酸テンプレートにアニールされなければなら
ない。伸長を起させるために、すべてのプライマのヌク
レオチドがテンプレートにアニールする必要はない。該
プライマ配列は、テンプレートの正確な配列を反映する
必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプラ
イマの5′末端に結合させ、プライマ配列の残る部分が
テンプレートに相補的であってもよい。別法として、非
相補的塩基を、該プライマがテンプレートに対してアニ
ールするに充分な相補性を有し、相補的DNA鎖の合成
を許容する限りにおいて該プライマ中に散在させること
ができる。
【0050】PCR等の増幅系は、標的増幅に使用され
る酵素と両立し得る緩衝溶液中の標的核酸を必要とす
る。標的核酸は、組織、体液、便、痰、唾液、植物細
胞、細菌培養物等を含む種々の生物学的材料から単離さ
れ得る。
る酵素と両立し得る緩衝溶液中の標的核酸を必要とす
る。標的核酸は、組織、体液、便、痰、唾液、植物細
胞、細菌培養物等を含む種々の生物学的材料から単離さ
れ得る。
【0051】一般的に試料中の核酸は、DNA配列であ
り、最も普通にはゲノムDNAである。しかしながら、
本発明はメッセンジャRNA、リボソームRNA、ウイ
ルスRNAまたはクローンDNA等の他の核酸を用いて
実施することもできる。好適な核酸試料は、本発明にお
いて使用するために単鎖または二重鎖DNAもしくはR
NAを含む。当業者は、該核酸の性質がどうであろう
と、使用される方法について適切かつ良く認識された修
飾を行なうのみで該核酸が増幅されることを認識するで
あろう。
り、最も普通にはゲノムDNAである。しかしながら、
本発明はメッセンジャRNA、リボソームRNA、ウイ
ルスRNAまたはクローンDNA等の他の核酸を用いて
実施することもできる。好適な核酸試料は、本発明にお
いて使用するために単鎖または二重鎖DNAもしくはR
NAを含む。当業者は、該核酸の性質がどうであろう
と、使用される方法について適切かつ良く認識された修
飾を行なうのみで該核酸が増幅されることを認識するで
あろう。
【0052】試料中の標的核酸配列を増幅するために
は、該配列は、増幅系の成分が接近可能でなければなら
ない。一般的には、粗製の生物学的試料から核酸を単離
することによって、接近可能性が確実となる。この分野
においては、生物学的試料からの核酸の抽出技術とし
て、例えば、Maniatisらの、Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harb
or Laboratory, 1982 : Arrand のPreparation of Nucl
eic Acid Probes, 18-30 頁、Nucleic Acid Hybridizat
ion : A Practical Approach, HamesおよびHiggins
編、IRL Press, 1985; またはPCR Protoco
ls,18−20章、Innisら編、Academi
c Press,1990等に記述されている多くの技
術が知られている。
は、該配列は、増幅系の成分が接近可能でなければなら
ない。一般的には、粗製の生物学的試料から核酸を単離
することによって、接近可能性が確実となる。この分野
においては、生物学的試料からの核酸の抽出技術とし
て、例えば、Maniatisらの、Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harb
or Laboratory, 1982 : Arrand のPreparation of Nucl
eic Acid Probes, 18-30 頁、Nucleic Acid Hybridizat
ion : A Practical Approach, HamesおよびHiggins
編、IRL Press, 1985; またはPCR Protoco
ls,18−20章、Innisら編、Academi
c Press,1990等に記述されている多くの技
術が知られている。
【0053】PCR工程は、熱安定性酵素を用いた自動
化工程として、最も普通に実施されている。この工程に
おいて、該反応混合物は、変性温度範囲、プライマアニ
ール温度範囲、および伸長温度範囲を通り循環される。
熱安定性酵素を用いて特定的に適用される装置は、EP
第236,069号により完全に開示されており、商業
的に入手可能である。
化工程として、最も普通に実施されている。この工程に
おいて、該反応混合物は、変性温度範囲、プライマアニ
ール温度範囲、および伸長温度範囲を通り循環される。
熱安定性酵素を用いて特定的に適用される装置は、EP
第236,069号により完全に開示されており、商業
的に入手可能である。
【0054】LCRは、PCT特許公開WO 89/0
9835に記述されている。該方法は、標的核酸にアニ
ールするオリゴヌクレオチド分節を連結するリガーゼの
使用を含む。LCRは、元の標的分子の増幅を生じ、数
百万の生成物DNA複写物を与え得る。従って、LCR
は二重鎖DNAの正身の増大を生じる。本検出方法は、
PCRに加えてLCRにも適用できる。LCRは、生成
物DNA検出用オリゴヌクレオチドプローブを必要とす
る。増幅生成物検出用の開示された方法との関連におい
て使用される場合、プローブ工程が不要となり、LCR
の結果が直ちに検出され得る。
9835に記述されている。該方法は、標的核酸にアニ
ールするオリゴヌクレオチド分節を連結するリガーゼの
使用を含む。LCRは、元の標的分子の増幅を生じ、数
百万の生成物DNA複写物を与え得る。従って、LCR
は二重鎖DNAの正身の増大を生じる。本検出方法は、
PCRに加えてLCRにも適用できる。LCRは、生成
物DNA検出用オリゴヌクレオチドプローブを必要とす
る。増幅生成物検出用の開示された方法との関連におい
て使用される場合、プローブ工程が不要となり、LCR
の結果が直ちに検出され得る。
【0055】他の増幅スキームは、RNAバクテリオフ
ァージQβ由来のレプリカーゼを有効に使用する。この
増幅スキームにおいて、標的配列に特異的な配列を有す
る修飾組換えバクテリオファージゲノムが、試験される
核酸と最初にハイブリッドされる。バクテリオファージ
プローブと試料中の核酸との間に形成される二重体の富
有化に続いて、Qβレプリカーゼが添加され、保持され
た組換えゲノムを認識しつつ多数の複写物の作成を開示
する。
ァージQβ由来のレプリカーゼを有効に使用する。この
増幅スキームにおいて、標的配列に特異的な配列を有す
る修飾組換えバクテリオファージゲノムが、試験される
核酸と最初にハイブリッドされる。バクテリオファージ
プローブと試料中の核酸との間に形成される二重体の富
有化に続いて、Qβレプリカーゼが添加され、保持され
た組換えゲノムを認識しつつ多数の複写物の作成を開示
する。
【0056】該Qβ系は、プライマ配列を必要とせず、
またPCRおよびLCR増幅系のような熱変性工程がな
い。該反応は、一温度、典型的には37℃にて起こる。
好ましいテンプレートは、Qβレプリカーゼの基質であ
る中間変異−1(midvariant−1)RNAで
ある。この系の使用により、該テンプレートの極めて多
量の増大が達成される。この増幅系の概説は、国際特許
出願公開WO 87/06270およびLizardi らの、
1988, Bio/Technology 6 : 1197-1202に見出される。
またPCRおよびLCR増幅系のような熱変性工程がな
い。該反応は、一温度、典型的には37℃にて起こる。
好ましいテンプレートは、Qβレプリカーゼの基質であ
る中間変異−1(midvariant−1)RNAで
ある。この系の使用により、該テンプレートの極めて多
量の増大が達成される。この増幅系の概説は、国際特許
出願公開WO 87/06270およびLizardi らの、
1988, Bio/Technology 6 : 1197-1202に見出される。
【0057】3SR系は、インビトロ転写に基づく増幅
系の変法である。転写に基づく増幅系(TAS)は、標
的鎖のDNA複写物を生成するためのプロモータをコー
ドするプライマの使用、およびRNAポリメラーゼによ
るDNA複写物からのRNA複写物の生成を含む。例え
ば、米国特許第4,683,202号の例9BおよびE
P第310,229号参照。該3SR系は、標的核酸の
等温転写を実施するために3種類の酵素を使用する系で
ある。
系の変法である。転写に基づく増幅系(TAS)は、標
的鎖のDNA複写物を生成するためのプロモータをコー
ドするプライマの使用、およびRNAポリメラーゼによ
るDNA複写物からのRNA複写物の生成を含む。例え
ば、米国特許第4,683,202号の例9BおよびE
P第310,229号参照。該3SR系は、標的核酸の
等温転写を実施するために3種類の酵素を使用する系で
ある。
【0058】該系は、T7 RNA DNAプライマが
結合する単鎖RNAの標的により開始される。逆転写酵
素によるプライマの伸長によって、cDNAが形成さ
れ、またRNAseH処理が、異種二重体からcDNA
を遊離させる。第2のプライマが該cDNAに結合し、
DNAポリメラーゼ(すなわち逆転写酵素)処理により
二重鎖cDNAが形成される。一方または両方のプライ
マは、プロモータ、すなわちT7 RNAポリメラーゼ
に対するプロモータをコードし、しかして該二重鎖cD
NAはT7 RNAポリメラーゼに対する転写テンプレ
ートである。
結合する単鎖RNAの標的により開始される。逆転写酵
素によるプライマの伸長によって、cDNAが形成さ
れ、またRNAseH処理が、異種二重体からcDNA
を遊離させる。第2のプライマが該cDNAに結合し、
DNAポリメラーゼ(すなわち逆転写酵素)処理により
二重鎖cDNAが形成される。一方または両方のプライ
マは、プロモータ、すなわちT7 RNAポリメラーゼ
に対するプロモータをコードし、しかして該二重鎖cD
NAはT7 RNAポリメラーゼに対する転写テンプレ
ートである。
【0059】転写能力のあるcDNAは、元の標的のア
ンチセンスRNA複写物を産する。次いで、該転写物
は、二重鎖プロモータを含み、場合により両端において
逆転反復配向である二重鎖cDNAに、逆転写酵素によ
り変換される。これらのDNAは、再度サイクル中に介
入するRNAを生じ得る。3SR系のより完全な記述
は、Guatelliらの1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
7 : 1874-1878 、およびEP第329,822号に見出
される。TAS系は、Innis ら編、1990 PCR Protocol
s, Academic Press, San Diego 中にGingerasらにより
記述されている。
ンチセンスRNA複写物を産する。次いで、該転写物
は、二重鎖プロモータを含み、場合により両端において
逆転反復配向である二重鎖cDNAに、逆転写酵素によ
り変換される。これらのDNAは、再度サイクル中に介
入するRNAを生じ得る。3SR系のより完全な記述
は、Guatelliらの1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
7 : 1874-1878 、およびEP第329,822号に見出
される。TAS系は、Innis ら編、1990 PCR Protocol
s, Academic Press, San Diego 中にGingerasらにより
記述されている。
【0060】ここに例示される本発明の実施態様は、P
CRに関連して増幅核酸検出のための方法を開示するも
のである。従って、PCRに基づく方法において使用す
る場合には、該DNA結合試剤は、プライマのアニーリ
ング、相補テンプレートに沿ったプライマ伸長、または
DNA二重体の鎖分離を阻害しないであろう試剤として
特徴付けられる。
CRに関連して増幅核酸検出のための方法を開示するも
のである。従って、PCRに基づく方法において使用す
る場合には、該DNA結合試剤は、プライマのアニーリ
ング、相補テンプレートに沿ったプライマ伸長、または
DNA二重体の鎖分離を阻害しないであろう試剤として
特徴付けられる。
【0061】ここにおいて記述される方法では、試料
は、興味ある特定のオリゴヌクレオチド配列である標的
核酸を含むか、または含むと考えられるものとして与え
られる。該標的は、RNAまたはDNAまたはRNA/
DNAハイブリッドであってよい。該標的は、単鎖また
は二重鎖であってよい。標的調製は、遂行される特定の
増幅方法に対して適切な方法で実施されるであろう。例
えば、標的核酸が単鎖DNAであるPCR法において
は、mRNA等の標的は、増幅に先立って、まずcDN
Aに逆転写される。
は、興味ある特定のオリゴヌクレオチド配列である標的
核酸を含むか、または含むと考えられるものとして与え
られる。該標的は、RNAまたはDNAまたはRNA/
DNAハイブリッドであってよい。該標的は、単鎖また
は二重鎖であってよい。標的調製は、遂行される特定の
増幅方法に対して適切な方法で実施されるであろう。例
えば、標的核酸が単鎖DNAであるPCR法において
は、mRNA等の標的は、増幅に先立って、まずcDN
Aに逆転写される。
【0062】RNAをcDNAに逆転写する方法は、周
知であってManiatisらの前出文献に記述されて
いる。別法として、好ましい逆転写方法は、熱活性DN
Aポリメラーゼを使用する。本明細書は、挿入試剤がD
NAポリメラーゼ活性を阻害しないことを教示してい
る。従って、本方法は、DNA標的に加えてRNA標的
に対して均質的検出アッセイを提供する。
知であってManiatisらの前出文献に記述されて
いる。別法として、好ましい逆転写方法は、熱活性DN
Aポリメラーゼを使用する。本明細書は、挿入試剤がD
NAポリメラーゼ活性を阻害しないことを教示してい
る。従って、本方法は、DNA標的に加えてRNA標的
に対して均質的検出アッセイを提供する。
【0063】本発明の他の実施態様において、一群のプ
ライマが使用される(Mullisらの、1986, Cold Spring
Harbor Symposium on Quantitative Bialogy 51 : 26
3)。この方法は、例えば記録的なパラフィン床試料が使
用される場合等、試料中の核酸量が極めて限定されてい
る場合に好ましい。一群のプライマを使用する場合、核
酸は、最初に外部側のプライマの組を用いて増幅され
る。この増幅反応は、内部側のプライマの組を使用する
第2巡目の増幅サイクルに続く。例VIおよびVII は、引
き続く増幅サイクルにおいて一群のプライマを使用する
ことにより必要とされる追加の試料処理を要することな
く優れた結果を与える、一群のプライマの修飾方法を記
述する。
ライマが使用される(Mullisらの、1986, Cold Spring
Harbor Symposium on Quantitative Bialogy 51 : 26
3)。この方法は、例えば記録的なパラフィン床試料が使
用される場合等、試料中の核酸量が極めて限定されてい
る場合に好ましい。一群のプライマを使用する場合、核
酸は、最初に外部側のプライマの組を用いて増幅され
る。この増幅反応は、内部側のプライマの組を使用する
第2巡目の増幅サイクルに続く。例VIおよびVII は、引
き続く増幅サイクルにおいて一群のプライマを使用する
ことにより必要とされる追加の試料処理を要することな
く優れた結果を与える、一群のプライマの修飾方法を記
述する。
【0064】本発明によれば、増幅生成物の生成が、反
応の進行中において監視され得る。結合試剤により生成
される信号の検出装置は、増幅の前、途中および後にお
いて信号の検出、測定および定量に使用され得る。当然
のことながら、特定の型の信号は、検出方法の選択に関
与する。例えば、本発明の好ましい実施態様において、
PCR生成物を標識するために、螢光DNA結合染料が
使用される。該染料は、二重鎖PCR生成物に挿入また
は結合され、得られる螢光が、二重鎖DNAの量の増大
と共に増加する。螢光の量は、PCR容器を開くか、ま
たは開かずに分光螢光測定装置を使用する測定によって
定量され得る。例VII およびVIIIは、本発明のこの側面
について例示する。
応の進行中において監視され得る。結合試剤により生成
される信号の検出装置は、増幅の前、途中および後にお
いて信号の検出、測定および定量に使用され得る。当然
のことながら、特定の型の信号は、検出方法の選択に関
与する。例えば、本発明の好ましい実施態様において、
PCR生成物を標識するために、螢光DNA結合染料が
使用される。該染料は、二重鎖PCR生成物に挿入また
は結合され、得られる螢光が、二重鎖DNAの量の増大
と共に増加する。螢光の量は、PCR容器を開くか、ま
たは開かずに分光螢光測定装置を使用する測定によって
定量され得る。例VII およびVIIIは、本発明のこの側面
について例示する。
【0065】例VIIIにおいて、正の対照試料の螢光は、
背景測定より充分に高かった。信号生成が、反応試験管
を開くことなく測定されるため、この検出方法は、信号
が増幅工程を通じて監視される自動化様式に対し、容易
に適用される。例VIIIは、自動化、オンラインPCR検
出方法を示すもので、光ファイバリードが、加熱/冷却
ブロック中のPCRチューブに直接に励起光を入力する
ために使用されている。同じ光ファイバが、帰還螢光輻
射を値が読取られる分光螢光測定装置に戻すために使用
されている。
背景測定より充分に高かった。信号生成が、反応試験管
を開くことなく測定されるため、この検出方法は、信号
が増幅工程を通じて監視される自動化様式に対し、容易
に適用される。例VIIIは、自動化、オンラインPCR検
出方法を示すもので、光ファイバリードが、加熱/冷却
ブロック中のPCRチューブに直接に励起光を入力する
ために使用されている。同じ光ファイバが、帰還螢光輻
射を値が読取られる分光螢光測定装置に戻すために使用
されている。
【0066】PCRの好適な方法において、増幅反応は
自動化工程として実施される。現在利用可能なサーモサ
イクラーは、48個の反応チューブを保持し得る加熱ブ
ロックを使用している。従って、48の増幅反応を同時
に実施することができる。本発明は、試料操作、チュー
ブの開放、または周期反応の中断なしに、48の試料す
べてにおいてPCR生成物の検出を可能にする。好適な
光学系は、光源からの励起光を反応チューブに導き、各
チューブからの輻射光を測定する。例えば、多重光ファ
イバリードは、サーモサイクルが行なわれているすべて
のPCRチューブを同時に読取る。しかしながら、各光
ファイバは、例えばPCR温度浸透の時間枠の間におい
て、一度に1つが迅速に読取られるため、反応チューブ
からの螢光を読取るには単一の螢光測定装置のみが必要
である。別法として、このような検出系が特定のサーモ
サイクラ装置または反応容器の数に限定される必要が無
いことは、当業者には自明であろう。しかしながら、4
8ウエルのサーモサイクラの記述は、本発明のこの側面
を例示する役割をはたしている。
自動化工程として実施される。現在利用可能なサーモサ
イクラーは、48個の反応チューブを保持し得る加熱ブ
ロックを使用している。従って、48の増幅反応を同時
に実施することができる。本発明は、試料操作、チュー
ブの開放、または周期反応の中断なしに、48の試料す
べてにおいてPCR生成物の検出を可能にする。好適な
光学系は、光源からの励起光を反応チューブに導き、各
チューブからの輻射光を測定する。例えば、多重光ファ
イバリードは、サーモサイクルが行なわれているすべて
のPCRチューブを同時に読取る。しかしながら、各光
ファイバは、例えばPCR温度浸透の時間枠の間におい
て、一度に1つが迅速に読取られるため、反応チューブ
からの螢光を読取るには単一の螢光測定装置のみが必要
である。別法として、このような検出系が特定のサーモ
サイクラ装置または反応容器の数に限定される必要が無
いことは、当業者には自明であろう。しかしながら、4
8ウエルのサーモサイクラの記述は、本発明のこの側面
を例示する役割をはたしている。
【0067】反応ウエルまたはチューブが、外部光が螢
光測定に影響を与えることを防止すべく光封止されてい
る限り、任意の上部プレート、試験管キャップ、または
蓋装置で光ファイバリードを有するものであるか、また
は取付け可能なものが適している。例VIIIの本発明の実
施態様において、光ファイバを取付けるために反応チュ
ーブの蓋は取除いた。しかしながら、透明または半透明
のキャップを有する反応容器を使用する場合には、線を
試験管中に挿入する必要がなくなる。線が、増幅反応成
分に物理的に接触することなく、反応チューブに光ファ
イバ線を挿入できれば望ましいことは明らかであろう。
表面または容器が加熱および冷却可能な分光螢光測定装
置においては、光ファイバは不要である。光ファイバ
は、サーモサイクラと分光螢光測定装置とが独立して装
置される場合に必要となる。
光測定に影響を与えることを防止すべく光封止されてい
る限り、任意の上部プレート、試験管キャップ、または
蓋装置で光ファイバリードを有するものであるか、また
は取付け可能なものが適している。例VIIIの本発明の実
施態様において、光ファイバを取付けるために反応チュ
ーブの蓋は取除いた。しかしながら、透明または半透明
のキャップを有する反応容器を使用する場合には、線を
試験管中に挿入する必要がなくなる。線が、増幅反応成
分に物理的に接触することなく、反応チューブに光ファ
イバ線を挿入できれば望ましいことは明らかであろう。
表面または容器が加熱および冷却可能な分光螢光測定装
置においては、光ファイバは不要である。光ファイバ
は、サーモサイクラと分光螢光測定装置とが独立して装
置される場合に必要となる。
【0068】同様な検出系が、96−ウエルマイクロタ
イター様式においても好適である。この型の様式は、例
えば血液バンクのスクリーニング処理における鎌形赤血
球性貧血またはAIDSウイルスのスクリーニング等、
遺伝子的分析について、大量の試料のスクリーニングの
ための臨床検査所においてしばしば必要とされる。本発
明は、この型の分析についても好適であって、公知の
“ウエル内”アッセイ処理、例えばELISA型式、ま
たは他の光学密度に基づく方法で必要とされる多くの洗
浄および抽出操作の必要性を除去する(Kolberらの、19
88, J. of Immun.Meth. 108 : 255-264 ; Huschtscha
らの1989, In Vitro Cell and Dev. Bial.25 (1) : 105
-108 ; Vollerらの1979, The Enzyme Linked Immunosor
bent Assay, Dynatech Labs, Alexandria, VA参照)。
イター様式においても好適である。この型の様式は、例
えば血液バンクのスクリーニング処理における鎌形赤血
球性貧血またはAIDSウイルスのスクリーニング等、
遺伝子的分析について、大量の試料のスクリーニングの
ための臨床検査所においてしばしば必要とされる。本発
明は、この型の分析についても好適であって、公知の
“ウエル内”アッセイ処理、例えばELISA型式、ま
たは他の光学密度に基づく方法で必要とされる多くの洗
浄および抽出操作の必要性を除去する(Kolberらの、19
88, J. of Immun.Meth. 108 : 255-264 ; Huschtscha
らの1989, In Vitro Cell and Dev. Bial.25 (1) : 105
-108 ; Vollerらの1979, The Enzyme Linked Immunosor
bent Assay, Dynatech Labs, Alexandria, VA参照)。
【0069】本検出方法は、ELISAプレート読取装
置に類似するが螢光の励起と測定をすべく設計された装
置を使用して、直接螢光測定することができる。例え
ば、Millipore により製造されているCytoFluo
r(商標)2300は、このような方法に好適である。
背景の螢光を測定するために、サーモサイクルの前後に
おいてマイクロタイタープレートの読取りを行なうこと
が適当である。別法として、螢光の連続的測定を与える
装置は、増幅反応中のPCR生成物の増大を監視するた
めに有用である。
置に類似するが螢光の励起と測定をすべく設計された装
置を使用して、直接螢光測定することができる。例え
ば、Millipore により製造されているCytoFluo
r(商標)2300は、このような方法に好適である。
背景の螢光を測定するために、サーモサイクルの前後に
おいてマイクロタイタープレートの読取りを行なうこと
が適当である。別法として、螢光の連続的測定を与える
装置は、増幅反応中のPCR生成物の増大を監視するた
めに有用である。
【0070】本発明の別の実施態様において、増幅に続
いて増幅生成物の大きさが、プローブの使用またはHP
LCもしくはゲル電気泳動等の大きさ分画方法の使用を
せずに決定される。本発明は、増幅生起の有無および増
幅標的生成物を、例えばプライマ二量体および高分子量
のDNAから同時に区別する場合に有用である。
いて増幅生成物の大きさが、プローブの使用またはHP
LCもしくはゲル電気泳動等の大きさ分画方法の使用を
せずに決定される。本発明は、増幅生起の有無および増
幅標的生成物を、例えばプライマ二量体および高分子量
のDNAから同時に区別する場合に有用である。
【0071】本発明の好ましい実施態様において、結合
可能な結合試剤は挿入螢光染料である。本願の例は、エ
チジウムブロマイドが増幅反応混合物に含まれることを
記述する。エチジウムブロマイドは、アクリジン、プロ
フラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フル
オルクマリン、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロ
キン、ジスタマイシンD、クロモマイシン、ホミジウ
ム、ミスラマイシン、ルテニウム、ポリピリジル類、お
よびアンスラマイシン等の他のDNA結合染料と同様
に、二重鎖DNAに結合した場合に螢光輻射の変化を示
す。増幅反応において、出発テンプレートから多量の二
重鎖DNAが生成する。従って、これが挿入螢光染料の
存在下に生起すればDNA依存性螢光の実質的増大を生
じる。PCRの標的特異性および適切な正および負の対
照の使用は、検出可能な螢光の増大が増幅標的核酸の存
在に依存することを保証する。
可能な結合試剤は挿入螢光染料である。本願の例は、エ
チジウムブロマイドが増幅反応混合物に含まれることを
記述する。エチジウムブロマイドは、アクリジン、プロ
フラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フル
オルクマリン、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロ
キン、ジスタマイシンD、クロモマイシン、ホミジウ
ム、ミスラマイシン、ルテニウム、ポリピリジル類、お
よびアンスラマイシン等の他のDNA結合染料と同様
に、二重鎖DNAに結合した場合に螢光輻射の変化を示
す。増幅反応において、出発テンプレートから多量の二
重鎖DNAが生成する。従って、これが挿入螢光染料の
存在下に生起すればDNA依存性螢光の実質的増大を生
じる。PCRの標的特異性および適切な正および負の対
照の使用は、検出可能な螢光の増大が増幅標的核酸の存
在に依存することを保証する。
【0072】本明細書は、均質的検出アッセイの種々の
面を示すいくつかの例を含んでいる。特定の実施態様
は、PCRにおいてエチジウムブロマイドが0.53−
1.27μMの濃度で存在することを記述しているが、
0.08μM(0.03μg/ml)−40.6μM(1
6μg/ml)の濃度も安定であり、また、PCR混合物
におけるエチジンブロマイドの濃度は、0.15μM
(0.06μg/ml)−20.3μM(8μg/ml)の
範囲が好ましい。当業者には、別のDNA結合試剤の好
適な濃度をいかにして経験的に修正すればよいか明らか
であろう。試剤の好適な濃度は、増幅反応において二重
鎖DNAの実質的増大が起きた場合に、検出可能な信号
を与える任意の量である。従って、増幅反応混合物に含
まれる試剤の好ましい濃度は、二重鎖非標的DNAの量
(すなわち背景ゲノムDNA)、標的の複写数および
量、増幅プライマの量および螢光、ならびに使用する特
定の試剤に依存して変化する。例えば、既知量の標的を
使用し、結合試剤の量を変化させた標準曲線は適当であ
ろう。螢光染料は、温度サイクル開始前にPCR混合物
に添加される。好適な螢光染料は、増幅の生起を阻害し
ない。この方法において新規な任意の染料の適切さを決
定することは、当業者には自明のことであろう。例I
は、PCR増幅がエチジウムブロマイドの検出可能な量
の存在下で起こることを示している。
面を示すいくつかの例を含んでいる。特定の実施態様
は、PCRにおいてエチジウムブロマイドが0.53−
1.27μMの濃度で存在することを記述しているが、
0.08μM(0.03μg/ml)−40.6μM(1
6μg/ml)の濃度も安定であり、また、PCR混合物
におけるエチジンブロマイドの濃度は、0.15μM
(0.06μg/ml)−20.3μM(8μg/ml)の
範囲が好ましい。当業者には、別のDNA結合試剤の好
適な濃度をいかにして経験的に修正すればよいか明らか
であろう。試剤の好適な濃度は、増幅反応において二重
鎖DNAの実質的増大が起きた場合に、検出可能な信号
を与える任意の量である。従って、増幅反応混合物に含
まれる試剤の好ましい濃度は、二重鎖非標的DNAの量
(すなわち背景ゲノムDNA)、標的の複写数および
量、増幅プライマの量および螢光、ならびに使用する特
定の試剤に依存して変化する。例えば、既知量の標的を
使用し、結合試剤の量を変化させた標準曲線は適当であ
ろう。螢光染料は、温度サイクル開始前にPCR混合物
に添加される。好適な螢光染料は、増幅の生起を阻害し
ない。この方法において新規な任意の染料の適切さを決
定することは、当業者には自明のことであろう。例I
は、PCR増幅がエチジウムブロマイドの検出可能な量
の存在下で起こることを示している。
【0073】エチジウムブロマイドの輻射スペクトル
は、非結合エチジウムブロマイドについて650nmにピ
ークを有し、また該試剤が二重鎖核酸に結合した場合に
611nmにピークを有している。しかしながら、結合お
よび非結合エチジウムブロマイドの輻射スペクトルは、
結合エチジウムがより低波長にて輻射する異なるピーク
を有しているため、結合および非結合エチジウム間の識
別は、非ピーク波長、すなわち結合エチジウムのピーク
より低い輻射の検出によって増強される。例VIIに開示
される実施態様において、試料の螢光輻射は、570nm
にて検出される。例VIIIにおいては、励起波長が500
nmに設定され、輻射検出が570nmに設定される。
は、非結合エチジウムブロマイドについて650nmにピ
ークを有し、また該試剤が二重鎖核酸に結合した場合に
611nmにピークを有している。しかしながら、結合お
よび非結合エチジウムブロマイドの輻射スペクトルは、
結合エチジウムがより低波長にて輻射する異なるピーク
を有しているため、結合および非結合エチジウム間の識
別は、非ピーク波長、すなわち結合エチジウムのピーク
より低い輻射の検出によって増強される。例VIIに開示
される実施態様において、試料の螢光輻射は、570nm
にて検出される。例VIIIにおいては、励起波長が500
nmに設定され、輻射検出が570nmに設定される。
【0074】本発明の実施のために検出および励起波長
が最適化されることは、本質的なことではない。例えば
例IIにおいては、励起波長300nmのU.V.ライトボ
ックス、および赤色フィルタを介した写真撮影が好適で
ある。分光螢光測定装置は、使用する特定の装置の特徴
に依存して、励起および輻射波長に加えてバンド幅の設
定の機会を与える。検出すべき特定のDNA結合試剤に
対して、いかにして波長およびバンド幅の設定を決定す
べきであるかは、当業者には自明であろう。かくして、
各試剤は離散的螢光スペクトルを有するものであるが、
ここに例示されるように本発明の実施について、広範囲
の検出波長が好適である。一般的な手引は、例えばThe
Merck Index, Budavari ら編、1989, Merck Co. Inc. R
ahway, NJ.に見出され、これにはヘリックスDNAに対
して結合および非結合の特定の螢光剤についてピーク輻
射波長が、各記載事項に記述されている。同様に、Mole
cular Probes Inc., Eugene, Oregon のカタログ、199
0, (Haugland による)は、本発明に有用なDNA結合
試剤を記述する参考文献として適している。
が最適化されることは、本質的なことではない。例えば
例IIにおいては、励起波長300nmのU.V.ライトボ
ックス、および赤色フィルタを介した写真撮影が好適で
ある。分光螢光測定装置は、使用する特定の装置の特徴
に依存して、励起および輻射波長に加えてバンド幅の設
定の機会を与える。検出すべき特定のDNA結合試剤に
対して、いかにして波長およびバンド幅の設定を決定す
べきであるかは、当業者には自明であろう。かくして、
各試剤は離散的螢光スペクトルを有するものであるが、
ここに例示されるように本発明の実施について、広範囲
の検出波長が好適である。一般的な手引は、例えばThe
Merck Index, Budavari ら編、1989, Merck Co. Inc. R
ahway, NJ.に見出され、これにはヘリックスDNAに対
して結合および非結合の特定の螢光剤についてピーク輻
射波長が、各記載事項に記述されている。同様に、Mole
cular Probes Inc., Eugene, Oregon のカタログ、199
0, (Haugland による)は、本発明に有用なDNA結合
試剤を記述する参考文献として適している。
【0075】一般に、本質的ではないが、DNAポリメ
ラーゼを、プライマおよびテンプレートの両者を添加
後、PCR反応混合物に添加することが好ましい。別法
として、例えば酵素およびプライマが最後に添加される
か、あるいはPCR緩衝液またはテンプレートと緩衝液
が最後に添加される。一般的に、重合に基本的な少なく
とも1種の成分が、プライマとテンプレートとの両者が
存在し、酵素が結合し得て所望のプライマ/テンプレー
ト基質が伸長され得るまで存在しないことが好ましい。
ラーゼを、プライマおよびテンプレートの両者を添加
後、PCR反応混合物に添加することが好ましい。別法
として、例えば酵素およびプライマが最後に添加される
か、あるいはPCR緩衝液またはテンプレートと緩衝液
が最後に添加される。一般的に、重合に基本的な少なく
とも1種の成分が、プライマとテンプレートとの両者が
存在し、酵素が結合し得て所望のプライマ/テンプレー
ト基質が伸長され得るまで存在しないことが好ましい。
【0076】増幅反応物の交差夾雑の効果を低減する方
法は、非慣用塩基を増幅生成物に導入し、残留分を該生
成物が続く増幅においてテンプレートとして作用し得な
くする酵素的、および/または物理化学的処理に曝すこ
とを要する。ここに記述される均質的検出アッセイは、
滅菌方法と組合せることが好適である。これらの方法
は、工程の削減およびこれによる生成物処理の最小化に
より残留分を低減し、従って増幅結果の精度および信頼
性を向上させる。滅菌方法は、残留分の削減について付
加的な信証を与える。
法は、非慣用塩基を増幅生成物に導入し、残留分を該生
成物が続く増幅においてテンプレートとして作用し得な
くする酵素的、および/または物理化学的処理に曝すこ
とを要する。ここに記述される均質的検出アッセイは、
滅菌方法と組合せることが好適である。これらの方法
は、工程の削減およびこれによる生成物処理の最小化に
より残留分を低減し、従って増幅結果の精度および信頼
性を向上させる。滅菌方法は、残留分の削減について付
加的な信証を与える。
【0077】好ましくは、DNA結合試剤は、保存安定
的であり、PCR試薬緩衝剤中の成分として含まれ得る
ものである。かくして本発明は、キットの様式で商業的
に適した新規試薬を提供する。このような試薬は、PC
Rによる核酸検出のためのキット中に、DNA結合試剤
の溶液を含んでもよい。別法として、該試薬はTris
−HCl,KCl,およびMgCl2 等のPCR緩衝剤
成分をPCRの実施に適当な濃度で含むと共にDNA結
合試剤を含有するであろう。一実施態様において、キッ
トはエチジウムブロマイドを増幅反応において好適な濃
度、すなわち最終エチジウムブロマイド濃度が0.15
μM−20.3μMの範囲にあるように与える濃度で含
む緩衝剤を含有する。該緩衝剤は、次の試薬のいずれ
か、または全部を付加的に含んでもよい:Tris−H
Cl,pH8.0−8.3;KCl、およびMgCl
2 の、それぞれPCR増幅に適した濃度のもの。増幅核
酸検出用キットは、次のいずれかを含むことも考えられ
る:重合試薬、dNTP類、適切なプライマ、および正
の対照テンプレート。
的であり、PCR試薬緩衝剤中の成分として含まれ得る
ものである。かくして本発明は、キットの様式で商業的
に適した新規試薬を提供する。このような試薬は、PC
Rによる核酸検出のためのキット中に、DNA結合試剤
の溶液を含んでもよい。別法として、該試薬はTris
−HCl,KCl,およびMgCl2 等のPCR緩衝剤
成分をPCRの実施に適当な濃度で含むと共にDNA結
合試剤を含有するであろう。一実施態様において、キッ
トはエチジウムブロマイドを増幅反応において好適な濃
度、すなわち最終エチジウムブロマイド濃度が0.15
μM−20.3μMの範囲にあるように与える濃度で含
む緩衝剤を含有する。該緩衝剤は、次の試薬のいずれ
か、または全部を付加的に含んでもよい:Tris−H
Cl,pH8.0−8.3;KCl、およびMgCl
2 の、それぞれPCR増幅に適した濃度のもの。増幅核
酸検出用キットは、次のいずれかを含むことも考えられ
る:重合試薬、dNTP類、適切なプライマ、および正
の対照テンプレート。
【0078】米国特許第4,683,202号は、5′
未満に付加された非相補的配列を有するPCR用プライ
マの調製および使用方法を記述している。これらのテイ
ルは、PCRの間に該非相補的テイルが二重鎖PCR生
成物中に導入されるため、特定の制限部位の操作、また
は他の目的のために有用である。特定のテイル配列は、
特定の染料の結合標的を与える。例えば、Hoechs
t 33258(Searle およびEmbrey, 1990, Nuc. Aci
ds Res. 18 : 3753-3762)は、A−T塩基対に優先的に
結合する。長いA−T富有5′テイルを伴って合成され
るPCRプライマは、ゲノムDNAに比べて相対的にA
−T富有なPCR生成物を与える。Hoechst 3
3358を使用して、A−T富有PCR生成物は、ゲノ
ムDNAに対して相対的に螢光を増大し、従ってゲノム
DNAの存在下における信号強度を増大させるために有
用である。
未満に付加された非相補的配列を有するPCR用プライ
マの調製および使用方法を記述している。これらのテイ
ルは、PCRの間に該非相補的テイルが二重鎖PCR生
成物中に導入されるため、特定の制限部位の操作、また
は他の目的のために有用である。特定のテイル配列は、
特定の染料の結合標的を与える。例えば、Hoechs
t 33258(Searle およびEmbrey, 1990, Nuc. Aci
ds Res. 18 : 3753-3762)は、A−T塩基対に優先的に
結合する。長いA−T富有5′テイルを伴って合成され
るPCRプライマは、ゲノムDNAに比べて相対的にA
−T富有なPCR生成物を与える。Hoechst 3
3358を使用して、A−T富有PCR生成物は、ゲノ
ムDNAに対して相対的に螢光を増大し、従ってゲノム
DNAの存在下における信号強度を増大させるために有
用である。
【0079】同様に、DAPIはAT富有DNAと螢光
複合体を形成する(Kapuseinski およびSzer, 1979, Nu
c. Acids Res., 6 (112) : 3519)。対照的に、アクチノ
マイシンDは、G−C富有DNAと螢光複合体を形成す
る(JainおよびSobell, 1972, J. Mol. Biol. 68 : 2
1)。従って、本発明は、増幅中に反応混合物に2種類の
螢光色素を含ませることによって、1つの反応容器中で
2種類の異なる標的核酸の量を監視するために適してい
る。1種類の螢光色素が配列特異性を有し、その配列が
2種類の標的核酸の一方に対するプライマのテイル(す
なわち5′末端)に含まれることのみが必要とされる。
各螢光色素の輻射スペクトルは、増幅中および/または
後に分光螢光測定装置により別個に測定される。従っ
て、本発明は同じ試料中の2種類の異なる核酸標的の定
量的比較のために特に有用であり、これは、例えば一方
の標的がすべての細胞に存在する配列であり、かつ他方
が病原に存在するものである場合に、感染または疾患の
程度を測定するために有用であろう。
複合体を形成する(Kapuseinski およびSzer, 1979, Nu
c. Acids Res., 6 (112) : 3519)。対照的に、アクチノ
マイシンDは、G−C富有DNAと螢光複合体を形成す
る(JainおよびSobell, 1972, J. Mol. Biol. 68 : 2
1)。従って、本発明は、増幅中に反応混合物に2種類の
螢光色素を含ませることによって、1つの反応容器中で
2種類の異なる標的核酸の量を監視するために適してい
る。1種類の螢光色素が配列特異性を有し、その配列が
2種類の標的核酸の一方に対するプライマのテイル(す
なわち5′末端)に含まれることのみが必要とされる。
各螢光色素の輻射スペクトルは、増幅中および/または
後に分光螢光測定装置により別個に測定される。従っ
て、本発明は同じ試料中の2種類の異なる核酸標的の定
量的比較のために特に有用であり、これは、例えば一方
の標的がすべての細胞に存在する配列であり、かつ他方
が病原に存在するものである場合に、感染または疾患の
程度を測定するために有用であろう。
【0080】異なる結合特性を有する同様な試剤は、一
旦増幅反応を開始した後には、反応容器を開くことなし
に、一試料中の数種類の標的を検出するための多重PC
R法を可能とする。螢光DNA結合染料は、各々異なる
輻射および励起スペクトルを有してよい。臨床的設定に
おいて、異なるDNA配列特異性を有する異なったDN
A結合染料が、異なった標的の存在を示すために有用で
ある。
旦増幅反応を開始した後には、反応容器を開くことなし
に、一試料中の数種類の標的を検出するための多重PC
R法を可能とする。螢光DNA結合染料は、各々異なる
輻射および励起スペクトルを有してよい。臨床的設定に
おいて、異なるDNA配列特異性を有する異なったDN
A結合染料が、異なった標的の存在を示すために有用で
ある。
【0081】本発明は、標的の相対量を測定するため、
あるいは増幅前に存在する標的の量を正確に定量するた
めに、内部標準を使用する方法との組合せにおいて好適
である。
あるいは増幅前に存在する標的の量を正確に定量するた
めに、内部標準を使用する方法との組合せにおいて好適
である。
【0082】別の実施態様において、本発明はDNA試
料の完全性を決定する手段を提供する。例えば、法医学
的分析は、記録標本的試料等の部分分解標的を含む試料
にしばしば関与する。例VIIIに示すように、PCR生成
物の生成を監視する能力は、別個の反応における小さい
PCR生成物と大きいPCR生成物とに関するDNA試
料の増幅プロフィールの比較を可能とする。分解が無い
場合、二重鎖DNA増大の監視は、両方の反応が略同じ
サイクルでプラトーに達することを示す。分解がある場
合、より多くの完全な標的分子の存在によって小さい生
成物が大きい断片より速くプラトーに達する。
料の完全性を決定する手段を提供する。例えば、法医学
的分析は、記録標本的試料等の部分分解標的を含む試料
にしばしば関与する。例VIIIに示すように、PCR生成
物の生成を監視する能力は、別個の反応における小さい
PCR生成物と大きいPCR生成物とに関するDNA試
料の増幅プロフィールの比較を可能とする。分解が無い
場合、二重鎖DNA増大の監視は、両方の反応が略同じ
サイクルでプラトーに達することを示す。分解がある場
合、より多くの完全な標的分子の存在によって小さい生
成物が大きい断片より速くプラトーに達する。
【0083】ここに提供される均質的検出アッセイは、
例えば遺伝子スクリーニング、法医学的ヒトの同定、病
原検出、および定量、環境監視または核酸による物質の
標識および追跡を含む広範囲の応用に適することが、当
業者には明白であろう。
例えば遺伝子スクリーニング、法医学的ヒトの同定、病
原検出、および定量、環境監視または核酸による物質の
標識および追跡を含む広範囲の応用に適することが、当
業者には明白であろう。
【0084】一実施態様において、検出可能な信号は螢
光である。螢光は、定量法に加えて定性方法における使
用にも適している。定性的検出は、UV光への露出によ
る反応チューブの目視検査で単純かつ迅速に行ない得
る。この型式の迅速な高感度アッセイは、病原の存在、
または特定遺伝子配列に帰因する、または関連する疾患
状態の迅速スクリーニングとして望ましい。本発明は、
標的の群の任意の構成体の存在について正/負の前スク
リーニングによって、費用削減の手段を提供する。例え
ば病原検出系のための環境監視等、ほとんどの試料が負
であることが予測される場合に、このような多くの異な
る標的の増幅が、このことを可能とする。多重PCR
は、一つの増幅反応中に異なる多くのプライマ対を含む
方法である(Gibbs らの1989, PCR Technology, Erlich
編、Stockton Press, NY)。広範囲の可能性ある標的を
アッセイするための多重プライマ対を使用する均質検出
アッセイは、次いで、正の試料についてのみ、より複雑
な型決め処理に続けられる。この前スクリーニングは、
負の試料に対するより複雑な型決め処理の実施の費用、
および/または負の試料に対する反復試験実施の費用を
削減する。
光である。螢光は、定量法に加えて定性方法における使
用にも適している。定性的検出は、UV光への露出によ
る反応チューブの目視検査で単純かつ迅速に行ない得
る。この型式の迅速な高感度アッセイは、病原の存在、
または特定遺伝子配列に帰因する、または関連する疾患
状態の迅速スクリーニングとして望ましい。本発明は、
標的の群の任意の構成体の存在について正/負の前スク
リーニングによって、費用削減の手段を提供する。例え
ば病原検出系のための環境監視等、ほとんどの試料が負
であることが予測される場合に、このような多くの異な
る標的の増幅が、このことを可能とする。多重PCR
は、一つの増幅反応中に異なる多くのプライマ対を含む
方法である(Gibbs らの1989, PCR Technology, Erlich
編、Stockton Press, NY)。広範囲の可能性ある標的を
アッセイするための多重プライマ対を使用する均質検出
アッセイは、次いで、正の試料についてのみ、より複雑
な型決め処理に続けられる。この前スクリーニングは、
負の試料に対するより複雑な型決め処理の実施の費用、
および/または負の試料に対する反復試験実施の費用を
削減する。
【0085】標的核酸の均質的検出についての本方法
は、特定標的の定量にも適している。該方法が自動的あ
るいは手作業のいずれで行なわれる場合にも、多くの手
段により定量を実施可能である。例えば、既知標準の一
連の希釈物と並行する試料の一連の希釈物は、PCRお
よび信号検出に続く既知試料中の出発材料の定量に好適
な一連のテンプレートを提供する。同様に、螢光は、P
CR過程のサイクル間に測定可能であるから、PCRの
指数相および生成物がプラトー相に達したサイクルが容
易に決定され得る。より多くの標的DNAが、PCRの
開始時点に存在するほど、より速く反応はプラトー相、
すなわち生成物蓄積速度が減少し始める時点に達する。
プラトーに達するに要するサイクル数は、試料中に存在
する標的量に直接に関連するため、PCR進行中におけ
る螢光の監視は、少量DNAの定量に役立つ。
は、特定標的の定量にも適している。該方法が自動的あ
るいは手作業のいずれで行なわれる場合にも、多くの手
段により定量を実施可能である。例えば、既知標準の一
連の希釈物と並行する試料の一連の希釈物は、PCRお
よび信号検出に続く既知試料中の出発材料の定量に好適
な一連のテンプレートを提供する。同様に、螢光は、P
CR過程のサイクル間に測定可能であるから、PCRの
指数相および生成物がプラトー相に達したサイクルが容
易に決定され得る。より多くの標的DNAが、PCRの
開始時点に存在するほど、より速く反応はプラトー相、
すなわち生成物蓄積速度が減少し始める時点に達する。
プラトーに達するに要するサイクル数は、試料中に存在
する標的量に直接に関連するため、PCR進行中におけ
る螢光の監視は、少量DNAの定量に役立つ。
【0086】本発明は、二重鎖ゲノム核酸の存在下にお
ける増幅核酸の検出に適している。0.5gまたはそれ
以上のDNAの背景水準は、正のアッセイ結果を不明瞭
とすることはないであろう。標的核酸は、クローン化分
節、反復配列、例えば遺伝子の多重複写物または縦列反
復、単一複写遺伝子、または70,000個の細胞中の
1複写物程度の低濃度で存在する感染物質であり得る。
PCRは、いずれかのテンプレート核酸から出発して二
重鎖核酸の実質の増大を与えるものであるから、出発テ
ンプレートは、RNAまたはDNAである。
ける増幅核酸の検出に適している。0.5gまたはそれ
以上のDNAの背景水準は、正のアッセイ結果を不明瞭
とすることはないであろう。標的核酸は、クローン化分
節、反復配列、例えば遺伝子の多重複写物または縦列反
復、単一複写遺伝子、または70,000個の細胞中の
1複写物程度の低濃度で存在する感染物質であり得る。
PCRは、いずれかのテンプレート核酸から出発して二
重鎖核酸の実質の増大を与えるものであるから、出発テ
ンプレートは、RNAまたはDNAである。
【0087】標的核酸は、例えば70,000個以上の
細胞由来のヒトゲノムDNAの背景における単一複写物
AIDSウイルスDNAのように希少配列であり得る。
このような場合、特異性増大処理手続は、増幅が標的配
列の存在に対する応答においてのみ二重鎖DNAの実質
的利得を与えること、ならびに実質的利得がゲノムDN
Aの高い背景の存在下で検出可能であることを保証す
る。米国特許第4,683,195号は、単一複写遺伝
子の増幅における背景減少のための一群のプライマの使
用を示している。
細胞由来のヒトゲノムDNAの背景における単一複写物
AIDSウイルスDNAのように希少配列であり得る。
このような場合、特異性増大処理手続は、増幅が標的配
列の存在に対する応答においてのみ二重鎖DNAの実質
的利得を与えること、ならびに実質的利得がゲノムDN
Aの高い背景の存在下で検出可能であることを保証す
る。米国特許第4,683,195号は、単一複写遺伝
子の増幅における背景減少のための一群のプライマの使
用を示している。
【0088】米国特許第4,683,195号における
一群の増幅の方法は、標的配列を増幅するための第1の
プライマ対、および該第1の増幅反応により形成される
PCR生成物の副分節を増幅するための第2のプライマ
対を必要とする。第1のPCRに続いて、該反応混合物
が第1のプライマ対濃度を低減するために10倍に希釈
され、該反応混合物に第2のプライマ対が導入される。
しかしながら、本発明の特に優位点とするところは工程
の削減にあり、試料の希釈による増幅反応の停止、およ
び第2のプライマ対の添加の付加的な工程は望ましいも
のではない。
一群の増幅の方法は、標的配列を増幅するための第1の
プライマ対、および該第1の増幅反応により形成される
PCR生成物の副分節を増幅するための第2のプライマ
対を必要とする。第1のPCRに続いて、該反応混合物
が第1のプライマ対濃度を低減するために10倍に希釈
され、該反応混合物に第2のプライマ対が導入される。
しかしながら、本発明の特に優位点とするところは工程
の削減にあり、試料の希釈による増幅反応の停止、およ
び第2のプライマ対の添加の付加的な工程は望ましいも
のではない。
【0089】この問題点に向けて、修飾された一群増幅
処理が提供される。本願の一群プライマ法は、核酸増幅
について従来の一群プライマ処理に比べて大きく改善さ
れている。これらの方法は、向上された特異性を与え、
いずれのPCRに基づく増幅スキームに適用可能であ
る。しかしながら、本願の開示においてはこれらの方法
は均質的アッセイにおける使用について記述される。
処理が提供される。本願の一群プライマ法は、核酸増幅
について従来の一群プライマ処理に比べて大きく改善さ
れている。これらの方法は、向上された特異性を与え、
いずれのPCRに基づく増幅スキームに適用可能であ
る。しかしながら、本願の開示においてはこれらの方法
は均質的アッセイにおける使用について記述される。
【0090】修飾された一群のプライマ法においては、
PCRプライマの両側対より内部側である第3のプライ
マが、特定の標的分節増幅のためにPCR反応中に含ま
れる。該第3のプライマは、それが相補的標的鎖にハイ
ブリッドした場合に、側端プライマのものより低いアニ
ール/融解温度を有する。この性質は、より短い長さ、
および/またはより低いG−C含有量によってプライマ
に付与され得る。最初の15−20のPCRサイクルに
ついては、各PCRサイクルの伸長相における温度が、
充分高く、すなわち約65℃に保たれて、短いプライマ
が特異的にアニールし、増幅を開始することが阻止され
る。側部プライマは充分にアニールし、PCRは高い伸
長温度において通常に進行する。しかしながら、第3の
プライマの側方にある該プライマは、低濃度で存在す
る。この方法において、増幅プラトーの前に、制限的プ
ライマの供給がほぼ底をついたときに、アニーリング温
度を約42℃まで低下させる。この温度において、第3
のプライマが加わって来て、標的の増幅を残る15サイ
クル程度、進行させる。
PCRプライマの両側対より内部側である第3のプライ
マが、特定の標的分節増幅のためにPCR反応中に含ま
れる。該第3のプライマは、それが相補的標的鎖にハイ
ブリッドした場合に、側端プライマのものより低いアニ
ール/融解温度を有する。この性質は、より短い長さ、
および/またはより低いG−C含有量によってプライマ
に付与され得る。最初の15−20のPCRサイクルに
ついては、各PCRサイクルの伸長相における温度が、
充分高く、すなわち約65℃に保たれて、短いプライマ
が特異的にアニールし、増幅を開始することが阻止され
る。側部プライマは充分にアニールし、PCRは高い伸
長温度において通常に進行する。しかしながら、第3の
プライマの側方にある該プライマは、低濃度で存在す
る。この方法において、増幅プラトーの前に、制限的プ
ライマの供給がほぼ底をついたときに、アニーリング温
度を約42℃まで低下させる。この温度において、第3
のプライマが加わって来て、標的の増幅を残る15サイ
クル程度、進行させる。
【0091】一群プライマ増幅の別法において、一方の
プライマが低濃度である必要性も取り除かれる。側部プ
ライマは、G−C富有テイルを伴って合成される。非相
補的プライマテイル配列は、増幅の2サイクル後にはP
CR生成物中に取込まれるため、A−T対に対してG−
C対の増大した熱安定性故にPCR生成物の変性に要す
る温度をG−Cテイルが引き上げる作用をする(Myers
らの1989, PCR Technology, Erlich編、Stockton Pres
s, New York)。一群および側部PCR生成物間の変性
温度に生じた差異は、次いでテイル付加側部プライマに
よる増幅を効果的に停止させるために有効に利用され
る。側部プライマから一旦PCR生成物が作られた後
は、変性温度が96℃から86℃に下げられ、側部PC
R生成物の増幅には温度が低すぎるが、一群PCR生成
物の増幅を許容するためには充分高い温度にされる。ア
ニール温度もまた、“参加(drop−in)”法と同
様に、必要に応じて一群プライマ由来の合成を開始させ
るために操作してもよい。
プライマが低濃度である必要性も取り除かれる。側部プ
ライマは、G−C富有テイルを伴って合成される。非相
補的プライマテイル配列は、増幅の2サイクル後にはP
CR生成物中に取込まれるため、A−T対に対してG−
C対の増大した熱安定性故にPCR生成物の変性に要す
る温度をG−Cテイルが引き上げる作用をする(Myers
らの1989, PCR Technology, Erlich編、Stockton Pres
s, New York)。一群および側部PCR生成物間の変性
温度に生じた差異は、次いでテイル付加側部プライマに
よる増幅を効果的に停止させるために有効に利用され
る。側部プライマから一旦PCR生成物が作られた後
は、変性温度が96℃から86℃に下げられ、側部PC
R生成物の増幅には温度が低すぎるが、一群PCR生成
物の増幅を許容するためには充分高い温度にされる。ア
ニール温度もまた、“参加(drop−in)”法と同
様に、必要に応じて一群プライマ由来の合成を開始させ
るために操作してもよい。
【0092】適切な変性およびアニール温度を経験的に
決定し、これに従ってサーモサイクラをプログラムする
ことは当業者には自明のことであろう。この“辞退(d
rop out)プライマ”法は、PCR効率を維持す
るために高濃度の側部プライマを含ませる手段を提供
し、またこのプライマにより開始される増幅を、反応の
間に所望により停止させることを可能とする。一群プラ
イマ増幅の特定の方法は、例VIおよびVII に示される。
決定し、これに従ってサーモサイクラをプログラムする
ことは当業者には自明のことであろう。この“辞退(d
rop out)プライマ”法は、PCR効率を維持す
るために高濃度の側部プライマを含ませる手段を提供
し、またこのプライマにより開始される増幅を、反応の
間に所望により停止させることを可能とする。一群プラ
イマ増幅の特定の方法は、例VIおよびVII に示される。
【0093】以下の例は、本発明の種々の側面を例示す
る。使用されるプライマ配列は、例VIIIの末尾に掲載す
る。
る。使用されるプライマ配列は、例VIIIの末尾に掲載す
る。
【0094】
【実施例】例 1 この例は、エチジウムブロマイドの存在下でのPCRの
進行能力を例示する。2組のPCRを次のように実施し
た。各々100μlのPCRは:50ngのヒトDNA、
10mMのTris−HCl pH8,50mMのKCl,4
mMのMgCl 2 ,250μMの各dNTP、2.5単位
Taqポリメラーゼ(Perkin-Elmer Cetus Instrument
s, Norwalk Connecticut)、20ピコモルの各プライマ
GH26(配列番号:1)およびGH27(配列番号:
2)を含む。ヒトDNAを、ヒトB−細胞株から精製し
た。DNAを、Maniatis(前出文献)に記述さ
れている方法に従って調製した。蒸発防止のため、各反
応物には油のおおいを添加した。
進行能力を例示する。2組のPCRを次のように実施し
た。各々100μlのPCRは:50ngのヒトDNA、
10mMのTris−HCl pH8,50mMのKCl,4
mMのMgCl 2 ,250μMの各dNTP、2.5単位
Taqポリメラーゼ(Perkin-Elmer Cetus Instrument
s, Norwalk Connecticut)、20ピコモルの各プライマ
GH26(配列番号:1)およびGH27(配列番号:
2)を含む。ヒトDNAを、ヒトB−細胞株から精製し
た。DNAを、Maniatis(前出文献)に記述さ
れている方法に従って調製した。蒸発防止のため、各反
応物には油のおおいを添加した。
【0095】2組のPCRを、一方には0.51μMの
エチジウムブロマイド(Sigma)が含まれることを
除いて同等な条件下で実施した。Perkin-Elmer Cetus I
nstrumentsから購入したサーモサイクラを、次のサイク
ルパラメタによりプログラムした:96℃にて変性、1
分間保持、55℃にてアニール、1分間保持、72℃に
て伸長、1分間保持。このプロフィールを32サイクル
反復した。増幅後、各PCRの5μlを3%NuSie
veアガロースゲル(FMC)を用いたゲル電気泳動に
より分析した。該ゲルを、エチジウムブロマイドを用い
て標準方法により染色し、2つの反応により生じたPC
R生成物の量を比較した。結果は、エチジウムブロマイ
ドの存在下に生成された増幅DNAの量が、該染料を含
まずに生成されたPCR生成物の量と区別し得ないこと
を示した。更に、期待される大きさのDNA断片を生成
する能力によって測定されるPCRの特異性は、変化が
無かった。
エチジウムブロマイド(Sigma)が含まれることを
除いて同等な条件下で実施した。Perkin-Elmer Cetus I
nstrumentsから購入したサーモサイクラを、次のサイク
ルパラメタによりプログラムした:96℃にて変性、1
分間保持、55℃にてアニール、1分間保持、72℃に
て伸長、1分間保持。このプロフィールを32サイクル
反復した。増幅後、各PCRの5μlを3%NuSie
veアガロースゲル(FMC)を用いたゲル電気泳動に
より分析した。該ゲルを、エチジウムブロマイドを用い
て標準方法により染色し、2つの反応により生じたPC
R生成物の量を比較した。結果は、エチジウムブロマイ
ドの存在下に生成された増幅DNAの量が、該染料を含
まずに生成されたPCR生成物の量と区別し得ないこと
を示した。更に、期待される大きさのDNA断片を生成
する能力によって測定されるPCRの特異性は、変化が
無かった。
【0096】例II この例は、PCRの特異性が、螢光に基づく標的核酸の
均質的検出に対して充分であることを示す。例Iに記述
される実験を、標的特異的エチジウムブロマイドの螢光
が、標準PCR条件を使用して容易に視認できるか否か
を測定するために拡張した。かくして5組の100μl
反応混合物を、10mMのTris−HCl pH8,50
mMのKCl,2.5mMのMgCl2 ,1.27μMのエ
チジウムブロマイド、150μMの各dNTP,2.5
単位のTaqポリメラーゼを含めて調製した。プライマ
類および標的DNAは、次に記すように含まれる。プラ
イマ対GH15(配列番号:3)およびGH16(配列
番号:4)は、DQαの増幅に特異的であり、DRβ1
標的DNAを増幅しない。DQα標的DNAは、例Iに
記述されるようにヒトDQα遺伝子を増幅して調製され
た。増幅に続いて、DQα PCR生成物を希釈して、
増幅あたり〜2×107 の複写物(5pg)の増幅DN
Aを与えた。DQα生成物を、正の対照として使用し
た。DRβ1標的DNAは、プライマ対GH46(配列
番号:5)およびGH50(配列番号:6)を、ヒトゲ
ノムDNAを用いるPCRにおいてDRβ1の増幅に使
用して調製された。該PCR生成物を希釈して、DRβ
1 DNAの〜2×107 個の複写物を与え、下記の反
応4において負の対照として使用した。5種類の反応混
合物は、以下のとおりのプライマおよび標的を含む: 反応1−プライマ無し+DQα標的 反応2−プライマ+DQα標的 反応3−プライマ+DQα標的 反応4−プライマ+DQβ1標的 反応5−プライマ+標的無し
均質的検出に対して充分であることを示す。例Iに記述
される実験を、標的特異的エチジウムブロマイドの螢光
が、標準PCR条件を使用して容易に視認できるか否か
を測定するために拡張した。かくして5組の100μl
反応混合物を、10mMのTris−HCl pH8,50
mMのKCl,2.5mMのMgCl2 ,1.27μMのエ
チジウムブロマイド、150μMの各dNTP,2.5
単位のTaqポリメラーゼを含めて調製した。プライマ
類および標的DNAは、次に記すように含まれる。プラ
イマ対GH15(配列番号:3)およびGH16(配列
番号:4)は、DQαの増幅に特異的であり、DRβ1
標的DNAを増幅しない。DQα標的DNAは、例Iに
記述されるようにヒトDQα遺伝子を増幅して調製され
た。増幅に続いて、DQα PCR生成物を希釈して、
増幅あたり〜2×107 の複写物(5pg)の増幅DN
Aを与えた。DQα生成物を、正の対照として使用し
た。DRβ1標的DNAは、プライマ対GH46(配列
番号:5)およびGH50(配列番号:6)を、ヒトゲ
ノムDNAを用いるPCRにおいてDRβ1の増幅に使
用して調製された。該PCR生成物を希釈して、DRβ
1 DNAの〜2×107 個の複写物を与え、下記の反
応4において負の対照として使用した。5種類の反応混
合物は、以下のとおりのプライマおよび標的を含む: 反応1−プライマ無し+DQα標的 反応2−プライマ+DQα標的 反応3−プライマ+DQα標的 反応4−プライマ+DQβ1標的 反応5−プライマ+標的無し
【0097】ここにおいてプライマは、GH15(配列
番号:3)およびGH16(配列番号:4)をそれぞれ
10ピコモル含む。反応混合物1および2は、増幅サイ
クルに付さなかった。反応3,4および5は、20サイ
クルの増幅を行なった。サイクルパラメタは、94℃、
1分間保持;45℃、1分間保持;および72℃、1分
間保持であった。
番号:3)およびGH16(配列番号:4)をそれぞれ
10ピコモル含む。反応混合物1および2は、増幅サイ
クルに付さなかった。反応3,4および5は、20サイ
クルの増幅を行なった。サイクルパラメタは、94℃、
1分間保持;45℃、1分間保持;および72℃、1分
間保持であった。
【0098】次いで、反応チューブを、UVライトボッ
クス(300nm)に置き、2秒および2分の1秒の露光
で撮影した。図1に示される結果は、反応3において特
異的標的DNAの増幅による螢光の増大を示している。
反応1および2は、増幅生起前に存在する螢光の水準を
示している。反応4および5は、反応中に特定のプライ
マ対が存在し、適切なテンプレートも存在しない限り、
螢光が目視的に増大しないことを示している。異なる撮
影時の露光は、図1に示すように螢光の相対的差異を示
している。
クス(300nm)に置き、2秒および2分の1秒の露光
で撮影した。図1に示される結果は、反応3において特
異的標的DNAの増幅による螢光の増大を示している。
反応1および2は、増幅生起前に存在する螢光の水準を
示している。反応4および5は、反応中に特定のプライ
マ対が存在し、適切なテンプレートも存在しない限り、
螢光が目視的に増大しないことを示している。異なる撮
影時の露光は、図1に示すように螢光の相対的差異を示
している。
【0099】例III 非−標的二重鎖DNAの存在下における本発明の均質的
アッセイ法の特異的標識検出能力を試験した。この例
は、ゲノムDNAの背景における特異的DNA配列の検
出を示している。20組の100μl PCR配合物を
次のように調製した。各々は、10mMのTris−HC
l,pH8;50mMのKCl;2mMのMgCl2 ;2.9
単位のTaqポリメラーゼ;180μmの各dNTP;
1.27μMのエチジウムブロマイド;15picam
oleのRH191(配列番号:7);および15pi
camoleのRH192(配列番号:8)を含む。プ
ライマRH191(配列番号:7);およびRH192
(配列番号:8)は、Koganらの1987, N. Engl. J. Me
d., 317 : 985-990 に記述されているプライマy1.1
およびy1.2から誘導した。これらのプライマは、ヒ
ト男性細胞あたりに数千個のコピーを生じるヒト男性特
異的配列に対して特異的である。15組のPCR反応混
合物を、次のように設定した。試料DNAを、各反応物
について特定されているように男性または女性由来のヒ
ト血液から調製した。DNAは、Maniatisの前出文献に
従って調製した。
アッセイ法の特異的標識検出能力を試験した。この例
は、ゲノムDNAの背景における特異的DNA配列の検
出を示している。20組の100μl PCR配合物を
次のように調製した。各々は、10mMのTris−HC
l,pH8;50mMのKCl;2mMのMgCl2 ;2.9
単位のTaqポリメラーゼ;180μmの各dNTP;
1.27μMのエチジウムブロマイド;15picam
oleのRH191(配列番号:7);および15pi
camoleのRH192(配列番号:8)を含む。プ
ライマRH191(配列番号:7);およびRH192
(配列番号:8)は、Koganらの1987, N. Engl. J. Me
d., 317 : 985-990 に記述されているプライマy1.1
およびy1.2から誘導した。これらのプライマは、ヒ
ト男性細胞あたりに数千個のコピーを生じるヒト男性特
異的配列に対して特異的である。15組のPCR反応混
合物を、次のように設定した。試料DNAを、各反応物
について特定されているように男性または女性由来のヒ
ト血液から調製した。DNAは、Maniatisの前出文献に
従って調製した。
【0100】反応1−5は2ngのヒト男性DNAを含む 反応6−10はDNAを含まない 反応11−15は60ngのヒト男性DNAを含む 反応16−20は60ngのヒト女性DNAを含む
【0101】該反応物を、示されたサイクル数につい
て、94℃にて1分間;60℃にて1分間のサイクルで
プログラムされたPerkin−Elmer Cetu
s Instrumentsのサーモサイクラーにすべ
て設置した。以下に示されるように、チューブを種々の
サイクルにおいてサーモサイクラーから取出し、各テン
プレートについてPCRの時間経過を与えた。特定的に
は、5本のチューブの各組について、0,17,21,
25および29回の増幅サイクルを実施した。PCR生
成物を、上述したようにチューブをUV光に露出するこ
とによって検出した。
て、94℃にて1分間;60℃にて1分間のサイクルで
プログラムされたPerkin−Elmer Cetu
s Instrumentsのサーモサイクラーにすべ
て設置した。以下に示されるように、チューブを種々の
サイクルにおいてサーモサイクラーから取出し、各テン
プレートについてPCRの時間経過を与えた。特定的に
は、5本のチューブの各組について、0,17,21,
25および29回の増幅サイクルを実施した。PCR生
成物を、上述したようにチューブをUV光に露出するこ
とによって検出した。
【0102】撮影および目視検査により、チューブ番号
6−15は、螢光の増大を示さなかった。0および17
サイクルの男性DNA試料であるチューブ番号1および
2は、目視的検出によれば螢光の増大が無かった。2
1,25および29サイクルの男性DNA反応物のみ
が、UV光の下で螢光を発し、また螢光の量はサイクル
数の増大と共に増加した。チューブ番号16−20によ
る結果も、螢光の増大が17サイクルで示された点を除
いて同様であった。このことは、増幅前に試料中に存在
するより多くの標的DNA配列の複写物の存在と合致し
ている。
6−15は、螢光の増大を示さなかった。0および17
サイクルの男性DNA試料であるチューブ番号1および
2は、目視的検出によれば螢光の増大が無かった。2
1,25および29サイクルの男性DNA反応物のみ
が、UV光の下で螢光を発し、また螢光の量はサイクル
数の増大と共に増加した。チューブ番号16−20によ
る結果も、螢光の増大が17サイクルで示された点を除
いて同様であった。このことは、増幅前に試料中に存在
するより多くの標的DNA配列の複写物の存在と合致し
ている。
【0103】例IV 標的特異的エチジウムブロマイドの螢光の定量的測定の
ために、例III の反応物を開き、各反応物の定量的螢光
値を得るために、内容物を分光螢光測定装置(SPEX
Fluorolog−2,Spex,Edison,
NJより購入)に移した。図2に示される結果は、該検
出方法の標的特異性を示すのみならず、本発明の定量的
側面も例示している。試料中の増大した標的の効果は、
2ngおよび60ngの男性テンプレートの間について、螢
光の時間経過を比較することにより観察できる。試料中
の標的DNAが多いほど、反応物はより速く測定可能な
螢光増大を得、最終的には螢光のプラトー水準に達す
る。事実、反応物の螢光が測定可能に増大を開始した時
点は、増幅前にどの程度標的が存在したかを示す効果的
な定量的尺度である。
ために、例III の反応物を開き、各反応物の定量的螢光
値を得るために、内容物を分光螢光測定装置(SPEX
Fluorolog−2,Spex,Edison,
NJより購入)に移した。図2に示される結果は、該検
出方法の標的特異性を示すのみならず、本発明の定量的
側面も例示している。試料中の増大した標的の効果は、
2ngおよび60ngの男性テンプレートの間について、螢
光の時間経過を比較することにより観察できる。試料中
の標的DNAが多いほど、反応物はより速く測定可能な
螢光増大を得、最終的には螢光のプラトー水準に達す
る。事実、反応物の螢光が測定可能に増大を開始した時
点は、増幅前にどの程度標的が存在したかを示す効果的
な定量的尺度である。
【0104】例 V この例は、全ヒトゲノムDNA中の単一複写物遺伝子の
検出のみならず、試料中に存在する単一複写物遺伝子の
1個のヌクレオチドのみが異なる2種類の対立遺伝子間
の識別についても該均質的アッセイが適することを示
す。(対立遺伝子特異的検出方法は、ヨーロッパ特許公
開第237,362号に詳細に記述されており、これを
ここに参考として取入れる)。
検出のみならず、試料中に存在する単一複写物遺伝子の
1個のヌクレオチドのみが異なる2種類の対立遺伝子間
の識別についても該均質的アッセイが適することを示
す。(対立遺伝子特異的検出方法は、ヨーロッパ特許公
開第237,362号に詳細に記述されており、これを
ここに参考として取入れる)。
【0105】検出すべき特定の遺伝子は、β−グロビン
遺伝子である。単一塩基対の変化は、野生型β−グロビ
ン対立遺伝子を鎌形細胞対立遺伝子に変異させる。この
例において以下のプライマを使用した:RH187(配
列番号:9)、RH188(配列番号:10)、および
RH189(配列番号:11)。プライマ対RH187
/RH188(配列番号:9/配列番号:10)は、野
生型対立遺伝子を特異的に増幅する。プライマ対RH1
87/RH189(配列番号:9/配列番号:11)
は、鎌形細胞対立遺伝子を増幅する(これらのプライマ
は、Wuらの、1989, PNAS (USA), 86 : 2757-2760に記述
されているBGP2,Hβ14AおよびHβ14Sから
誘導された)。6組のPCRを次のように設定した:1
0mMのTris−HCl,pH8.3;50mMのKCl;
748μMの全dNTP;2.9単位のTaqポリメラ
ーゼ;10pmoleの各プライマ;1.5μMのMg
Cl 2 ;1.27μMのエチジウムブロマイド、および
次のような50ngのヒトDNAテンプレート:1対の反
応物は、鎌形赤血球対立遺伝子(SS)のヒトDNA同
型接合を含む;1対の反応物は、野生型DNA(AA)
を含む;ならびに1対は異型接合、すなわち1つの野生
型および1つの鎌形赤血球対立遺伝子(AS)を含む。
遺伝子である。単一塩基対の変化は、野生型β−グロビ
ン対立遺伝子を鎌形細胞対立遺伝子に変異させる。この
例において以下のプライマを使用した:RH187(配
列番号:9)、RH188(配列番号:10)、および
RH189(配列番号:11)。プライマ対RH187
/RH188(配列番号:9/配列番号:10)は、野
生型対立遺伝子を特異的に増幅する。プライマ対RH1
87/RH189(配列番号:9/配列番号:11)
は、鎌形細胞対立遺伝子を増幅する(これらのプライマ
は、Wuらの、1989, PNAS (USA), 86 : 2757-2760に記述
されているBGP2,Hβ14AおよびHβ14Sから
誘導された)。6組のPCRを次のように設定した:1
0mMのTris−HCl,pH8.3;50mMのKCl;
748μMの全dNTP;2.9単位のTaqポリメラ
ーゼ;10pmoleの各プライマ;1.5μMのMg
Cl 2 ;1.27μMのエチジウムブロマイド、および
次のような50ngのヒトDNAテンプレート:1対の反
応物は、鎌形赤血球対立遺伝子(SS)のヒトDNA同
型接合を含む;1対の反応物は、野生型DNA(AA)
を含む;ならびに1対は異型接合、すなわち1つの野生
型および1つの鎌形赤血球対立遺伝子(AS)を含む。
【0106】各1対の反応物について、1つのチューブ
は、鎌形赤血球グロビン対立遺伝子に特異的なプライマ
を含み、また1つのチューブは、野生型配列に対するプ
ライマを含む。該プライマの組の間の差異は、プライマ
対の一方の3′ヌクレオチドのみであって、鎌形赤血球
細胞または野生型の標的配列のいずれかに合致する。P
CR中のプライマアニール温度は、この3′ヌクレオチ
ドがテンプレートに合致した場合にのみ増幅が起こるよ
うに設定された。サイクルパラメタは:94℃に60秒
間、55℃に60秒間であった。
は、鎌形赤血球グロビン対立遺伝子に特異的なプライマ
を含み、また1つのチューブは、野生型配列に対するプ
ライマを含む。該プライマの組の間の差異は、プライマ
対の一方の3′ヌクレオチドのみであって、鎌形赤血球
細胞または野生型の標的配列のいずれかに合致する。P
CR中のプライマアニール温度は、この3′ヌクレオチ
ドがテンプレートに合致した場合にのみ増幅が起こるよ
うに設定された。サイクルパラメタは:94℃に60秒
間、55℃に60秒間であった。
【0107】該反応は、3組で実施され、PCRの30
サイクル後、チューブをUV−光源上に置いて撮影し
た。写真を図3に示す。結果は、次のとおりであった:
サイクル後、チューブをUV−光源上に置いて撮影し
た。写真を図3に示す。結果は、次のとおりであった:
【0108】 鎌形赤血球β−グロビンプライマ 野生型プライマ 同型接合AA − + 異型接合AS + + 同型接合SS + −
【0109】“+”は、UV光のもとで螢光が容易に見
られることを示し、また分光螢光測定装置にて測定した
場合に、“+”チューブは“−”反応物より約3倍以上
大きい螢光を有していた。“−”を付したPCRは、増
幅反応の結果として螢光について有意に変化を起こさな
かった。
られることを示し、また分光螢光測定装置にて測定した
場合に、“+”チューブは“−”反応物より約3倍以上
大きい螢光を有していた。“−”を付したPCRは、増
幅反応の結果として螢光について有意に変化を起こさな
かった。
【0110】各反応物の分別量を、ゲル電気泳動により
分析した。各“+”反応物は、特異的な分離されたDN
A断片を示した。“−”反応物は、ゲル分析によってそ
のようなDNA断片を有さなかった。
分析した。各“+”反応物は、特異的な分離されたDN
A断片を示した。“−”反応物は、ゲル分析によってそ
のようなDNA断片を有さなかった。
【0111】例VI 検出アッセイを、約70,000個の細胞由来のDNA
の背景中の希少標的配列を検出するために本発明が好適
であることを示すために設計した。詳細な説明の節にプ
ライマ“辞退”方法として簡単に記述したように、修飾
一群プライマ法は、PCR特異性を向上するために設計
された。このアッセイは以下のように行なわれた:PC
R反応容器1−8に、50マイクロリットルの分別量
を、次の溶液から取った:それぞれ、50mMのKCl;
10mMのTris−HCl,pH8.3;2.5mMのMg
Cl2 ;600μMの全dNTP;1.25単位のTa
qDNAポリメラーゼ(PECI);1.27μMのエ
チジウムブロマイド;0.5μgのヒト細胞株DNA;
プライマ対RH171(配列番号:12)およびRH1
76(配列番号:13)、各0.2μMのプライマ;な
らびに一群プライマRH182(配列番号:14)0.
2μMを含む。1滴の鉱油を、蒸発防止のために8組の
溶液をおおうように使用した。プライマRH176(配
列番号:13)は、GC−富有、非−相同(標的配列に
対して)、5′“テイル”を保有し、これは同プライマ
を用いて作成されるPCR生成物の増幅に必要な変性温
度を上昇させる。
の背景中の希少標的配列を検出するために本発明が好適
であることを示すために設計した。詳細な説明の節にプ
ライマ“辞退”方法として簡単に記述したように、修飾
一群プライマ法は、PCR特異性を向上するために設計
された。このアッセイは以下のように行なわれた:PC
R反応容器1−8に、50マイクロリットルの分別量
を、次の溶液から取った:それぞれ、50mMのKCl;
10mMのTris−HCl,pH8.3;2.5mMのMg
Cl2 ;600μMの全dNTP;1.25単位のTa
qDNAポリメラーゼ(PECI);1.27μMのエ
チジウムブロマイド;0.5μgのヒト細胞株DNA;
プライマ対RH171(配列番号:12)およびRH1
76(配列番号:13)、各0.2μMのプライマ;な
らびに一群プライマRH182(配列番号:14)0.
2μMを含む。1滴の鉱油を、蒸発防止のために8組の
溶液をおおうように使用した。プライマRH176(配
列番号:13)は、GC−富有、非−相同(標的配列に
対して)、5′“テイル”を保有し、これは同プライマ
を用いて作成されるPCR生成物の増幅に必要な変性温
度を上昇させる。
【0112】反応物1−4は、周囲の室温の溶液を用い
て作成され、温度サイクル開始前に3種類のプライマを
含めた。反応物5−8は、温度サイクル前に72℃の温
度で平衡するまで3種のプライマの添加を保留して調製
した。このため、反応物5−8は“ホット−スタート”
が与えられると称される。反応物2−4および6−8は
標的も含み、この正の対照DNA(PECIから購入)
は、RH171(配列番号:12)、RH176(配列
番号:13)およびRH182(配列番号:14)の
3′部位が相同であるHIV配列を含む。このDNA
を、各反応物が平均して4個のHIV配列複写物を含む
ように希釈した。この複写物の平均数が小さいため、所
定反応物中の実際の複写物の個数はかなり変化し得る。
反応物1および5にはHIV DNA標的を添加してい
ないため、これらの反応物は負の対照として作用する。
て作成され、温度サイクル開始前に3種類のプライマを
含めた。反応物5−8は、温度サイクル前に72℃の温
度で平衡するまで3種のプライマの添加を保留して調製
した。このため、反応物5−8は“ホット−スタート”
が与えられると称される。反応物2−4および6−8は
標的も含み、この正の対照DNA(PECIから購入)
は、RH171(配列番号:12)、RH176(配列
番号:13)およびRH182(配列番号:14)の
3′部位が相同であるHIV配列を含む。このDNA
を、各反応物が平均して4個のHIV配列複写物を含む
ように希釈した。この複写物の平均数が小さいため、所
定反応物中の実際の複写物の個数はかなり変化し得る。
反応物1および5にはHIV DNA標的を添加してい
ないため、これらの反応物は負の対照として作用する。
【0113】8組のすべての反応物を次のようにサーモ
サイクルにかけた:96℃にて変性、1分間保持、64
℃にてアニール、1分間保持。このプロフィールを29
サイクル反復し、この間において側部プライマRH17
1(配列番号:12)およびRH176(配列番号:1
2)は充分にアニールして増幅に使用され、一方、一群
プライマRH182(配列番号:14)は64℃では充
分にアニールせず、充分に増幅に使用されない。これ
は、次いで96℃にて変性、1分間保持、52℃にてア
ニール、1分間保持に付される。このプロフィールを2
サイクル反復し、この間3種のプライマはすべて効率的
にアニールし、RH171(配列番号:12)とRH1
76(配列番号:13)、またはRH171(配列番
号:12)とRH182(配列番号:14)のいずれか
を使用して生成物が生じるように増幅において伸長され
る。第3の一群プライマの使用は、生成物特異性を増大
するため、RH171(配列番号:12)およびRH1
82(配列番号:14)を使用して作られる生成物は、
よりHIV特異的であった。これらのサイクルは、86
℃にて変性、1分間保持、52℃にてアニール、1分間
保持に引続けられた。このプロフィールを18回反復
し、この間GC−富有プライマRH176(配列番号:
13)を含むHIV特異的および非特異的である生成物
は、効率的に86℃では変性せず、従って充分に増幅せ
ず、その一方、一群プライマRH182(配列番号:1
4)およびRH171(配列番号:12)を使用して作
られた増幅HIV配列は、効率的に変性し増幅した。
サイクルにかけた:96℃にて変性、1分間保持、64
℃にてアニール、1分間保持。このプロフィールを29
サイクル反復し、この間において側部プライマRH17
1(配列番号:12)およびRH176(配列番号:1
2)は充分にアニールして増幅に使用され、一方、一群
プライマRH182(配列番号:14)は64℃では充
分にアニールせず、充分に増幅に使用されない。これ
は、次いで96℃にて変性、1分間保持、52℃にてア
ニール、1分間保持に付される。このプロフィールを2
サイクル反復し、この間3種のプライマはすべて効率的
にアニールし、RH171(配列番号:12)とRH1
76(配列番号:13)、またはRH171(配列番
号:12)とRH182(配列番号:14)のいずれか
を使用して生成物が生じるように増幅において伸長され
る。第3の一群プライマの使用は、生成物特異性を増大
するため、RH171(配列番号:12)およびRH1
82(配列番号:14)を使用して作られる生成物は、
よりHIV特異的であった。これらのサイクルは、86
℃にて変性、1分間保持、52℃にてアニール、1分間
保持に引続けられた。このプロフィールを18回反復
し、この間GC−富有プライマRH176(配列番号:
13)を含むHIV特異的および非特異的である生成物
は、効率的に86℃では変性せず、従って充分に増幅せ
ず、その一方、一群プライマRH182(配列番号:1
4)およびRH171(配列番号:12)を使用して作
られた増幅HIV配列は、効率的に変性し増幅した。
【0114】完了後、8組のすべての反応物をゲル電気
泳動により分析した。反応物2−4および5−8は、ゲ
ル上の主要なバンドとして期待される大きさ(約200
bp)の生成物を含むことが示された。反応物1および
5は、負の対照であり、このような生成物を含まなかっ
た。しかしながら、“ホットスタート”が与えられなか
った反応物2−4は、期待される大きさ以外のDNA断
片を含むものと思われた。これらの別のDNA断片も、
反応物1中に視認でき、それらがHIV配列から誘導さ
れたものではないことが示される。これらの別のDNA
断片は、反応物5−8には認められず、“ホットスター
ト”の使用が、これらの反応の特異性を向上したことが
示される。
泳動により分析した。反応物2−4および5−8は、ゲ
ル上の主要なバンドとして期待される大きさ(約200
bp)の生成物を含むことが示された。反応物1および
5は、負の対照であり、このような生成物を含まなかっ
た。しかしながら、“ホットスタート”が与えられなか
った反応物2−4は、期待される大きさ以外のDNA断
片を含むものと思われた。これらの別のDNA断片も、
反応物1中に視認でき、それらがHIV配列から誘導さ
れたものではないことが示される。これらの別のDNA
断片は、反応物5−8には認められず、“ホットスター
ト”の使用が、これらの反応の特異性を向上したことが
示される。
【0115】8組の付加的な反応を、すべてが“ホット
スタート”を与えられた以外上述と同様にして行なっ
た。正の対照DNAを、これら8つの反応物に希釈して
1−8の番号を付け、それぞれがHIV標的分子の半分
を平均して含むようにした。分子は分割できないため、
このことは、ある反応物は標的分子を含み、またあるも
のは含まないことを意味している。この実験を多数回反
復すると、標的を含む反応物の部分はかなり変化する
が、平均して約2分の1である。標的分子を含むもの
は、単一の標的分子を含む可能性が最も高い。反応の完
結時、8つのすべてをゲル電気泳動により分析した。結
果は、8つの反応物中の2つ、1および8がゲル上の主
なバンドとして期待される大きさ(約200bp)のD
NA断片を示し、プライマに対応するバンドを除いて視
認可能なゲル中に位置する別のバンドを伴わなかった。
反応物2−6は、そのようなバンドも、また何らの別の
DNA断片のバンドも示さなかった。
スタート”を与えられた以外上述と同様にして行なっ
た。正の対照DNAを、これら8つの反応物に希釈して
1−8の番号を付け、それぞれがHIV標的分子の半分
を平均して含むようにした。分子は分割できないため、
このことは、ある反応物は標的分子を含み、またあるも
のは含まないことを意味している。この実験を多数回反
復すると、標的を含む反応物の部分はかなり変化する
が、平均して約2分の1である。標的分子を含むもの
は、単一の標的分子を含む可能性が最も高い。反応の完
結時、8つのすべてをゲル電気泳動により分析した。結
果は、8つの反応物中の2つ、1および8がゲル上の主
なバンドとして期待される大きさ(約200bp)のD
NA断片を示し、プライマに対応するバンドを除いて視
認可能なゲル中に位置する別のバンドを伴わなかった。
反応物2−6は、そのようなバンドも、また何らの別の
DNA断片のバンドも示さなかった。
【0116】例VII PCR生成物の定量的検出のために、ゲノムDNAの存
在下における単一HIV標的に予期されるものに応答し
て生成される螢光の実質的増大を定量すべく分光螢光測
定装置Spex Flurolog−2(Spex,E
dison,NJ)を使用した。該分光螢光測定装置
を、製造者の仕様書に従って例VIIIに記述されるように
使用した。正の対照DNAを反応物あたり2分の1のH
IV標的分子が含まれるように、8つの反応物に希釈し
た例VIに記載のPCR反応物を、それらの螢光について
分析した。完了反応物の各々20μlを、100μlの
10mM Tris−HCl,pH8,0.1mM EDT
A,1.27μMエチジウムブロマイドに添加した。こ
れらの溶液の螢光を570nmにて測定した。図4Aは、
2つの負の試料に比べて2つの正の試料の螢光における
有意な増大をグラフ的に示す。図において、破線は、負
の試料の平均からの2標準偏差の螢光値を示す。PCR
の正試料は、共にこの線を越えている。
在下における単一HIV標的に予期されるものに応答し
て生成される螢光の実質的増大を定量すべく分光螢光測
定装置Spex Flurolog−2(Spex,E
dison,NJ)を使用した。該分光螢光測定装置
を、製造者の仕様書に従って例VIIIに記述されるように
使用した。正の対照DNAを反応物あたり2分の1のH
IV標的分子が含まれるように、8つの反応物に希釈し
た例VIに記載のPCR反応物を、それらの螢光について
分析した。完了反応物の各々20μlを、100μlの
10mM Tris−HCl,pH8,0.1mM EDT
A,1.27μMエチジウムブロマイドに添加した。こ
れらの溶液の螢光を570nmにて測定した。図4Aは、
2つの負の試料に比べて2つの正の試料の螢光における
有意な増大をグラフ的に示す。図において、破線は、負
の試料の平均からの2標準偏差の螢光値を示す。PCR
の正試料は、共にこの線を越えている。
【0117】この結果は、図4Bにも背景控除方法を用
いて示される。平均未満の二次標準偏差までの螢光値を
検出値から差引いた。背景控除は、好ましくはPCRサ
イクルの開始点で各試料について螢光測定することによ
り行なわれ、(好ましくは二重鎖ゲノムDNAの比率を
低減する最初の変性後)、そしてその値をPCRサイク
ル最終時点における試料の螢光から差引くことによって
行なわれる。
いて示される。平均未満の二次標準偏差までの螢光値を
検出値から差引いた。背景控除は、好ましくはPCRサ
イクルの開始点で各試料について螢光測定することによ
り行なわれ、(好ましくは二重鎖ゲノムDNAの比率を
低減する最初の変性後)、そしてその値をPCRサイク
ル最終時点における試料の螢光から差引くことによって
行なわれる。
【0118】例VIII 以下の実験は、PCR反応の監視および増幅による二重
鎖DNAの実質増加の検出に、本方法が適していること
を示す。装置は、PCR生成物のオンライン検出を可能
とした。
鎖DNAの実質増加の検出に、本方法が適していること
を示す。装置は、PCR生成物のオンライン検出を可能
とした。
【0119】装置を次のように設定した:付属の光ファ
イバ(Spexカタログ番号1950)を備えたSpe
x−Fluorolog−2螢光測定装置を、500nm
の励起光を〜3.4nmのバンド幅をもって放射するよう
に設定した。GG435nm遮断フィルタを、2次光除去
のために使用した(Melles Grist In
c.から購入)。該放射光を、〜13.6nmのバンド幅
をもって570nmにて検出した。OG530フィルタ
(530nm遮断)を、励起光除去のために使用した。
イバ(Spexカタログ番号1950)を備えたSpe
x−Fluorolog−2螢光測定装置を、500nm
の励起光を〜3.4nmのバンド幅をもって放射するよう
に設定した。GG435nm遮断フィルタを、2次光除去
のために使用した(Melles Grist In
c.から購入)。該放射光を、〜13.6nmのバンド幅
をもって570nmにて検出した。OG530フィルタ
(530nm遮断)を、励起光除去のために使用した。
【0120】2組のPCR反応を、プライマRH191
(配列番号:7)およびRH192(配列番号:8)を
使用して、例III に記述されるように設定した。1つの
反応チューブは、ヒト男性DNA60ngを含み、他方
は、標的DNAを含まない。該反応物を、0.5mlポリ
エチレンチューブ内に設定したが、該チューブの上端は
光ファイバ線の装着のために切断した。該光ファイバ
を、反応チューブの上端にエポキシを用いて接着した。
この装置は、1本の光ファイバを有するため、1回に1
つのPCRのみ操作される。輻射光は、チューブ内の油
おおいを通して集めた。チューブの周囲に黒色の覆いを
作り、該反応物をサーモサイクラ内に設置した。該サー
モサイクラは、94℃および50℃にてそれぞれ1分間
のサイクルで30サイクル行ない、引続いて25℃にて
連続的インキュベーションするようにプログラムされ
た。螢光測定装置とサーモサイクラとを同時に始動し
た。螢光測定装置のパラメタは、時間に基づき5秒の積
分時間で走査;輻射信号を、光源の変化について調製す
るために励起光信号との比をとる。
(配列番号:7)およびRH192(配列番号:8)を
使用して、例III に記述されるように設定した。1つの
反応チューブは、ヒト男性DNA60ngを含み、他方
は、標的DNAを含まない。該反応物を、0.5mlポリ
エチレンチューブ内に設定したが、該チューブの上端は
光ファイバ線の装着のために切断した。該光ファイバ
を、反応チューブの上端にエポキシを用いて接着した。
この装置は、1本の光ファイバを有するため、1回に1
つのPCRのみ操作される。輻射光は、チューブ内の油
おおいを通して集めた。チューブの周囲に黒色の覆いを
作り、該反応物をサーモサイクラ内に設置した。該サー
モサイクラは、94℃および50℃にてそれぞれ1分間
のサイクルで30サイクル行ない、引続いて25℃にて
連続的インキュベーションするようにプログラムされ
た。螢光測定装置とサーモサイクラとを同時に始動し
た。螢光測定装置のパラメタは、時間に基づき5秒の積
分時間で走査;輻射信号を、光源の変化について調製す
るために励起光信号との比をとる。
【0121】図5は、DNAを含まないPCR反応の結
果を示す。図5Aは、サーモサイクラが25℃から始動
し、螢光が温度が94℃まで上昇するに従って低下し、
温度が50℃に低下した場合に再度螢光が上昇すること
を示している。このパターンは、サーモサイクラが再び
25℃に達するまで残るサイクルについて繰返され、螢
光は、出発時の値にほぼ戻った。
果を示す。図5Aは、サーモサイクラが25℃から始動
し、螢光が温度が94℃まで上昇するに従って低下し、
温度が50℃に低下した場合に再度螢光が上昇すること
を示している。このパターンは、サーモサイクラが再び
25℃に達するまで残るサイクルについて繰返され、螢
光は、出発時の値にほぼ戻った。
【0122】図6は、適切な標的DNAを含むPCR反
応の螢光プロフィールを示す。50℃における螢光強度
は、二重鎖DNA量の増加を反映してサイクル依存的な
増大を示している。30サイクル完了後、サーモサイク
ラが25℃に戻った際に、螢光は、最終値が25℃にお
ける初期値の3倍以上に増大した。
応の螢光プロフィールを示す。50℃における螢光強度
は、二重鎖DNA量の増加を反映してサイクル依存的な
増大を示している。30サイクル完了後、サーモサイク
ラが25℃に戻った際に、螢光は、最終値が25℃にお
ける初期値の3倍以上に増大した。
【0123】増幅に続いて、各反応混合物の分別量を、
アガロースゲル電気泳動により分析した。該ゲル分析
は、負の対照由来の試料を含むレーン中に目視可能なP
CR生成物を示さなかった。正の対照PCR由来の電気
泳動試料は、〜150塩基対において明確かつ固有のバ
ンドを示した。PCR生成物の予想される大きさは15
4bpであった。
アガロースゲル電気泳動により分析した。該ゲル分析
は、負の対照由来の試料を含むレーン中に目視可能なP
CR生成物を示さなかった。正の対照PCR由来の電気
泳動試料は、〜150塩基対において明確かつ固有のバ
ンドを示した。PCR生成物の予想される大きさは15
4bpであった。
【0124】かくしてオンライン法は、プローブまたは
更なる操作を必要とせずに標的DNAの存在または不在
について迅速な分析を提供した。加えて、増幅を通して
の螢光の連続的検出は、出発時に存在する標的量を反映
する増幅プロフィールを与えた。標的DNAが、例えば
細胞あたりに数百万の複写物をもって存在するヒトの反
復配列(例えば、“Alu”配列;NelsonおよびCaskey
のPCR Technology,Erlich編、1
989, Stockton Press,NY)である
場合、この定量方法は、現在放射同位体を使用せずには
困難である準細胞的量のDNAの迅速かつ簡便な測定に
使用できる。
更なる操作を必要とせずに標的DNAの存在または不在
について迅速な分析を提供した。加えて、増幅を通して
の螢光の連続的検出は、出発時に存在する標的量を反映
する増幅プロフィールを与えた。標的DNAが、例えば
細胞あたりに数百万の複写物をもって存在するヒトの反
復配列(例えば、“Alu”配列;NelsonおよびCaskey
のPCR Technology,Erlich編、1
989, Stockton Press,NY)である
場合、この定量方法は、現在放射同位体を使用せずには
困難である準細胞的量のDNAの迅速かつ簡便な測定に
使用できる。
【0125】
【表1】
【図1】図1は、エチジウムブロマイドの存在下におい
て特定標的DNAの増幅によるPCR混合物の螢光写真
を示す図である。
て特定標的DNAの増幅によるPCR混合物の螢光写真
を示す図である。
【図2】図2は、本発明の検出方法の標的特異性を示す
グラフである。
グラフである。
【図3】図3は、本発明を遺伝子スクリーニングに適用
した螢光写真を示す図である。
した螢光写真を示す図である。
【図4】図4は、例VII に記述される定量的均質アッセ
イの結果を示すグラフである。
イの結果を示すグラフである。
【図5】図5は、負の対照試料のPCRにおける螢光強
度のオンライン測定を示すグラフである。
度のオンライン測定を示すグラフである。
【図6】図6は、正の対照試料のPCRにおける螢光強
度のオンライン測定を示すグラフである。
度のオンライン測定を示すグラフである。
Claims (7)
- 【請求項1】 1又は複数の核酸増幅反応体積を収容す
るための支持体を有する熱循環器、及び前記支持体に収
容される前記1又は複数の核酸増幅反応体積に光学的に
連係される光学系を有する、核酸増幅反応モニター装
置。 - 【請求項2】 前記光学系が螢光計を含む、請求項1に
記載の装置。 - 【請求項3】 前記光学系が、該光学系と前記支持体に
収容された1又は複数の核酸増幅反応体積とを光学的に
連係させるための1又は複数の光ファイバーリードを含
む、請求項1又は2に記載の装置。 - 【請求項4】 前記1又は複数の光ファイバーリード
が、前記支持体に収容された1又は複数の核酸増幅反応
体積に物理的に接触しない、請求項3に記載の装置。 - 【請求項5】 前記支持体に収容された1又は複数の核
酸増幅反応体積を収容するための1又は複数の反応容器
をさらに有する請求項1〜4のいずれか1項に記載の装
置。 - 【請求項6】 前記1又は複数の反応容器が、透明な又
は半透明なキャップを有する、請求項5に記載の装置。 - 【請求項7】 前記光学系が、該光学系と前記1又は複
数の反応容器の透明な又は半透明なキャップとを光学的
に連係させるのに有効な1又は複数の光ファイバーリー
ドを含む、請求項6に記載の装置。
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