KR102533568B1 - 라이트 업 RNA 앱타머를 사용한 형광 기반 다중 miRNA 검출 시스템 - Google Patents

라이트 업 RNA 앱타머를 사용한 형광 기반 다중 miRNA 검출 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라이트 업 RNA 앱타머(Light up RNA aptamer)를 사용한 형광 기반 다중 miRNA 검출용 조성물 및 이를 이용한 miRNA의 다중 검출 방법에 관한 것이다.

Description

라이트 업 RNA 앱타머를 사용한 형광 기반 다중 miRNA 검출 시스템 {Highly sensitive multiplex detection of microRNA using light-up RNA aptamers}
본 발명은 라이트 업 RNA 앱타머(Light up RNA aptamer)를 사용한 형광 기반 다중 miRNA 검출용 조성물 및 이를 이용한 miRNA의 다중 검출 방법에 관한 것이다.
miRNA(micro RNA)는 진화적으로 보존되고 단백질을 인코딩하지 않는 15-27bp 크기의 내생의 단일 가닥 RNA 파편이다. miRNA는 세포분화, 증식, 신진대사, 사멸 등 다양한 생물학적 과정에 관여하며 유전자 발현 규제에 중요한 역할을 하고 있어 유방암, 뇌암, 폐암 등 여러 종류의 암의 발병에 관여하고 있다. 예를 들어 녹인(knock-in) 마우스를 사용한 miR21을 분석한 결과, miR21은 악성 B세포 림프종을 유발하는 과도한 발현과 함께 종양 유전자의 기능을 한다. miR141은 악성 종양에서도 교란된 것으로 알려져 있으며 암의 성장과 진행에 필수적인 역할을 한다. 많은 연구들이 miRNA가 암의 조기 진단과 예후를 위한 좋은 바이오 마커임을 확인하였다.
임상이나 실험실에서 miRNA를 검출하기 위한 표준 방법은 정량적인 역전사 PCR (qRT-PCR)이다. 이러한 방법은 fM의 민감도로 miRNA를 정확하게 계량할 수 있지만, 여전히 현장 진단 실험이나 시설 제한 환경에서 적용을 제한한다는 단점이 있다. 첫째 증폭 중 형광 신호 강도를 측정하기 위해 비싸고 부피가 큰 유전자 증폭기가 필요하다. 둘째, miRNA의 작은 크기 때문에, 헤어핀 (hair pin) 모양의 프라이머는 복잡하며 최적화로 설계되어야 한다. 상기의 문제를 해결하기 위해 exponential isothermal amplification (EXPAR), loop-mediated isothermal amplification (LAMP), rolling circle amplification (RCA), recombinase polymerase amplification (RPA) 및 strand displacement amplification (SDA)등 다양한 등온 핵산 증폭 전략을 이용하여 높은 민감도와 특이도로 miRNA를 검출하고 있다. 상기 등온 핵산 증폭 전략은 일반적으로 SYBR Green I, TaqMan 및 molecular beacons과 같은 형광 염료를 통해 모니터링 된다. 그러나 어떤 이중 가닥(double strand; ds) DNA에 결합할 수 있는 SYBR Green I은 거짓 양성 결과를 생성할 가능성이 높으며 여러 miRNA에 대한 다중 분석을 매우 어렵게 만든다. 시퀀스-특이적인 TaqMan 및 molecular beacon은 높은 특수성으로 다중 분석이 가능하지만, 특이적인 서열에 맞추어서 형광단 및 소광제로 이중 표지된 DNA 프로브의 설계가 필요하기 때문에, 전체 검사 비용을 시킨다. 따라서 서로 다른 miRNA의 다중 분석을 보다 편리하고 비용 효율적인 방법으로 달성하기 위한 기술이 필요하다.
지난 10년 동안, SELEX라고 불리는 체외 선택에 의해 이의 cognate fluorogen에 결합하는 다양한 라이트 업 RNA 앱타머(light-up RNA aptamers)이 발견되었다. 이러한 앱타머는 해당 형광 발생소와 특별히 상호작용하여 형광 신호를 상당히 강화시킨다. 지금까지, 라이트 업 RNA 앱타머(light-up RNA aptamers)와 형광 발생소로 구성된 서로 다른 쌍들이 전체 가시 스펙트럼을 커버하고 광범위한 용도에 사용되었다고 보고되었다.
qcPCR은 임상 환경에서 miRNA를 검출하는 표준 방법이지만 값비싼 장비와 복잡한 프라이머 디자인 필요하여 현장에서 사용하는데 한계가 있다. 이에 본 발명자들은 라이트 업 RNA 앱타머(light-up RNA aptamers)를 주요 검출 구성 요소로 사용하여 miRNA의 다중 검출을 위한 간단하며 경제적인 방법을 개발하였다. 표적 miRNA의 존재는 전사 증폭과 함께 strand displacement amplification (SDA) 통해 Spinach 및 Mango 앱타머와 같은 다량의 라이트 업 RNA 앱타머를 생성한다. 본 발명의 라이트 업 RNA 앱타머는 해당 형광원 (fluorogen)에 결합하고 서로 다른 파장에서 고도로 향상된 형광 신호를 방출하여 표적 miRNA의 다중 검출을 가능하게 한다. 본 발명을 통해 miR21 및 miR141과 같은 표적 miRNA는 각각 0.955 fM 및 0.195 fM의 검출 한계로 동시에 검출할 수 있다. 다른 암세포의 miRNA가 성공적으로 검출되었고 이는 표준인 qRT-PCR 방법으로 검출한 결과와 동일하므로 임상의 진단 및 예후에 실용적인 방법으로 확인되었다. 본 발명은 기존 검사 기법의 단점을 극복하는데 도움이 될 수 있으며 다른 miRNA를 탐지하는데 유망한 플랫폼이 될 수 있다.
이에 본 발명자들은, 라이트 업 RNA 앱타머(light-up RNA aptamers)를 주요 검출 구성 요소로 사용하여 간단하며 경제적으로 miRNA의 다중 검출할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명은 다중의 miRNA 검출용 주형 핵산 분자(template)에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 5'에서 3' 방향으로 (i) 프로모터 서열; (ii) RNA 앱타머 코딩영역; (iii) nick 부위; 및 (iv) 표적 핵산 분자와 상보적인 서열을 포함하는 주형(template) 핵산분자; (b) RNA 중합효소; (c) 클레나우 절편 (Klenow fragment); (d) 형광단; 및 (e) 절단 효소를 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 5'에서 3' 방향으로 (i) 프로모터 서열; (ii) RNA 앱타머 코딩영역; (iii) nick 부위; 및 (iv) 표적 핵산 분자와 상보적인 서열을 포함하는 주형(template) 핵산분자; (b) RNA 중합효소; (c) 클레나우 절편 (Klenow fragment); (d) 형광단; 및 (e) 절단 효소를 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 5'에서 3' 방향으로 (i) 프로모터 서열; (ii) RNA 앱타머 코딩영역; (iii) nick 부위; 및 (iv) 표적 핵산 분자와 상보적인 서열을 포함하는 주형(template) 핵산분자; (b) RNA 중합효소; (c) 클레나우 절편 (Klenow fragment); (d) 형광단; 및 (e) 절단 효소를 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 서로 다른 두 가지 miRNA의 민감한 다중 검출을 위한 방법에 대한 것이다. (a) 5 '말단의 회색 영역은 T7 RNA 중합 효소가 결합하여 전사를 시작하는 프로모터이고, (b) 주황색 (Mango 앱타머)/ 녹색 (Spinach 앱타머) 영역은 유사한 비형광 물질 (To1- Biotin 또는 DFHBI)에 결합한 후 형광을 크게 향상시키는 라이트 업 RNA 앱타머를 인코딩하며, (c) 검정색 영역은 nicking endonuclease (Nt.AlwI)이 결합하여 SDA 단계 동안 nicking 부위를 생성하는 nick 부위이고, (d) 3'말단의 파랑색 및 노랑색 영역은 miRNA141 (노란색) 및 miRNA21 (파란색)이 특이적으로 결합하는 표적 인식 부위를 포함하는 주형 핵산 분자를 디자인하였다 (도 1).
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 주형(template) 핵산 분자는 서열 번호 1의 염기서열로 이루어진 프로브 또는 서열 번호 2의 염기서열로 이루어진 프로브일 수 있다. 상기 서열 번호 1의 염기서열은 miR 141과 결합하여 Mango RNA 앱타머를 인코딩하여 To1-Biotin에 결합한 후 형광을 크게 향상시킨다. 상기 형광은 507 nm 여기 파장으로 547 nm 의 방출 파장에서 형광 신호를 검출할 수 있다. 상기 서열 번호 2의 염기서열은 miR 21와 결합하여 Spinach RNA 앱타머를 인코딩하여 DFHBI을 결합한 후 형광을 크게 향상 시킨다. 상기 형광은 452 nm 여기 파장으로 506nm 의 방출 파장에서 형광 신호를 검출할 수 있다 (도 1).
발명에서 용어 "프로브(probe)"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 일반적으로 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double stranded DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 표지될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 상기 표적 핵산 분자는 1 종 이상일 수 있다. 본 발명에서 용어 "타겟 DNA(target DNA)" 또는 "타겟 핵산(target nucleic acid)"은 프로브와의 결합에 의하여 시료 내 존재하는 RNA 또는 DNA를 동정하기 위해 선택된 핵산을 의미한다. 바람직하게는 miRNA일 수 있다. 두 가지 miRNA를 동시에 검출하려면 각각의 형광 물질 간의 간섭이 없어야 한다. 각 miRNA와 서로 다른 template의 조합으로 실험을 진행한 결과, miR141과 Template1(T1; 서열 번호 1)이 동시에 존재할 때 Mango 앱타머가 생성되어 형광 물질인 To1-biotin와 결합, 높은 형광을 나타내었다. Mango 앱타머가 생성되었음에도 불구하고 DFHBI와는 결합하지 않아서 신호가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지 원리로 도면 2(c)도 오직 DFHBI와 spinach 앱타머가 결합하여 신호를 생성하였다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 상기 RNA 중합 효소는 T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase 및 SP6 RNA polymerase로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 RNA 중합 효소의 농도는 0.11 U/μL 내지 10 U/μL일 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 1.5 U/μL일 수 있으며 가장 바람직하게는 1 U/μL일 수 있다 (도 4B).
본 발명에서 용어 "프로모터 서열" 은 인지된 서열에 결합하여, 전사 과정을 개시함으로써 RNA 전사물을 생성하는 RNA 중합효소에 의해 특이적으로 인지되는 핵산 서열의 영역을 의미한다. 원칙적으로는, 개시 서열을 인지할 수 있는 공지의 입수가능한 중합효소에 사용할 수 있는 것이라면 어떠한 프로모터 서열을 사용해도 무방하다. 공지의 이용가능한 프로모터는 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6 같은 특정 박테리오파지 RNA 중합 효소에 의해 인지되는 것이다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 상기 형광단은 로다민, 사이아닌(Cyanine) 3, 사이아닌 5, 피렌(pyrene), 사이아닌 2, 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein), 칼세인(Calcein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알렉사(Alexa) 488, 6-카르복시-플루오레세인(FAM), 2',4',5',7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(TET), 플루오레세인 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플루오레세인, 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE), 테트라메틸로다민 (Tetramethylrhodamine), 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 르복시테트라메틸 로다민(TAMRA), 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX(X-rhodamine), 칼슘크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red), Malachite green, 티아디카르보시아닌 (Thiadicarbocyanine), 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) 및 To1-biotin 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) 또는 To1-biotin일 수 있다.
상기 절단 효소는 Nicking Enzyme으로, Nb.BtsI, Nt.BstNBI, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI 및 Nt.AlwI로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 Nt.AlwI일 수 있다.
Klenow 절편과 절단 효소의 비율은 바람직하게는 1:2 내지 1:14일 수 있고, 바람직하게는 1:6 내지 1:10일 수 있으며, 더 바람직하게는 1:8일 수 있다 (도 4D).
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 검출용 조성물은 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)을 이용할 수 있다. 상기 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)은 10분 내지 180분 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 10분 내지 90분 동안 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 45분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 검출용 조성물은 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 및 전사 증폭(transcription amplification)을 이용할 수 있고, 바람직하게는 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 후 전사 증폭(transcription amplification)을 수행할 수 있으며, 상기 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA)은 10분 내지 180분 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 10분 내지 90분 동안 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 45분 동안 수행될 수 있으며, 상기 전사 증폭(transcription amplification)은 10분 내지 120분 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 30분 내지 90분 동안 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 60분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 조성물은 dNTP 및 반응완충액을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 표적 핵산 분자 검출용 키트를 제공할 수 있다.
상기 키트는 핵산 또는 항체 이외에 유전자 발현량이나 발현 패턴의 분석 방법의 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트가 유전자의 발현량이나 발현 패턴을 검출하기 위한 키트인 경우에는, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 키트일 수 있으며, 이러한 RT-PCR 키트는 바이오마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 구체적인 실시 양상에 따라 예를 들어 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 디옥시뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수 (DEPC-water), 멸균수, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 등을 포함할 수 있다. 한편, 상기 키트가 단백질의 존재량이나 존재 패턴을 검출하기 위한 키트인 경우에는, 이 키트는 예를 들어 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 성분을 포함하는 키트일 수 있으며, 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 성분들, 예를 들어 표지된 2차 항체, 발색단 (chromopores), 효소 (예를 들어, 항체와 접합된 효소) 및 그의 기질, 및 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체 등을 포함할 수 있다. 구체적인 실시 양상에 따라서는, 상기 키트는 DNA 마이크로어레이 또는 단백질 마이크로어레이를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 서술한 조성물을 시료와 혼합하여, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 및 전사 증폭(transcription amplification)을 수행하여 핵산 분자를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 핵산 분자를 이용하여 표적 핵산 분자의 검출을 확인하는 단계.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 표적 핵산 분자는 1 종 이상일 수 있다. 본 발명에서 용어 "타겟 DNA(target DNA)" 또는 "타겟 핵산(target nucleic acid)"은 프로브와의 결합에 의하여 시료 내 존재하는 RNA 또는 DNA를 동정하기 위해 선택된 핵산을 의미한다. 바람직하게는 miRNA일 수 있다. 두 가지 miRNA를 동시에 검출하려면 각각의 형광 물질 간의 간섭이 없어야 한다. 각 miRNA와 서로 다른 template의 조합으로 실험을 진행한 결과, miR141과 Template 1(T1; 서열 번호 1)이 동시에 존재할 때 Mango 앱타머가 생성되어 형광 물질인 To1-biotin와 결합, 높은 형광을 나타내었다. Mango 앱타머가 생성되었음에도 불구하고 DFHBI와는 결합하지 않아서 신호가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지 원리로 도면 2(c)도 오직 DFHBI와 spinach 앱타머가 결합하여 신호를 생성하였다.
상기 표적 핵산은 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 및 전사 증폭(transcription amplification)을 통해 라이트 업 앱타머를 (light-up RNA aptamer)를 생산할 수 있다.
본 발명의 주형(template) 핵산 분자는 서열 번호 1의 염기서열로 이루어진 프로브 또는 서열 번호 2의 염기서열로 이루어진 프로브일 수 있다. 상기 서열 번호 1의 염기서열은 miR 141과 결합하여 Mango RNA 앱타머를 인코딩하여 DFHBI에 결합한 후 형광을 크게 향상 시킨다. 상기 형광은 507 nm 여기 파장으로 547 nm 의 방출 파장에서 형광 신호를 검출할 수 있다. 상기 서열 번호 2의 염기서열은 miR 21와 결합하여 Spinach RNA 앱타머를 인코딩하여 To1-Biotin을 결합한 후 형광을 크게 향상 시킨다. 상기 형광은 452 nm 여기 파장으로 506nm 의 방출 파장에서 형광 신호를 검출할 수 있다. 이에 하나의 튜브에서 다중의 miRNA를 분석할 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명의 라이트 업 RNA 앱타머는 해당 형광원 (fluorogen)에 결합하고 서로 다른 파장에서 고도로 향상된 형광 신호를 방출하여 표적 miRNA의 다중 검출하는 효과가 있다. 또한 본 발명의 라이트 업 RNA 앱타머를 이용하여 miR21 및 miR141를 동시에 검출한 결과, 높은 특이성으로, 정확한 검출이 가능한 특징을 가진다. 다른 암세포의 miRNA가 성공적으로 검출하는 효과가 있고, 이는 표준인 qRT-PCR 방법으로 검출한 결과와 동일하므로 임상의 진단 및 예후에 실용적인 방법으로 사용할 수 있는 효과가 있다. 37℃인 등온에서 증폭이 진행되어 현장 진단에서도 사용할 수 있는 효과가 있다. 본 발명은 기존 검사 기법의 단점을 극복하는데 도움이 될 수 있으며 다른 miRNA를 탐지하는 효과가 있다.
도 1은 라이트 업 RNA 앱타머를 사용한 miRNA의 다중 검출에 대한 모식도이다: 템플릿의 (a), (b), (c) 및 (d) 영역은 프로모터 (회색), Mango 앱타머(주황색), Spinach 앱타머(녹색), Nicking 부위(검정색), 표적 인식 부위 (miR141: 노란색, miR21: 파란색)이고, T1'및 T2'는 각각 T1 및 T2의 완전 상보 적 서열을 나타내고, PT1'및 PT2'는 각각 T1 및 T2의 부분 상보적 서열이다.
도 2는 본 발명의 검출 가능성을 확인한 결과로서, (A)는 T1, miRNA 141, Klenow 파편, Nt.AlwI의 500 nM, 50 nM, 0.05 U/μL 및 0.4 U/μL의 각각 농도로 45분 동안 SDA 반응을 한 후 겔 전기 영동을 분석한 결과이고, (B)는 T1, miR141, Klenow 절편, Nt.AlwI, T7 RNA 중합 효소의 100nM, 5nM, 0.05 U/μL, 0.4 U/μL 및 1 U/μL의 각각 농도로 45분동안 SDA을 수행한 후 1시간 동안 전사 증폭하고 형광 방출 스펙트럼을 480 nm의 여기 파장으로 520 nm에서 570 nm까지 다양한 방출 파장에서 형광 신호를 검출한 결과이다.
도 3은 SYBR Green II로 전사 증폭 중 실시간 형광 모니터링한 결과로서, T1, miR141, Klenow 절편, Nt.AlwI 및 T7 RNA 중합 효소의 100 nM, 5 nM, 0.05 U/μL, 0.4 U/μL 및 1 U/μL의 각각 농도로 45분 동안 SDA 증폭 반응을 한 뒤, 전사 증폭을 1분 단위로 SYBR Green II의 형광 신호를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 반응 매개 변수의 최적화를 확인한 결과로서, (A)는 miRNA 141의 부재(w/o) 또는 존재(w/)하에 추가 ss 프로모터, T1 및 miR141의 100 nM 및 5 nM의 각각 농도로 45분간 SDA 수행한 후 1시간 동안 증폭 반응을 수행하여 추가 ss 프로모터의 신호 향상 효과를 확인한 결과이고, (B)는 T1, miR141, Klenow 절편, Nt.AlwI의 100 nM, 5 nM, 0.05 U/μL 및 0.2 U/μL의 각각 농도로 45분간 SDA 수행한 후 1시간 동안 증폭 반응을 수행하여 T7 RNA 중합 효소 농도의 최적화를 확인한 결과이며, (C)는 T1, miR141, Klenow 절편, Nt.AlwI 및 T7 RNA 중합 효소의 100 nM, 5 nM, 0.05 U/μL, 0.4 U/μL 및 1 U/μL의 각각 농도로 45분간 SDA 수행한 후 전사 증폭 시간을 상이하게 하여 전사 증폭 시간의 최적화를 확인한 결과이고, (D)는 Klenow 절편의 농도는 0.05 U/μL로 고정하고, Nicking 효소의 농도를 변경하여 T1, miR141 및 T7 RNA 중합 효소의 100 nM, 5 nM 및 1 U/μL의 각각의 농도로 SDA 및 증폭 반응을 수행하여 Klenow 절편 및 닉킹 효소 비율의 최적화를 확인한 결과이다.
도 5은 두 가지 다른 miRNA를 다중 검출한 결과로서, (A)는 다양한 조건에서 형광 신호를 보여주는 heatmap을 나타내는 결과이고, (B)는 T1, T2, miR141, miR21, Klenow 절편, Nt.AlwI 및 T7 RNA 중합 효소의 100 nM, 100 nM, 5 nM, 5 nM, 0.05 U/μL, 0.4 U/μL 및 1 U/μL의 각각 농도로 45분 동안 SDA 수행한 후 1시간 동안 전사 증폭을 수행한 후 DFHBI의 형광 방출 스펙트럼은 432 nm의 여기 파장으로 470 nm에서 530 nm까지 기록하였고, To1-biotin의 형광 방출 스펙트럼은 480 nm의 여기 파장으로 520 nm에서 600 nm까지 기록하여, Spinach 앱타머 및 Mango 앱타머에 각각 결합하는 DFHBI 및 To1-biotin의 형광 방출 스펙트럼 결과이다.
도 6은 본 발명의 검출 방법의 민감도를 확인한 결과로서, (A)는 DFHBI의 형광 강도와 miR21의 로그 값의 선형 상관 관계를 계산한 결과이고, (B)는 다른 농도의 miR21의 존재하에 DFHBI의 형광 방출 스펙트럼을 452 nm의 여기 파장으로 492 nm에서 550 nm까지 기록한 형광 방출 스펙트럼 결과이며, (C)는 To1-biotin의 형광 강도와 miR141의 로그 값의 선형 상관 관계를 계산한 결과이고, (D)는 다른 농도의 miR141의 존재하에 To1-biotin의 형광 방출 스펙트럼을 480 nm의 여기 파장으로 520 nm에서 570 nm까지 기록한 형광 방출 스펙트럼 결과이다: T1, T2, Klenow 절편, Nt.AlwI 및 T7 RNA 중합 효소의 100 nM, 100 nM, 0.05 U/μL, 0.4U/μL 및 1 U/μL의 각각 농도로 45분간 SDA를 수행하고, 1시간 동안 증폭 반응을 수행하였다.

도 7은 본 발명의 검출 방법의 특이도를 확인한 결과이다: miR21 및 miR141의 다중 검출은 하나의 튜브에서 수행되었고, SDA 및 전사 증폭 후 506 nm (DFHBI) 및 547 nm (To1-biotin)에서 형광 강도를 얻었으며, 각각 표적 miRNA의 부재(w/o) 및 존재(w/)하에 진행하였고, 모든 miRNA의 농도는 5 nM이며, T1, T2, Klenow 절편, Nt.AlwI 및 T7 RNA 중합 효소의 농도는 각각 100 nM, 100 nM, 0.05 U/μL, 0.4 U/μL 및 1 U/μL이고, 45분간 SDA을 수행하였고, 1시간 동안 전사 증폭을 수행하였다.
도 8은 (A) miR21 및 (B) miR141의 로그 값과 주기 정량화 (Cq) 값의 선형 상관 관계 결과이다: 세 가지 프라이머 (hairpin, 정방향 및 역방향 프라이머; 표 1) 각각의 농도는 1μM이었다.
도 9는 다른 세포에서 miRNA를 검출한 결과이다: 본 발명(회색)에서 T1, T2, Klenow 절편, Nt.AlwI 및 T7 RNA 중합 효소의 농도는 각각 100nM, 100nM, 0.05 U/μL, 0.4 U/μL 및 1 U/μL이었고 45분 동안 SDA를 수행하였고 1시간 동안 전사 증폭을 수행하였다. qRT-PCR (녹색)에서는 miR21 및 miR141의 증폭을 위해 3 개의 DNA 프라이머 (1μM, 표 1)를 사용하였다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 실험의 재료 및 방법
모든 DNA 염기 서열은 하기 표 1과 같다. miRNAs (miR21, miR141, miR155, miR429, miR375 및 miR122)을 제외한 모든 DNA 염기서열은 Bionics (Seoul, Korea)을 통해 합성하였다. miRNAs (miR21, miR141, miR155, miR429, miR375 및 miR122)은 Integrated DNA Technology (Skokie, IL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모든 DNA 및 RNA은 DEPC-treated water에 녹여 사용하였다. Klenow DNA polymerase (exo-), T7 RNA polymerase, RNase inhibitor, qPCR kit (TOPreal qPCR 2X PreMIX SYBR Green with low ROX), Moloney murine leu-kemia virus (M-MLV) cDNA Synthesis Kit는 Enzynomics (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. RNA extraction kit (NucleoSpin miRNA)은 MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.KG (Duren, Germany)에서 구입하여 사용하였다. DEPC-treated water 및 Tris-borate-EDTA (TBE) 버퍼는 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Nt.AlwI, CutSmart Buffer, deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs), ribonucleotide triphosphates (rNTPs)은 New England Biolabs (Ips-wich, MA, USA에서 구입하여 사용하였다. Spinach 앱타머에 결합하는 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) 및 SYBR Green II는 SYBR Green II에서 구입하여 사용하였다. Mango 앱타머에 결합하는 To1-3PEG-Biotin Fluorophore (To1-biotin)는 Applied Biological Materials (Richmond, Canada)에서 구입하여 사용하였다. 모든 실험은 RNA의 분해(RNA degradation)을 피하기 위해 DEPC-treated water을 사용하여 수행되었다.
Figure 112020140401365-pat00001
* 상기 회색, 녹색, 주황색, 검은색 파란색 및 노란색은 도 1에 표시한 것과 같이 miR141 및 miR21에 대한 프로모터, Spinach 앱타머, Mango 앱타머, nick 부위 및 표적 특정 부위를 나타낸다.
* 원하지 않는 부반응을 방지하기 위해 T1과 T2의 3' 끝에 인산화(P)를 적용하였다.
실시예 2. 본 발명의 실험 및 프로브의 디자인
도 1은 두가지 다른 miRNA의 민감한 다중 검출을 위한 전체적인 절차를 보여준다. 타겟으로 miRNA 21과 miRNA 141을 선택하였고, T1과 T2는 타겟 miRNA를 인식하도록 합리적으로 설계하였다. T1과 T2는 각각 4 개의 영역으로 구성되어있다. (a) 5 '말단의 회색 영역은 T7 RNA 중합 효소가 결합하여 전사를 시작하는 프로모터이고, (b) 주황색 (Mango 앱타머)/ 녹색 (Spinach 앱타머) 영역은 유사한 비형광 물질 (To1- Biotin 또는 DFHBI)에 결합한 후 형광을 크게 향상시키는 라이트 업 RNA 앱타머를 인코딩하며, (c) 검정색 영역은 nicking endonuclease (Nt.AlwI)이 결합하여 SDA 단계 동안 nicking 부위를 생성하는 nick 부위이고, (d) 3'말단의 파랑색 및 노랑색 영역은 miRNA141 (노란색) 및 miRNA21 (파란색)이 특이적으로 결합하는 표적 인식 부위이다 (표 1). 제안된 전략은 각 표적 miRNA에 대해 단일 template DNA를 필요로 하며 template DNA에서 표적 인식 부위를 변경하여 다른 miRNA의 검출로 간단히 확장 할 수 있다. 프라이머 역할을 하는 표적 miRNA가 존재하면 DNA 중합 효소 (Klenow fragment)가 증폭 반응을 시작하고 T1 및 T2 (T1/T1' 및 T2/T2')에 완전히 보완적인 ds DNA가 형성되어 SDA 반응을 유발한다. dsDNA에서만 작동하여 3'-OH로 새로운 프라이머를 제공하는 Nt.AlwI는 Klenow 절편이 라이트 업 RNA 앱타머의 프로모터 및 DNA 대응물을 포함하는 다수의 단일 가닥 (ss) SDA 생산물 (partial template 1'(PT1') 및 2'(PT2'))을 지속적으로 생산할 수 있도록 한다. 중요한 것은 T1과 T2가 과도하게 적용되었기 때문에, SDA 반응을 통해 생성 된 많은 PT1' 및 PT2'가 T1과 T2에 결합하여 각각 dsT1/PT1'및 T2/PT2'를 형성한다. ds 프로모터 부위가 생성됨에 따라 T7 RNA 중합 효소는 전사를 시작하여 전사 증폭을 통해 많은 라이트 업 RNA 앱타머를 생성한다 (도 1). NUPACK 분석을 통해 라이트 업 RNA 앱타머 (Mango 및 Spinach 앱타머)가 상호 작용하지 않아 해당 형광원인 To1-biotin 및 DFHBI이 각각 Mango 및 Spinach 앱타머에 특이적으로 결합하여 크게 향상된 형광 신호를 생성하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 본 발명의 검출 가능성의 확인
도 1과 같은 제안된 전략의 첫번째 SDA 단계를 확인하기 위해 4% 아가로스 겔을 사용하여 겔 전기 영동을 수행하였다. template 1 (T1; 100 nM), template 2 (T2; 100 nM), dNTPs (0.25 mM), 다른 농도의 target miRNA, DEPC-treated water로 구성된 반응 용액 (6.4 μL)을 먼저 가열하였다. 원하지 않은 2차 구조(undesirable secondary structure) 및 이량체(dimer)의 형성을 피하기 위해 95℃에서 5분 동안 변성하고, 25℃로 냉각하였다. 반응 용액에 Klenow DNA polymerase (0.05 U/μL), Nt.AlwI (0.4 U/μL) 및 RNase 억제제 (0.08 U/μL)에 1X CutSmart 버퍼 (50 mM CH3COOK,　10 mM Mg(C2H3O2)2,　100 μg/mL BSA,　20 mM tris-acetate;　pH 7.9) 첨가하여 총 부피를 10 μL로 만든 다음 37℃에서 45 분간 배양하여 SDA를 수행하였다. 반응 용액을 겔에 로딩하고, 135V에서 40분 동안 1X TBE 버퍼에서 실행하였다. 마지막으로 GreenStar Nucleic Acid Staining Solution I (Bioneer, Daejeon, Korea)으로 염색하여 결과를 시각화 하였다. 도 2와 같이, 다수의 ss SDA 생산물 (PT1') 및 DNA duplexes((T1/PT1')은 Klenow 절편과 Nt.AlwI에 의해 매개된 SDA 반응을 통해 타겟 miRNA (miR141)의 존재 하에 생성되었다 (도 2A의 line (e)). 단 miR141 및 Klenow 절편 중 하나라도 없는 경우에는 이러한 현상이 발생하지 않았다 (도 2A의 line (a-c)). Nt.AlwI이 없이 miR141 및 Klenow 절편이 있는 경우, 증폭 생산물 (T1/T1')은 Klenow 절편의 작용으로 생성되었으나, ss SDA 생산물 ((PT1')은 생성하지 못하였다 (도 2A의 line (d)). 상기의 결과를 통해 Klenow 절편과 Nt.AlwI이 SDA 반응의 효율적인 작동을 위해 필수적임을 확인하였다.
다음으로 제안된 전략의 두 번째 단계인 전사 증폭은 높은 형광 신호를 방출하기 위해 ss DNA에 결합하는 SYBR Green II의 형광 신호를 측정하여 확인하였다. 도 3과 같이, T7 RNA 중합 효소의 존재와 더불어 SDA 반응의 성분들은 SYBR Green II의 높은 형광 신호에 의해 증명 되었듯이 전사 증폭을 통해 많은 RNA 생산물을 생산한다. 반면에 miR141, Klenow 절편, T7 RNA 중합효소와 같은 성분이 없을 때는 전사 증폭이 발생하지 않는다 (도 3의 a, c 및 d). Nt.AlwI만 부재한 경우 Klenow 절편은 ds 프로모터를 포함하는 증폭 산물 (T1/T1
Figure 112020140401365-pat00002
을 형성하여 T7 RNA 폴리메라아제에 의한 전사 증폭을 가능하게 한다 (도 3b). 그러나 RNA 생산물의 양은 모든 성분을 포함하는 RNA 생산물보다 적었다 (도 3e). 전반적으로, 이러한 결과는 겔 전기 영동으로 얻은 결과와 일치한다. 상기의 실험을 통해 라이트 RNA 앱타머로 검출 실현 가능성을 확인하였다. 도 1에서 설명한 바와 같이 T1은 Mango RNA 앱타머를 생산하기 위해 설계되었기 때문에 To1-biotin을 형광원으로 사용하였다. 도 2(B)의 결과와 같이 miR141, Klenow 절편, T7 RNA 중합효소(a, c, d)와 같은 성분이 없을 때 To1-biotin으로부터 형광 신호를 얻지 못하여 등온증폭제가 시작되지 않았음을 확인하였다. ds 프로모터를 포함하는 완전하게 일치하는 ds T1/T1'의 형성에 기여하는 Nt.AlwI가 부재하였을 때 To1-biotin의 형광 신호(ca. 50%)가 생성되었다 (도 2A의 line b). 그러나 형광 신호는 도 2(A)와 도 3에 나타난 결과에 따라 모든 구성 요소(도 2A의 line e)가 있는 경우보다 높지 않았다.
나아가 PT1'에서 프로모터 지역에 바인딩하는 ss 프로모터를 추가하면 증폭 효율을 높일 수 있을지를 평가하였다. 도 4와 같이, 추가 ss 프로모터가 있는 경우와 없는 경우의 To1-biotin의 형광 강도를 비교하였다. miR141이 존재하는 형광 신호는 추가 ss 프로모터가 있는 경우와 없는 경우 모두 비교가 가능하지만, miR141이 없는 경우 background 신호는 추가 ss 프로모터가 없는 경우가 추가 ss 프로모터가 있는 경우보다 훨씬 높았다. signal-to-noise의 비율을 계산할 때, 추가적인 ss 프로모터가 없는 것은 ca. 24.43이고, 이는 추가 ss 프로모터가 있는 것 보다 훨씬 높았다. 추가적인 ss 프로모터가 있는 상황에서 원치 않는 부작용은 배경 형광 신호를 증가시킨다고 가정하였다.
대상 miRNA의 효율적인 분석에 필요한 파라미터가 최적화 되었다. T7 RNA 중합 효소의 양, 전사 증폭 시간, Klenow 절편과 Nt.AlwI의 비율을 비교 한 실험 결과, 1U/μL의 T7 RNA 중합 효소, 60 분의 전사 증폭 반응 및 Klenow와 Nt.alwI 간의 1:8 비율이 최고의 signal-to-noise를 달성하기 위한 가장 최적의 조건이었다 (도 4(B-D)).
실시예 4. miRNA의 다중 검출
고감도 표적 miRNA 검출을 위해 SDA (strand displacement amplification)를 이용한 등온 증폭과 전사 증폭을 수행 하였다. template 1 (T1; 100 nM), template 2 (T2; 100 nM), dNTPs (0.25 mM), 다른 농도의 target miRNA, DEPC-treated water로 구성된 반응 용액 (6.4 μL)을 먼저 가열하였다. 원하지 않은 2차 구조(undesirable secondary structure) 및 이량체(dimer)의 형성을 피하기 위해 95℃에서 5분 동안 변성하고, 25℃로 냉각하였다. 반응 용액에 Klenow DNA polymerase (0.05 U/μL), Nt.AlwI (0.4 U/μL) 및 RNase 억제제 (0.08 U/μL)에 1X CutSmart 버퍼 (50 mM CH3COOK,　10 mM Mg(C2H3O2)2,　100 μg/mL BSA,　20 mM tris-acetate;　pH 7.9) 첨가하여 총 부피를 10 μL로 만든 다음 37℃에서 45 분간 배양하여 SDA를 수행하였다. 80℃에서 10 분 동안 효소를 비활성화 한 후 두 번째 전사 증폭을 하였다. rNTPs (0.5 mM), T7 RNA polymerase (1 U/μL), 10 μM of DFHBI, 100 nM of To1-biotin에 0.5X 반응 버퍼 (3 mM MgCl2,　0.5 mM dithiothreitol, 1 mM spermidine,　20 mM Tris-HCl;　pH 7.9)를 첨가하여 총 부피를 20 μL로 만들고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 마지막으로 반응 용액을 384 웰 플레이트로 옮기고 마이크로 플레이트 리더 (SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 형광 신호를 측정하였다. DFHBI의 형광 강도는 각각 452 nm 및 506 nm의 여기 및 방출 파장에서 측정하였다. To1-biotin의 형광 강도는 각각 507 nm 및 547 nm의 여기 및 방출 파장에서 측정하였다. Mango 및 Spinach RNA 앱타머에 각각 바인딩하는 To1-biotin과 DFHBI 사이에 형광 간섭이 없음을 입증하였다. 도 5A의 Heatmap에 나타난 바와 같이, T1이 타겟 대상인 miR141 (도 5A의 b)과 함께 있을 때와 T2가 타겟 대상인 miR21 (도 5A의 c)과 함께 있을 때만 각각 To1-biotin과 DFHBI의 높은 형광 신호를 얻었다. 반면에 T1의 타겟 대상이 아닌 miR21 (도 5A의 a)과 함께 있을 때와 T2의 타겟 대상이 아닌 miR141 (도 5A의 d)는 To1-biotin과 DFHBI의 형광 신호는 생성되지 않았다. T1과 T2의 존재는 타겟 miRNA (도 5A의 e 및 f)의 특정 검출에 지장을 주지 않는 것으로 확인되었다. DFHBI와 To1-biotin의 형광 방출 스펙트럼은 각각 506nm와 547nm의 최대 방출 파장에서 명확하게 구별되었다 (도 5B). 상기 결과를 통해 SDA와 결합하여 라이트 업 RNA 앱타머를 이용한 제안된 전략이 miRNA의 다중 검출에 적합하다는 것을 확인하였다.
실시예 5. miRNA의 검출 민감도의 측정
본 발명의 검출 민감도는 miR21 및 miR141의 다른 농도에서 형광 강도를 측정하여 확인하였다. 도 6A 와 6B과 같이 1 fM에서 100 pM까지의 miR21 농도의 로그 값에서 선형 관계가 확인되었다. 상관 관계 회귀 방정식은 상관 계수 (R2)가 0.99인 F = 10082ХlogC + 51789에 적합하였다. 공식: 표준 편차Х3/기울기를 사용하여 계산된 검출 한계 (LOD)는 0.955 fM으로, 다른 등온 증폭 전략과 비슷하거나 뛰어났다 (표 2). 상기와 같은 방식으로 1 fM에서 100 pM까지의 miR141 농도의 로그 값을 사용하여 miR141의 선형 관계도를 얻었다 (도 6C 및 도 6D). 상관 회귀 방정식은 0.96의 상관 계수로 F= 7598ХlogC+50836에 적합하였다. LOD는 0.195 fM으로 추정되었다.
Figure 112020140401365-pat00003
실시예 6. miRNA의 검출 특이도의 측정
본 발명의 검출 특이성을 측정하기 위해 다른 miRNA (miR21, miR141, miR429, miR122, miR155, miR375)의 존재에서 실험이 수행되었다. 도 7과 같이 miR21에 특이적인 실험군(도 7의 검은색: DFHBI)에서 T2에만 결합하는 miR21의 존재는 많은 수의 Spinach 앱타머를 생성하고 DFHBI에 결합한 후 506 nm의 최대 방출 파장에서 상당히 증가된 형광 신호를 생성했지만, 다른 miRNA의 존재는 무시할 수 있는 형광 신호를 생성하였다. 유사한 방식으로, miR141에 특이적인 실험 그룹 (도 7의 회색: To1-biotin)에서 Mango 앱타머는 miR141의 존재 하에서만 생성되었으며, To1-biotin에 결합한 뒤 547 nm의 최대 방출 파장에서 상당히 증가된 형광 신호를 방출하였다. 그러나 다른 non-target miRNA는 특정 표적 miRNA의 검출을 방해하지 않아 제안 된 시스템이 우수한 특이성을 가지고 있음을 입증하였다. 나아가, 중요한 것은 miR21과 miR141이 동시에 존재할 때 DFHBI와 To1-biotin 모두에서 발생하는 높은 형광 신호가 얻어져 본 발명의 기술이 다중의 miRNA를 검출할 있다는 것이다.
실시예 7. 세포 내 miRNA 검출
제안된 세포 샘플 분석 전략의 실제 적용 가능성을 조사하기 위해 HT29 (대장암), MCF-7 및 MDA-MB-231(유방암), HeLa(자궁 경부암)을 포함하는 다양한 세포에서 miR21 및 miR141의 다양한 발현 수준을 확인하였다. HT29 세포는 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토 마이신 (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 Dulbecco의 Modified Eagle 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. MCF-7 및 MDA-MB-231 세포는 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토 마이신 (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 RPMI 1640 (Welgene, Gueongsan, Korea)배지에서 37℃ 및 5% CO2로 배양하였다. HeLa 세포는 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토 마이신 (Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 Minimum Essential Media Eagle (Welgene, Gueongsan, Korea)배지에서 37℃ 및 5% CO2로 배양하였다. RNA 추출 키트(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co. KG의 NucleoSpin miRNA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 배양된 세포에서 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA의 농도는 SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices)를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 추출한 RNA (10 ng/μL)는 상기 설명한 miRNA의 다중 검출과 동일한 절차를 거쳐 qRT-PCR을 사용하여 비교하였다. qRT-PCR의 경우 각 표적 miRNA에 대해 3 개의 프라이머를 설계하였다 (표 1). M-MLV cDNA 합성 키트 (Enzynomics) 및 헤어핀 프라이머 (1 μM)를 사용하여 표적 miRNA는 먼저 반응 용액을 25℃에서 10분 동안 반응시킨 다음 42℃에서 1시간 동안 다시 반응하여 cDNA로 전환하였다. 추출한 RNA (10 ng/μL)는 모두 동일한 농도로 실험에 사용되었다. 95℃에서 5분간 효소를 비활성화한 후 qPCR 키트 (TOPreal qPCR 2X Pre-MIX [SYBR Green with low ROX], Enzynomics) 및 정방향/역방향 프라이머 (1μM)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭은 95℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 15초, 58℃에서 15초 및 72℃에서 30초의 총 30 사이클을 CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 서로 다른 세포에서 표적 miRNA의 정량 분석을 위해 서로 다른 농도의 표준 miRNA를 사용하여 표준 곡선을 얻었으며, 표준 곡선에서 주기 정량화 (Cq) 값을 보정하여 서로 다른 세포에서 miR21 및 miR141의 양을 측정하였다. 세포에서 총 RNA를 추출한 후 본 발명을 사용하여 miRNA의 발현 수준을 결정하고, 상기 결과를 표준 qRT-PCR 기술을 사용하여 얻은 결과(도 8)와 비교하였다. 도 9와 같이 HeLa 세포에서 miR21 및 miR141의 발현 수준이 매우 낮음을 확인하였다. 또한 MCF-7 세포에서 miR21과 miR141의 높은 발현을 확인한 반면에 MDA-MB-231 세포에서는 miR21만이 높은 발현을 확인하였는데 이는 이전 연구 결과와 동일하였다. 본 발명을 사용하여 얻은 결과가 qRT-PCR을 사용하여 얻은 결과와 일치하여 라이트 업 RNA 앱타머를 사용하는 방법이 세포에서 miRNA의 분석에 적용할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> Highly sensitive multiplex detection of microRNA using light-up RNA aptamers <130> 1068507 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template 1 <400> 1 taatacgact cactataggg cgggagaagg acgggtccag cgttcgcgct gttgagtaga 60 gtgtgagctc ccatatgatc ctcaacatca gtctgataag cta 103 <210> 2 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template 2 <400> 2 taatacgact cactataggg gtacgaagga aggtttggta tggggtagtt gtcgtacata 60 tgatccccat ctttaccaga cagtgtta 88 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Additional promoter <400> 3 taatacgact cactataggg 20 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR21 <400> 4 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR141 <400> 5 uaacacuguc ugguaaagau gg 22 <210> 6 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR155 <400> 6 uuaaugcuaa ucgugauagg gguu 24 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR429 <400> 7 uaauacuguc ugguaaaacc gu 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR375 <400> 8 uuuguucguu cggcucgcgu ga 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR122 <400> 9 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 10 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hairpin primer of qRT-PCR primers for miR21 <400> 10 gaaagaaggc gaggagcaga tcgaggaaga agacggaaga atgtgcgtct cgccttcttt 60 ctcaacatc 69 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of qRT-PCR primers for miR21 <400> 11 aggcggtagc ttatcagact 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer of qRT-PCR primers for miR21 <400> 12 cgaggaagaa gacggaagaa t 21 <210> 13 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hairpin primer of qRT-PCR primers for miR141 <400> 13 gaaagaaggc gaggagcaga tcgaggaaga agacggaaga atgtgcgtct cgccttcttt 60 cccatcttt 69 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of qRT-PCR primers for miR141 <400> 14 aggctgtaac actgtctggt 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of qRT-PCR primers for miR141 <400> 15 cgaggaagaa gacggaagaa t 21

Claims (11)

  1. (a) 5'에서 3' 방향으로 (i) 프로모터 서열; (ii) RNA 앱타머 코딩영역; (iii) nick 부위; 및 (iv) 표적 핵산 분자와 상보적인 서열을 포함하는 주형(template) 핵산분자; (b) RNA 중합효소; (c) 클레나우 절편 (Klenow fragment); (d) 형광단; 및 (e) 절단 효소를 포함하는, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 및 전사 증폭(transcription amplification)을 이용한 표적 핵산 분자의 다중 검출용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 주형(template) 핵산 분자는 서열 번호 1의 염기서열로 이루어진 프로브 또는 서열 번호 2의 염기서열로 이루어진 프로브인, 표적 핵산 분자의 다중 검출용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 표적 핵산 분자는 1 종 이상인, 표적 핵산 분자의 다중 검출용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 RNA 중합 효소는 T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase 및 SP6 RNA polymerase로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 표적 핵산 분자의 다중 검출용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 형광단은 로다민, 사이아닌(Cyanine) 3, 사이아닌 5, 피렌(pyrene), 사이아닌 2, 녹색형광단백질(GFP; Green Fluorescent Protein), 칼세인(Calcein), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 알렉사(Alexa) 488, 6-카르복시-플루오레세인(FAM), 2',4',5',7'-테트라클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(HEX), 2',7'-디클로로-6-카르복시-4,7-디클로로플루오레세인(TET), 플루오레세인 클로로트리아지닐(Fluorescein Chlorotriazinyl), 플루오레세인, 오레건 그린(Oregon Green), 마그네슘 그린(Magnesium Green), 칼슘 그린(Calcium Green), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE), 테트라메틸로다민 (Tetramethylrhodamine), 테트라메틸-로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 르복시테트라메틸 로다민(TAMRA), 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 피로닌 Y(Pyronin Y), 리싸민(Lissamine), ROX(X-rhodamine), 칼슘크림선(Calcium Crimson), 텍사스 레드(Texas Red), 나일 레드(Nile Red), Malachite green, 티아디카르보시아닌 (Thiadicarbocyanine), 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) 및 To1-biotin 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 표적 핵산 분자의 다중 검출용 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 dNTP 및 반응완충액을 추가로 포함하는, 표적 핵산 분자의 다중 검출용 조성물.
  9. 제 1항의 조성물을 시료와 혼합하여, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification, SDA) 및 전사 증폭(transcription amplification)을 수행하여 핵산 분자를 증폭하여 라이트 업 앱타머(light up aptamer)를 생산하는 단계; 및
    상기 증폭된 핵산 분자에서 생산된 라이트 업 앱타머를 이용하여 표적 핵산 분자의 검출을 확인하는 단계;
    를 포함하는, 표적 핵산 분자를 검출하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 표적 핵산 분자는 1종 이상인, 표적 핵산 분자를 검출하는 방법.
  11. 삭제
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