JP6026977B2 - 多次元プローブ分析法によるc型肝炎ウイルス型判定のためのプローブ及び方法 - Google Patents
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Description
HCVのゲノム(図1参照)は鎖長約10kbのプラス一本鎖RNAであり、ペスチウイルス及びフラビウイルス属のゲノムとの類似性が顕著である。最初のHCV分離株(HCV-1)のゲノムは約9.4kb であり、3'末端ポリAテールを含んでいた。Choo et al.(1991) “Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus” (C型肝炎ウイルス遺伝子の構成と多様性) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455(非特許文献2)参照。HCV-1のゲノム配列は341塩基の5'非翻訳領域(5'-UTR)、3,011アミノ酸からなるポリプロテインをコードする長い読み取り枠(ORF)、それに約27塩基の3'非翻訳領域(3'-UTR)を含んでいた。HCVゲノム及びポリプロテインの略図(図1)を参照。
本発明の論議に移るには予めHCV型命名法の理解が求められる。研究者たちはいくつかの分類体系/命名法を使用して種々のHCV分離株を解析してきたという経緯があるが、結果として学術文献に混乱が生じてしまった。今日では統一的なHCV遺伝子型/亜型命名法が採用されるに至った。Simmonds et al. (1994) Letter, Hepatology 19:1321-1324; Zein (2000) “Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes” (C型肝炎ウイルス遺伝子型の臨床的重要性) Clinical Microbiol. Reviews 13(2):223-235(非特許文献5);Maertens and Stuyver (1997) “Genotypes and Genetic Variation of Hepatitis C Virus” (C型肝炎ウイルスの遺伝子型及び遺伝子変化) p.182-233, in Harrison and Zuckerman (eds.), The Molecular Medicine of Viral Hepatitis, John Wiley and Sons, Ltd., Chichester, England(非特許文献5)参照。この分類法によれば、HCV分離株は塩基配列分散を基準にして主要遺伝子グループすなわち遺伝子型へと分類される。これらの遺伝子型には番号が(アラビア数字で)一般に発見順に付与される。ある遺伝子型の内部で互いに関連性の強いHCV株は亜型と命名され、アルファベットの小文字が一般に発見順に付与される。個別分離株の内部に見られる遺伝子変異体は準種という。HCVの準種は宿主内での複製時の突然変異の集積に由来すると推測される。
患者のHCV感染の型判別は引き続き、該感染の悪性度に関する、また種々の治療方針への該感染の反応の可能性に関する、重要な予測因子である。HCV遺伝子型1はHCV遺伝子型2又は3と比べて高感染性の株であり、またαインターフェロン(INF-α)療法(及びリバビリン併用療法)に反応しにくい株である。Nolte, “Hepatitis C Virus Genotyping: Clinical Implications and Methods” (C型肝炎ウイルスの遺伝子型判別: 臨床的な意義及び方法) Molecular Diagnosis 6(4):265-277(2001)(非特許文献8);Dufour, “Hepatitis C: Laboratory Test for Diagnosis and Monitoring of Infection” (C型肝炎: 感染診断/監視のための臨床検査) Clinical Laboratory News, November 2002, p.10-14(非特許文献9);及びPawlotsky, “Use and Interpretation of Hepatitis C Virus Diagnostic Assays” (C型肝炎ウイルス診断アッセイの使用と解釈) Clinics in Liver Disease, Vol. 7, No. 1 (February 2003) (非特許文献10)参照。HCV感染の型判別の目標はしばしばHCV遺伝子型1に感染した患者の、他HCV型に感染した患者と対比する形での識別である。さらに、既知HCV亜型の数が増加しているため、複雑なHCV系統識別を可能にするような、臨床目的と研究目的を兼ねた単純なHCV型判別方法が技術上必要である。HCV負荷情報(たとえばコピー数及びHCVゲノム定量)を同時にもたらすようなHCV型判別方法もまた技術上必要である。
任意の感染で見つかるHCV分離株は、地理的な株分布、疾患転帰及び抗HCV療法への反応などの差異に応じて異なる。信頼性の高いHCV遺伝子型判別方法は重要な臨床検査法である。さらに、多数の、別々のHCV種が同定されているため、HCV型判別方法は多数のHCV型(遺伝子型及び亜型)を識別しうることが重要である。たとえばHCV型判別検査法では5つ以上の遺伝子型を識別しうるのが有用である。あるいはHCV型判別検査法では5つ以上の亜型を識別しうるのが有用である。以下は核酸に基づくHCV型判別方法のまとめである。
HCV遺伝子型及び亜型判別の参照標準は(たとえば患者由来の臨床サンプルに由来する)HCVゲノムRNAのRT-PCRでHCVゲノムから得られたアンプリコンの塩基配列分析とそれに続く系統学的解析である。しかし、直接的な配列分析は(たとえ非放射性試薬を使用する自動配列分析装置を導入しても)能率が低いし、また専用装置が必要となるため、非現実的である。そのうえ、混合感染の症例では塩基配列分析による遺伝子型及び亜型判別法を用いると、あいまいな結果に終わりかねない。
型特異的PCRプライマーを使用するPCR再増幅法でHCV型を判別する場合もある。型判別は汎用コンセンサスプライマー(すなわちHCV型に関係なくHCVゲノムのアンプリコンを生成するプライマー)による1次PCR増幅とそれに続く型特異的プライマーたとえばコア領域内の型特異的プライマーによるネステッドPCRとによって行う。これらのアッセイでは遺伝子型/亜型判別を行うに足る量のアンプリコンを生成させるためには複数のPCRプライマーセットが必要となる。これら方法は、HCV型判別に複数のPCRプライマーセットを必要とし、またしばしば感度と特異性を欠くといった難点がある。Xavier and Bukh (1998) “Methods for determining the hepatitis C genotypes(C型肝炎ウイルス遺伝子型の判別方法)” Clinical Microbiol. Reviews 13(2):223-235(非特許文献14);前掲Zein (2000); Okamoto et al. (1992) “Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveys and tracing infectious sources(型特異的プライマー使用のPCR法によるC型肝炎ウイルスの型判別: 臨床検査及び感染源特定への応用)” J. Gen. Virol., 73:673-679(非特許文献15);Widell et al. (1994) “Genotyping of hepatitis C virus isolates by a modified polymerase chain reaction assay using type-specific primers: epidemiological applications(型特異的プライマー使用の改良PCR法によるC型肝炎ウイルス分離株の遺伝子型判別: 疫学的応用)” J. Med. Virol., 44:272-279(非特許文献16)参照。
HCV分離株の型判別は複数の型特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用して行うこともできる。このウイルス型判別法では汎用プライマーによる1次PCR増幅とそれに続く型特異的プローブとのハイブリダイゼーションとを使用する。この型特異的プローブとのハイブリダイゼーションは固定ハイブリダイゼーション条件で行い、所与のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション複合体の存在又は不存在を評価する。このアッセイ法では任意の1プローブでは複数の遺伝子型/亜型からの決定的な識別を行うことは不可能なので、遺伝子型/亜型を帰属させるには複数のプローブが必要となる。この方法はHCV型判別に複数のプローブを必要とするのが難点である。
HCVの型判別は従来の制限断片長多型(RFLP)アッセイ法の変法によっても試みられてきた。このHCVアッセイ法では、遺伝子型特異的切断部位を認識する制限酵素で汎用PCRアンプリコンを消化する。たとえばNakao et al. (1991) “Typing of hepatitis C virus genomes by restriction fragment length polymorphism(制限断片長多型によるC型肝炎ウイルスゲノムの型判別)” J. Gen. Virol., 72:2105-2112(非特許文献24);Murphy et al. (1994) Letter, J. Infect. Dis., 169:473-475(非特許文献25)を参照。NS5及び5'-UTRドメインには型特異的制限部位が存在することが分かっている。このアッセイ法の遺伝子型/亜型判別への使用は、制限部位の変化を招く結果となるような多型遺伝子座の数が限られるため、限定される。
サンプル中のHCVウイルス型の判別は重要な臨床手段である。HCV型判別手法の1つは、既知HCV型と試験用HCVサンプルを使用して、HCV型特異的プローブで形成されるハイブリダイゼーション複合体の融解温度を特性解析することである。理想的には、HCVゲノム配列(又はHCVゲノム配列の誘導体及び/又は部分)と複合体を形成するHCV型判別用プローブは個別HCV型に対応して固有のTm値を生じ、以ってその試験で計測されるTm値に基づいて特定のHCV型への帰属が行われるようにする。
(c)HCVアンプリコンを生成させることができる増幅プライマー対であって、該アンプリコンは複数の型判別プローブのうち少なくとも2つの型判別プローブの内部の塩基配列と相補的又は部分的に相補的である塩基配列を含むことを特徴とする増幅プライマー対、及び(d)アンプリコン蓄積のリアルタイム検出のためのアンプリコン定量プローブであって、塩基対合が起こるような条件下で該アンプリコンと定量用ハイブリダイゼーション複合体を形成することを特徴とするアンプリコン定量プローブ。
本発明の詳細な説明に移る前に、本発明は、種々変化しうる特定の実施態様に当然ながら限定されないものとする。また当然ながら、本明細書で使用する用語は専ら特定の実施態様の説明を目的としており、範囲を限定するものではない。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数及び単数形の用語たとえば「ある」、「一(つの)」、「該」は文脈上明らかに無理な場合を除いて複数形を包含する。従って、たとえば「(単数形の)核酸」は複数の核酸分子を包含するし、また用語「プローブ」は実際問題として多数のプローブ分子を包含する。
本発明はHCV型判別のための組成物と方法を提供するが、該方法は複数の型判別プローブを使用し、また該複数の型判別プローブから相補的な情報を使用してHCV遺伝子型又は亜型の帰属を行う。本発明の組成物と方法は(たとえばHCV遺伝子型1、2、3、4、5又は6; 又は亜型1a/b/c、2a/b/c、3a、3b、4a、5a又は6aより選択される)少なくとも5つのHCV型を区別するために使用することができる。本発明の方法はまた、混合HCV感染の場合にも使用可能であり、サンプル中に存在する各HCV種をHCV型(遺伝子型又は亜型)に帰属させることができる。
実施態様によっては、未知の型のC型肝炎ウイルスを含むサンプルが型判別分析に直接(増幅ステップを介する必要もなく)使用される。この場合には、該サンプルから、たとえば任意好適の核酸単離手法を使用して、HCVゲノム物質又はHCV転写産物を単離することができる。その単離物質はその後の分析に使用することができる。ごく少ないコピー数の核酸を分析する手法(たとえば蛍光検出法)は技術上周知であり、本発明に使用することができる。たとえばMirkin et al., “PCR-Less detection of genomic DNA with nanoparticle probes”(ナノ粒子プローブによるゲノムDNAの無PCR法検出), Abstract Papers, 222nd ACS National Meeting, Chicago, IL, United States (August 26-30, 2001)を参照。
次にHCV物質(たとえばサンプル物質、又はRT-PCR増幅で生成されたHCVアンプリコンなど)を複数のHCV型判別プローブとのハイブリダイゼーション反応に使用してハイブリダイゼーション複合体を形成する。HCV型判別プローブの設計では次の点などを含めて種々の事項が配慮される: (i)プローブの配列はHCVアンプリコン内部のヌクレオチド配列と少なくとも部分的に相補的であり、そこには少なくとも非ストリンジェント条件の下でのハイブリダイゼーションを可能にするに足る相補性が存在する; (ii)ハイブリダイゼーション複合体の相補性領域は少なくとも2つのHCV型(遺伝子型又は亜型)間で配列異質性を示す; (iii)各型判別プローブと少なくとも2つのHCV型とを含むハイブリダイゼーション複合体は各々を他の型から区別するような特徴的ハイブリダイゼーション特性を有する。使用される複数の型判別プローブのヌクレオチド配列は同一ではないが、HCVゲノムの同じ領域にハイブリダイズするような、重複ヌクレオチド配列を、又は同じヌクレオチド配列の修飾を、有してもよい。複数の型判別プローブとのハイブリダイゼーション反応は単一の反応混合液中で起きても別個の独立した反応混合液中で起きてもよい。原則として、ハイブリダイゼーションステップは単一のハイブリダイゼーション反応系で起きても、あるいは複数のハイブリダイゼーションステップにまたがってもよい。
ひとたびステップ(C)に記載の要領で複数のプローブを使用してハイブリダイゼーション特性を計測したら、計測したハイブリダイゼーション特性値に基づいてHCV型をサンプル中のHCVに帰属させる。たとえばTmがハイブリダイゼーション特性の計測値であるとき、試験サンプルの分析に先立ち、複数の型判別プローブについて既知HCV型分離株を使用して標準化Tm値テーブルを作成する。この標準化Tm値テーブルは各型判別プローブに対応する、及び各HCV遺伝型又は亜型に対応する、試験サンプルの分析に使用した同じハイブリダイズ条件下での既定Tm値 からなろう。ひとたび試験サンプルに対応するTm値が計測されたら、それらの値を標準化テーブルTm値と比較し、図9に記載のものと類似する分析を行う。標準化及び試験サンプルに対応する値が同一であるか又は同一に近ければ、既知の型と実験の型は一致することになる。
一般に、本発明のHCV型判別プローブは次の指針に従って設計する。
ハイブリダイゼーションの標的となるHCVゲノム中の配列は特に限定されない。プローブは、HCVゲノム内の十分な異質性を備えた比較的高保存ドメイン(たとえば5’-UTR)と、又は比較的可変性のドメイン内にある比較的高保存ドメインと、ハイブリダイズする。好適なプローブ標的が特定されたら、適切な汎用増幅プライマーの使用も検討する。その場合、生成されるHCVアンプリコンは型判別プローブ配列を含まなければならないし、またプローブ標的配列の上流側及び下流側配列は保存性が十分に高く、HCV型に関係なくHCVアンプリコンを生成するような汎用PCRプライマーの使用を可能にするほどでなければならない。候補HCV型判別プローブは異質性領域にハイブリダイズするように設計する。
候補プローブ配列が特定されたら、その配列を随意にin silicoで試験して、既知HCV型配列とハイブリダイズしたときに弁別特性を示す能力の有無を調べる。たとえば候補プローブ配列が特定されたら、in silicoモデリングを使用して、そのプローブと各既知HCV型の標的相補鎖からなる仮想ハイブリダイゼーション複合体のTmを予測することができる。プローブ候補は有効であるためには、各HCV型とのハイブリダイゼーションで十分に特徴的な特性(たとえばTm)を示さなければならない。
プローブ設計の最終ステップとして、型判別プローブをin vitro試験にかけ、各HCV型を区別する能力の有無を少なくとも1つの試験方法により調べる。プローブ挙動のin silico予測は100%の精度ではないので、その予測結果を確認するにはこの試験ステップが必要である。ここでは2つの試験方法を示すが、他の同等の試験方法を採用してもよい。
Tm値を求めるような実施態様では、プローブは、各HCV型に対応するヌクレオチド配列(図5)をもつ人工合成(化学合成)HCV標的と共に、融解曲線分析に使用する。型判別プローブと各HCV合成鋳型とを含む各ハイブリダイゼーション複合体のTmは実験的決定する。これらのアッセイではHCVアンプリコンを生成するRT-PCR反応は不要である。有効なプローブは、少なくとも2つのHCV型(遺伝子型又は亜型)について異なる、識別可能なTm値をもたらすプローブである。
あるいは、又は化学合成標的に加えて、合成(たとえばin vitro転写法で酵素的に合成した)HCV転写産物を使用してTm値融解曲線検証を行うこともできる。この検証試験には、既知遺伝子型又は亜型のHCVインサートを導入したプラスミドからin vitro転写法で生成した転写産物を使用することができる(実施例2を参照)。
本発明はまた多数のプローブとプライマーたとえばHCV型判別プローブ、HCV定量(TaqManタイプ)プローブ及びHCV増幅プライマー(RT-PCR用)を提供する。これらのプローブ及びプライマーの作製方法は何ら限定されないものとする。当業者はプローブ及びプライマー作製のための多様な化学合成技術及び試薬を熟知している。
本発明はまた、本発明に使用する多数のプローブたとえばHCV型判別プローブやHCV定量(TaqManタイプ)プローブを提供する。これらのプローブ分子は一般に好適な標識を含む。標識、標識検出システム又は標識検出及び定量装置は何ら限定されないものとする。当業者は好適に標識したポリヌクレオチドを生成するための多様な標識技術及び試薬を熟知している。
実施態様によっては、本発明のプローブたとえばTaqManタイプのプローブ及びHCV定量プローブにFRET標識システムを使用する。しかし、本発明はFRET供与体/消光体システムの使用に限定されないものとする。それどころか、FRETシステムは本発明に使用しうるエネルギー移動システムの一例にすぎないし(非蛍光エネルギー移動システムは技術上周知である)、また本発明は特定のFRETペアシステムに限定されない。実施態様によってはFRETシステムに可溶性消光体を使用する。好ましいのは、少なくとも1つの供与体がFRET供与体を含み、またハイブリダイゼーションステップが可溶性FRET消光体と混合するステップを含むような実施態様である。
本発明はHCV型判別のための方法を提供し、またHCV型判別とHCV定量の同時並行のための方法を提供する。ある種の実施態様では、HCV型判別及びHCV型判別/定量のための反応系は「閉管」システムである(実施例2を参照)。
本発明は製造品たとえばキットを、特に診断キット及びHCV遺伝子型判別キットを、提供する。これらのキットは、開示の方法を使用してHCV感染の型判別を行うための必要な資材を備える。これらのキットは臨床医には有用である。臨床医は、診療場面でHCV型判別情報を利用し、ウイルスの型(遺伝子型又は亜型)に基づいて種々の治療に対する特定HCV感染の反応性を予測することができる。本発明は、本発明の方法特にサンプル中のHCVの型判別のための方法を容易にするキットを提供する。これらの方法を実行するための資材と試薬はキットとして提供し、方法の実行を容易にすることができる。
実施態様によっては、本発明は信号の検出をC型肝炎ウイルスの型に相関させるための総合システムを提供する。該システムは、特にHCV型を導き出すための手段がアルゴリズム及び/又は電子的に記憶された情報(たとえば収集した蛍光データ、所定のHCV型相関関係など)を含む場合には、収集データを解釈し分析するための装置と手段を含んでもよい。該総合システムの各部分は機能的に相互接続されており、場合によっては物理的に接続されている。実施態様によっては、該総合システムは自動化されていて、HCV型判別分析の開始後は操作者がサンプルや装置を操作する必要は一切ない。
一組のHCV型判別プローブを設計し、化学的に合成した。これらのプローブは図6に記載している。各プローブはHCVゲノムの5'-UTR内部の、少なくとも2つの異なるHCV型間で配列異質性を示す領域とハイブリダイズする(図5参照)。図6に記載の各プローブは、該プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の特徴的ハイブリダイゼーション特性に基づいて少なくとも2つのHCV型を単独で区別しうるという基準を満たす。この場合には、図6に記載の各プローブにより、該プローブを含むハイブリダイゼーション複合体のTm値に基づいて、少なくとも2つのHCV型を区別することができる。
本例では、単一RT-PCR及びTm分析反応系への2つのHCV型判別プローブの使用によるデュアルプローブ、デュアルチャンネルの閉管融解曲線分析(Tm決定)を説明する。この反応系は「閉管」システムであり、RT-PCR反応の開始後は外的なサーモサイクリング条件の変更以外に反応混合液への一切の操作が不要である。分析対象の各HCV型は2つのプローブに対応する融解曲線分析データ(Tm)の組み合わせに基づいて他の諸々のHCV型から区別される。本例では、少なくとも5つの、さらには6以上のHCV型を区別するうえでのマルチプローブ(すなわち多次元)分析の有効性を説明する。
追加のプローブ対を前記実施例2の要領で試験し、それらのプローブ対がHCV型判別のための相互補完的なデータセットをもたらしうるかどうか調べた。プローブ対の試験はどれもデュアルプローブ、デュアルチャンネルの「閉管」システムで行ったが、該システムでは各プローブ対を蛍光体FAM、HEXで標識する。2つの発光チャンネルを使用して各プローブについて別々にTmを決定する。本例もまた5つの、さらには6以上のHCV型を区別するうえでの多次元分析の有効性を示す。
第3のプローブ対を前記実施例2の要領で試験し、それらのプローブ対がHCV型判別のための相互補完的なデータセットをもたらしうるかどうか調べた。このプローブ対もまたデュアルチャンネルシステムで蛍光体FAM及びHEXを使用した。このペアもまた、5つの、さらには6以上のHCV型を区別するうえでの多次元分析の有効性を示す。
この実施例では閉管定量/型判別反応系によるHCV型判別及びHCVウイルス量(HCV定量)の同時決定法を開示する。定量と型判別反応を一体化したこの閉管システムでは精製ステップも反応混合液調製後の追加成分の添加も不要である。
この実施例では本発明の説明に使用したヌクレオチド配列を示す。次表に記載の配列はあくまでも例示であり、本発明が次表に記載の配列に限定されることを意味しない。
Claims (5)
- サンプル中に存在する場合のC型肝炎ウイルス(HCV)の型を識別するための閉管法であって:
a)該サンプルに由来するHCVゲノムの一部分を増幅して少なくとも1つのアンプリコンを生成させるステップ;
b)単一のハイブリダイゼーション反応において、該アンプリコンを少なくとも第1プローブ及び第2プローブとハイブリダイズさせて、少なくとも2つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップであって、
i)各プローブはHCVゲノム内のヌクレオチド配列と相補的又は部分的に相補的であり;
ii)HCVゲノム内の該ヌクレオチド配列は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示し;
iii)第1プローブと該ヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような温度依存的ハイブリダイゼーション特性を有し、ここで温度依存的ハイブリダイゼーション特性とは、あるHCV遺伝子型内の配列のばらつきにより生じる、識別可能な融点(Tm)範囲であり;また
iv)第2プローブと該ヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような温度依存的ハイブリダイゼーション特性を有するが、ステップiv)の温度依存的ハイブリダイゼーション特性はステップiii)の温度依存的ハイブリダイゼーション特性と同じであり、また第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なることを特徴とするステップ;
c)標的ハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性を計測して、各ハイブリダイゼーション複合体に対応するハイブリダイゼーションプロファイルを生成させるステップであって、ある温度範囲で標的ハイブリダイゼーション複合体を検出することにより、標的ハイブリダイゼーション複合体のTmを決定することを含むステップ;
d)ハイブリダイゼーションプロファイルを多次元分析により互いに比較して複合プロファイルを生成させるステップ;及び
e)複合プロファイルを少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関させ、第1プローブ及び第2プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を考慮することによりHCV型の帰属を行うステップ
を含み、
第1及び第2プローブは配列番号9〜57のヌクレオチド配列より独立に選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。 - a)前記ハイブリダイゼーションステップは、複数の、少なくとも3つの標的のハイブリダイゼーション複合体を形成させるべく、第1及び第2プローブに加えて、少なくとも1つの追加的なプローブをさらに含み、
b)前記複数のハイブリダイゼーション複合体は、識別可能なハイブリダイゼーション特性を有し、
c)前記相関ステップでのHCV型の帰属は、該複数の、少なくとも3つのハイブリダイゼーション複合体の識別可能なハイブリダイゼーション特性を考慮して行われる
ことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - アンプリコンの蓄積速度をモニターし、そのアンプリコン蓄積速度をウイルス量と相関させることによって、サンプル中のHCVのウイルス量を決定するステップをさらに含むとともに、前記モニタリングステップはアンプリコン定量プローブを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- サンプル中に存在する場合のC型肝炎ウイルス(HCV)の型を識別するための閉管法であって:
a)単一のハイブリダイゼーション反応において、該HCVに由来する核酸を少なくとも第1プローブ及び第2プローブとハイブリダイズさせて、少なくとも2つの標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップであって、
i)各プローブはHCVゲノム内のヌクレオチド配列と相補的又は部分的に相補的であり;
ii)該HCVゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも2つのHCV型の間で配列異質性を示し;
iii)第1プローブと該ヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような温度依存的ハイブリダイゼーション特性を有し、ここで温度依存的ハイブリダイゼーション特性とは、あるHCV遺伝子型内の配列のばらつきにより生じる、識別可能な融点(Tm)範囲であり;また、
iv)第2プローブと該ヌクレオチド配列とを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも2つのHCV型を区別するような温度依存的ハイブリダイゼーション特性を有するが、ステップiv)の温度依存的ハイブリダイゼーション特性はステップiii)の温度依存的ハイブリダイゼーション特性と同じであり、また第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なることを特徴とするステップ;
b)標的ハイブリダイゼーション複合体の温度依存的ハイブリダイゼーション特性を計測して、各ハイブリダイゼーション複合体に対応するハイブリダイゼーションプロファイルを生成させるステップであって、ある温度範囲で標的ハイブリダイゼーション複合体を検出することにより、標的ハイブリダイゼーション複合体のTmを決定することを含むステップ;
c)ハイブリダイゼーションプロファイルを多次元分析により互いに比較して複合プロファイルを生成させるステップ;及び
d)複合プロファイルを少なくとも5つのHCV型のうちの1つと相関させ、少なくとも第1プローブ及び第2プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を考慮することによりHCV型の帰属を行うステップ
を含み、
第1及び第2プローブは配列番号9〜57のヌクレオチド配列より独立に選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。 - 第1プローブ及び第2プローブからなるプローブ対であって、第1プローブ及び第2プローブが各々、配列番号9〜57より選択されるヌクレオチド配列からなると共に、少なくとも2つのウイルス型を区別することができ、且つ、第1プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型は、第2プローブによって区別される少なくとも2つのウイルス型とは異なる、プローブ対。
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