JP4602945B2

JP4602945B2 - 核酸の同定のための後ｐｃｒ特性の複合した非対称ｐｃｒ

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Publication number: JP4602945B2
Application number: JP2006179847A
Authority: JP
Inventors: ニュートンニコラス; ゴードンウィルスティーブン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2005-06-30
Filing date: 2006-06-29
Publication date: 2010-12-22
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Description

本発明は、核酸化学の分野と核酸同定の分野に関する。より詳細には、本発明は、特定の核酸配列を増幅し、分類するための方法と組成物に関するものであり、この方法と組成物は、診断などの目的に使用できる。

迅速かつ信頼性よく核酸を分類／同定する必要のあるケースが、特に医学などの分野に多数存在している。例えば多くの疾患や感染症は、多数の病原体（病原体は互いに関連していることがしばしばある）によって引き起こされる。疾患の症状は互いに似ているように見えても、効果的な治療を行なうには原因となる実際の病原体を明らかにすることが最も重要である。それは、感染性のある別々の種を区別する場合に当てはまるだけでなく、互いに密接に関係した媒体（例えばC型肝炎ウイルス（HCV）のサブタイプなど、ある1つの病原体の異なる株）を識別しようとする場合にも当てはまるが、後者の場合には、この問題は解決がより一層困難である可能性がある。

さらに、遺伝子型の迅速かつ信頼性ある決定法は、1人のヒトの対立遺伝子の組成、または個人間の対立遺伝子の組成の違いを明らかにする上で有用である可能性がある。例えばある個人の特定の対立遺伝子を信頼性よく分類できると、ヒトの遺伝学カウンセリングに役立ち、特定の対立遺伝子が検出された場合には、予防処置を計画するのにさえ役立つ可能性がある。特定の対立遺伝子を同定することは、マーカー支援選択（例えば作物や動物の育成計画）を実施する際のほか、病原体その他の生物の同定や遺伝子型決定を行なう際にも極めて有用である。

さまざまな核酸を検出したり、同定したり、遺伝子型を決定したり、定量化したりするための多数の異なる方法が現在存在している。そのうちの多くは、核酸プローブと調べる核酸の間のさまざまな結合作用（例えば制限長断片多型分析、シークエンシング、特定の標的配列が存在しているときだけ起こるプローブの開裂など）を含む方法に依存している。

しかし、より早く、より簡単で、より柔軟な分析ツールが常に必要とされている。核酸配列の分類または遺伝子型決定を行なうための理想的な方法は、利用しやすくて必要な要素の操作回数が最少であるため、エラーの機会が減るとともにコストが低下するようなものであろう。本発明は、この明細書、請求項、図面を調べることによって明らかになる上記利点とそれ以外の利点を提供する。

この明細書に記載したいろいろな特徴の中で、本発明は、サンプル中の1つ以上の核酸標的（例えば対象からの血液サンプルまたは尿サンプル、および／または対象からの生物学的単離物（例えば核酸サンプル）を溶液中で混合したサンプル）を同定する方法を含んでいる。この方法は、標識した1種類以上の5'-ヌクレアーゼ・プローブと、標識した1種類以上のハイブリダイゼーション・プローブとを含む反応混合物の中で非対称PCRを実施し（例えば配列、標識などに関し、5'-ヌクレアーゼ・プローブはハイブリダイゼーション・プローブと同じであってもよいし、両方のプローブが互いに異なっていてもよい）；例えば蛍光などのインディケータを追跡することにより、動的PCR（kPCR）から1つ以上の増加曲線をモニターしてそのような増加曲線を構成し；kPCRの後に反応混合物の温度を変化させる（例えばある範囲にわたって温度を上昇または下降させるが、そのとき連続した1つの範囲にわたって、または多数の離散した温度にわたって変化させる）ことにより、標識したハイブリダイゼーション・プローブと核酸標的の間の会合（例えば融解またはアニーリング）を変化させ；標識したハイブリダイゼーション・プローブから発生する1つ以上の蛍光信号（またはいくつかの実施態様では、輻射などの信号）をモニターすることにより、融解曲線またはアニーリング曲線を作り；このようにして作った融解曲線またはアニーリング曲線を、既知の核酸標的からなる完全に相補的なプローブまたは一部が相補的なプローブ、あるいは既知のサンプルに対してテストした同じプローブの基準融解曲線または基準アニーリング曲線と相関させることにより、サンプル中の核酸標的を同定する操作を含んでいる。基準融解曲線または基準アニーリング曲線は、場合によっては、決まった条件下でのその曲線の実際の振る舞いから決定することや、その曲線の実際の振る舞いとは無関係に、決まった条件下でのハイブリダイゼーション・プローブと標的の核酸組成に基づいて予測することができる。

このような方法のいくつかの実施態様では、“1つ以上の核酸標的を同定する”には、標的核酸を有する生物または生物株の同定操作が含まれる。例えばさまざまな実施態様では、同定操作は、特定の細菌または細菌株（例えばブドウ球菌属、マイコバクテリウム属、ボレリア属、さまざまな腸球菌、さまざまな大腸菌株など）、特定のウイルスやウイルス株（例えばHCV、HIV、インフルエンザ、HPV、HBV）、特定の真菌または真菌株の同定、または特定の対立遺伝子またはハプロタイプ（例えば遺伝学カウンセリングで利用されているように、特定の対立遺伝子の存在および／またはタイプの検出）の存在確認を伴う可能性がある。

この明細書に記載した非対称動的PCRにおけるさまざまな実施態様では、第1のプライマーと第2のプライマーの比は、選択的に操作することができる。例えばいくつかの実施態様では、非対称kPCRは、1つの第1のプライマーと少なくとも1つの第2のプライマーを含んでおり、第1のプライマーの量は、第2のプライマー（すなわち制限プライマー）の量よりも多い。またいくつかの実施態様では、（非対称kPCRにおいて第1のプライマーすなわち非制限プライマーによって生じた鎖と相補的な）1つ以上のハイブリダイゼーション・プローブが、反応混合物中に、第2のプライマーすなわち制限プライマーよりも多くの量存在している。例えばいくつかの実施態様では、（第1のプライマーと第2のプライマーの）比は、例えば標的核酸の鎖間の最終的な比（例えば増幅したときの一方の鎖と他方の鎖の比）をどのような値したいかに応じ、例えば少なくとも2：1、少なくとも3：1、少なくとも4：1、少なくとも5：1、少なくとも6：1、少なくとも7：1、少なくとも8：1、少なくとも9：1、少なくとも10：1、少なくとも15：1、少なくとも20：1、少なくとも50：1、少なくとも100：1、少なくとも200：1またはそれ以上にすることができる。

いくつかの実施態様では、この方法は、非対称kPCRを実施した後、蛍光標識または別の標識をした5'-ヌクレアーゼ・プローブを含む増幅インディケータ（例えば標的配列の動的PCR増幅のインディケータ）の存在下で熱融解／アニーリング・ステップを実施する操作を含んでいる。このようなプローブは、標的核酸配列と少なくとも実質的に相補的なものにしてその標的核酸配列とハイブリダイズさせることができる。さまざまな実施態様では、増幅が蛍光の増加によって示されるのに対し、さらに別の実施態様では、増幅が蛍光の減少によって示される。

いくつかの実施態様では、同じプローブを5'-ヌクレアーゼ・プローブおよびハイブリダイゼーション・プローブとして用いることで、本発明の方法の各ステップを単純化・効率化する。したがって例えば5'-ヌクレアーゼ・プローブは、熱融解／アニーリング曲線を作るのに用いたハイブリダイゼーション・プローブと同じプローブにすることができる。しかしさらに別の実施態様では、蛍光標識した5'-ヌクレアーゼ・プローブは、ハイブリダイゼーション・プローブとは例えば配列、標識などが異なるプローブにすることができる。

いくつかの実施態様では、プローブ（例えばハイブリダイゼーション・プローブおよび／または5'-ヌクレアーゼ・プローブ）は、核酸標的のある領域と完全に相補的にすることができる。別の実施態様では、プローブは、核酸標的のある領域と一部が相補的になっているようにすることができる。そこで例えばあるサンプルが多数の異なる細菌を含んでいて、そのすべてについて1つの標的領域を増幅することにするが、その標的領域には細菌ごとに異なる配列が含まれている場合、ハイブリダイゼーション・プローブは（5'-ヌクレアーゼ・プローブと同じであってもそうでなくても）、1つの細菌の諸領域と完全に相補的で、しかも他のどの細菌の配列とも一部だけが相補的であるか、まったく相補的ではないようにすることができる。あるいはこのプローブは、その細菌のどの配列とも完全には相補的でない一方で、他の種の配列のそれぞれと一部だけが相補的であるか、まったく相補的ではないようにすることなどができる。

本発明のいくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーション・プローブと核酸標的の会合が変化することで、蛍光が変化する（例えば増加する）可能性がある（したがって、場合によってはその蛍光を検出し、定量化することができる）。さらに別の実施態様では、ハイブリダイゼーション・プローブと核酸標的の会合が変化することで、蛍光が減少する可能性がある。この減少も、検出して定量化することができる。

この明細書の方法で使用するハイブリダイゼーション・プローブは、場合によっては、標的核酸の増幅中に反応混合物の中に存在している可能性がある（例えばハイブリダイゼーション・プローブが5'-ヌクレアーゼ・プローブと同じである場合、または両方のプローブは互いに異なっているが、両方とも増幅前の反応混合物の中に存在している場合など）。あるいはいくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーション・プローブは、標的核酸の増幅中に存在していない可能性がある（例えばハイブリダイゼーション・プローブが5'-ヌクレアーゼ・プローブと同じプローブを含んでおらず、kPCRの後に添加する場合）。

この明細書の実施態様におけるモニタリングは、ある範囲の温度にわたって、例えば連続的な範囲にわたって、またはある範囲内の離散的な温度点において行なうことができる。

5'-ヌクレアーゼ・プローブを通じた標的核酸の動的PCR増幅を検出して定量化する際には、少なくとも第1の蛍光における変化をモニターできると同時に、ハイブリダイゼーション・プローブが標的核酸と会合する際の変化の検出と定量化を、いろいろな蛍光の変化によってモニターすることができる。いろいろな蛍光は、場合によっては、異なるプローブから発生させることができる。異なるいろいろなプローブが存在している実施態様では（すなわち5'-ヌクレアーゼ・プローブがハイブリダイゼーション・プローブと異なっている場合には）、それぞれのプローブを場合によっては（例えば異なる蛍光染料からの）異なる蛍光または他のインディケータによって測定することができる。他の実施態様は、動的PCR増加曲線を得るため、そしてハイブリダイゼーション／融解曲線における会合の変化を知ることを目的として、同じ蛍光を測定する操作を含むことができる。なぜならこれらの曲線は、連続した反応中の異なる時期に蛍光を発生するからである。

いくつかの特徴では、1つ以上の核酸標的がC型肝炎ウイルス（HCV）の核酸（例えば任意のHCV（例えばHCV 1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5、6のいずれか、または他の任意の型、および／または亜型、および／または遺伝子型）からの核酸）を含んでいる方法が、本発明に含まれる。そこでこのような実施態様では、HCV核酸標的を同定することにより、サンプル中のHCV株を同定する。さらに、このような実施態様では、ハイブリダイゼーション・プローブは、1つのHCV株の遺伝子型（または2つ以上のHCV株の遺伝子型）と実質的に相補的である。このような実施態様は、異なるHCV株に対して異なる相補性を示す1つのタイプのハイブリダイゼーション・プローブを含むこと、または、第1のプローブが第1のHCV株遺伝子型と実質的に相補的であり、少なくとも第2のプローブが第2のHCV株遺伝子型と実質的に相補的であるといった具合になっている複数のハイブリダイゼーション・プローブを含むこと、または、これらHCV株遺伝子型の複数の領域と実質的に相補的である複数のハイブリダイゼーション・プローブを含むことができる。

本発明のさらに別の特徴には、サンプル中の1つ以上の核酸を同定するキットが含まれる。このキットは、1つ以上の標的の増幅に特異的なそれぞれ量が異なる複数のプライマーと；核酸標的の少なくとも1つの領域と完全に、または一部が相補的になっていて、融点がTmのハイブリダイゼーション複合体を標的との間に形成する、標識した1つ以上のハイブリダイゼーション・プローブ（場合によっては蛍光標識されている）と；標識した1つ以上の5'-ヌクレアーゼ・プローブ（場合によっては蛍光標識されている）と；標的のリアルタイム非対称PCR増幅を行ない、ハイブリダイゼーション複合体のTmを測定し、ハイブリダイゼーション複合体のそのTmに基づいて核酸を同定するための使用説明書とを含むことができる。このキットのいくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブは同じプローブである。いくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブは同じプローブでなく、例えば配列、標識などが異なっていてよい。

別の特徴によると、本発明には、標識した1つ以上のハイブリダイゼーション・プローブ（場合によっては蛍光標識されている）と；標識した1つ以上の5'-ヌクレアーゼ・プローブ（場合によっては蛍光標識されている）と；1つ以上の標的の増幅に特異的なそれぞれ量が異なる2つ以上のPCRプライマーと；これらのプローブおよびプライマー（と、動的PCRの構成要素である緩衝液、塩など）を含む1つ以上の容器と；この容器に接続されていてその容器内の温度を操作することのできる1つ以上の温度調節装置と；ハイブリダイゼーション・プローブおよび／または5'-ヌクレアーゼ・プローブからの信号（例えば蛍光信号）を検出する構成にされた1つ以上の検出器と；上記検出器と上記温度調節装置に接続されていて、その温度調節装置とその検出器を制御するための1つ以上の使用説明セットを備えるとともに、蛍光信号と容器内の温度を1つ以上の標的核酸の存在と相関させる1つ以上の使用説明セットも備えることができる1つ以上の制御装置とを備えるシステムが含まれる。いくつかの実施態様では、このキットの5'-ヌクレアーゼ・プローブはハイブリダイゼーション・プローブと同じプローブであるのに対し、いくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブは互いに異なっている。いくつかの実施態様では、このシステムは、蛍光標識したプローブを励起するのに有効な光源をさらに含むことができる。別の実施態様では、このシステムは、このシステムによって得られたデータを表示または処理する1つ以上のデバイスまたはサブシステムをさらに備えることができる。

別の特徴によると、本発明には、少なくとも1つの核酸標的の増幅に特異的なそれぞれ量が異なる複数の動的PCRプライマーと、標識した1つ以上の5'-ヌクレアーゼ・プローブと、標識した1つ以上のハイブリダイゼーション・プローブとを含む反応混合物が含まれる。ただし5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブは、同じプローブでも異なるプローブでもよい。このような実施態様では、それぞれのプライマーは異なる量が存在しており、いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーション・プローブが、制限プライマー（すなわち、より少ない量が存在しているプライマー）よりも多く存在している。

本発明により、HCVの遺伝子型決定に適したプローブも提供される。それは例えば、配列ID番号3のポリヌクレオチド配列を含む核酸である。

本発明のこれらの目的および特徴と、他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と合わせて読むとき、より完全に理解できよう。

定義

特に断わらない限り、この明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が関係する分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を持つ。以下の定義は、従来技術における定義を補足するもので本出願が対象であり、本出願と関係するケースまたは無関係のケース（例えば譲受人に譲渡されたすべての特許または出願）のどれかと必ずしも関係があるわけではない。この明細書に記載したのと似た方法や材料、同等な方法や材料はどれも、本発明のテストを実施するのに利用できるが、この明細書には好ましい材料と方法が記載してある。したがってこの明細書で用いる用語は、特定の実施態様を説明することだけを目的としており、そのことによって本発明が制限されることは意図していない。

この明細書と添付の請求項では、単数形の“1つの”や“その”に、文脈からそうでないことが明らかにわかる場合を除いて複数形が含まれる。したがって例えば“1つのオリゴヌクレオチド”に言及するときには複数のオリゴヌクレオチドが含まれており、“1つのプローブ”に言及するときにはそのようなプローブの混合物が含まれるといった具合である。

この明細書では、“サンプル”は、（例えば細菌、ウイルスなどからの）核酸を含むあらゆる物質、または核酸を含んでいると考えられるあらゆる物質を意味する。サンプルは、天然起源のもの、または合成起源のものが可能であり、当業者に知られている任意の手段で得ることができる。このようなサンプルとしては、一人または複数の個人から単離したある量の組織または体液が可能である。具体例としては、例えば皮膚、血漿、血清、全血、脊髄液、唾液、腹膜液、リンパ液、房水、硝子体液、滑液、尿、涙、赤血球、血液製剤、精液、膣液、肺滲出液、漿液、臓器、気管支-肺胞洗浄液、腫瘍、パラフィン埋包組織などがある。サンプルには、試験管内細胞培養物の構成要素や成分も含まれていてよい（例えば細胞培養培地の中で増殖した細胞から得られたならし培地、組み換え細胞、細胞成分など）。核酸は、従来技術でよく知られている方法により、生物サンプルから得ることができる。

“核酸”という用語は、リボ核酸（RNA）ポリマーまたはデオキシリボ核酸（DNA）ポリマーに対応させることのできるモノマーのポリマー、またはそのアナログを意味する。核酸には、ヌクレオチド（例えばRNAやDNA）のポリマー、その修飾された形態、ペプチド核酸（PNA）、ロックされた核酸（LNA（登録商標））などのポリマーが含まれる。いくつかの用途では、核酸は、複数のタイプのモノマー（例えばRNAのサブユニットとDNAのサブユニットの両方）を含むポリマーにすることができる。核酸としては、例えば、染色体またはその断片、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のDNAポリマーまたはRNAポリマー、アンプリコン、オリゴヌクレオチド、プライマー、プローブなどが可能である。核酸としては、例えば、一本鎖または二本鎖のもの、DNA：RNAハイブリッド、DNAとRNAのキメラ構造体が可能である。特に断わらない限り、特定の核酸配列は、場合によっては、明示したあらゆる配列に加え、相補的な配列も含むかコードしている。“核酸”、“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”で長さが違うとは考えておらず、これらの用語は、文脈からそうでないことが明らかにわかる場合を除き、この明細書では同じ意味で使用することができる。これらの用語は、分子の一次構造だけに関する。

核酸は、一般に一本鎖または二本鎖であり、ホスホジエステル結合を一般に含んでいる。しかし場合によっては、この明細書に概略を説明したように、別の骨格を持つことのできる核酸アナログが核酸という用語に含まれる。核酸アナログの具体例としては、ホスホラミド（Beaucage他、1993年、Tetrahedron、第49巻(10)、1925ページと、その中にある参考文献；Letsinger、1970年、J. Org. Chem.、第35巻、3800ページ；Sprinzl他、1977年、Eur. J. Biochem.、第81巻、579ページ；Letsinger他、1986年、Nucl. Acids Res.、第14巻、3487ページ；Sawai他、1984年、Chem. Lett.、805ページ；Letsinger他、1988年、J. Am. Chem. Soc.、第110巻、4470ページ；Pauwels他、1986年、Chemica Scripta、第26巻、1419ページ）、ホスホロチオエート（Mag他、1991年、Nucleic Acids Res.、第19巻、1437ページと、アメリカ合衆国特許第5,644,048号）、ホスホロジチオエート（Briu他、1989年、J. Am. Chem. Soc.、第111巻、2321ページ）、O-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein、『オリゴヌクレオチドとアナログ：実践的アプローチ』、オックスフォード大学出版、1992年）、ペプチド核酸の骨格と結合（Egholm、1992年、J. Am. Chem. Soc.、第114巻、1895ページ；Meier他、1992年、Chem. Int. Ed. Engl.、第31巻、1008ページ；Nielsen、1993年、Nature、第365巻、566ページ；Carlsson他、1996年、Nature、第380巻、207ページ）などがあるが、これですべてではない。なおこれら参考文献は、それぞれが参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。他の核酸アナログとしては、正に帯電した骨格を有するもの（Denpcy他、1995年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第92巻、6097ページ）；非イオン性骨格を有するもの（アメリカ合衆国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号、第4,469,863号；Angew、1991年、Chem. Intl. Ed. English、第30巻、423ページ；Letsinger他、1988年、J. Am. Chem. Soc.、第110巻、4470ページ；Letsinger他、1994年、Nucleoside & Nucleotide、第13巻、1597ページ；ASCシンポジウム・シリーズ580、『アンチセンス研究における炭化水素修飾』（Y.S. SanghviとP. Dan Cook編）の第2章と第3章；Mesmaeker、1994年、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.、第4巻、395ページ；Jeffs他、1994年、J. Biomolecular NMR、第34巻、17ページ；Tetrahedron Lett.、第37巻、743ページ、1996年）；非リボース骨格を有するもの（アメリカ合衆国特許第5,235,033号、第5,034,506号と、ASCシンポジウム・シリーズ580、『アンチセンス研究における炭化水素修飾』（Y.S. SanghviとP. Dan Cook編）の第6章と第7章）などがある。1つ以上の炭素環式糖を含む核酸も核酸の定義に含まれる（Jenkins他、1995年、Chem. Soc. Rev.、169〜176ページ）。いくつかの核酸アナログが、例えばRawls、C & E News、1997年6月2日号、35ページにも記載されている。リボース-リン酸骨格のこうした修飾は、追加部（例えば標識部）の付加を容易にするため、または生理学的環境におけるこうした分子の安定性や半減期を変えるために行なうことができる。

核酸アナログには、核酸に一般に見いだされる天然に存在する複素環式塩基（例えばアデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル）に加え、天然には存在しない複素環式塩基や修飾された他の塩基を有する核酸アナログも含まれる。その多くはこの明細書に記載されており、そうでない場合には言及されている。特に、天然には存在しない多くの塩基が例えばSeela他、1991年、Helv. Chim. Acta、第74巻、1790ページ、Grein他、1994年、Bioorg. Med. Chem. Lett.、第4巻、971〜976ページ、Seela他、1999年、Helv. Chim. Acta、第82巻、1640ページにさらに記載されている。さらに具体例を挙げると、融点（Tm）変更剤として機能するヌクレオチドで使用されるいくつかの塩基が場合によっては含まれる。例えばそのうちのいくつかとして、7-ゼアザプリン（例えば7-ゼアザグアニン、7-ゼアザアデニンなど）、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、プロピニル-dN（例えばプロピニル-dU、プロピニル-dCなど）などがある。1999年11月23日にSeelaに付与された「7-デアザ-2'-デオキシグアノシン・ヌクレオチドの合成」という名称のアメリカ合衆国特許第5,990,303号を参照のこと。代表的な他の複素環式塩基としては、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチンの8-アザ誘導体；アデニン、グアニン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチンの7-デアザ-8-アザ誘導体；6-アザシトシン；5-フルオロシトシン；5-クロロシトシン；5-ヨードシトシン；5-ブロモシトシン；5-メチルシトシン；5-プロピニルシトシン；5-ブロモビニルウラシル；5-フルオロウラシル；5-クロロウラシル；5-ヨードウラシル；5-ブロモウラシル；5-トリフルオロメチルウラシル；5-メトキシメチルウラシル；5-エチルウラシル；5-プロピニルウラシル；4-アセチルシトシン；5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、7-デアザアデニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、7-デアザグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、2,6-ジアミノプリン、5-プロピニルピリミジンなどがある。

修飾された塩基とヌクレオチドの追加例は、例えば、1996年1月16日にFroehlerらに付与された「5-プロピニルピリミジンを含むオリゴヌクレオチド」という名称のアメリカ合衆国特許第5,484,908号、1997年7月8日にFroehlerらに付与された「修飾されたピリミジンを含むオリゴマーを用いた三重螺旋と二重螺旋の形成増大」という名称のアメリカ合衆国特許第5,645,985号、1998年11月3日にFroehlerらに付与された「修飾されたピリミジンを含むオリゴマーの利用法」という名称のアメリカ合衆国特許第5,830,653号、2003年10月28日にKochkineらに付与された「[2.2.1]ビシクロヌクレオシドの合成」という名称のアメリカ合衆国特許第6,639,059号、2001年10月16日にSkouvに付与された「1ステップでのサンプル調製と、複雑な生物サンプル中の核酸の検出」という名称のアメリカ合衆国特許第6,303,315号、2003年5月15日に公開されたKochkineらの「[2.2.1]ビシクロヌクレオシドの合成」という名称のアメリカ合衆国特許出願公開第2003/0092905号にも記載されている。

本発明が、核酸、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドの供給源によって限定されることは想定していない。このような核酸としては、ヒト、非ヒト哺乳動物、他の任意の生物（例えば植物、両生類、細菌、ウイルス、マイコプラズマなど）、組織、細胞系からのものや、任意の組み換え体供給源に由来するもの、試験管内で合成されたもの、化学的に合成されたものが可能である。また核酸としては、DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、ロックされた核酸（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、これらのハイブリッドまたは任意の混合物が可能である。核酸は、二本鎖の形態、一本鎖の形態、一部が二本鎖の形態で存在することができる。本発明の核酸には、精製された形態または未精製の形態の核酸とその断片の両方が含まれ、具体例としては、生物材料（微生物（例えば細菌）、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌、植物、動物、ヒト、マイコプラズマなど）の遺伝子、染色体、プラスミド、ゲノムなどがある。

この明細書では、“対応する”は、核酸内の所定のヌクレオチド配列と同じか、そのヌクレオチド配列と相補的であることを意味するものとする。当業者にとって、この用語の厳密な意味は、この用語が使用されている文脈から明らかであろう。

ある核酸（または別の核酸と“特別な”関係にある核酸）の“相補体”は、その核酸の少なくとも一部の配列と逆平行に会合するか、ハイブリダイズすることができる少なくとも核酸セグメントを意味する。逆平行な会合は、分子内（例えば核酸内のヘアピンループの形態）、または分子間（例えば2つ以上の一本鎖核酸が互いにハイブリダイズするとき）において可能である。天然の核酸には一般に見られないいくつかの塩基（例えばイノシン、7-デアザグアニン、ならびに上記のもの）を本発明の核酸に含めることができる。相補性は完全である必要はない（すなわち核酸は“部分的に相補的”であってよい）。例えば安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基対、すなわち互いに対合しない塩基を含んでいてよい。核酸技術の当業者であれば、多数の変数（例えば相補的な領域の長さ、塩基組成、相補的な領域のヌクレオチド配列、イオン強度、ミスマッチ塩基対の発生）を経験的に考慮することにより、二本鎖の安定性を明らかにすることができよう。

“対象”は、ある1つの生物を意味する。一般に、その生物は哺乳動物、特にヒトである。いくつかの実施態様では、対象は、例えば、遺伝疾患、疾患状態、または他の疾患を有することが疑われる患者である。

1つのモノヌクレオチドペントース環の5'-リン酸がその隣の3'-酸素とホスホジエステル結合によって一方向に結合するというやり方でモノヌクレオチドが配列されてオリゴヌクレオチドを作り上げているため、オリゴヌクレオチドの一端は、5'-リン酸がモノヌクレオチドペントース環の3'-酸素と結合していない場合に“5'末端”と呼ばれ、3'-酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の5'-リン酸と結合していない場合に“3'末端”と呼ばれる。この明細書では、核酸配列も、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にある場合でさえ、5'末端と3'末端を持つと言うことができる。

“プライマー核酸”または“プライマー”は、標的核酸または鋳型核酸とハイブリダイズできる核酸であり、適切な反応条件下で例えばヌクレオチドを組み込んだ生物触媒（例えばポリメラーゼ）を用いることにより、鎖を延長または伸長させることができる。その条件は、一般に、適切な緩衝液（“緩衝液”には、補因子である置換基や、pH、イオン強度などに影響を与える置換基が含まれる）の中に、適切な温度にて、1つ以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸と、ヌクレオチドを組み込んだ生物触媒とが存在しているというものである。プライマー核酸は、一般に、天然または合成のオリゴヌクレオチド（例えば一本鎖のオリゴデオキシリボヌクレオチドなど）である。プライマー核酸は、長さが約6個〜約100個のヌクレオチドの範囲であるハイブリダイゼーション領域を一般に含んでいるが、場合によっては他の長さが利用される。鋳型核酸を用いて十分に安定なハイブリッド複合体を形成するとき、一般に短いプライマー核酸ほどより低い温度を利用する。一般に、鋳型核酸の部分配列と少なくとも一部が相補的であるプライマー核酸があれば、鋳型とハイブリダイズして伸長するのに十分である。例えば所定の標的配列を増幅するのに適したプライマーの設計は従来技術において周知であり、この明細書に引用した文献に記載されている。プライマー核酸は、望むのであれば、例えば分光学的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、化学的方法、または他の方法で検出できる標識を組み込んで標識することができる。例えば有用な標識としては、放射性同位体、蛍光染料、電子が密な試薬、酵素（ELISAで一般に使用されているようなもの）、ビオチンのほか、抗血清またはモノクローナル抗体が利用できるハプテンやタンパク質などが挙げられる。これらのうちの多くのものや他の標識は、この明細書により詳しく説明してある、および／または従来技術で知られている。当業者であれば、いくつかの実施態様において、プライマー核酸をプローブ核酸としても使用できることがわかるであろう。以下の説明を参照のこと。

この明細書では、“プローブ”という用語は、そのプローブ内の少なくとも1つの配列が標的核酸内のある配列と部分的に、または完全に相補的であるため、適切な条件下で標的核酸（またはそのような標的核酸に由来するアンプリコン）のある領域と二本鎖構造を形成できるオリゴヌクレオチド（または他の核酸配列）を意味する。いくつかの実施態様では、プローブは、5'-ヌクレアーゼ反応におけるプライマーの配列と相補的な配列を含んでいない。この明細書で検討してあるように、プローブは、標識してもしなくてもよい。プローブの3'末端を場合によっては“ブロック”し、そのプローブがプライマー伸長産物に組み込まれるのを妨げることができる。“ブロッキング”は、相補的でない塩基を用いることによって、または化合物の一部（例えばビオチンやリン酸基）を最後のヌクレオチドの3'-ヒドロキシルに付加することによって実現できる。化合物の一部は、どのような部分を選択するかにもよるが、二つの目的に役立つ。なぜならその部分は標的としても機能することで、その標的に結合した核酸をあとで検出または捕獲できるからである。ブロッキングは、3'-OHを除去することによっても、または3'-OHが欠けているヌクレオチド（例えばジデオキシヌクレオチド）を利用することによっても、またはかさばる基を付加立体障害によって伸長を阻止することによっても実現できる。

“ハイブリダイゼーション領域”という用語は、核酸の領域のうちで、標的配列と正確に、または実質的に相補的であるためにその標的配列とハイブリダイズする領域を意味する。ハイブリダイゼーション・アッセイで使用するため（例えば配列中の単一のヌクレオチドの違いを区別するため）、ハイブリダイゼーション領域は、一般に長さが約8個〜約100個のヌクレオチドである。ハイブリダイゼーション領域は一般にオリゴヌクレオチド全体を指すが、プローブには、例えばリンカー結合部位として機能してプローブ配列を固体支持体などに結合させる追加のヌクレオチド配列が含まれていてよい。この明細書に記載したプローブには、“5'-ヌクレアーゼ”プローブ（一般に蛍光標識を含んでおり、消光剤も一般に含んでいる）、FRETプローブ、分子ビーコンなどが含まれていてよく、これらのプローブは、サンプル中のプローブと標的核酸の間のハイブリダイゼーションを検出するのにも用いることができる。いくつかの実施態様では、プローブのハイブリダイゼーション領域は、標的配列と完全に相補的である。しかし完全な相補性は一般に必要なく（すなわち核酸は互いに一部が相補的であればよい）、安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基、すなわち対合しない塩基を含んでいてよい。1つ以上のミスマッチ塩基対すなわち対合しない塩基との間でハイブリダイズする安定な二本鎖を可能にするには、ストリンジェント条件の変更が必要となる可能性がある。Sambrook他、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第3版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、2001年（参考としてその内容がこの明細書に組み込まれているものとする）には、適切な修飾のためのガイドが提供されている。標的／プローブ二本鎖の安定性は、多数の変数（例えばオリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成、オリゴヌクレオチド配列、温度、イオン条件）に依存する。当業者であれば、一般に、所定のプローブの正確な相補体がプローブとして同様に有用であることが理解されよう。当業者であれば、いくつかの実施態様において、プローブ核酸をプライマー核酸としても利用できることが理解されよう。

“5'-ヌクレアーゼ・プローブ”は、少なくとも1つの発光性標識部分を備えていて、標的核酸の検出を行なう5'-ヌクレアーゼ反応で使用されるオリゴヌクレオチドを意味する。いくつかの実施態様では、例えば5'-ヌクレアーゼ・プローブは、単一の発光部分（例えば蛍光染料など）だけを備えている。いくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブに自己相補性領域が含まれるため、プローブは選択された条件下でヘアピン構造を形成することができる。さらに説明すると、いくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブが少なくとも2つの標識部分を備えており、その2つの標識の一方が開裂するかオリゴヌクレオチドから分離した後に、強度が大きくなった光が放射される。いくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブが2つの異なる蛍光染料（例えば5'末端のレポーター染料と、3'末端の消光染料または消光部分）で標識されている。いくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブが、末端位置以外の1つ以上の位置に、または末端位置に加えて1つ以上の位置に標識されている。プローブが変化していない場合、エネルギー移動は一般に2つの発蛍光団の間で起こるため、レポーター染料からの蛍光が少なくとも部分的に消える。例えばポリメラーゼ連鎖反応の伸長ステップの間に、鋳型核酸に結合した5'-ヌクレアーゼ・プローブが例えばTaqポリメラーゼの5'から3'へのヌクレアーゼ活性によって、またはこの活性を持つ別のポリメラーゼによって開裂するため、レポーター染料の蛍光はもはや低下しない。具体的な5'-ヌクレアーゼ・プローブは、例えば、Gelfandらに1993年5月11日に付与された「核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を利用したホモジニアス・アッセイ系」という名称のアメリカ合衆国特許第5,210,015号、Higuchiに1999年11月30日に付与された「核酸の増幅と検出を行なうためのホモジニアスな方法」という名称のアメリカ合衆国特許第5,994,056号、Higuchiに2001年1月9日に付与された「核酸のホモジニアスな増幅と検出を行なうための方法と装置」という名称のアメリカ合衆国特許第6,171,785号にも記載されている。なおこれらの内容は、それぞれ参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。別の実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブに、2つ以上の異なるレポーター染料と、3'末端の1つの消光染料または消光部分を標識することができる。

この明細書では、“ハイブリダイゼーション・プローブ”は、Tmの決定に用いる標識したプローブを意味する。いくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブは同じである。別の実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブは別々のプローブであり、それぞれ、場合によっては異なる標識および／または消光剤を含むことができ、それぞれ、場合によっては標的核酸の異なる領域とハイブリダイズすることができる。この明細書では、ハイブリダイゼーション・プローブは、場合によっては二重に標識または消光をしたプローブである。その場合の消光剤は、蛍光性であってもなくてもよい。プローブ内では、エネルギー移動がレポーター部分と消光剤の間で起こる。このようなプローブは、例えば暗い消光剤などを含むことができる。ある場合にはハイブリダイゼーション・プローブは遺伝子型決定プローブとして用いられ、そのプローブを用いてハイブリダイゼーション標的を特定の遺伝子型（例えばウイルスの1つの遺伝子型）に割り当てる。

“標識”は、分子に（共有または非共有）結合した部分、または分子に結合できる部分を意味する。この部分は、その分子に関する情報（例えばその分子を記述する情報またはその分子を同定する情報）、または標識した分子が相互作用する（例えばハイブリダイズする）別の分子に関する情報を提供する、あるいは提供できる。具体的な標識としては、蛍光標識（例えば消光剤や吸光剤などが含まれる）、非蛍光性標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量変更基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、酵素（例えばペルオキシダーゼ、ホスファターゼなどが含まれる）などが挙げられる。標識は、蛍光、放射線、比色分析、重量測定、X線回折、吸収、磁性、酵素活性などによって検出できる信号を出すことができる。標識を利用して検出可能な（そして場合によっては定量化可能な）信号を出させることができる。標識は、核酸またはタンパク質に結合させることができる。

本発明のいくつかの実施態様では、標識は蛍光染料または発蛍光団である。一般に、ある特定の発蛍光団は、ある波長の光を吸収した後に、より長い特定の波長の光を出すことができる。特定の発蛍光団が出す光の波長は、その発蛍光団に特徴的である。したがって特定の発蛍光団は、その発蛍光団をある波長の光で励起した後にそれよりも長い適切な波長の光を検出することによって検出できる。蛍光標識には、負に帯電した染料（例えばフルオレセイン・ファミリーの染料）、電荷が中性の染料（例えばカルボキシローダミン・ファミリーの染料）、正に帯電した染料（例えばシアニン・ファミリーの染料やローダミン・ファミリーの染料）が含まれる。本発明で利用可能な他のファミリーの染料としては、例えばポリハロフルオレセイン・ファミリーの染料、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの染料、クマリン・ファミリーの染料、オキサジン・ファミリーの染料、チアジン・ファミリーの染料、スクアレン・ファミリーの染料、キレート化ランタニド・ファミリーの染料、ALEXA FLUOR（登録商標）染料、BODIPY（登録商標）ファミリーの染料などが挙げられる。フルオレセイン・ファミリーの染料としては、例えば、FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOEなどがある。カルボキシローダミン・ファミリーの染料としては、テキサス・レッド、ROX、R110、R6G、TAMRAなどがある。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、TAMRAは、パーキン-エルマー社（フォスター・シティ、カリフォルニア州）から市販されているのに対し、テキサス・レッドは、モレキュラー・プローブズ社（ユージン、オレゴン州）から市販されている。シアニン・ファミリーの染料としては、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7などがあり、アマーシャムGEヘルスケア社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から市販されている。

この明細書では、“消光剤”は、蛍光染料から出るエネルギーを吸収するか、蛍光染料が光を出す能力を妨げる化合物の部分を意味する。一実施態様では、消光剤と蛍光染料の両方とも共通のポリヌクレオチドに結合する。消光剤は、蛍光染料から吸収したエネルギーを、その消光剤に特徴的な信号として再び放出することができる。したがって消光剤は、“標識”になることもできる。この現象は、一般に、蛍光共鳴エネルギー移動またはFRETとして知られている。あるいは消光剤は、蛍光染料から吸収したエネルギーを熱として散逸させることもできる（すなわち非蛍光性消光剤）。FRETで一般に使用される分子としては、例えば、フルオレセイン、FAM、JOE、ローダミン、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、EDANSなどがある。蛍光染料が標識であるか消光剤であるかは、その励起スペクトルおよび発光スペクトルと、それがペアを形成する蛍光染料によって決まる。例えばFAMは、波長が494nmの光によって非常に効果的に励起され、500〜650nmのスペクトルを持った光を出す。最大の発光は525nmである。FAMは、例えば消光剤としてのTAMRA（最大励起は544nm）とともに用いるのに適したドナー標識である。蛍光染料から吸収したエネルギーを散逸させる非蛍光性消光剤の具体例としては、バイオサーチ・テクノロジーズ社（ノヴァト、カリフォルニア州）から市販されているブラック・ホール・クエンチャーズ（登録商標）、エポック・バイオサイエンシーズ社（ボセル、ワシントン州）から市販されているエクリプス・ダーク・クエンチャーズ、アイオワ・ブラック（インテグレイティッドDNAテクノロジーズ社、コラルヴィル、アイオワ州）などがある。

この明細書では、“5'から3'へのヌクレアーゼ活性”は、鋳型特異的核酸ポリメラーゼの活性を意味すし、例えば、5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性（通常はいくつかのDNAポリメラーゼが関係するため、ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの5'末端から順番に除去される。例えば大腸菌のDNAポリメラーゼIがこの活性を持つのに対し、クレノウ・フラグメントはこの活性を持たない）と5'から3'へのエンドヌクレアーゼ活性（この場合には、開裂が5'末端から2つ以上のホスホジエステル結合（ヌクレオチド）で起こる）の一方または両方がある。特定の動作理論に囚われるつもりはないが、プローブ-鋳型ハイブリダイゼーション複合体における5'から3'へのエンドヌクレアーゼ活性に依存した開裂のための好ましい基質は、フォーク状構造である変位した一本鎖核酸である。加水分解は、一般に、変位した領域を鎖の塩基対形成部とつなぐホスホジエステル結合の位置で起こる。これについては、Holland他、1991年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、第88巻、7276〜7280ページに記載されており、その内容全体が参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。

この明細書では、“熱安定性”および／または“熱活性”核酸ポリメラーゼという用語は、加熱したとき、例えば大腸菌からのヌクレオチド・ポリメラーゼと比べて相対的に安定な、および／または活性な酵素で、ヌクレオシドの三リン酸を重合させる触媒となるものを意味する。一般に、この酵素は、標的配列とアニールしたプライマーの3'末端で合成を開始し、鋳型の5'末端に向かって新しい鎖の合成を続ける。そしてこの酵素が5'から3'へのヌクレアーゼ活性を持っている場合には、アニールされたあらゆる介在プローブを加水分解するため、場合によっては標識されたプローブ断片と標識されていないプローブ断片の両方が放出される。このような作用は、合成が終了するまで、またはプローブ断片が標的配列を融解させるまで続くことになる。テルムス・アクアティクス（Taq）から単離した代表的な1つの熱安定性酵素がアメリカ合衆国特許第4,889,818号に記載されており、それを従来のPCRで用いる方法が、Saiki他、1988年、Science、第239巻、487〜491ページに記載されている。当業者は、他の同様の酵素に馴染みがあろう。Taq DNAポリメラーゼは、DNAの合成に依存した鎖置換5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有する。Erlich編、『PCR技術の原理とDNA増幅への応用』（ストックトン出版、ニューヨーク、1989年）の中の第2章、Gelfand、「Taq DNAポリメラーゼ」を参照のこと。一般に溶液中では、このようなポリメラーゼによるプローブの分解は、あったとしても少ない。

標的または鋳型、プライマー、プローブ（例えば5'-ヌクレアーゼ・プローブなど）の核酸の“5'-ヌクレアーゼ反応”または“5'-ヌクレアーゼ・アッセイ”は、5'から3'へのヌクレアーゼ活性を有する生物触媒を組み込んだヌクレオチドによってプライマーが伸長するときに鋳型核酸とハイブリダイズしたプローブが分解することを意味する。5'-ヌクレアーゼPCR（タックマン反応とも呼ばれる）は一種のPCRまたはRT-PCRであり、一本鎖核酸標的と結合する標識したオリゴヌクレオチド・プローブを利用している。5'-ヌクレアーゼPCRでは、プローブは、1つまたは複数の標的の1つ以上の領域と（少なくとも一部が）相補的である。プローブは、場合によっては多数ある部分のうちの任意のもので標識することができるが、一般には蛍光標識と消光剤で標識する。プローブ内のこれら部分の配置は、それぞれの実施態様で変えることができる。蛍光部分はオリゴヌクレオチド・プローブ上で消光剤の近くにあるため、その蛍光は抑制される。

5'-ヌクレアーゼ・アッセイには、標的核酸に結合したプローブに加え、標的核酸の配列中でその結合したプローブを含む領域を増幅できる増幅用プライマーが含まれる。5'-エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（一般にDNAポリメラーゼなど）は、標的核酸上を相補的なポリマーが伸長していくとき、標識されたプローブを開裂させる。プローブが開裂すると、そのプローブ上の標識はもはや消光剤の近くにはないため、蛍光に現われる識別可能で定量化可能な変化を観察することができる。観察は、増幅の進行と同時に行なうことができる。

もちろん、基本的な5'-ヌクレアーゼ・スキームの範囲で多くの変形例が可能である。例えば5'-ヌクレアーゼ・アッセイのさまざまな組み合わせや応用を利用し、例えばコピー数、遺伝子型、対立遺伝子の組成などを決定することができる。このような変形例のさらに別の具体例は、例えば、Gelfandらに1993年5月11日に付与された「核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を利用したホモジニアス・アッセイ系」という名称のアメリカ合衆国特許第5,210,015号、Gelfandらに1996年1月30日に付与された「互いに隣接してハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに作用するポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性による核酸の検出」という名称のアメリカ合衆国特許第5,487,972号、Gelfandらに1998年9月8日に付与された「標的核酸を検出するための反応混合物」という名称のアメリカ合衆国特許第5,804,375号、Gelfandらに2001年4月10日に付与された「ホモジニアス・アッセイ系」という名称のアメリカ合衆国特許第6,214,979号に見いだすことができる。

5'-ヌクレアーゼ（例えばタックマン（登録商標））アッセイのデータの1つの指標は、一般に閾値サイクル（Ct）として表現される。蛍光レベルがそれぞれのPCRサイクルの間に記録される。蛍光レベルは、増幅反応中のその時点までに増幅された生成物の量に比例する。PCRサイクルは、蛍光信号が最初に統計的に有意であるとして記録される場合に、または蛍光信号が他の任意のレベル（例えば任意の蛍光レベルすなわちAFL）を超えた場合に、閾値サイクル（Ct）である。

実際上は、Ctの値は、動的曲線と蛍光の任意の閾値が交差する点である。Ctの値は、鋳型の初期コピー数の対数に反比例する。Ctの値は、鋳型核酸の初期濃度の対数に反比例するため、標的のコピー数を計算するのに使用できる。

“標的核酸”は、本発明によって増幅および／または同定される核酸を意味する（例えばアンプリコン）。一般に、標的核酸または“標的”は、プローブおよび／またはプライマーが結合する核酸である（例えば標的は、場合によっては、プライマーおよび／またはプローブと完全に相補的な1つ以上の配列を含んでいたり、1つ以上のプライマーおよび／またはプローブと十分に相補的な配列を含んでいたりするため、そのようなプライマーおよび／またはプローブは、適切な環境条件または反応条件において標的核酸と結合する）。一般に、標的が何であるか、遺伝子型、配列などは、本発明の方法によって明らかにされる。“標的プライマー”と“標的プローブ”は、標的核酸とハイブリダイズできるプライマーとプローブをそれぞれ意味する。

“多型”は、複数ある遺伝子型の1つを含んでいる可能性のある核酸の1つまたは複数の部位を意味する。多型としては、当業者に知られている任意の多型が可能であり、可能な突然変異、挿入、欠失が多型に含まれる。多型は、核酸内の1つの部位または複数の部位に存在することが可能であり、多型には1つのヌクレオ塩基（例えば1つのSNP）、または2つ以上のヌクレオ塩基が含まれる。本発明の目的では、“多型”は、核酸の1つの部位における多型、または複数部位多型の特定の1つの部位を意味することができる。いくつかの実施態様では、多型は当業者によく知られている必要はなく、当業者に知られていなくてもよい。多型は、単に、既知の（例えば対照）核酸と標的核酸の間の核酸配列のあらゆる違いであってよい。

2つの核酸配列の“％相補性”または“％一致”を明らかにするには、最適な比較を目的としてその2つの配列のアラインメントを行なう（例えばギャップを第1の核酸配列に導入することで、第2の核酸配列と最適なアラインメントにすることができる）。次に、対応するヌクレオチド位置にあるヌクレオチドを比較する。第1の配列における1つの位置が、第2の配列の対応する位置と相補的なヌクレオチドで占められている場合には、分子はその位置が相補的である。同様に、第1の配列における1つの位置が、第2の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合には、分子はその位置が同じである。2つの配列の間の％相補性（または％一致）は、配列が共有する相補的な位置（または一致する位置）の数を、比較した位置の総数で割った値の関数である（すなわち、％相補性=(互いに相補的な位置の数)×100/(短いほうのヌクレオチドの位置の総数)；％一致=(互いに一致する位置の数)×100/(短いほうのヌクレオチドの位置の総数)）。

2つの配列間の％一致は、数学的アルゴリズムを用いて決定することもできる。2つの配列を比較するのに用いる好ましい数学的アルゴリズムの一例は、KarlinとAltschulのアルゴリズム（1990年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第87巻、2264〜2268ページ）と、それを改変したKarlinとAltschulのアルゴリズム（1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第90巻、5873〜5877ページ）である。このようなアルゴリズムは、Altschulら（1990年、J. Mol. Biol.、第215巻、403ページ）のNBLASTプログラムに組み込まれている。

この明細書では、“Tm”は、“融点”の意味で用いる。融点は、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖（すなわち完全に相補的な二本鎖、または一部が相補的な二本鎖）に含まれる二本鎖のポリヌクレオチドまたはヌクレオ塩基オリゴマー（例えばハイブリダイゼーション複合体）の集団の半分が（所定のイオン強度、pH、核酸濃度で）解離して一本鎖になる温度である。二本鎖ポリヌクレオチドのTmを予測するには、塩基配列と、他の因子（例えば構造特性、配列特性、オリゴマー結合の性質）を考慮する。Tmを予測する方法とTmを実験的に決定する方法は、従来技術で知られている。

例えばTmは、通常は融解曲線によって決定される。そのためには二本鎖核酸分子を制御された温度プログラムで加熱し、その二本鎖の2本の鎖の会合／解離状態を、2本の鎖が完全に解離する温度に到達するまでモニターしてプロットする。Tmは、この融解曲線から読み取る。あるいはTmは、アニーリング曲線から決定することもできる。そのためには二本鎖核酸分子を、2本の鎖が完全に解離する温度まで加熱する。次に、制御された温度プログラムで温度を下げ、二本鎖の2本の鎖の会合／解離状態を、2本の鎖が完全にアニールされる温度に到達するまでモニターしてプロットする。Tmは、このアニーリング曲線から読み取る。

この明細書では、“ストリンジェント”または“ストリンジェント条件”という表現は、従来技術でよく知られているように、イオン強度が低くて高温というハイブリダイゼーション条件を表わす。例えばSambrook他、2001年、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第3版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州；『分子生物学における最新プロトコル』（Ausbel他編、J.ワイリー＆サンズ社、ニューヨーク、1988年）；『生化学と分子生物学における実験技術：核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション』（エルゼビア社、1993年）の中のTijssen、「ハイブリダイゼーションの原理のまとめと核酸アッセイの戦略」を参照のこと。なおそれぞれの内容が参考としてこの明細書に組み込まれているものとする。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度とpHにおいて特定の配列の融点（Tm）よりも約5〜30℃低くなるように選択する。あるいはストリンジェント条件は、所定のイオン強度とpHにおいて特定の配列のTmよりも約5〜15℃低くなるように選択する。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、例えば、pHが約7.0〜8.3における塩の濃度がナトリウム（または他の塩）に関して約1.0M未満（一般にナトリウム・イオンの濃度が約0.01〜約1M）であり、温度が、短いプローブ（例えばヌクレオチドが10〜50個）に関しては少なくとも約25℃、長いプローブ（例えばヌクレオチドが50個超）に関しては少なくとも約55℃というものになろう。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション不安定化剤（例えばホルムアミド）を添加して変えることもできる。長いプローブ（例えばヌクレオチドが50個超）に関するストリンジェントでない条件またはストリンジェンシーが弱い条件の一例は、20mMのトリス（pH8.5）と、50mMのKClと、2mMのMgCl₂とからなる緩衝液を含み、反応温度を25℃にするというものになろう。

この明細書では、“C型肝炎ウイルスの型”という用語は、C型肝炎ウイルス（HCV）をそのゲノムの構成に基づいてカテゴリー化することを意味する。1つのHCV単離体を特定の1つのカテゴリーに分類する際には、そのゲノムが他のHCV単離体と関連していることと、他のHCV単離体とは相対的にあまり関係していないことが反映される。この明細書では、HCVの型の名称は、Simmondsら（1994年、Letter, Hepatology、第19巻、1321〜1324ページ）によって提案されて広く認められている名称と一致している。Zein、2000年、「C型肝炎ウイルス遺伝子型の臨床上の重要性」、Clinical Microbiol. Reviews、第13巻(2)、223〜235ページ；HarrisonとZuckerman編、1997年、『ウイルス性肝炎の分子医学』（ジョン・ワイリー＆サンズ社、チチェスター、イギリス国）の中のMaertensとStuyver、「C型肝炎ウイルスの遺伝子型と遺伝子変異」も参照のこと。Simmondsら（1994年）のシステムは、既知のHCV単離体を11あるHCV遺伝子型の1つ、すなわち遺伝子型1〜11の1つに分類する。それぞれの遺伝子型はさらに、同じ遺伝子型の株間の関連性を反映した亜型と名づけるグループに分けられる。1つのHCV亜型は、遺伝子型の後に小文字のアルファベットを付けて書かれる。例えば亜型1a、亜型1c、亜型6aなどである。個々の単離体の中に見られる遺伝子変異体は、準種と名づける。11種類の遺伝子型すべてで約78種類のHCV亜型が世界中で知られている。亜型の数は一定ではなく、より多くのHCV単離体が研究されて配列が決まるにつれて、さらに追加の亜型（そしておそらく遺伝子型）が認識される可能性がある。

この明細書では、“HCVウイルスの型”という用語は、HCVの遺伝子型またはHCVの亜型を意味する。この明細書では、“HCVの型分類”という用語は、実験的にわかった（例えば未知の型の）HCVを既知の遺伝子型（例えば1、2、3、4、5、6のいずれか、またはそのサブセット）に割り当てること、または実験的にわかったHCVを既知の亜型（例えば1a、1b、1c、2a、2b、2cなど、またはそのサブセット）に割り当てることを意味する。

いくつかの報告書（例えばRobertson他、1998年、Arch. Virol.、第143巻(12)、2493〜2503ページを参照のこと）には、ウイルスのゲノムの構成は、いくつかのHCV遺伝子型が他のHCV遺伝子型よりも互いにより近い関係にあるという観察結果を反映するウイルス系統分岐を作ることによって最もよく表現されることが指摘してある。このシステムでは、クレード1、2、4、5が遺伝子型1、2、4、5に対応するのに対し、クレード3は、遺伝子型3と10を、クレード6は、遺伝子型6、7、8、9、11を含んでいる。本発明の説明では、クレード名を使用しない。

この明細書では、“キット”という用語は、サンプルに関する処理、方法、アッセイ、分析、操作を容易にする要素の組み合わせを意味する。キットは、このキットの使い方を説明する文字で書かれた使用説明書（HCVの遺伝子型を決定する方法を記載した使用説明書）と、本発明の方法に必要な化学試薬または酵素、プライマーとプローブのほか、他のあらゆる要素を含むことができる。本発明のいくつかの実施態様では、RT-PCRを利用してHCVの遺伝子型を決定するキットが提供される。このキットは、例えば、サンプルを回収するための試薬（例えば血液サンプルの回収）、血液からのRNAを回収して精製するための試薬、逆転写酵素、逆転写ならびに第1と第2のcDNA鎖合成を行なってHCVアンプリコンを産生させるのに適したプライマー、熱安定性DNA依存性DNAポリメラーゼ、遊離したデオキシリボヌクレオチド三リン酸などを含むことができるが、それだけに限定されるわけではない。いくつかの実施態様では、逆転写酵素活性と熱安定性DNA依存性DNAポリメラーゼ活性を持つ酵素は、同じ酵素（例えばテルムス属ZO5ポリメラーゼやテルムス・テルモフィルス・ポリメラーゼ）である。

本発明を実施するにあたり、特に断わらない限り、当業者に知られている従来の分子生物学の技術、微生物学の技術、組み換えDNA技術を利用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えばSambrook他、2001年、『分子クローニング：実験室マニュアル』、第3版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州；『オリゴヌクレオチドの合成』（M.J. Gait編、1984年）；『核酸のハイブリダイゼーション』（B.D. HamesとS.J. Higgins編、1984年）；『分子クローニングの実践的ガイド』（B. Perbal、1984年）；『酵素学における方法』シリーズ（アカデミック出版）などを参照のこと。当業者は、同様の多くの参考文献に馴染みがあろう。

本発明には、サンプル（例えば血液や痰などの臨床サンプル、単離したDNAまたはRNAサンプルなど）中の特定の核酸配列を検出、分類、定量化するのに役立つ方法、組成物、システム、反応混合物が含まれる。本発明は、例えば、（例えばヒト、家畜、植物などの）感染症や疾患に特に関与する細菌、ウイルス、真菌などのさまざまな株からの核酸の分類、および／または同定、および／または定量化、および／または遺伝子型決定に利用することができる。

本発明の方法では、標的核酸配列のリアルタイムのポリメラーゼ連鎖増幅または動的ポリメラーゼ連鎖増幅を、標識したオリゴヌクレオチド・プローブ（例えば5'-ヌクレアーゼ・プローブ）の存在下で非対称に実施する。非対称動的PCRを実施すると、一本鎖と二本鎖の増幅産物の混合物が、一方の鎖が他方の鎖よりも過剰になった状態で得られる。動的PCRが終わると、1つ以上のハイブリダイゼーション・プローブを用いて融解／アニーリング曲線を作る。この融解／アニーリング曲線を利用し、ハイブリダイゼーション・プローブのためのTmを得る。このTmは、サンプルに含まれる標的核酸の同定に使用できる。いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーション・プローブが動的PCRの最中に存在しているのに対し、他の実施態様では、ハイブリダイゼーション・プローブを増幅反応が完了した後に添加する。いくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブ（例えば熱曲線を得るのに使用されるプローブ）は、異なるプローブを含んでいる（例えば配列および／または結合部位などが異なる）が、他のいくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブがハイブリダイゼーション・プローブとしても機能することができる。

5'-ヌクレアーゼ・プローブが制限PCRプライマーよりも大量に含まれる非対称動的PCRを行なう実施態様では、過剰な鎖とハイブリダイズする5'-ヌクレアーゼ・プローブの一部は、増幅反応が完了したときに開裂しないまま残される。次に、この“残された”プローブを用い、Tmを決定するためのアニーリング曲線または融解曲線を作ることができる。このTmは、増幅した標的核酸が何であるかを明らかにするのに役立てることができる。

融解またはアニーリングのステップを非対称動的PCRに組み込むには、いくつかのことを考慮する必要がある。第1に、従来の動的PCRでは、プローブの標的は一般に（単なる一本鎖の相補体とは違って）二本鎖のアンプリコンであるため、特にアンプリコンの濃度が後期PCRサイクルで大きくなるとき、鎖の再アニーリングから生じる大きな競合効果が存在する。第2に、どの動的PCRでもプローブはDNAポリメラーゼの5'から3'へのヌクレアーゼ活性によって分解されるため、融解／アニーリング曲線を作るためにはプローブの供給がPCRの終了時に供給されるようにせねばならない。この2つの問題は、両方とも、本発明で非対称動的PCRを実施することで解決できる。非対称動的PCRでは、5'-ヌクレアーゼ・プローブ（例えば5'-ヌクレアーゼ反応で使用するプローブ）が結合する鎖を作るのに用いるプライマーの濃度は、他方のプライマーの濃度よりも過剰になっている。したがってこの操作により、アンプリコンの一方の鎖が他方の鎖よりも大量に産生される。すると今度は5'-ヌクレアーゼ・プローブが、アンプリコンの他方の鎖と競合することなく、（過剰に存在している鎖上の）対応する標的に結合することができる。第2のプライマー（すなわち制限プライマー）も、PCRの間に開裂するプローブの量を制限するため、（追加のハイブリダイゼーション・プローブがPCR後に追加されない実施態様、および／または別のハイブリダイゼーション・プローブを用いる実施態様において）PCR後に融解ステップを実施するのためのプローブが確実に残される。図1を参照のこと。非対称条件下でPCRを実施している間に増加曲線の信号（すなわち開裂した信号）がいかに少ししか失われないかは驚くべきことである。増加曲線の信号にはわずかな低下しかないため、十分な量のプローブが残されて追加の融解データを得ることができる。

リアルタイムPCRまたは動的PCRの間に増加曲線の形で蛍光信号を発生させるのに5'-ヌクレアーゼ・プローブが一般に用いられてきた。このような増加曲線からCt（閾値サイクル）値を計算し、その値を定量的または定性的なアルゴリズムで利用すると、コピー数、遺伝子型、標的が何であるかなどの望む結果が得られる。このプロセスの間に5'-ヌクレアーゼ・プローブは5'-ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって開裂するため、多彩なDNA断片が生じる。そのうちのいくつかは、蛍光レポーターで標識することになる。これらの断片が生じると、その断片はもはや信号発生に寄与しない。しかし非対称動的PCRを利用することにより、例えば非対称PCRを実施したとき、および／または制限プローブよりも過剰にプローブを添加したときにPCRが完了した後、完全な完全長5'-ヌクレアーゼ・プローブを残すことができる。また、増加曲線を作った後に十分な量のプローブが残されるようにすることで、融解ステップまたはアニーリング・ステップを実施することで増幅した標的に関するさらに多くの情報を得ることができる。ある特定のTmは、プローブと標的が完全にマッチしていること、したがって標的核酸が特定のグループのウイルスに属すること、または標的核酸が特定のウイルス、特定のウイルス型、特定のウイルス亜型などであることを示している可能性がある。あるいはTmは、プローブと標的が完全にマッチした場合に得られるであろうTmよりも低い可能性がある。Tmが低下する程度は、どのようなミスマッチが存在しているかを示している（または計算できるようにする）可能性があり、したがって標的配列が異なるグループのウイルスに属していることを示している可能性がある。

したがって本発明で得られるTmは、増加曲線のデータから得られる情報の追加情報となりうる。例えば血液スクリーニング・アッセイにおける陽性サンプル中のウイルスの同定；微生物アッセイにおける細菌または真菌の同定；例えばHCV陽性サンプル中の遺伝子型決定はすべて、本発明のさまざまな実施態様で実施することができる。いくつかの実施態様では、本発明の諸ステップは、キャップを取ることなしに単一試験管ホモジニアス・アッセイで実施される。このようにすると、プライマーとプローブの濃度をわずかに変えるだけでよく、しかも市販されている既存の5'-ヌクレアーゼ反応プラットフォームを利用できるため、既存のアッセイと将来のアッセイの両方にとって価値がある。

典型的な5'-ヌクレアーゼ・アッセイの間に、プローブは、5'-ヌクレアーゼ活性を有する酵素（一般にはTaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼ）によって開裂する。リアルタイムPCRまたは動的PCRの間にプローブが開裂することによって蛍光信号が発生する。この信号を利用し、増加曲線（または増幅曲線）を作る。この曲線は、Ctを計算し、例えば核酸の存在または不在、コピー数、遺伝子型、標的が何であるかなどを定量的または定性的なアルゴリズムから明らかにするのに用いることができる。プローブは、開裂すると、一般にもはや信号の発生には関与できない。本発明により、5'-ヌクレアーゼ・アッセイとして、アッセイを実施した後に所定量のプローブが残るため、その残ったプローブを用いて融解曲線（または熱アニーリング曲線）を作ることができるアッセイが提供される。なぜなら標識したプローブが標的核酸とハイブリダイズするとき、または標的核酸から融解するときに蛍光が変化するからである。標的核酸に関する情報（例えば配列、したがってその標的核酸の遺伝子型やその標的核酸が何であるかなど）を、得られたTmから、増加曲線によって得られた情報とは別に明らかにすることができる。十分な量のプローブが確実に残るようにするため、一方のプライマーを他方のプライマーよりも過剰にして非対称PCRを実施する。

非対称PCR

本発明では、非対称PCRを利用し、動的PCRによる増幅後に十分な量のプローブが確実に残るようにするとともに、そのプローブ（5'-ヌクレアーゼ・プローブまたは非5'-ヌクレアーゼ・ハイブリダイゼーション・プローブ）が結合するssDNAが存在しているようにする。図1に、この明細書で利用する非対称PCRの概略を示してある。図1からわかるように、プローブは過剰な標的核酸の鎖（すなわち過剰なプライマーによって生じた鎖）と結合する。PCRは、プライマーが結合した後に行ない、制限プライマーが欠乏するまで二本鎖標的を合成する。制限プライマーが欠乏する状態になった後は、線形増幅を継続して過剰な一本鎖を生成させる。この過剰な鎖（すなわち他方と比べて過剰な鎖）は、プローブが結合する鎖である。結合したプローブを有する鎖（すなわち過剰な鎖）は、動的PCR増幅の間に5'-ヌクレアーゼが標識を放出することによって発生する信号に関与する鎖であると同時に、PCR後の融解／アニール・ステップにおいてハイブリダイゼーションに関与する信号の発生に関与する鎖である。

非対称PCRを利用する際の1つの因子が、PCRの間に低濃度の制限プライマーが標的核酸の生成と信号の発生に及ぼす効果に関係する。非対称PCRが本発明に過度に影響しないようにするため、CMV 5'-ヌクレアーゼ・アッセイにおいてプライマーを1：1から5：1といういろいろな比にして調べた。図2に、染色したゲルの写真を示してある。ここには、PCRを対称PCR（ここでは各プライマーを30ピコモル）から非対称PCR（ここでは1つのプライマーが50ピコモル、他のプライマーは10ピコモル）に移行させたとき、生成した全標的核酸が減少したことが示されている。しかし図3に示したように、非対称PCRから得られた増加曲線は、いろいろな量のプライマーから発生した蛍光信号にごくわずかな影響しか与えなかった。この結果は、有用な増加曲線を作る上で、非対称PCRにおいてプローブが開裂すれば十分であることを示している。例えばいくつかの実施態様では、プライマーの比を、少なくとも2：1、少なくとも3：1、少なくとも4：1、少なくとも5：1、少なくとも6：1、少なくとも7：1、少なくとも8：1、少なくとも9：1、少なくとも10：1、少なくとも15：1、少なくとも20：1、少なくとも50：1、少なくとも100：1、少なくとも200：1またはそれ以上にすることができる。

図4に、例えば標的が何であるかや、標的の遺伝子型などを明らかにするのに用いられるPCR後の融解曲線を示してある。プライマーの比を違えることが信号発生に及ぼす効果をこの図に見ることができる。完全に対称なPCR（すなわちプライマーが同量存在している場合）では、融解信号がまったくない。最も可能性が高そうな理由は、プローブの大半が増幅プロセスの間に開裂するから、またはアンプリコンの鎖が再アニーリングする際に競合するからというものである。比が2：1未満の非対称PCRでも信号は発生しない。これも同様の理由によるのであろう。プライマーの比が2：1〜5：1だと、いろいろな量の融解信号が観察される。非対称プライマーを用いて発生した信号の大きさは、プライマーの比にほぼ比例する。いくつかの実施態様では、添加するプローブの量は、非対称PCRにおける制限プライマーの量よりも多い。さらに、プローブのTmもプライマーの比に応じてシフトする。その最大の原因としては、Tmはオリゴヌクレオチドの濃度に依存するため、PCRの後にさまざまな濃度のプライマーが残されることが考えられる。

FAMの蛍光を検出するレーザー誘導蛍光キャピラリー電気泳動において反応させることにより、プローブのさまざまな濃度を見ることができる。プライマーの比が大きくなるにつれ、PCRが完了した後に、開裂していないより完全長のプローブが残される。

標的核酸

すでに説明したように、この明細書の標的核酸としては、任意の長さの任意の核酸が可能であり、その核酸の遺伝子型、その核酸が何であるか、その核酸の配列などが明らかにされる。いくつかの実施態様では、標的核酸が全体として何であるかはわかるが、1つ以上の多型の遺伝子型はわからない。例えばサンプルがHCVであることはわかるが、そのウイルスの正確な型または亜型はわからない可能性がある。さらに別の実施態様では、標的が全体として何であるかさえ信頼性よくはわからない可能性がある。本発明の方法を利用し、1つ以上の多型の遺伝子型を同定することができる。明らかにする多型または特定の配列は、2つのプライマー結合部位に挟まれた標的核酸中の任意の位置にある任意のサイズのものでよい。一般に、多型は標的核酸の両端部には存在していないが、両端部にある多型でさえ、本発明の方法を用いて遺伝子型を明らかにすることができる。

標的核酸は、当業者に知られている任意の供給源から得ることができる。例えば生物サンプル（例えば上記のものや、それ以外のもの）から得ることができる。標的核酸としては、任意の天然供給源（例えばヒトまたはヒト病原体、または他の任意の天然供給源）からの核酸が可能である。また、いくつかの実施態様では、標的核酸は、合成法、半合成法、組み換え技術によって作り出すこともできる。

本発明のいくつかの実施態様では、標的核酸を当業者に知られている多数の方法で増幅することができる。そのような方法は、例えば、Saiki他、1988年、Science、第239巻、487〜491ページに記載されている。なおその内容は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。いくつかの実施態様では、増幅技術を利用して標的核酸にヌクレオチド配列を導入すること、または標的核酸中のヌクレオチド配列を変化させることが望ましかろう。例えば同定する多型、または遺伝子型を決定する多型が標的核酸の端部または端部近傍に存在している場合、付加ヌクレオチド配列を標的核酸のその端部に結合させ、本発明の方法を実施しやすくすることができる。

オリゴヌクレオチド・プローブ

本発明は、標的核酸の特定の領域にハイブリダイズする標識したプローブの選択と利用に関する。このようなプローブの選択（例えばその具体的な配列だけでなく、どの標的領域を標的とすべきか）は、調べる具体的な標的が何であるかに大きく依存する。現在のところ、5'-ヌクレアーゼ・プローブや、さまざまな用途のためのそれ以外のハイブリダイゼーション・プローブの選択と設計を助ける多数のソフトウエア・プログラムやそれ以外のプロトコルが存在している。このようなプログラムやプロトコルを場合によっては本発明と組み合わせて利用し、この明細書に記載した非対称動的PCR／融解曲線アッセイのためのプローブの選択と設計を行なうことができる。もちろんプローブの視覚的設計と配置は、本発明にも極めてうまく適用される。融解／アニーリング曲線を作るには、5'-ヌクレアーゼ・プローブだけでなく、いろいろなハイブリダイゼーション・プローブが用いられるが、このようなプローブを設計するためのパラメータは、当業者には極めて馴染み深いものである。いろいろなアルゴリズムやパラメータのセットが利用されていてこのような設計に役立つプログラムとしては、ビジュアルOMP（DNAソフトウエア社、アン・アーバー、ミシガン州）、オリゴ6（ストラタジーン社、ラ・ジョラ、カリフォルニア州）、シークエンチャー（ジーン・コーヅ社、アン・アーバー、ミシガン州）、DNAスター（DNAスター社、マディソン、ウィスコンシン州）などがある。

本発明のいくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブおよび／またはハイブリダイゼーション・プローブに、標的の同定、遺伝子型決定、配列決定を容易にする標識を付ける。プローブのヌクレオチド配列は、標的核酸上の標的領域に適切にハイブリダイズするのに十分な任意の長さにすることができ、そのプローブを標的核酸の遺伝子型決定または同定に用いることができる。この標的プローブの長さは、一般に、PCRのアニーリング・ステップの温度においてプローブが対応する標的にハイブリダイズする上で熱力学的に十分に安定であるように選択する。例えば一般的でないDNA塩基を有するプローブは、場合によっては、一般的なDNA塩基を有するプローブよりも長くしたり短くしたりすることができる。別の具体例として、A/Tが豊富な配列を有するプローブは、Tmが同じだと、G/Cが豊富な配列を有するプローブよりも長くなる。多型領域または標的領域がある部位は、プローブのヌクレオチド配列内のどの位置にあってもよい。いくつかの実施態様では、このような領域がある部位は、プローブのヌクレオチド配列の5'末端ではない。

この明細書で使用するプローブの個々の配列の設計がどうであれ、多数の異なる方法が存在する。例えば同じプローブを5'-ヌクレアーゼ増加曲線と融解／アニーリング曲線の両方に用いることができる。このようなプローブは、場合によっては、調べる可能なすべてのサンプルに共通する（少なくともいくらかの変異がある）標的核酸の1つの領域を標的とする。例えば多数のいろいろな可能性の中からウイルスのある亜型（例えばこの明細書の実施例で説明している亜型）の遺伝子型を決定するには、標的核酸の配列中で各亜型に独自の配列モチーフを含む多型領域を選択することを一般に考慮する。したがってプローブは、標的核酸の遺伝子型が何であるかに応じ、そのような標的領域にそれぞれ違ったようにハイブリダイズする。また、サンプル中のプローブと標的の間で、および／またはサンプル中の異なる遺伝子型相互間でマッチングの程度がこのように異なると、アッセイで得られるTm曲線に影響が及ぶため、核酸サンプルの同定が可能になる。

したがって1つの仮想例では、サンプルは、型が同定されていない任意の数の核酸の混合物を含んでいる可能性がある。例えばサンプルは、おそらく互いに関連しているウイルスの株（例えばHCVの型／亜型）を含んでいる可能性がある。プローブ（5'-ヌクレアーゼ・プローブ、および／または5'-ヌクレアーゼ・プローブとそれ以外の独立したハイブリダイゼーション・プローブ）は、HCV核酸上の特定の多型領域に合わせた設計にすることができる。プローブとさまざまな多型領域の間にミスマッチがあると、プローブとさまざまな標的核酸の間の（同様の条件下での）Tmが異なってくるであろう。想定される標的の配列に基づき、（所定の条件下で）予想されるTmを計算することができよう。

次に、得られた実際のTm曲線を、予想曲線または以前に作った標準曲線と比較することができる。例えばウイルス1が所定の条件下でXというTmになることが予想されるのに、サンプル1はその条件下でXというTmにならなかったとすれば、ウイルス1は、サンプル混合物の可能な成分から除外できよう。同様に、サンプル中の未知成分から得られたTmがYというTmになったとすると、ハイブリダイゼーションの標的領域の配列は、既知のプローブ配列、アッセイ条件などに基づいて計算できよう。すると（例えば計算による配列を既知のウイルスの配列と比較することなどによって）サンプル中のその未知成分を明らかにすることができよう。

本発明のいくつかの実施態様には、分析において5'-ヌクレアーゼ増加曲線を作る際に使用するプローブであって、分析においてTm曲線を作る際に使用するプローブとは異なるプローブを含めることができる。このような構成は、例えば標的核酸上の多型領域に非常に多様性があって増幅条件において機能するであろう安定な5'-ヌクレアーゼ・プローブを構成することが望みにくい場合に有効である可能性がある。したがって例えば完全に相補的な複数のプローブ、または実質的に相補的な複数のプローブ、または一部が相補的な複数のプローブを、5'-ヌクレアーゼ分析に使用できる可能性がある（したがって望むすべての標的の増幅が確実に測定される）のに対し、より一般的なプローブ配列（例えば多数の関連した配列にハイブリダイズするであろうプローブ配列）は、多数の異なる標的配列からTm曲線を作るのに使用できよう。また、本発明のいくつかの実施態様には（例えば動的PCR増加曲線を構成する際の）5'-ヌクレアーゼ・プローブが含まれる一方で、増加曲線と融解曲線を作るのにいろいろなプローブを用いる実施態様では、融解曲線を構成するのに用いるプローブが5'-ヌクレアーゼ・プローブである必要はない（すなわちこのようなプローブは、いくつかの実施態様では必ずしも加水分解されない）ことがわかるであろう。プローブが加水分解されるかどうかは、プローブの設計に影響を与える可能性がある。例えばいくつかの5'-ヌクレアーゼ・プローブは長さが約30bpであり、プローブの両端に染料を含んでいる。しかし加水分解されないプローブでは、長さはより短く、染料は末端に位置していなくてもよい、などの状況になっている。

本発明のいくつかの実施態様では、5'-ヌクレアーゼ・プローブおよび／またはハイブリダイゼーション・プローブに標識を付け、オリゴヌクレオチド断片が何であるかや、その遺伝子型、配列が容易に明らかになるようにする。プローブのヌクレオチド配列は、標的核酸上の標的領域に適切にハイブリダイズするのに十分な任意の長さが可能であり、このプローブを標的核酸の遺伝子型決定または同定に用いることができる。標的プローブの長さは、一般に、PCRのアニーリング・ステップの温度でそのプローブが対応する標的と確実にハイブリダイズするのに十分な熱力学的安定性が得られるように選択する。例えば一般的でないDNA塩基を有するプローブは、場合によっては、一般的なDNA塩基を有するプローブよりも長くしたり短くしたりすることができる。別の一例として、A/Tが豊富な配列を有するプローブは、G/Cが豊富な配列を有するプローブよりも長くなるであろう。例えば本発明では5'-ヌクレアーゼ・プローブを開裂させることになる5'-ヌクレアーゼ反応を利用しているため、非5'-ヌクレアーゼ反応におけるよりも長いプローブを用いることができる。より長いこのようなプローブにより、Tm分析において配列をより細かく区別することと、より大きな診断の窓を提供することが可能になる。多型領域または標的領域の部位は、プローブのヌクレオチド配列中のどの位置にあってもよい。いくつかの実施態様では、このような領域がある部位は、プローブのヌクレオチド配列の5'末端ではない。

さらに、5'-ヌクレアーゼ曲線とTm曲線で異なるプローブを用いる実施態様では、プローブは、場合によっては同時に添加する。それは、一般に分析を開始するときである。この明細書の他の実施態様では、場合によっては分析中の異なる時期に複数のプローブを添加することができる。例えば5'-ヌクレアーゼ曲線用プローブは、ハイブリダイゼーション・プローブを添加する前に添加することができる。

いくつかの実施態様では、（5'-ヌクレアーゼ・プローブであれハイブリダイゼーション・プローブであれ）プローブのヌクレオチド配列は、標的領域と同一または相補的である。しかし多くの実施態様では、プローブのヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド領域と100％未満の一致だったり100％未満の相補性であったりしてよい。本発明のいくつかの実施態様では、プローブのヌクレオチド配列は、標的ヌクレオチド領域との相補性または一致が99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％またはそれ以下であってよい。本発明のいくつかの実施態様では、プローブのヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下または非常にストリンジェント条件下で標的ヌクレオチド領域とハイブリダイズする。本発明の別の実施態様では、プローブのヌクレオチド配列は、あまりストリンジェントでない条件下で標的ヌクレオチド領域とハイブリダイズする。

本発明のいくつかの実施態様では、プローブは1つ以上の標識を含むことができ、場合によっては1つ以上の消光剤を含むことができる。好ましい実施態様では、標識は、動的増加曲線および／またはTm曲線の決定を容易にする標識にすることができる。

プローブは、分光学的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、化学的方法で検出できる標識を組み込んで標識することができる。標識をオリゴヌクレオチド・プローブと結合または共役させる方法は、もちろん、使用する標識および／または消光剤のタイプと、プローブ上の標識の位置に依存する。一般に、標識は、蛍光によって検出できる信号を出すが、いくつかの実施態様は、例えば放射線、比色分析、重量測定、X線回折、吸収、磁性、酵素活性などによって検出できる標識も含むことができる。前に記載した内容を参照のこと。

蛍光標識には、負に帯電した染料（例えばフルオレセイン・ファミリーの染料）、電荷が中性の染料（例えばローダミン・ファミリーの染料）、正に帯電した染料（例えばシアニン・ファミリーの染料）が含まれる。フルオレセイン・ファミリーの染料としては、例えば、FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOEなどがある。ローダミン・ファミリーの染料としては、テキサス・レッド、ROX、R110、R6G、TAMRAなどがある。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、TAMRAは、パーキン-エルマー社（フォスター・シティ、カリフォルニア州）から市販されており、テキサス・レッドは、モレキュラー・プローブズ社（ユージン、オレゴン州）から市販されている。シアニン・ファミリーの染料としては、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7などがあり、アマーシャム社（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から市販されている。本発明で利用可能な他のファミリーの染料としては、例えばポリハロフルオレセイン・ファミリーの染料、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの染料、クマリン・ファミリーの染料、オキサジン・ファミリーの染料、チアジン・ファミリーの染料、スクアレン・ファミリーの染料、キレート化ランタニド・ファミリーの染料、ALEXA FLUOR（登録商標）染料（モレキュラー・プローブズ社、ユージン、オレゴン州）、BODIPY（登録商標）ファミリーの染料（モレキュラー・プローブズ社）などが挙げられる。

他の実施態様は、蛍光標識に加え、1つ以上の消光剤部分を有するプローブを含むことができる。消光剤は、蛍光染料から放出されるエネルギーを吸収するか、蛍光染料が光を出す能力を妨げる化合物の部分を意味する。消光剤は、蛍光染料から吸収されたエネルギーを、その消光剤に特徴的な信号として再び放出することができる。したがって消光剤は標識にもなりうる。あるいは消光剤は、蛍光染料から吸収したエネルギーを熱として散逸させることもできる。FRETで一般に使用される分子としては、例えば、フルオレセイン、FAM、JOE、ローダミン、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、EDANSなどがある。蛍光染料から吸収したエネルギーを散逸させる非蛍光性消光剤の具体例としては、バイオサーチ・テクノロジーズ社（ノヴァト、カリフォルニア州）から市販されているブラック・ホール・クエンチャーズ（登録商標）、エポック・バイオサイエンシーズ社（ボセル、ワシントン州）から市販されているエクリプス・ダーク・クエンチャーズ、アイオワ・ブラック（インテグレイティッドDNAテクノロジーズ社、コラルヴィル、アイオワ州）などがある。

標識および／または消光剤は、さまざまな方法でオリゴヌクレオチド・プローブに直接または間接に結合させることができる。使用する標識が正確にどのタイプであるかに応じ、標識は、プローブの5'末端または3'末端に位置させること、またはヌクレオチド配列の内部に位置させることができよう。標識および／または消光剤は、信号の相互作用を容易にするため、ヌクレオチドに直接結合させること、またはさまざまなサイズと組成のリンカーまたはスペーサ・アームを介して間接的に結合させることができる。市販されているホスホラミダイト試薬を用いると、適切に保護されたホスホラミダイトを介して官能基（例えばチオールや第一級アミン）をいずれかの端部に含むオリゴマー・プローブを作ることができる。このプローブには、例えば『PCRのプロトコル：方法と応用のためのガイド』、Innis他編、アカデミック出版、1990年に記載されているプロトコルを利用して標識することができる。例えばポリヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを用いて望む部分（例えば、コルジセピン、³⁵S-dATP、ビオチニル化されたdUTP）を結合させることにより、プローブの3'末端に検出可能な部分を結合させることもできる。

1つ以上のスルフヒドリル部分、アミノ部分、ヒドロキシル部分をオリゴヌクレオチド・プローブの配列（一般に5'末端）に導入するためにオリゴヌクレオチド機能化試薬を導入する方法が、アメリカ合衆国特許第4,914,210号に記載されている。ポリヌクレオチドキナーゼと[γ-³²P]ATPを利用することにより、放射性（例えば³²Pで標識した）リン酸基をオリゴヌクレオチドの5'末端に導入することができる。ビオチンは、合成中に導入するアミノチミジン残基またはアルキルアミノ・リンカーをビオチンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって5'末端に結合させることができる。オリゴヌクレオチドの3'末端の標識は、ポリヌクレオチドターミナルトランスフェラーゼを用いて望む部分（例えば、コルジセピン、³⁵S-dATP、ビオチニル化されたdUTP）を結合させることによって結合させることができる。いくつかのヌクレオチド誘導体も標識として使用できる。例えばエテノ-dAとエテノ-Aは、オリゴヌクレオチド・プローブに組み込むことのできる公知の蛍光性アデニン・ヌクレオチドである。同様に、エテノ-dCは、プローブの合成に使用できる可能性のある別のアナログである。

本発明のいくつかの実施態様では、プローブが多重標識されていて、それぞれの標識は、プローブの異なる位置に個別に結合する。本発明の別の一実施態様では、1つのプローブが、蛍光染料（すなわち標識）と消光剤で二重に標識されている。このプローブが完全であると、標識の蛍光が消光剤によって打ち消される。このプローブが標識と消光剤の間の位置で開裂すると、標識から放出される蛍光の抑制が弱まる。本発明のこの点に関する組み合わせの一例は、蛍光染料FAMと消光剤BHQ-2である。

HCV遺伝子型決定プローブ

本発明により、HCVの遺伝子型を決定するための組成物が提供される。この組成物は、HCVの1つの遺伝子型への割り当てを可能にする少なくとも1つのHCV遺伝子型決定プローブを含んでいる。本発明により、実施例に示したように、例えばTmを区別することに基づいて多数のHCVの遺伝子型を区別できるHCV遺伝子型決定プローブ（例えば配列ID番号3のHCV遺伝子型決定プローブHCGT27P5'3'）が提供される。このプローブは、以下の配列を有する。
EFFGGAALLGFFAGGAFGAFFGGGTCCTJ（配列ID番号3）
ただしE=BHQ2；J=cx-FAM；F=プロピニルdU；L=プロピニルdCである。

この1つの配列を示したとはいえ、本発明がこの配列に限定されることは意図していない。当業者にとって、このプローブ配列を改変して実質的に機能が同等なプローブ分子（すなわち多数のHCVの遺伝子型を区別することのできる機能が同等な分子）を容易に得られることは明らかであろう。例えば配列ID番号3に示したプローブは、さまざまな標識および／または消光剤（例えばBHQ-2とcx-FAM）を含んでいる。当業者にとって、これらの部分を他のタイプの標識または標識系で置換でき、しかもその場合にプローブが、HCVのいろいろな遺伝子型と別々に結合するという重要な特性を保持していることと、本発明の本質的な特徴からは逸脱しないことは直ちに明らかであろう。実際、このような標識は除去することさえ可能であり、それでもプローブは、HCVの遺伝子型を区別するという本質的な特徴を保持している。機能が同等なこのような追加の改変分子も本発明の範囲に含まれるものとする。

Tmとハイブリダイゼーション

本発明の利点の1つは、融解／アニーリング曲線が、例えば同じサンプル容器内で動的PCR曲線と同じ反応サンプルから得られることである。この明細書に記載したさまざまな実施態様では、分析しているサンプルの温度プロファイルを場合によっては何通りかの方法で操作して融解／アニーリング曲線を得ることができる。例えば融解／アニーリング曲線を作るためのサンプルの加熱および／または冷却は、一般に、所定の温度範囲にわたって実施される。具体的な温度範囲は、一般に、例えば考えている具体的な標的／プローブが何であるか、その配列（少なくともわかっている範囲で）、プローブの長さなどに基づいて設定される。本発明のいろいろな実施態様では、温度レベルに加え、温度変化の速度も場合によっては変数となる。温度変化は、場合によっては連続であるが、いくつかの実施態様では不連続にすることができる。

得られたTm曲線をその裏に隠れている標的の遺伝子型、配列などの決定との関係で解釈するにあたって、場合によっては、標的サンプルのTm曲線と1つ以上の対照のTm曲線、または標的サンプルのTm曲線とプローブの配列を与えるであろうと予想されるTm曲線を比較したり、標的配列であることがわかっているか標的配列であると想定されるもの、反応条件などを参照したりする。この明細書に記載したさまざまな実施態様では、場合によってはこのような手段の一方または両方を利用してあらゆるTm曲線を解釈し、サンプル中の標的核酸の遺伝子型決定、配列決定、同定を行なう。

本発明の具体的な利用例

本発明は、場合によっては、例えば病気の症状の診断に利用される。診断としては、感染症が関係する診断、非感染性疾患の症状（例えばがん）の診断などが考えられる。対象の疾患状態の原因を明らかにするため、本発明は、多様な病原体が疾患の原因となっている可能性のある状況において、原因となる病原体を区別することができる。例えば上気道感染症（URI）は、感染した人にとっては非常に危険であり、裏に隠れている病原体を正確に診断することが適切な治療を行なう上で非常に重要である。URIがウイルスや細菌などが原因になっているかどうかは、患者が適切に治療されるかどうかに大きく影響する。さらに、グラム陰性菌による感染症は、異なる治療法を必要とする。プライマーとプローブを適切に選択することにより、本発明でサンプル中の特定の病原体の存在または不在を明らかするとともに、サンプル中に存在するいくつかの病原体を区別することができる。

診断での本発明の別の用途は、配列が互いに似ている原因病原体を区別することである。例えばこの明細書の実施例に示したように、HCVの亜型は、本発明を利用すると互いに区別することができる。適切なプライマーとプローブを使用することにより、関連する他の疾患の病原体の宿主を区別し、そのような病原体を持つ対象を、その区別した結果に基づいて適切に治療することができる。例えばHCV亜株、HCV株／亜株、フラビウイルスの型などは、すべて、必要に応じて本発明の実施態様によって区別することができる。

本発明の別の実施態様は、場合によっては、（例えば遺伝学的スクリーニングで利用する場合のように）より高等な生物の対立遺伝子の型決定、ある種のがんの検出、HLAの型決定などとの関連での核酸の同定に利用することができる。

キット、システム、反応混合物

本発明のいろいろな実施態様には、核酸の検出、および／または定量化、および／または同定を行なうためのキットも含まれる。このようなキットは、例えば（例えばテストしたり遺伝子型を決定したりする具体的な核酸が何であるかに基づいた）適切な5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブ、（例えば標的核酸を増幅するための）適切なプライマー、標的核酸の増幅と同定のための試薬と材料（例えば緩衝液、ヌクレオチド、塩など）のあらゆる組み合わせを含むことができる。このキットは、場合によってはさらに、このキットの要素を用いて発見するための好ましい方法や診断セットの応用法を詳述した使用説明セットまたはユーザー・マニュアルを含んでいる。一般にこのキットは、上記の要素に加え、追加の材料を備えている。それは例えば、核酸の検出、および／または定量化、および／または同定を目的として本発明の方法を実施するための使用説明書、包装材料、1つ以上の容器などである。

本発明のいくつかの実施態様には、核酸の検出および／または定量化および／または同定のためのシステムも含まれる。このようなシステムは、例えば蛍光標識した1つ以上のハイブリダイゼーション・プローブと；標識した1つ以上の5'-ヌクレアーゼ・プローブ（ハイブリダイゼーション・プローブと同じでもよい）と；標的核酸の増幅に特異的であり非対称動的PCRのために量を違えて存在している2つ以上の動的PCRプライマーと；プローブ、プライマー、ならびに他のPCR構成要素のための1つ以上の容器と；容器に接続されていて（すなわち熱的に接続されていて）容器内の温度を制御可能な状態で変えることができる1つ以上の温度調節装置と；反応中のさまざまなプローブ（例えばハイブリダイゼーション・プローブや5'-ヌクレアーゼ・プローブ）からの蛍光信号を検出する構成の検出器と；データを目で見えるように表示するモニターと；上記モニターと、上記検出器と、上記温度調節装置に接続されていて、そのモニターと、その検出器と、その温度調節装置を制御するための使用説明セットを含むことのできる制御装置のほか、蛍光信号と容器内の温度を1つ以上の標的核酸の存在と相関させるための使用説明セットを備えることができる。プローブが非蛍光性手段（例えば放射性標識）で標識されているさらに別の実施態様では、このようなシステムの検出器は、このような非蛍光活性を検出する検出器を備える。

本発明には、少なくとも1つの標的核酸の増幅に特異的なプライマーと、標識した1つ以上の5'-ヌクレアーゼ・プローブと、標識した1つ以上のハイブリダイゼーション・プローブも含まれる。ただし5'-ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブは、同じプローブでも異なるプローブでもよい。このような実施態様では、プライマーはそれぞれ異なる量が存在しており、いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーション・プローブが制限プライマー（すなわち、より少ない量が存在しているプライマー）よりも大量に存在している。本発明のキットなどの実施態様には、単一の試験管または容器の中で、その試験管または容器を開けることなく反応を行なわせることのできる実施態様も含めることができる。

以下の実施例は例示であり、権利を請求する本発明を制限するものではない。当業者であれば、権利を請求する本発明の範囲を逸脱することなく、決定的に重要ではない多彩なパラメータを変えうることが認識できよう。この明細書に記載した具体例と実施態様は説明だけが目的であり、当業者はその説明に照らしてさまざまな変更や変形を思いつくであろうし、そうした変更や変形は、本出願と添付の請求項の精神ならびに範囲に含まれることが理解されよう。

本発明を利用したHCV遺伝子型の決定

HCV（C型肝炎ウイルス）陽性サンプルの遺伝子型決定は、臨床上、非常に重要かつ有用である。すでに説明したように、本発明を利用すると、多数の核酸標的（例えば配列が互いによく似た核酸標的でさえ）を識別すること（例えばHCV遺伝子型の識別）ができる。本発明の方法では、核酸標的を識別するため、標的配列中で多様性のある領域（例えば、異なる株、異なる対立遺伝子、異なる種などの間で多様性が見られる領域）と少なくとも一部が相補的になるように特別に設計したオリゴヌクレオチド・プローブを利用するとともに、PCR後の融解および／またはアニーリング分析から得られたさまざまなTmも合わせて利用する。

図5には、6つの異なるHCV遺伝子型（すなわち1a型、2a型、3a型、4型、5型、6型）の配列のアラインメントと、異なるHCV遺伝子型を識別するのに本発明で利用できるハイブリダイゼーション・プローブの一例を示してある。

すでに指摘したように、5'-ヌクレアーゼ・プローブは、場合によってはハイブリダイゼーション・プローブとは異なる色チャネルを利用することができる。例えば図6〜図8に見られるように、HCV遺伝子型が1a型、2a型、3a型、4型、5型、6型である選択したRNA転写産物に対し、（HCVの異なる遺伝子型を識別するための）FAM標識したハイブリダイゼーション・プローブとHEX標識した5'-ヌクレアーゼ・プローブを用いた。

この実施例では、非対称PCRサンプル・マスター混合物（すなわちPCRの構成要素）は、2.5％のグリセリン；5％のDMSO；50mMのトリシン、pH8.3；90mMの酢酸カリウム；300μMのdATP、300μMのdGTP、300μMのdCTP；550μMのdUTP；0.1μMの上流（制限）プライマー；0.5μMの下流（過剰）プライマー；0.2μMの加水分解プローブ、0.2μMのハイブリダイゼーション・プローブ；10Uのウラシル-N-グリコシラーゼ；40UのZO5 DNAポリメラーゼ；2.7mMの酢酸マンガンで構成した。

RT-PCRによってHCVアンプリコンを作るための鋳型RNAは、1a型、2a型、3a型、4型、5型、6型に対応するHCVゲノム材料挿入体を有するプラスミドから、試験管内転写によって得られたものであった。これら挿入体の配列は、図5に示したように、それぞれの型のコンセンサス配列に対応している。試験管内転写の後、RNAをオリゴ-dT-セファロース・クロマトグラフィによって精製した。

この実施例では、ハイブリダイゼーション／遺伝子型決定プローブは、すべてのプローブが開裂することがないよう、制限プライマーの2倍の濃度で存在していた。過剰プライマーは、ハイブリダイゼーション・プローブが結合するための一本鎖アンプリコンが過剰になっているよう、制限プライマーの5倍の濃度で存在していた。この実施例で利用した熱サイクル・プロファイルは、50℃で5分間（UNGステップ）；59℃で30分間（RTステップ）；94℃で20秒間と58℃で40秒間を60サイクル；94℃で60秒間；40℃から90℃へと1℃ずつのステップで上昇させる融解ステップで構成されていた。

HEX標識した5'-ヌクレアーゼ・プローブからの増加曲線のデータを図6に示してある。いくつかの実施態様では、このようなプローブは保存されたプローブであり、そのプローブと使用する選択した核酸転写産物の間にはミスマッチがない。そのためこのようなプローブを用いてすべての遺伝子型を同じように検出できるはずである。しかしFAM標識したハイブリダイゼーション・プローブから得られた増加曲線のデータは、図7に示したように、調べたすべての転写産物に対して完全に相補的ではないプローブから得られたものであるため、より大きな違いを示す。プローブと転写産物の間のミスマッチの量が最大である亜型2aと3aとの反応からは、5'-ヌクレアーゼの信号がほとんど発生しない。

図8に、それぞれの転写産物とハイブリダイゼーション／遺伝子型決定プローブについてPCR後のアニーリングのデータを示してある。この実施例では、融解／アニーリング曲線は、ABIプリズム7700サーモサイクラーを用いて得られた。当業者であれば、核酸相互間の融解／アニーリング曲線を作るための基本的なプロトコルと関連するパラメータ（例えばストリンジェシーの制御、サーモサイクラーなど）を極めてよく知っているであろう。この図からわかるように、広い範囲にわたるTmが、異なるHCV遺伝子型の間に存在している（例えば50℃〜78℃の間）。すでに説明したように、より高いTmは、ハイブリダイゼーション・プローブと、そのプローブと配列がよく一致するHCV遺伝子型からの転写産物とが対合することで生じるのに対し、そのような領域でプローブと一致する配列がより少ない遺伝子型は、より低いTmを示す。図8に見られるようにTmの範囲は異なっているため、異なる遺伝子型を容易に区別することができる。遺伝子型2aと遺伝子型3aのTmは他の読み取り値よりも接近しているが、場合によっては別の遺伝子型決定プローブ（例えば配列が異なるが、転写産物の同じ領域または異なる領域に結合するもの）を選択して用いることで、サンプル中の遺伝子型相互間の違いをさらに明確にできよう。また、このような識別を助けるため、反応条件（例えば温度、塩の濃度など）を変えることもできよう。図8は、融解／アニーリングに基づくあらゆるアッセイと同様、標的領域における新たなミスマッチまたは未知のミスマッチによって結果が大きな影響を受けることを示している。この明細書に記載した別の実施態様では、多彩なハイブリダイゼーション・プローブを構成することなどにより、プローブの結合領域におけるこのような新たなミスマッチまたは未知のミスマッチを場合によっては説明できる可能性がある。

本発明を明確にして理解できるようにするためにいくらか詳細に説明してきたが、当業者であれば、この開示内容を読むことにより、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態や詳細におけるさまざまな変形が可能であることは明らかであろう。例えば上記のあらゆる方法と装置は、さまざまに組み合わせて利用することができる。この出願で引用したすべての出版物、特許、特許出願、他の文献は、参考としてその全体が、個々の出版物、特許、特許出願、他の文献が参考として実際にこの明細書に組み込まれているかのようにして実際にこの明細書に組み込まれているものとする。

非対称PCRを実施している間、プライマーとプローブが核酸鎖上のどこに位置するかを示す図である。染色したアガロース・ゲルであり、非対称PCRと対称PCRでの核酸の増幅を比較してある。ここでは標的核酸としてサイトメガロウイルス（CMV）のDNAを2×10⁵個用い、プライマーの比をいろいろと変えた。非対称kPCRの間に得られる増加曲線である。非対称kPCRにおいてプライマーの比をいろいろと変えて得られた融解曲線の1階微分のグラフである。 6つの異なるHCV遺伝子型からの可変領域のアラインメントと、対応するハイブリダイゼーション・プローブの一例である。 HCVゲノムの可変領域に対するHEX標識したプローブを使用し、6つの異なるHCV遺伝子型の非対称kPCRを実施して得られた増加曲線のデータである。 HCVゲノムの可変領域に対するFAM標識したプローブを使用し、6つの異なるHCV遺伝子型の非対称kPCRを実施して得られた増加曲線のデータである。 HCVゲノムの可変領域に対するプローブを使用し、6つの異なるHCV遺伝子型の非対称kPCRを実施して得られたアニーリング曲線の2階微分のグラフである。

Claims

サンプル中の１つ以上の核酸標的を同定する方法であって、
ａ）標識した１つ以上の５’−ヌクレアーゼ・プローブと、標識した１つ以上のハイブリダイゼーション・プローブとを含む反応混合物の中で非対称動的ＰＣＲを実施し、ここで５’−ヌクレアーゼ・プローブとハイブリダイゼーション・プローブは同じプローブでも異なるプローブでもよく；
ｂ）その動的ＰＣＲから得られる１つ以上の増加曲線をモニターし；
ｃ）その動的ＰＣＲの後に反応混合物の温度を変化させることにより、標識した１つ以上の上記ハイブリダイゼーション・プローブと１つ以上の核酸標的の間の会合を変化させ；
ｄ）標識した１つ以上の上記ハイブリダイゼーション・プローブから発生する１つ以上の蛍光信号をモニターすることにより、融解曲線またはアニーリング曲線を作り；
ｅ）ステップｄ）の融解曲線またはアニーリング曲線を、１つ以上の既知の核酸標的からなる完全に相補的なプローブの融解曲線またはアニーリング曲線と相関させることで、サンプル中の１つ以上の核酸標的を同定する操作を含み、
ここで前記非対称動的ＰＣＲが、１つの第１のプライマーと少なくとも１つの第２のプライマーを含んでいて、第１のプライマーの量が第２のプライマーの量よりも多く、上記ハイブリダイゼーション・プローブが、第２のプライマーよりも多い量存在している、方法。
１つ以上の核酸標的を同定する上記操作が、その核酸を含む１つ以上の生物または生物株を同定する操作を含む、請求項１に記載の方法。
上記非対称動的ＰＣＲが、１つの第１のプライマーと少なくとも１つの第２のプライマーを含んでいて、このＰＣＲが、第１のプライマーを第２のプライマーの２倍以上多く含んでいる、請求項１に記載の方法。
１つ以上の上記ハイブリダイゼーション・プローブが、動的ＰＣＲの間を通じて存在している、請求項１に記載の方法。
１つ以上の蛍光信号をモニターする上記操作が、ある温度範囲にわたるモニター操作を含む、請求項１に記載の方法。
１つ以上の上記核酸標的が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の核酸を含む、請求項１に記載の方法。
少なくとも１つの上記ハイブリダイゼーション・プローブが、１つのＨＣＶ株遺伝子型と相補的である、請求項１に記載の方法。
上記反応混合物が、第１のハイブリダイゼーション・プローブと、少なくとも１つの第２のハイブリダイゼーション・プローブとを含んでおり、前記第１のハイブリダイゼーション・プローブが、第１のＨＣＶ株遺伝子型と相補的であり、少なくとも１つの前記第２のハイブリダイゼーション・プローブが、第２のＨＣＶ株遺伝子型と相補的である、請求項１に記載の方法。
配列ＩＤ番号３のポリヌクレオチド配列を有し、長さが２７〜１００ヌクレオチドである、標識化されたプローブ。
配列ＩＤ番号３のポリヌクレオチド配列から成る核酸。