ES2605016T3 - PCR asimétrica junto con caracterización post-PCR para la identificación de ácidos nucleicos - Google Patents

PCR asimétrica junto con caracterización post-PCR para la identificación de ácidos nucleicos Download PDF

Info

Publication number
ES2605016T3
ES2605016T3 ES06013329.5T ES06013329T ES2605016T3 ES 2605016 T3 ES2605016 T3 ES 2605016T3 ES 06013329 T ES06013329 T ES 06013329T ES 2605016 T3 ES2605016 T3 ES 2605016T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
probe
nucleic acid
probes
hybridization
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES06013329.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Nicolas Newton
Stephen Gordon Will
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2605016T3 publication Critical patent/ES2605016T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Un método para clasificar, identificar, cuantificar y/o genotipificar una o más dianas de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo el método: a) realizar una PCR cinética asimétrica en una mezcla de reacción que contiene una o más sondas 5'- nucleasa marcadas y una o más sondas de hibridación marcadas en la que dichas una o más sondas 5'- nucleasa y dichas una o más sondas de hibridación pueden ser la(s) misma(s) sonda(s) o diferentes sondas en secuencia; b) hacer un seguimiento de las señales fluorescentes generadas a partir de la una o más sondas 5'-nucleasa marcadas para crear una o más curvas de crecimiento a partir de la PCR cinética para calcular un valor Ct (umbral de ciclo) y de ese modo determinar el número de copia, el genotipo o la identidad de diana; c) modificar la temperatura de la mezcla de reacción después de la PCR cinética para causar un cambio en la asociación entre la una o más sondas de hibridación marcadas y la una o más dianas de ácido nucleico; d) hacer un seguimiento de una o más señales fluorescentes generadas a partir de la una o más sondas de hibridación marcadas unidas a la cadena en exceso generada en la PCR cinética asimétrica produciendo de ese modo una curva de fusión o curva de hibridación; e) correlacionar la curva de fusión o la curva de hibridación de la etapa d) con una curva de fusión o hibridación de una sonda completamente complementaria de una o más dianas de ácido nucleico conocidas, por tanto, identificar la una o más dianas de ácido nucleico en la muestra, en el que la PCR cinética asimétrica comprende un primer cebador y al menos un segundo cebador, en el que la cantidad del primer cebador es mayor que la cantidad del segundo cebador y en el que la sonda de hibridación está presente en mayor cantidad que el segundo cebador.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
15
25
35
45
55
65
Un “sujeto” se refiere a un organismo. Generalmente, el organismo es un mamífero, particularmente un humano. En ciertas realizaciones, por ejemplo, un sujeto es un paciente sospechoso de tener un trastorno genético, enfermedad u otra afección.
Debido a que los mononucleótidos se pueden disponer para crear oligonucleótidos de una manera tal que el 5’fosfato de un anillo de pentosa de mononucleótido está acoplado al oxígeno 3’ de su vecino en una dirección vía un enlace fosfodiéster, un extremo de un oligonucleótido se refiere como “extremo 5’ si su fosfato 5’ no está unido al oxígeno 3’ de un anillo de pentosa de mononucleótido y un extremo se refiere como “extremo 3’” si su oxígeno 3’ no está unido a un fosfato 5’ de un anillo de pentosa de mononucleótido posterior. Tal como se usa en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico, incluso si es interna a un oligonucleótido mayor, también se puede decir que tienen extremos 5’ y 3’.
Un “ácido nucleico cebador” o “cebador” es un ácido nucleico que puede hibridar con un ácido nucleico diana o plantilla y permitir la elongación o alargamiento de cadena usando, por ejemplo, un biocatalizador que incorpora nucleótido, tal como una polimerasa bajo condiciones apropiadas de reacción. Tales condiciones generalmente incluyen la presencia de uno o más desoxirribonucleósido trifosfatos y el biocatalizador que incorpora nucleótido, en un tampón adecuado (“tampón” incluye sustituyentes que son cofactores, o que afectan al pH, fuerza iónica, etc.), y en a una temperatura adecuada. Un ácido nucleico cebador es generalmente un oligonucleótido natural o sintético (por ejemplo, un oligodesoxirribonucleótido de cadena sencilla, etc.). Aunque se utilizan opcionalmente otras longitudes de ácido nucleico cebador, generalmente comprenden regiones de hibridación que oscilan entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos cebadores cortos generalmente utilizan temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con ácidos nucleicos plantillas. Un ácido nucleico cebador que es al menos parcialmente complementario a uno posterior de un ácido nucleico plantilla es generalmente suficiente para hibridar con la plantilla para que se dé la elongación. El diseño de cebadores adecuados para, por ejemplo, la amplificación de una secuencia diana dada se conoce bien en la técnica y se describe en la bibliografía citada en el presente documento. Un ácido nucleico cebador se puede marcar, si se desea, incorporando un marcador detectable por, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, fotoquímicas, bioquímicas, inmunoquímicas, químicas u otras. Para ilustrar, marcadores útiles incluyen radioisótopos, tintes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (como las frecuentemente usadas en ELISA), biotina, o haptenos y proteínas para las que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Muchos de estos y otros marcadores están más descritos en el presente documento y/o de lo contrario se conocen en la técnica. Un experto en la técnica reconocerá que, en ciertas realizaciones, se pueden usar también ácidos nucleicos cebadores como ácidos nucleicos sondas. Véase, más adelante.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sonda” se refiere a un oligonucleótido (u otra secuencia de ácidos nucleicos) que puede formar una estructura dúplex con una región de un ácido nucleico diana (o amplicón derivado de dicho ácido nucleico diana), debido a la complementariedad parcial o completa de al menos una secuencia en la sonda a una secuencia en el ácido nucleico diana bajo condiciones adecuadas. La sonda, en ciertas realizaciones, no contiene una secuencia complementaria a secuencia(s) de un cebador en una reacción de la 5’nucleasa. Tal como se discute en el presente documento, la sonda puede estar marcada o no marcada. El terminal 3’ de la sonda opcionalmente se puede “bloquear” para prohibir la incorporación de la sonda en un producto de elongación de cebador. El “bloqueo” se puede alcanzar usando bases no complementarias o añadiendo un resto químico tal como biotina o un grupo fosfato al 3’-hidroxilo del último nucleótido, que puede, dependiendo del resto seleccionado, servir a un fin doble actuando también como un marcador para la posterior detección o captura del ácido nucleico acoplado al marcador. El bloqueo también se puede alcanzar eliminando el 3’-OH o usando un nucleótido que carezca de un 3’-OH tal como didesoxinucleótido, o añadiendo un grupo voluminoso que bloquee la elongación por obstáculo estérico.
El término “región de hibridación” se refiere a esa región de un ácido nucleico que es exactamente o básicamente complementaria a y, por lo tanto, hibrida con, la secuencia diana. Para su uso en un ensayo de hibridación, por ejemplo, para la discriminación de las diferencias de nucleótido sencillo en secuencia, la región de hibridación generalmente es de aproximadamente 8 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Aunque la región de hibridación generalmente se refiere al oligonucleótido entero, la sonda puede incluir secuencias de nucleótidos adicionales que funcionan, por ejemplo, como conector que se une a sitios para proporcionar un sitio para acoplar la secuencia sonda a un soporte sólido o similares. Las sondas en el presente documento pueden comprender sondas “5’-nucleasa” (comprendiendo generalmente un marcador(es) fluorescente(s) y generalmente también un desactivador (quencher)) una sonda de FRET, o una baliza molecular, o similares, que también se pueden utilizar para detectar la hibridación entre la sonda y los ácidos nucleicos diana en una muestra. En algunas realizaciones, la región de hibridación de la sonda es completamente complementaria a la secuencia diana. Sin embargo, en general, no es necesaria la completa complementariedad (es decir, los ácidos nucleicos pueden ser parcialmente complementarios uno a otro); los dúplex estables pueden contener bases mal emparejadas o bases no emparejadas. La modificación de las condiciones estrictas puede ser necesaria para permitir un dúplex de hibridación estable con uno o más mal emparejamientos de bases o bases no emparejadas. Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3º Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), proporciona la guía para la modificación adecuada. La estabilidad del dúplex diana/sonda depende de un número de variables que incluyen la longitud del oligonucleótido, composición de base y secuencia del
15
25
35
45
55
65
oligonucleótido, temperatura y condiciones iónicas. Un experto en la técnica reconocerá que, en general, el complemento exacto de una sonda dada es igualmente útil como sonda. Un experto en la técnica reconocerá también que, en ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos sondas también se pueden usar como ácidos nucleicos cebadores.
Una “sonda 5’-nucleasa” se refiere a un oligonucleótido que comprende al menos un resto de marcación emisor de luz y que se usa en una reacción de la 5’-nucleasa para efectuar la detección del ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, por ejemplo, una sonda 5’-nucleasa incluye solamente un único resto emisor de luz (por ejemplo, un tinte fluorescente, etc.). En ciertas realizaciones, las sondas 5’-nucleasa incluyen regiones de autocomplementariedad de modo que las sondas son capaces de formar estructuras en horquilla bajo condiciones seleccionadas. Para ilustrar más, en algunas realizaciones una sonda 5’-nucleasa comprende al menos dos restos de marcación y emite radiación de intensidad aumentada después de que uno de los dos marcadores se escinda o de lo contrario se separe del oligonucleótido. En ciertas realizaciones, una sonda 5’-nucleasa está marcada con dos tintes fluorescentes diferentes, por ejemplo, un tinte indicador terminal 5’ y el tinte o resto desactivador terminal 3’. En algunas realizaciones, las sondas 5’-nucleasa están marcadas en una o más posiciones aparte de, o además de, las posiciones terminales. Cuando la sonda está intacta, generalmente se da transferencia de energía entre los dos fluoróforos de modo que la emisión fluorescente del tinte indicador se apaga al menos en parte. Durante una etapa de elongación de una reacción en cadena de la polimerasa, por ejemplo, una sonda 5’-nucleasa unida a un ácido nucleico plantilla se escinde por la actividad 5’ a 3’-nucleasa de, por ejemplo, una Taq polimerasa u otra polimerasa que tiene esta actividad de modo que la emisión fluorescente del tinte indicador no se apaga más. Las sondas 5’nucleasa como ejemplo también están descritas en, por ejemplo, la Patente U.S. Nº 5.210.015, titulada "Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase," expedida el 11 de mayo de 1993 a Gelfand y col., la Patente U.S. Nº. 5.994.056, titulada "Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection," expedida el 30 de noviembre de1999 a Higuchi, y la Patente U.S. Nº. 6.171.785, titulada "Methods and devices for homogeneous nucleic acid amplification and detector," expedida el 9 de enero de 2001 a Higuchi. En otras realizaciones, una sonda 5’-nucleasa puede estar marcada con dos o más tintes indicadores diferentes y un tinte o resto desactivador de terminal 3’.
Una “sonda de hibridación” en el presente documento se refiere a una sonda marcada usada en la determinación de Tm. En ciertas realizaciones, la sonda 5’-nucleasa y la sonda de hibridación son la misma. En otras realizaciones, la sonda 5’-nucleasa y la sonda de hibridación son sondas separadas y cada una opcionalmente puede comprender diferentes marcadores y/o activadores y cada una opcionalmente puede hibridar con áreas diferentes del ácido nucleico diana. Las sondas de hibridación en el presente documento opcionalmente son sondas marcadas duales o apagadas, en las que los desactivadores pueden o no ser fluorescentes. En las sondas, la transferencia de energía se da entre el resto indicador y el desactivador. Tales sondas pueden incluir, por ejemplo, desactivadores oscuros o similares. En algunos aspectos, la sonda de hibridación se usa como una sonda de genotipificación, donde la sonda se usa para asignar una diana de hibridación a un genotipo particular, por ejemplo, un genotipo vírico.
Un “marcador” se refiere a un resto acoplado (covalentemente o no covalentemente), o capaz de estar acoplado, a una molécula, dicho resto proporciona o es capaz de proporcionar información sobre la molécula (por ejemplo, información descriptiva o de identificación sobre la molécula) u otra molécula con la que la molécula marcada interactúa (por ejemplo, hibrida). Marcadores como ejemplos incluyen marcadores fluorescentes (incluyendo, por ejemplo, desactivadores o absorbentes), marcadores no fluorescentes, marcadores colorimétricos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores radioactivos, grupos modificadores de masa, anticuerpos, antígenos, biotina, haptenos, enzimas (incluyendo, por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa) y similares. Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radioactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática y similares. Los marcadores se pueden usar para proporcionar una señal detectable (y opcionalmente cuantificable), y que se puede acoplar a un ácido nucleico
o proteína.
En ciertas realizaciones de la invención, un marcador es un tinte fluorescente o fluoróforo. Generalmente, un fluoróforo particular puede emitir luz de una longitud de onda particular seguido de absorbancia de luz de longitud de onda más corta. La longitud de onda de la luz emitida por un fluoróforo particular es característica de ese fluoróforo. Por tanto, un fluoróforo particular se puede detectar por luz de detección de una apropiada longitud de onda seguido de excitación del fluoróforo con luz de longitud de onda más corta. Los marcadores fluorescentes pueden incluir tintes que están negativamente cargados, tales como tintes de la familia de la fluoresceína, o tintes que son neutros en carga, tales como tintes de la familia de la carboxirodamina, o tintes que están cargados positivamente, tales como tintes de la familia de la cianina o la familia de la rodamina. Otras familias de tintes que se pueden usar en la invención incluyen, por ejemplo, tintes de la familia de la polihalofluoresceina, tintes de la familia de la hexaclorofluoresceina, tintes de la familia de la cumarina, tintes de la familia de la oxazina, tintes de la familia de la tiazina, tintes de la familia de la escuaraina, tintes de la familia de la lantánida quelada, tintes Alexa Fluor®, y tintes de la familia de Bodipy®. Tintes de la familia de la fluoresceína incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Tintes de la familia de la carboxirodamina incluyen Rojo Texas, ROX, R110, R6G y TAMRA. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G y TAMRA están comercializados por Perkin-Elmer (Foster City, CA), mientras que el Rojo Texas está comercializado por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Tintes de la familia de la cianina
imagen6
15
25
35
45
55
65
De nuevo, por su puesto, son posibles muchas variaciones opcionales dentro del esquema básico de la 5’-nucleasa. Por ejemplo, se pueden usar diversas permutaciones y aplicaciones de los ensayos 5’-nucleasa para, por ejemplo, determinar el número de copia, genotipo, composición alélica, etc. Ejemplos adicionales de tales variaciones se pueden encontrar en, por ejemplo, la Patente U.S. Nº 5.210.015 titulada “Homogeneous Assay System Using the Nuclease Activity of a Nucleic Acid Polymerase” a Gelfand, y col. expedida el 11 de mayo de 1993; la Patente U.S. Nº 5.487.972 titulada “Nucleic Acid Detection by the 5’-3’ Exonuclease Activity of Polymerases Acting on Adjacently Hybridized Oligonucleotides”, a Gelfand y col., expedida el 30 de enero, 1996; la Patente U.S. Nº 5.804.375 titulada "Reaction Mixtures for Detection of Target Nucleic Acids," a Gelfand y col. expedida el 8 de septiembre de 1998; y la Patente U.S. Nº 6.214-979 titulada "Homogeneous Assay System," a Gelfand y col., expedida el 10 de abril de 2001.
Una medida de los datos del ensayo 5’-nucleasa (por ejemplo, TaqMan®) generalmente se expresa como el ciclo umbral (Ct). Los niveles de fluorescencia se registran durante cada ciclo de PCR y son proporcionales a la cantidad de producto amplificado para ese punto en la reacción de amplificación. El ciclo de PCR cuando la señal de fluorescencia se registra primero como estadísticamente significativa, o donde la señal de fluorescencia está por encima de otro nivel arbitrario (por ejemplo, nivel de fluorescencia arbitrario, o AFL), es el ciclo umbral (Ct).
En la práctica, un valor Ct es el punto de cruce entre la curva cinética y un umbral arbitrario de fluorescencia. El valor Ct es inversamente proporcional al logaritmo del número inicial de las copias de plantilla. Los valores Ct son inversamente proporcionales al logaritmo de la concentración de plantilla de ácido nucleico inicial y, por tanto, se puede usar para calcular el número de copia de diana.
Un “ácido nucleico diana” se refiere a un ácido nucleico que se amplifica y/o identifica por la presente invención (por ejemplo, un amplicón). Generalmente, un ácido nucleico diana, o “diana”, es uno al que se une una sonda y/o cebador(es) (por ejemplo, una diana opcionalmente comprende una o más secuencias de complementariedad completa a un cebador y/o sonda o comprende una secuencia(s) con suficiente complementariedad a uno o más cebadores y/o sondas para que tal cebador y/o sonda se una a la diana bajo condiciones de ambiente o reacción apropiadas). Generalmente, la identidad, genotipo, secuencia, etc., de la diana es para ser identificados por los métodos de la presente invención. Un “cebador diana” y una “sonda diana” se refiere a un cebador y sonda, respectivamente, que pueden hibridar con el ácido nucleico diana.
Un “polimorfismo” se refiere a un sitio o sitios de un ácido nucleico que puede comprender uno de una pluralidad de genotipos. El polimorfismo puede ser cualquier polimorfismo conocido por los expertos en la técnica incluyendo posibles mutaciones, inserciones o deleciones. El polimorfismo puede estar en un sitio dentro del ácido nucleico o en múltiples sitios dentro del ácido nucleico, y puede abarcar una nucleobase, tal como un SNP, o más de una nucleobase. Para los fines de la presente invención un “polimorfismo” puede referirse a un polimorfismo que está en un sitio de un ácido nucleico o a un sitio particular de un polimorfismo de sitio múltiple. En ciertas realizaciones, el polimorfismo no necesita ser bien conocido o ni siquiera conocido por los expertos en la técnica. El polimorfismo puede ser simplemente cualquier diferencia en la secuencia de ácidos nucleicos entre un ácido nucleico conocido (por ejemplo, un control) y un ácido nucleico diana.
Para determinar “porcentaje de complementariedad” o “porcentaje de identidad” de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la secuencia de una primera secuencia de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo con una segunda secuencia de ácido nucleico). A continuación, se comparan los nucleótidos en las correspondientes posiciones de nucleótido. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por un nucleótido complementario a la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son complementarias en esa posición. Así mismo, cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de complementariedad (o porcentaje de identidad) entre las dos secuencias es una función del número de posiciones complementarias (o posiciones idénticas) compartidas por las secuencias dividida por el número total de posiciones comparadas (es decir, porcentaje de complementariedad = número de posiciones superpuestas complementarias/total de número de posiciones del nucleótido más corto x 100; y porcentaje de identidad = número de posiciones superpuestas idénticas/número total de posiciones del nucleótido más corto x 100).
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias también se puede conseguir usando un algoritmo matemático. Una muestra preferida de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2.264-2.268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:5.873-5.877. Tal algoritmo se incorpora en el programa NBLAST de Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol. 215:403.
Tal como se usa en el presente documento, el término “Tm” se usa en referencia a la “temperatura de fusión”. La temperatura de fusión es la temperatura a la cual la mitad de una población de los polinucleótidos de doble cadena u oligómeros de nucleobase (por ejemplo, complejos de hibridación), en homodúplex o heterodúplex (es decir, dúplex que son completamente o parcialmente complementarios), llega a estar disociada en cadenas sencillas (bajo fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos). La predicción de una Tm de un polinucleótido dúplex tiene en cuenta la secuencia base, así como otros factores incluyendo las características estructurales y de secuencia y la
15
25
35
45
55
65
naturaleza de los enlaces oligoméricos. Los métodos para predecir y determinar experimentalmente la Tm son bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, una Tm tradicionalmente se determina por una curva de fusión, en la que una molécula de ácido nucleico dúplex se calienta en un programa de temperatura controlada, y se hace un seguimiento del estado de asociación/disociación de las dos cadenas sencillas en el dúplex y se traza hasta llegar a una temperatura en la que las dos cadenas están completamente disociadas. La Tm se lee a partir de esta curva de fusión. Alternativamente, una Tm se puede determinar por una curva de hibridación, en la que una molécula de ácido nucleico dúplex se calienta a una temperatura en la que las dos cadenas se disocian completamente. A continuación, se baja la temperatura en un programa de temperatura controlada, y se hace un seguimiento del estado de asociación/disociación de las dos cadenas sencillas en el dúplex y se traza hasta alcanzar una temperatura en la que las dos cadenas están completamente anilladas. La Tm se lee a partir de la curva de hibridación.
Los términos “estricto” o “condiciones estrictas”, como se usa en el presente documento, indican las condiciones de hibridación de baja fuerza iónica y alta temperatura, como es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001, “Molecular Closing: A Laboratory Manual”, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel y col., ed., J. Wiley & Sons Inc., Nueva York, 1988); Tijssen, 1993, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays in Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology: Hybridization with nucleic acid probes” (Elsevier). Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para ser aproximadamente 5 a 30 ºC inferiores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia especificada a una fuerza iónica y pH definidos. Alternativamente, las condiciones estrictas se seleccionan para ser aproximadamente 5 a 15 ºC inferiores que la Tm para la secuencia especificada a una fuerza iónica y pH definidos. Por ejemplo, las condiciones de hibridación estrictas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor que la concentración de ion de sodio (u otras sales) aproximadamente 1,0 M, generalmente ion de sodio aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 M a aproximadamente pH 7,0 a aproximadamente pH 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 25 ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 55 ºC para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos). Las condiciones estrictas también se pueden modificar con la adición de agentes desestabilizadores de hibridación tales como formamida. Una condición no estricta o de baja astringencia como ejemplo para una sonda larga (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) comprendería un tampón de Tris 20 mM, pH 8,5, KCl 50 mM y MgCl2 2 mM, y una temperatura de reacción de 25 ºC.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “tipo virus de la hepatitis C” se refiere a la categorización de un virus de la hepatitis C (VHC) basado en su organización genómica. La categorización de un aislado de VHC en una categoría de tipo particular refleja su parentesco genómico a otros aislados de VHC y su parentesco relativamente menor con otros aislados de VHC. Tal como se usa en el presente documento, la nomenclatura de tipificación de VHC es coherente con la nomenclatura ampliamente adoptada propuesta por Simmonds y col., (1994) Letter, Hepatology 19:1.321-1.324. Véase, también, Zein (2000) “Clinical Significance of Heptatitis C Virus Genotypes”, Clinical Microbiol. Reviews 13(2):223-235; Maertens y Stuyver (1997) "Genotypes and Genetic Variation of Hepatitis C Virus," p. 182-233, en Harrison, y Zuckerman (eds.), “The Molecular Medicine of Viral Hepatitis”, John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, Inglaterra.). El sistema de Simmonds y col (1994) coloca los aislados de VHC conocidos en uno de los once (11) genotipos de VHC, concretamente genotipos 1 a 11. Cada genotipo se subdivide más en agrupamientos denominados subtipos que reflejan el parentesco entre las cepas del mismo genotipo. Un subtipo de VHC está escrito por una letra romana minúscula después del genotipo, por ejemplo, subtipo 1a, subtipo 1c, subtipo 6a, etc. Las variantes genéticas encontradas dentro de un aislado individual se denominan cuasiespecies. Aproximadamente 78 subtipos de VHC que abarcan todos los 11 genotipos son mundialmente conocidos; el número de subtipos no es estático; ya que se estudian y se secuencian más aislados de VHC, es probable que se puedan reconocer subtipos adicionales (y posiblemente genotipos).
Tal como se usa en el presente documento, el término “tipo virus de VHC” se puede referir o bien a genotipos de VHC o subtipos de VHC. Tal como se usa en el presente documento, el término “tipificación de VHC” significa asignar el VHC experimental (por ejemplo, tipo desconocido) a un genotipo conocido (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 o un subconjunto de los mismos) o asignar el HVC experimental a un subtipo conocido (por ejemplo, 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, etc., o un subconjunto del mismo).
Algunos informes (véase, por ejemplo, Robertson y col., (1998) Arch. Virol. 143(12):2.493-2.503) sugieren que la organización genómica vírica está mejor representada por la creación de clados víricos, que refleja la observación de que algunos genotipos de VHC están más estrechamente relacionados uno a otro que con otros genotipos de VHC. En este sistema, los clados 1, 2, 4 y 5 corresponden a los genotipos 1, 2, 4 y 5, mientras que el clado 3 comprende los genotipos 3 y 10, y el clado 6 comprende los genotipos 6, 7, 8, 9 y 11. La descripción de la presente invención no usa la nomenclatura de clado.
Tal como se usa en el presente documento, el término “kit” se usa en referencia a una combinación de artículos que facilitan un proceso, método, ensayo, análisis o manipulación de una muestra. Los kits pueden contener instrucciones escritas que describen cómo usar el kit (por ejemplo, instrucciones que describen los métodos para la genotipificación de VHC), los reactivos químicos o enzimas requeridas para el método, cebadores y sondas, así
15
25
35
45
55
65
como algún otro componente. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona kits para la tipificación de VHC empleando RT-PCR. Estos kits pueden incluir, por ejemplo, reactivos para la recogida de muestra (por ejemplo, la recogida de una muestra sanguínea), reactivos para la recogida y purificación de ARN de sangre, una transcriptasa inversa, cebadores adecuados para la transcripción inversa y la síntesis de ADNc de primera cadena y segunda cadena para producir un amplicón de VHC, una ADN polimerasa dependiente de ADN termoestable y desoxirribonucleótido trifosfatos libres. En algunas realizaciones, la enzima que comprende actividad de transcriptasa inversa y actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN termoestable son la misma enzima, por ejemplo, polimerasa Z05 de Thermus sp. o polimerasa de Thermus thermophilus.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de la biología molecular, técnicas de microbiología y de ADN recombinante, que están dentro de la especialidad de la técnica. Tales técnicas están completamente explicadas en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 2001, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B. D. Hames &
S. J. Higgins, eds., 1984); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (B. Perbal, 1984); y una serie, “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.), etc. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con miles de referencias similares.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 proporciona un diagrama que ilustra la colocación de los cebadores y la sonda sobre las cadenas de ácido nucleico durante la PCR asimétrica.
La Figura 2 proporciona un gel de agarosa teñido que compara la amplificación de ácido nucleico en PCR asimétrica frente a PCR simétrica, usando diferentes proporciones de cebador con 2x105 copias de ADN de citomegalovirus (CMV) como ácido nucleico diana.
La Figura 3 proporciona curvas de crecimiento generadas durante una kPCR asimétrica.
La Figura 4 proporciona la primera derivada de las curvas de fusión usando diferentes relaciones de cebador en una kPCR asimétrica.
La Figura 5 proporciona un alineamiento de una región variable a partir de seis genotipos de VHC diferentes y una correspondiente sonda de hibridación como ejemplo.
La Figura 6 proporciona datos de la curva de crecimiento generados en kPCR asimétricas de seis genotipos diferentes de VHC, usando una sonda marcada con HEX dirigida a una región conservada del genoma de VHC.
La Figura 7 proporciona datos de la curva de crecimiento en kPCR asimétricas de seis genotipos diferentes de VHC, usando una sonda marcada con FAM dirigida a una región variable del genoma de VHC.
La Figura 8 proporciona la segunda gráfica de derivada de las curvas de hibridación generadas en kPCR asimétricas de seis genotipos diferentes de VHC usando una sonda dirigida a una región variable del genoma de VHC.
Descripción detallada
La presente invención comprende métodos, composiciones, kits, sistemas y mezclas de reacción útiles para la detección, clasificación y cuantificación de secuencias particulares de ácidos nucleicos dentro de las muestras (por ejemplo, dentro de muestras clínicas tales como sangre o esputo o dentro de muestras de ADN o ARN aisladas, etc.). La presente invención se puede usar para, por ejemplo, clasificar, identificar, cuantificar y/o genotipificar ácidos nucleicos a partir de diversas cepas de bacterias, virus, hongos, etc., especialmente aquellas implicadas en infecciones y enfermedades (por ejemplo, de humanos, ganado, plantas, etc.).
Los métodos de la invención utilizan amplificación por reacción en cadena de la polimerasa, en tiempo real, o cinética, de las secuencias de ácidos nucleicos diana realizada de una manera asimétrica en presencia de una sonda de oligonucleótido marcada (una sonda 5’-nucleasa). Los resultados de la PCR cinética asimétrica en una mezcla de productos de amplificación de cadena sencilla y cadena doble que tiene un exceso de una cadena sobre la otra. Cuando se completa la PCR cinética, se crean las curvas de fusión/hibridación usando una o más sondas de hibridación. Estas curvas de fusión/hibridación se usan para generar una Tm para la sonda de hibridación, la cual se puede usar para identificar el ácido nucleico diana en la muestra. En algunas realizaciones, la sonda de hibridación está presente en la PCR cinética; en otras realizaciones, la sonda de hibridación se añade después de la finalización de la reacción de amplificación. En ciertas realizaciones las sondas 5’-nucleasa y las sondas de hibridación (por ejemplo, sondas que se usan en la construcción de las curvas térmicas), comprenden diferentes sondas (por ejemplo, diferentes en secuencia y/o en sitio de unión, etc.) mientras que en ciertas otras realizaciones, las sondas 5’-nucleasa también pueden actuar como sondas de hibridación.
imagen7
imagen8
15
25
35
45
55
65
En ciertas realizaciones de la invención, el ácido nucleico diana se puede amplificar por un número de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos están descritos, por ejemplo, en Saiki y col., 1988, Science 239:487-91. En ciertas realizaciones, las técnicas de amplificación ventajosamente se pueden emplear para introducir o alterar secuencias de nucleótidos en un ácido nucleico diana. Por ejemplo, si un polimorfismo a identificar o genotipificar está en o cerca de un extremo del ácido nucleico diana, se pueden añadir secuencias de nucleótidos adicionales al extremo del ácido nucleico diana para facilitar los métodos de la presente invención.
Sondas de oligonucleótido
La presente invención implica la selección y el uso de sondas marcadas para hibridar con regiones específicas del ácido nucleico diana. La elección de tales sondas, por ejemplo, no solamente su secuencia específica, sino el área diana al cual se deberían dirigir, depende en gran parte de la diana específica a ensayar. Actualmente, numerosos programas informáticos y otros protocolos existen para ayudar en la elección y diseño de las sondas 5’-nucleasa u otras sondas de hibridación para diversas aplicaciones. Tales programas y protocolos opcionalmente se pueden utilizar con la presente invención para elegir y diseñar sondas para los ensayos de curva de fusión/PCR cinética asimétrica en el presente documento. Por supuesto, el diseño visual y la colocación de las sondas es también bastante aplicable a la presente invención. Los parámetros para el diseño de no solamente sondas 5’-nucleasa, sino diversas sondas de hibridación para construir curvas de fusión /hibridación térmico son extremadamente familiares para los expertos en la técnica. Los programas que utilizan diferentes conjuntos de algoritmos y parámetros y que son útiles para tal diseño incluyen, por ejemplo, Visual OMP (DNA Software, Inc., Ann. Arbor, MI), Oligo 6 (Stratagene, La Jolla, CA), Sequencher (Gene Codes, Ann. Arbor, MI), y DNAStar (DNAStar, Inc., Madison, WI).
En ciertas realizaciones de la invención, la sonda 5’-nucleasa y/o la sonda de hibridación está marcada con un marcador que facilita la determinación de la identidad, genotipo, o secuencia de una diana. La secuencia de nucleótidos sonda puede ser de cualquier longitud suficiente para hibridar de manera apropiada con regiones diana sobre el ácido nucleico diana y que se puede usar para genotipificar o identificar el ácido nucleico diana. La longitud de la sonda diana generalmente será elegida para dar suficiente estabilidad termodinámica para asegurar la hibridación de la sonda con su diana a la temperatura de la etapa de hibridación de la PCR, etc. Por ejemplo, sondas con bases de ADN no convencionales opcionalmente pueden ser más largas o más cortas que aquellas con bases de ADN convencionales. Como otro ejemplo, sondas con secuencias ricas en A/T serán más largas que aquellas con secuencias ricas en G/C, en las que las Tm son idénticas. El sitio del polimorfismo o región diana puede estar en cualquier localización dentro de la secuencia de nucleótidos sonda. En algunas realizaciones, el sitio de tales regiones no está en el extremo 5’ de la secuencia de nucleótidos sonda.
No importa el diseño de secuencia individual de las sondas usadas en el presente documento, existen un número de diferentes enfoques. Por ejemplo, la misma sonda se puede usar para tanto la curva de crecimiento de 5’-nucleasa como para la curva de fusión/hibridación. Tal sonda opcionalmente está dirigida a una región de ácido nucleico diana que es común (al menos en alguna variación) a todas las posibles muestras a ensayar. Por ejemplo, en la genotipificación de un subtipo de virus (por ejemplo, como lo ilustrado en el Ejemplo en el presente documento) de entre un número de diferentes posibilidades, la consideración generalmente se tomará en la elección de áreas polimórficas del ácido nucleico diana que contienen motivos de secuencia únicos a cada subtipo. Por tanto, la sonda hibridará diferencialmente con tal región diana dependiendo del genotipo del ácido nucleico diana. De nuevo, tal grado variante de emparejamiento entre la sonda y la diana en una muestra y/o entre los diferentes genotipos en una muestra, influye las curvas de Tm generadas en el ensayo y así puede permitir la identificación de la(s) muestra(s) de ácido nucleico.
Por tanto, en un ejemplo hipotético, una muestra puede contener una mezcla de cualquier número de tipos de ácido nucleico no identificados. Por ejemplo, la muestra puede contener posiblemente cepas víricas relacionadas (por ejemplo, tipos/subtipos de VHC). Las sondas (5’-nucleasa y/o 5’-nucleasa y otras sondas de hibridación separadas) pueden estar diseñadas para una región polimórfica particular en el ácido nucleico de VHC. Los mal emparejamientos entre la(s) sonda(s) y las diversas regiones diana polimórficas conduciría a diferentes Tm (bajo condiciones similares) entre la(s) sonda(s) y los diferentes ácidos nucleicos diana. En base a las secuencias de las supuestas dianas, se podrían calcular las esperadas Tm (bajo condiciones definidas).
A continuación, las concretas curvas de Tm generadas se pueden comparar frente a curvas previstas o curvas patrón previamente generadas. Por ejemplo, si se esperaba que los virus 1 produjeran una Tm de X bajo condiciones definidas y la muestra 1 no produjera una Tm de X bajo esas condiciones, entonces los virus 1 se podrían descartar como posible componente de la mezcla de muestra. Correspondientemente, si la Tm producida a partir de lo desconocido en una muestra producía una Tm de Y, la secuencia del área diana de hibridación se podría calcular en base a la secuencia sonda conocida, las condiciones de ensayo, etc. Entonces, se podría hacer la determinación de lo desconocido en la muestra (por ejemplo, a través de comparación de secuencias calculadas frente a bases de datos de secuencia de virus conocidos, etc.).
En ciertas realizaciones en el presente documento, la invención puede comprender sonda(s) usada(s) para la parte de la curva de crecimiento de 5’-nucleasa del análisis que son diferentes de la(s) sonda(s) usada(s) para la parte de generación de curva de Tm del análisis. Tal disposición podría ser útil en situaciones en las que, por ejemplo, la
15
25
35
45
55
65
región de polimorfismo sobre el ácido nucleico diana es tan diversa que la construcción de una sonda 5’-nucleasa estable que funcionara dentro de las condiciones de amplificación no es factible. Por tanto, por ejemplo, una pluralidad de sondas completamente complementarias o básicamente complementarias o sondas parcialmente complementarias, cada una específica para al menos uno de los ácidos nucleicos diana, se podría usar para el análisis 5’-nucleasa (asegurando así la medición de la amplificación de todas las dianas deseadas) mientras que se podrían usar una secuencia de sonda más generalizada (por ejemplo, una que hibridara con un número de secuencias relacionadas) para la generación de curvas de Tm a partir de un número de diferentes secuencias diana. También, se apreciará que mientras que ciertas realizaciones de la invención contienen sondas nucleasa-5’ (por ejemplo, en la construcción de la curva de crecimiento de PCR cinética), en aquellas realizaciones en las que se usan sondas diferentes para la curva de crecimiento y la curva de fusión, las sondas usadas en la construcción de la curva de fusión no necesitan ser sondas 5’-nucleasa (es decir, tales sondas no necesariamente se hidrolizan en ciertas realizaciones). Si las sondas son o no hidrolizadas, puede influir su diseño. Por ejemplo, algunas sondas 5’nucleasa pueden ser aproximadamente 30 pb de longitud y contener un tinte interno a los extremos de la sonda. Sin embargo, en las sondas que no se hidrolizan la longitud puede ser más corta, el tinte puede estar localizado en un terminal, etc.
En ciertas realizaciones de la invención, la sonda 5’-nucleasa y/o la sonda de hibridación está marcada con un marcador que facilita la determinación de la identidad, genotipo o secuencia de un fragmento de oligonucleótido. La secuencia de nucleótidos de sonda puede ser de cualquier longitud suficiente para hibridar apropiadamente con regiones diana sobre el ácido nucleico diana y que se puede usar para genotipificar o identificar el ácido nucleico diana. La longitud de la sonda diana generalmente se elegirá para dar suficiente estabilidad termodinámica para asegurar la hibridación de la sonda con su diana a la temperatura de la etapa de hibridación de PCR, etc. Por ejemplo, las sondas con bases de ADN no convencionales opcionalmente pueden ser más largas o más cortas que aquellas con bases de ADN convencionales. Como otro ejemplo, sondas con secuencias ricas en A/T serán más largas que aquellas con secuencias ricas en G/C. Por ejemplo, puesto que la presente invención utiliza reacciones de 5’-nucleasa, que escindirán las sondas 5’-nucleasa, se pueden utilizar sondas más largas que en las reacciones de no 5’-nucleasa. Tales sondas más largas pueden permitir discriminación más fina entre las secuencias en el análisis de Tm y una mayor ventana de diagnosis. El sitio del polimorfismo o la región diana puede estar en cualquier localización dentro de la secuencia de nucleótidos sonda. En algunas realizaciones, el sitio de tales regiones no está en el extremo 5’ de la secuencia de nucleótidos sonda.
Además, en realizaciones en las que se usan sondas diferentes para las curvas de 5’-nucleasa y Tm, las sondas opcionalmente se añaden al mismo tiempo, generalmente al inicio del análisis. Otras realizaciones en el presente documento opcionalmente pueden comprender la adición de múltiples sondas en diferentes momentos dentro del análisis. Por ejemplo, la(s) sonda(s) de la curva de 5’-nucleasa se pueden añadir antes de que se añadan la(s) sonda(s) de hibridación.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos sonda (sea 5’-nucleasa o de hibridación) es idéntica o complementaria a la región diana. Sin embargo, en muchas realizaciones, la secuencia de nucleótidos sonda puede tener menos del 100 % de identidad o complementariedad a la región de nucleótidos diana. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia de nucleótidos sonda puede tener 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 % u 80 % o menos de complementariedad o identidad a la región de nucleótidos diana. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia de nucleótidos sonda hibrida con la región de nucleótidos diana bajo condiciones estrictas o altamente estrictas. En otras realizaciones de la invención, la secuencia de nucleótidos sonda hibrida con la región de nucleótidos diana bajo condiciones de baja astringencia.
En ciertas realizaciones de la invención, la sonda puede comprender uno o más marcadores, y opcionalmente uno o más desactivadores. En realizaciones convenientes, el marcador puede ser un marcador que facilita la determinación de la curva de crecimiento cinético y/o la curva de Tm.
La sonda se puede marcar incorporando restos detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. El método de unión o conjugación del marcador con la sonda de oligonucleótidos depende, por supuesto, del tipo de marcador(es) y/o desactivador(es) usado(s) y la posición de dichos en la sonda. Generalmente, los marcadores proporcionan señales que son detectables por fluorescencia, pero algunas realizaciones también pueden comprender marcadores detectables mediante, por ejemplo, radioactividad, colorimetría, gravimetría, difracción por rayos X o absorción, magnetismo, actividad enzimática y similares. Véase lo anterior.
Los marcadores fluorescentes pueden incluir tintes que están cargados negativamente, tales como tintes de la familia de la fluoresceína, o tintes que son neutros en carga, tales como tintes de la familia de la rodamina, o tintes que están cargados positivamente, tales como tintes de la familia de la cianina. Tintes de la familia de la fluoresceína incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Tintes de la familia de la rodamina incluyen Rojo Texas, ROX, R110, R6G, y TAMRA. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, y TAMRA están comercializados por Perkin-Elmer (Foster City, CA) y el Rojo Texas está comercializado por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Tintes de la familia de la cianina incluyen Cy2, Cy3, Cy5, and Cy7 y están comercializados por Amersham (Piscataway, NJ). Otras familias de tintes que se pueden usar en la invención incluyen, por ejemplo, tintes de la
15
25
35
45
55
65
familia de la polihalofluoreceina, tintes de la familia de la hexaclorofluoresceina, tintes de la familia de la cumarina, tintes de la familia de la oxazina, tintes de la familia de la tiacina, tintes de la familia de la escuaraina, tintes de la familia de la lantánida quelada, tintes ALEXA FLUOR® (Molecular Probes, Inc., Eugene OR), y tintes de la familia de BODIPY® (Molecular Probes, Inc.).
Además del (de los) marcador(es) fluorescente(s), otras realizaciones pueden comprender sondas que tienen uno o más restos de desactivador. Un desactivador se refiere a un resto químico que absorbe energía emitida a partir de un tinte fluorescente, o de lo contrario que interfiere con la capacidad del tinte fluorescente para emitir luz. Un desactivador puede volver a emitir la energía absorbida a partir de un tinte fluorescente en una característica de señal para ese desactivador, por tanto, un desactivador también puede ser un marcador. Alternativamente, un desactivador puede disipar la energía absorbida a partir de un tinte fluorescente como calor. Moléculas frecuentemente usadas en FRET incluyen, por ejemplo, fluoresceína, FAM, JOE, rodamina, R6G, TAMRA, ROX, DABCYL, y EDANS. Desactivadores no fluorescentes como ejemplos que disipan la energía absorbida a partir de un tinte fluorescente incluyen los Black Hole Quenchers™ comercializados por Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Calif), Eclipse Dark Quenchers de Epoch Biosciences (Bothell, WA) y Iowa Black (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA).
Los marcadores y/o desactivadores pueden estar acoplados a la sonda de oligonucleótidos directa o indirectamente por una diversidad de técnicas. Dependiendo del tipo preciso de marcador usado, el marcador podría estar localizado en el extremo 5’ o 3’ de la sonda, o estar internamente localizado en la secuencia de nucleótidos. Los marcadores y/o desactivadores pueden estar acoplados directamente a un nucleótido, o pueden estar acoplados indirectamente por conectores o secciones separadoras de diversos tamaños y composiciones para facilitar interacciones de señal. Usando reactivos de fosforamidita comercialmente disponibles, se puede producir sondas de oligómero que contienen grupos funcionales (por ejemplo, tioles o aminas primarias) en ambos terminales por una fosforamidita apropiadamente protegida, y se pueden marcar usando protocolos descritos en, por ejemplo, “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, ed. por Innis y col., Academic Press, Inc. 1990. También es posible acoplar un resto detectable en el terminal 3’ de la sonda empleando, por ejemplo, transferasa terminal de polinucleótido para añadir un resto deseado, tal como, por ejemplo, cordicepina 35S-dATP, y dUTP biotinilado.
En la Patente U.S. Nº 4.914.210 se describen métodos para introducir reactivos de funcionalización de oligonucleótidos para introducir uno o más restos de sulfhidrilo, amino o hidroxilo en la secuencia sonda de oligonucleótidos, generalmente en el terminal 5’. Un grupo fosfato radiactivo (por ejemplo, marcado con 32P) se puede introducir en un terminal 5’ de un oligonucleótido usando polinucleótido quinasa y [gamma-32P]ATP. La biotina se puede añadir al extremo 5’ haciendo reaccionar un residuo de aminotimidina o conector alquilamino, introducido durante la síntesis, con un éster de N-hidroxisuccinimida de biotina. Se pueden añadir marcadores en el terminal 3’ de un oligonucleótido usando transferasa terminal de polinucleótido para añadir el resto deseado, tal como, por ejemplo, cordicepina 35S-dATP, y dUTP biotinilado. Ciertos derivados de nucleótido también se pueden usar como marcadores. Por ejemplo, eteno-dA y eteno-A son nucleótidos de adenina fluorescente conocidos que se pueden incorporar en una sonda de oligonucleótidos. Igualmente, eteno-dC es otro análogo que se podría usar en síntesis de sonda.
En ciertas realizaciones de la invención, una sonda está múltiplemente marcada, con cada marcador individualmente acoplado a diferentes localizaciones de la sonda. En otra realización de la invención, una sonda sencilla está doblemente marcada con un tinte fluorescente (es decir, un marcador) y un desactivador. Cuando la sonda está intacta, la fluorescencia del marcador se apaga por el desactivador. Escindir la sonda entre el marcador y el desactivador da como resultado menos desactivación (quenching) de la fluorescencia emitida por el marcador. Una combinación como ejemplo para este aspecto de la invención es el tinte fluorescente FAM y el desactivador BHQ-2.
Sondas de genotipificación de VHC
La invención proporciona composiciones para la genotipificación de VHC, en la que las composiciones incluyen al menos una sonda de genotipificación de VHC que puede producir una asignación de genotipo de VHC. Por ejemplo, la invención proporciona una sonda de genotipificación de VHC, por ejemplo, la sonda de genotipificación de VHC HCGT27P5’3’ de SEQ ID NO:3, que es capaz de diferenciar un gran número de genotipos de VHC basados en la discriminación de Tm, como se ilustra en el Ejemplo. Esta sonda tiene la secuencia:
EFFGGAALLGFFAGGAFGAFFGGGTCCTJ (SEQ ID NO: 3) en la que E = BHQ2; J = cx-FAM; F = propinil dU; L = propinil dC.
Estará claro para un experto en la técnica que esta secuencia sonda fácilmente se puede modificar para obtener básicamente moléculas sonda funcionalmente equivalentes, es decir, moléculas funcionalmente equivalentes que también son capaces de discriminar múltiples genotipos de VHC. Por ejemplo, la sonda proporcionada en SEQ ID NO: 3 comprende diversos marcadores y/o desactivadores (por ejemplo, BHQ2 y cx-FAM). Inmediatamente estará claro para un experto en la técnica que estos restos se pueden sustituir por otros tipos de marcadores o sistemas marcadores, y donde la sonda conservará su propiedad crítica de unirse de manera diferencial a una multitud de genotipos de VHC y no desviarse de la característica básica de la invención. De hecho, incluso se puede eliminar
15
25
35
45
55
65
tales marcadores, y la sonda conserva aún su propiedad básica de discriminación de genotipo de VHC.
Tm e hibridación
Uno de los beneficios de la presente invención es que las curvas de fusión/hibridación se crean a partir de la misma muestra de reacción que las curvas de la PCR cinética, por ejemplo, dentro del mismo recipiente de muestra. En diversas realizaciones en el presente documento, el perfil de temperatura de las muestras bajo análisis opcionalmente se puede manipular de diversas maneras para producir las curvas de fusión/hibridación. Por ejemplo, el calentamiento y/o enfriamiento de las muestras para construir las curvas de fusión/hibridación generalmente se hace sobre un intervalo determinado de temperaturas. El intervalo de temperatura específico generalmente se fija en base a, por ejemplo, las dianas/sondas específicas en estudio, sus secuencias (tanto como se conozca al menos), la longitud de la(s) sonda(s), etc. Además de los niveles de temperaturas en la presente invención, la velocidad de cambio de temperatura es también opcionalmente variable en diferentes realizaciones. Los cambios en la temperatura opcionalmente son continuos, pero en algunas realizaciones pueden ser discontinuos.
En la interpretación de la curva de Tm resultante para determinar el genotipo diana subyacente, secuencia, etc., la referencia opcionalmente se hace entre la curva de Tm de la(s) muestra(s) diana y una o más curvas de Tm control
o entre la curva de Tm de las muestras y la curva de Tm prevista que se esperará que dé la secuencia sonda y que se sabe o se asume que es la secuencia diana, las condiciones de reacción, etc. Diversas realizaciones en el presente documento pueden usar opcionalmente uno o ambos medios para interpretar cualquier curva de Tm para determinar genotipo, secuencia, identidad, etc. de un ácido nucleico diana en una muestra.
Usos a modo de ejemplo de la invención
La presente invención opcionalmente se utiliza en diagnosis, por ejemplo, de enfermedades. Tales afecciones pueden incluir enfermedades infecciosas que implican diagnosis, así como enfermedades no infecciosas tales como el cáncer, etc. En la determinación de un agente causante en una enfermedad en un sujeto, la presente invención puede distinguir entre agentes causantes de la enfermedad en situaciones en las que muchos agentes diversos podrían posiblemente causar la enfermedad. Por ejemplo, las infecciones de las vías respiratorias superiores (URI) son muy peligrosas para los infectados con ellos y la diagnosis correcta del agente de enfermedad subyacente es muy importante para el tratamiento apropiado. Si la URI es debida a un virus, bacteria, etc. influye enormemente en el curso apropiado del tratamiento del paciente. Además, las infecciones bacterianas gram prositivas y gram negativas requieren diferentes tratamientos. Con cebadores y sondas apropiadamente seleccionadas, la presente invención puede determinar la presencia o ausencia de agentes particulares dentro de una muestra, así como distinguir entre ciertos agentes presentes en una muestra.
Otros usos de diagnosis de la presente invención implican la diferenciación entre agentes causantes que están cerca uno de otros en secuencia. Por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo en el presente documento, los subtipos de VHC se pueden distinguir uno de otro a través del uso de la presente invención. A través del uso de las sondas y los cebadores apropiados, se puede diferenciar un hospedador de otros agentes de enfermedad relacionados y sujetos que tienen tales agentes de enfermedad se pueden tratar apropiadamente en base a tal diferenciación. Por ejemplo, subcepas de VIH, cepas/subcepas de VHC, tipos de flavivirus y similares todos se pueden distinguir apropiadamente por realizaciones de la presente invención.
En otras realizaciones, la presente invención opcionalmente se puede usar para la identificación de ácidos nucleicos en relación con el alelo que tipifica organismos superiores (por ejemplo, como en el cribado genético), la detección de ciertos cánceres, la tipificación de HLA, etc.
Kits, sistemas y mezclas de reacción
También se describen kits para la detección y/o cuantificación y/o identificación de ácidos nucleicos. Tales kits pueden comprender cualquier combinación de, por ejemplo, sondas 5’-nucleasa y de hibridación apropiadas (por ejemplo, basadas en los ácidos nucleicos específicos a ensayar, genotipificar, etc.), cebadores apropiados (por ejemplo, para amplificar el ácido nucleico diana), reactivos y materiales para la amplificación y la identificación del ácido nucleico diana tal como tampones, nucleótidos, sales, etc. El kit opcionalmente comprende además un conjunto de instrucciones o manual del usuario que detalla métodos preferidos de uso de los componentes del kit para el descubrimiento o la aplicación de conjuntos de diagnosis. Generalmente, el kit contiene, además de los anteriores componentes, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para realizar los métodos de la invención para la detección y/o cuantificación y/o identificación de ácidos nucleicos, material de empaquetamiento, y uno o más recipientes.
También se describe un sistema para la detección y/o cuantificación y/o identificación de ácidos nucleicos. Tales sistemas pueden comprender, por ejemplo, una o más sondas de hibridación fluorescentemente marcadas; una o más sondas 5’-nucleasa marcadas (las cuales pueden ser la misma que las sondas de hibridación); dos o más cebadores de la PCR cinética que son específicos para la amplificación de dianas de ácido nucleico y que están presentes en cantidades distintas para la PCR cinética asimétrica; uno o más recipientes para las sondas,
15
25
35
45
55
65
cebadores y otros constituyentes de la PCR; uno o más moduladores térmicos que están conectados operativamente (es decir, térmicamente conectados) al recipiente y que pueden cambiar controlablemente la temperatura en el recipiente; un detector configurado para detectar las señales fluorescentes de las diversas sondas en las reacciones (por ejemplo, sean sondas de hibridación, sondas 5’-nucleasa); una pantalla para la visualización de los datos; y un controlador que está operativamente conectado a la pantalla, el detector y/o el modulador térmico y que puede incluir conjuntos de instrucciones para controlar el modulador térmico y la pantalla, el detector y/o el modulador térmico, así como conjuntos de instrucciones para correlacionar las señales fluorescentes y la temperatura en el recipiente con la presencia de uno o más ácidos nucleicos diana. Si las sondas están marcadas por medios no fluorescentes (por ejemplo, radioactivos), los detectores en tales sistemas comprenden aquellos que detectan tal actividad no fluorescente.
También se describen mezclas de reacción que tienen cebadores específicos para la amplificación de al menos una diana de ácido nucleico, una o más sondas 5’-nucleasa marcadas y una o más sondas de hibridación marcadas en las que las sondas 5’-nucleasa y las sondas de hibridación pueden ser o bien la misma sonda o diferentes sondas. En el presente documento, los cebadores están presentes en diferentes cantidades y las sondas de hibridación están presentes en una cantidad mayor que la cantidad del cebador limitante (es decir, el cebador presente en la cantidad menor).
Los kits, etc., descritos en el presente documento pueden incluir los realizados en un tubo o recipiente sencillo, que permite que las reacciones se realicen sin apertura del tubo/recipiente.
Ejemplo
El siguiente ejemplo se ofrece para ilustrar la invención reivindicada. Un experto en la técnica reconocerá una diversidad de parámetros no críticos que se pueden alterar. Se entenderá que los ejemplos y las realizaciones descritas en el presente documento son solamente para fines ilustrativos y que los expertos en la técnica sugerirán diversas modificaciones o cambios en luz de los mismos.
Ejemplo
Uso de la invención para determinar el genotipo de VHC
Determinar el genotipo de una muestra VHC (virus de la hepatitis C) positiva tiene importante significancia y utilidad clínica. Conocer el genotipo del virus específico permite a los médicos seleccionar el correcto régimen de tratamiento. Tal como se explicó anteriormente, la presente invención se puede usar para discriminar entre un número de dianas de ácido nucleico (por ejemplo, incluso unas que están estrechamente relacionadas en la secuencia) tal como genotipos de VHC. Los métodos de la invención usan una sonda de oligonucleótidos que está específicamente diseñada para ser al menos parcialmente complementaria a una región de divergencia de secuencia diana (por ejemplo, una región que muestra divergencia entre diferentes cepas, alelos, especies, etc.) junto con el uso de las diferentes Tm obtenidas a partir del análisis de fusión y/o hibridación post-PCR para distinguir las dianas de ácido nucleico.
La Figura 5 muestra secuencias alineadas de 6 genotipos de VHC diferentes (concretamente tipos 1a, 2a, 3a, 4, 5, y 6) junto con una sonda de hibridación como ejemplo capaz de su uso en la presente invención para discriminar entre los diferentes genotipos de VHC.
Tal como se indicó previamente, la(s) sonda(s) 5’-nucleasa opcionalmente puede(n) usar un diferente canal de color que la(s) sonda(s) de hibridación. Por ejemplo, como se ve en las Figuras 6 a 8, se utilizaron una sonda de hibridación marcada con FAM (para distinguir entre diferentes genotipos de VHC) y una sonda 5’-nucleasa marcada con HEX con transcritos de ARN seleccionados de los genotipos de VHC 1a, 2a, 3a, 4, 5 y 6.
En el presente ejemplo, la mezcla maestra de la muestra de PCR asimétrica (es decir, los constituyentes de la PCR) consistía en: glicerol al 2,5 %, DMSO al 5 %; Tricina 50 mM, pH 8,3; acetato de potasio 90 mM; dATP 300 µM, dGTP 300 µM, dCTP 300 µM, dUTP 550 µM; cebador (limitante) corriente arriba (upstream) 0,1 µM; cebador (exceso) corriente abajo (downstream) 0,5 µM; sonda de hidrólisis 0,2 µM, sonda de hibridación 0,2 µM; 10 U de uracil-Nglicosilasa; 40 U de Z05 ADN polimerasa; y acetato de manganeso 2,7 mM.
Se obtuvo la ARN plantilla para generar amplicones de VHC por RT-PCR mediante transcripción in vitro a partir de plásmidos que llevan insertos de material genómico de VHC correspondientes a los tipos 1a, 2a, 3a, 4, 5 y 6. Las secuencias de estos insertos corresponden a secuencias consenso de cada uno de los respectivos tipos descritos en la Figura 5. Después de la transcripción in vitro, el ARN se purificó por cromatografía de oligo-dT-sefarosa.
En el ejemplo, la sonda de hibridación/genotipificación estaba presente en dos veces la concentración del cebador limitante para asegurar que no se escindía toda la sonda. El cebador en exceso estaba presente en 5 veces la concentración de cebador limitante para asegurar un exceso de amplicón de cadena sencilla para unirse a la sonda de hibridación. El perfil del ciclado térmico usado para el ejemplo era: 50 ºC durante 5 minutos (etapa UNG); 59 ºC

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
ES06013329.5T 2005-06-30 2006-06-28 PCR asimétrica junto con caracterización post-PCR para la identificación de ácidos nucleicos Active ES2605016T3 (es)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69629305P 2005-06-30 2005-06-30
US69599105P 2005-06-30 2005-06-30
US69625305P 2005-06-30 2005-06-30
US69630305P 2005-06-30 2005-06-30
US696293P 2005-06-30
US696303P 2005-06-30
US695991P 2005-06-30
US696253P 2005-06-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2605016T3 true ES2605016T3 (es) 2017-03-10

Family

ID=37104934

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06013329.5T Active ES2605016T3 (es) 2005-06-30 2006-06-28 PCR asimétrica junto con caracterización post-PCR para la identificación de ácidos nucleicos
ES06013330T Active ES2336934T3 (es) 2005-06-30 2006-06-28 Modificadores de la emision luminica y usos de los mismos en la deteccion, amplificacion y analisis de acidos nucleicos.
ES06013294.1T Active ES2630186T3 (es) 2005-06-30 2006-06-28 Sondas y procedimientos para el tipado del virus de la hepatitis C usando análisis multidimensional de sondas

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06013330T Active ES2336934T3 (es) 2005-06-30 2006-06-28 Modificadores de la emision luminica y usos de los mismos en la deteccion, amplificacion y analisis de acidos nucleicos.
ES06013294.1T Active ES2630186T3 (es) 2005-06-30 2006-06-28 Sondas y procedimientos para el tipado del virus de la hepatitis C usando análisis multidimensional de sondas

Country Status (7)

Country Link
US (9) US7465561B2 (es)
EP (5) EP1739190B1 (es)
JP (6) JP4602945B2 (es)
AT (2) ATE450623T1 (es)
CA (5) CA2549754C (es)
DE (1) DE602006010764D1 (es)
ES (3) ES2605016T3 (es)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080085515A1 (en) * 2000-03-24 2008-04-10 Eppendorf Array Technologies Sa (Eat) Identification of multiple biological (micro) organisms by detection of their nucleotide sequences on arrays
US7465561B2 (en) 2005-06-30 2008-12-16 Roche Molecular Systems, Inc. Probes and methods for hepatitis C virus typing using single probe analysis
US7972786B2 (en) * 2006-07-07 2011-07-05 Brandeis University Detection and analysis of influenza virus
JP5593582B2 (ja) * 2007-06-12 2014-09-24 東洋紡株式会社 核酸の迅速な検出方法
JP2009036687A (ja) * 2007-08-03 2009-02-19 Panasonic Corp 遺伝子検出方法
WO2009022939A1 (fr) * 2007-08-09 2009-02-19 Uchrezhdenie Rossiiskoi Akademii Nauk Institut Molekulyarnoi Biologii Im. V.A. Engelgardta Ran (Imb Ran) Procédé d'identification du génotype et du sous-type du virus de l'hépatite c sur une biopuce
US20110189665A1 (en) * 2007-08-13 2011-08-04 Miller Jesse D Methods for detecting drug-resistant microbes
US8767952B2 (en) * 2007-12-17 2014-07-01 Broadcom Corporation Method and system for utilizing a single connection for efficient delivery of power and multimedia information
EP2116614A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-11 Qiagen GmbH Simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction
EP2130929B1 (en) * 2008-06-06 2013-10-09 F. Hoffmann-La Roche AG Internally controlled multiplex detection and quantification of microbial nucleic acids
US8658366B2 (en) * 2008-09-18 2014-02-25 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of target variants using a fluorescent label and a soluble quencher
US8606527B2 (en) 2009-02-27 2013-12-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. SNP detection by melt curve clustering
US8039215B2 (en) 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
EP2419729A4 (en) * 2009-04-13 2015-11-25 Canon Us Life Sciences Inc FAST PROCEDURE FOR PATTERN RECOGNITION, MACHINE TRAINING AND AUTOMATED GENOTYPIC CLASSIFICATION THROUGH CORRELATION ANALYSIS OF DYNAMIC SIGNALS
WO2010135916A1 (zh) 2009-05-26 2010-12-02 厦门大学 一种单管检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法
EP2436777B1 (en) 2009-05-26 2015-08-19 Xiamen University Method for detecting variations in nucleic acid sequences
US8148515B1 (en) 2009-06-02 2012-04-03 Biotium, Inc. Detection using a dye and a dye modifier
JP2011062088A (ja) * 2009-09-15 2011-03-31 Ihi Corp レジオネラ菌検出方法
US20120237451A1 (en) * 2009-09-18 2012-09-20 Antony Kuang-Shih Chen Novel molecular beacons
US9677125B2 (en) * 2009-10-21 2017-06-13 General Electric Company Detection of plurality of targets in biological samples
CN102576389B (zh) * 2009-10-21 2016-08-03 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于扩增反应的分析工具
JP5623888B2 (ja) * 2009-12-10 2014-11-12 エフ．ホフマン−ラ ロシュアーゲーＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 分析対象物を分離して検出する方法
EP2556458B1 (en) 2010-04-09 2020-06-03 Life Technologies Corporation VISUALIZATION TOOL FOR qPCR GENOTYPING DATA
US20130095496A1 (en) * 2010-06-21 2013-04-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Soluble Quencher to reduce Background in qPCR assays
US9175332B2 (en) * 2010-07-29 2015-11-03 Roche Molecular Systems, Inc. Generic PCR
EP2614157A4 (en) * 2010-09-08 2014-03-26 Univ Brandeis NUCLEIC ACID DIAGNOSTIC ASSAY COMPOSITIONS AND METHODS FOR VARIABLE SEQUENCE TARGETS
JP5722001B2 (ja) * 2010-11-10 2015-05-20 株式会社日立ハイテクノロジーズ 遺伝子検査方法及び検査装置
JP5985503B2 (ja) 2010-12-16 2016-09-06 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 定量的増幅のためのユニバーサルリファレンス色素
US20120164641A1 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Roche Molecular Systems, Inc. Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene
EP2700935A4 (en) 2011-04-18 2014-10-22 Olympus Corp QUANTITATIVE PROCEDURE FOR TARGET PARTICLES, PHOTOMETRIC ANALYSIS DEVICE AND COMPUTER PROGRAM FOR PHOTOMETRIC ANALYSIS
EP2700934B1 (en) * 2011-04-20 2016-12-14 Olympus Corporation Method for detecting a nucleic acid molecule in a biosample
JP6013332B2 (ja) * 2011-06-27 2016-10-25 オリンパス株式会社 標的粒子の計数方法
WO2013040060A2 (en) * 2011-09-12 2013-03-21 Pathogenica, Inc. Nucleic acids for multiplex detection of hepatitis c virus
EP2809813B1 (en) 2012-02-03 2018-08-08 California Institute of Technology Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays
CN102766701B (zh) * 2012-07-04 2016-05-04 福州泰普生物科学有限公司 丙型肝炎病毒基因分型的试剂盒及方法
AU2013202808B2 (en) 2012-07-31 2014-11-13 Gen-Probe Incorporated System and method for performing multiplex thermal melt analysis
IN2015DN01609A (es) 2012-08-03 2015-07-03 California Inst Of Techn
EP2722397B1 (en) 2012-10-18 2017-12-13 F. Hoffmann-La Roche AG Dual probe assay for the detection of heterogeneous amplicon populations
EP2722398B1 (en) * 2012-10-18 2017-07-12 F. Hoffmann-La Roche AG Dual probe assay for the detection of HCV
CN105143847B (zh) * 2013-02-05 2019-05-28 三路影像公司 细胞染色组合物及其用途
WO2015038634A2 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Rutgers, The State University Of New Jersey Multiplex diagnostic assay for lyme disease and other tick-borne diseases
GB201411567D0 (en) * 2014-06-30 2014-08-13 Epistem Ltd Quantification methods
CN108779500B (zh) * 2016-03-11 2022-12-13 豪夫迈·罗氏有限公司 用于检测寨卡病毒的组合物和方法
WO2017218777A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 California Institute Of Technology Nucleic acid reactions and related methods and compositions
EP3529381B1 (en) * 2016-10-19 2022-07-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis c virus
CN108546748A (zh) * 2017-04-05 2018-09-18 杭州丹威生物科技有限公司 一种检测核酸的方法和试剂盒
EP3628060A1 (en) 2017-10-03 2020-04-01 Abbott Molecular Inc. Assay for detecting hepatitis c virus (hcv)
KR102063864B1 (ko) * 2018-05-16 2020-01-08 사회복지법인 삼성생명공익재단 표면-증강 라만 산란 기반의 감염 질환 진단용 마커 검출 방법
CN112766296B (zh) * 2019-11-06 2023-04-07 济南信通达电气科技有限公司 输电线路安全隐患目标检测模型训练方法及装置
WO2021236116A1 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 Delahoussaye Kevin Antiviral medicinal template
JP2024500169A (ja) 2020-12-22 2024-01-04 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 大ストークスシフト蛍光色素を使用して多重化リアルタイムｐｃｒを行うための方法
KR102533568B1 (ko) * 2020-12-23 2023-05-16 건국대학교 산학협력단 라이트 업 RNA 앱타머를 사용한 형광 기반 다중 miRNA 검출 시스템
KR102465706B1 (ko) * 2020-12-23 2022-11-09 건국대학교 산학협력단 Dna 주형 구리 나노입자 기반 fret 센서 및 이를 이용한 표적 핵산 분자의 검출 방법
CN114540526B (zh) * 2022-03-23 2023-10-31 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) 对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
DE3529478A1 (de) 1985-08-16 1987-02-19 Boehringer Mannheim Gmbh 7-desaza-2'desoxyguanosin-nukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur nukleinsaeure-sequenzierung
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US6251581B1 (en) * 1991-05-22 2001-06-26 Dade Behring Marburg Gmbh Assay method utilizing induced luminescence
DE69223562T2 (de) * 1991-08-27 1998-06-04 Hoffmann La Roche Verfahren und Reagenzien zum Nachweis von Hepatitis C
JP3739785B2 (ja) 1991-11-26 2006-01-25 アイシス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5644048A (en) 1992-01-10 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides
DE69324678T2 (de) * 1992-11-27 1999-12-09 Naamloze Vennootschap Innogenetics S.A., Gent Verfahren zur typisierung von hcv-isolaten
WO1994025601A2 (en) 1993-04-27 1994-11-10 N.V. Innogenetics S.A. New sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
US5882852A (en) * 1993-06-29 1999-03-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
US5491063A (en) * 1994-09-01 1996-02-13 Hoffmann-La Roche Inc. Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes
JPH10507643A (ja) 1994-10-21 1998-07-28 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型の新規配列、ならびにそれらの予防薬、治療薬および診断薬としての使用
US5837442A (en) * 1995-11-29 1998-11-17 Roche Molecular Systems, Inc. Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid
US5795729A (en) * 1996-02-05 1998-08-18 Biometric Imaging, Inc. Reductive, energy-transfer fluorogenic probes
ES2230631T3 (es) 1997-03-20 2005-05-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Cebadores modificados.
US6465175B2 (en) 1997-09-04 2002-10-15 Bayer Corporation Oligonucleotide probes bearing quenchable fluorescent labels, and methods of use thereof
JPH11148521A (ja) 1997-11-13 1999-06-02 Nichias Corp 鳴き防止シム
GB9725197D0 (en) * 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Detection system
US6140054A (en) * 1998-09-30 2000-10-31 University Of Utah Research Foundation Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes
WO2000056920A1 (en) 1999-03-18 2000-09-28 Exiqon A/S One step sample preparation and detection of nucleic acids in complex biological samples
ES2269113T3 (es) 1999-03-24 2007-04-01 Exiqon A/S Sintesis mejorada de -2.2.1 / biciclo-nucleosidos.
US6734291B2 (en) 1999-03-24 2004-05-11 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
US6472156B1 (en) * 1999-08-30 2002-10-29 The University Of Utah Homogeneous multiplex hybridization analysis by color and Tm
DK1081495T3 (da) 1999-09-01 2004-06-14 Invitrogen Corp Fotondæmpende midler til fluorescensassays
WO2001046469A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Procede d'etude du genotype du virus de l'hepatite c
DE10027113A1 (de) 1999-12-23 2001-09-27 Andreas Hoeft Verfahren zur Bestimmung von mikrobieller DNS/RNS, Kit dafür und Verwendung des Verfahrens
AU2229201A (en) 1999-12-27 2001-07-09 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Process for producing glycine
US7019129B1 (en) 2000-05-09 2006-03-28 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
JP2002345467A (ja) 2000-10-23 2002-12-03 Srl Inc Ｃ型肝炎ウイルスの型分類用プローブ及びそれを用いたｃ型肝炎ウイルスの型分類方法並びにそれを用いたインターフェロン投与の治療効果を予測する方法。
NZ543940A (en) 2000-12-04 2008-04-30 Primagen B V Determining the ratio of genomic DNA and mtDNA or their related gene products with regards to determining the stage of an asymptomatic disease
CN1366067A (zh) * 2001-01-15 2002-08-28 上海博华基因芯片技术有限公司 一种乙型、丙型肝炎双检基因芯片试剂盒及其制备和使用方法
EP1236804A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-04 Boehringer Mannheim Gmbh A method for determination of a nucleic acid using a control
JP2002272475A (ja) 2001-03-22 2002-09-24 Eiken Chem Co Ltd 蛍光偏光法による核酸増幅産物の検出方法
JP2004525643A (ja) 2001-04-12 2004-08-26 バイオコア シーオー． エルティーディー． Ｃ型肝炎ウィルス（ｈｃｖ）の遺伝子型分析のためのオリゴヌクレオチドチップ組成物及びその検査方法
JP2003084002A (ja) * 2001-06-27 2003-03-19 Fuji Photo Film Co Ltd 蛍光検出におけるバックグラウンドの低減方法
US6800765B2 (en) * 2001-08-02 2004-10-05 Molecular Devices Corporation Fluorescent pH indicators for intracellular assays
US7196183B2 (en) * 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
KR20040052455A (ko) 2001-11-08 2004-06-23 산코 준야쿠 가부시키가이샤 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한자기집합체의 형성 방법, 자기집합체 및 유전자의 검출방법
AU2003235767A1 (en) 2002-01-08 2003-07-24 Roche Diagnostics Gmbh Use of silica material in an amplification reaction
US20030136921A1 (en) * 2002-01-23 2003-07-24 Reel Richard T Methods for fluorescence detection that minimizes undesirable background fluorescence
PL211889B1 (pl) * 2002-05-20 2012-07-31 Bristol Myers Squibb Co Pochodna heterocyklosulfonamidowa, kompozycja ją zawierająca oraz ich zastosowanie
WO2004000995A2 (en) * 2002-05-22 2003-12-31 Marshall University Methods, probes, and accessory molecules for detecting single nucleotide polymorphisms
US7195885B2 (en) * 2002-08-12 2007-03-27 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus assays
AU2003264038A1 (en) 2002-08-12 2004-02-25 Bristol-Myers Squibb Company Combination pharmaceutical agents as inhibitors of hcv replication
GB0223563D0 (en) 2002-10-10 2002-11-20 Secr Defence Detection system
CN1711352A (zh) 2002-11-13 2005-12-21 华盛顿大学 丙型肝炎病毒复制的高允许性细胞系
EP1565480B1 (en) 2002-11-22 2018-08-22 Roche Diagnostics GmbH Detectable labeled nucleoside analogs and methods of use thereof
EP1431398A1 (en) * 2002-12-20 2004-06-23 Evotec OAI AG A method for detecting in a mixture an amount of analytes
JP4608483B2 (ja) 2003-02-18 2011-01-12 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ポリヌクレオチドの複合的分析のための組成物および方法
WO2005028650A2 (en) 2003-09-16 2005-03-31 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HEPATITIS C VIRUS (HCV) EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US7465561B2 (en) 2005-06-30 2008-12-16 Roche Molecular Systems, Inc. Probes and methods for hepatitis C virus typing using single probe analysis

Also Published As

Publication number Publication date
CA2549758A1 (en) 2006-12-30
US8222003B2 (en) 2012-07-17
ES2630186T3 (es) 2017-08-18
DE602006010764D1 (de) 2010-01-14
EP2128269A1 (en) 2009-12-02
JP2007006890A (ja) 2007-01-18
JP2007049985A (ja) 2007-03-01
US8163484B2 (en) 2012-04-24
US8067208B2 (en) 2011-11-29
EP1746170A2 (en) 2007-01-24
JP4638388B2 (ja) 2011-02-23
JP2007014333A (ja) 2007-01-25
ATE450623T1 (de) 2009-12-15
EP1746172A2 (en) 2007-01-24
US20120070820A1 (en) 2012-03-22
US20090098532A1 (en) 2009-04-16
EP1739190B1 (en) 2009-12-02
EP1746171B1 (en) 2017-05-17
EP1746171A3 (en) 2007-06-20
EP1746171A2 (en) 2007-01-24
US7465561B2 (en) 2008-12-16
CA2549754C (en) 2015-02-17
CA2549671C (en) 2015-10-20
JP4602945B2 (ja) 2010-12-22
CA2895667A1 (en) 2006-12-30
CA2549671A1 (en) 2006-12-30
JP2013255516A (ja) 2013-12-26
US8114595B2 (en) 2012-02-14
JP5155348B2 (ja) 2013-03-06
EP1746170A3 (en) 2007-07-04
US20100015629A1 (en) 2010-01-21
US7919242B2 (en) 2011-04-05
US20100015598A1 (en) 2010-01-21
EP1746172A3 (en) 2007-03-28
JP6026977B2 (ja) 2016-11-16
EP1746172B1 (en) 2016-10-05
US20100015630A1 (en) 2010-01-21
JP2010162027A (ja) 2010-07-29
CA2549754A1 (en) 2006-12-30
CA2895667C (en) 2016-04-26
US8119346B2 (en) 2012-02-21
US20070020664A1 (en) 2007-01-25
US20070072211A1 (en) 2007-03-29
ES2336934T3 (es) 2010-04-19
CA2549905A1 (en) 2006-12-30
US20070020665A1 (en) 2007-01-25
US20070141560A1 (en) 2007-06-21
JP5405715B2 (ja) 2014-02-05
EP1746170B1 (en) 2017-05-03
JP4634340B2 (ja) 2011-02-16
ATE507311T1 (de) 2011-05-15
JP2007006889A (ja) 2007-01-18
EP1739190A1 (en) 2007-01-03
EP2128269B1 (en) 2011-04-27
CA2549758C (en) 2017-03-07
CA2549905C (en) 2016-10-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2605016T3 (es) PCR asimétrica junto con caracterización post-PCR para la identificación de ácidos nucleicos
ES2183256T5 (es) Dispositivo para la deteccion de reacciones de amplificacion de acidos nucleicos.
ES2414286T3 (es) Detección de ácidos nucleicos
CN102686728B (zh) 具有发夹构象的嵌合引物及其使用方法
ES2202333T3 (es) Metodos de extincion de la fluorescencia de sondas de oligonucleotidos en solucion.
ES2629759T3 (es) Detección de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante un ensayo de escisión y extensión de PTO
US6251600B1 (en) Homogeneous nucleotide amplification and assay
ES2589102T3 (es) Ensayo cuantitativo de amplificación y fusión multiplex de ácidos nucleicos
JP6286419B2 (ja) 遺伝子多型の識別に用いるプライマーとプローブのセットおよびその利用
CN101528945A (zh) 2’-终止子有关的焦磷酸解作用激活的聚合
ES2605303T3 (es) Detección cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos microbianos
US20060194222A1 (en) Triplex probe compositions and methods for polynucleotide detection
ES2980651T3 (es) Método de detección de una secuencia de ácido nucleico
ES2773873T3 (es) Detección de polimorfismo mononucleotídico usando cebador y sonda de fusión superpuestos
US20220002824A1 (en) Primer sets, biomarkers, kit and applications thereof
JP5863162B2 (ja) 標的核酸の検出方法
ES2886605T3 (es) Procedimiento genérico para la estabilización de ARN específico
JP6999645B2 (ja) 核酸の増幅及び検出／定量の効率を改良するためのヘルパーオリゴヌクレオチド
JP2008517626A (ja) 乳房細胞を検出するための核酸プライマー及びプローブ
PT763133E (pt) Metodo para a deteccao de acidos nucleicos alvo