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単一プローブ分析を用いるｃ型肝炎ウイルスタイピングのためのプローブおよび方法
JP4638388B2
Japan
- Other languages
English - Inventor
グプタ アマール ゴードン ウィル スティーブン - Current Assignee
- F Hoffmann La Roche AG
Description
translated from
本発明は、ウイルス診断手法に関する。具体的には、本発明はＣ型肝炎ウイルスタイピング（例えば、ゲノタイピングおよびサブタイピング）に関する。本発明は、例えば、患者からの試料におけるＨＣＶタイピングのための組成物および方法を提供する。
〔従来の技術〕
米国特許第６，５４８，２４４号
国際特許出願ＷＯ９６／１３５９０号
国際特許出願ＷＯ９４／２５６０１号
米国特許第６，１７１，７８５号
米国特許第５，９９４，０５６号
米国特許出願第２００４／００９６２６号
米国特許第６，４６５，１７５号
米国特許第５，３６６，８０６号
米国特許第５，８４７，１６２号
米国特許第５，９３６，０８７号
米国特許第６，０５１，７１９号
米国特許第６，１９１，２７８号
米国特許第５，１８８，９３４号
米国特許第６，００８，３７９号
米国特許第６，０２０，４８１号
米国特許第６，１４０，５００号
米国特許第５，８６３，７２７号
米国特許第５，８００，９６６号
米国特許第５，９４５，５２６号
米国特許出願第１０／７１９，２５７号
〔従来の技術〕
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は増大する世界的な関心事である。ＨＣＶ感染は一般に持続性があり、肝臓の硬変および肝臓細胞癌腫において発現される慢性肝臓病を誘導する。ＨＣＶは合衆国において肝臓移植のための主導的原因である。世界的には、ほぼ１００万の新しいＨＣＶ感染が毎年報告されている。合衆国単独において、推定４００万人の人々が感染しており、３万の新しい感染が毎年起こる。
現在、ＨＣＶは合衆国において毎年推定８０００〜１万人の死亡の原因である。改良された診断剤および治療剤の開発なしでは、その数は次の１０〜２０年において３倍となることが予測される（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ（１９９７）Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｎｃｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｎｅｌ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ：「Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ」，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６（Ｓｕｐｐｌ．１）：２Ｓ−１０Ｓ）。
ＨＣＶゲノムは高度に多形であって、（遺伝子型およびサブタイプといわれる）多数の株が特徴付けられている。異なるウイルスのタイプは異なる病気の結果および治療計画に対する異なる応答性に相関する。感染に存在するウイルス遺伝子型（および／またはサブタイプ）を知ることは、臨床家に、感染した患者についての治療の最適なコースを決定するための重要なインジケーターを提供する。しかしながら、益々増大する数の公知のＨＣＶタイプを識別することができる単純な診断方法の開発は挑戦的となった。
ＨＣＶ診断のための改良された方法を開発する当分野における要望が存在する。益々増大する数の、遺伝子型サブタイプを含む公知のＨＣＶ遺伝子型単離体を識別できる改良された方法に対する要望が存在する。さらに、ＨＣＶ感染を同時に遺伝子型分けし、定量する（例えば、ウイルス負荷またはコピー数を測定する）ことができる方法に対する当分野における要望も存在する。本発明は、これらの要望を満足し、ならびにさらなる利点を提供する新規な組成物および方法を提供する。
本発明の詳細な記載に先立って、ＨＣＶ命名法および生物学の関連態様を以下に議論する。本発明を理解するのに必要なこれらのトピックスはＨＣＶゲノムの議論、ＨＣＶタイピングの命名法、ＨＣＶタイピングの臨床的関連性およびＨＣＶタイピング方法を含む。
ＨＣＶゲノム
ＨＣＶゲノム（図１参照）は、ＰｅｓｔｉｖｉｒｕｓおよびＦｌａｖｉｖｉｒｕｓ属のメンバーのゲノムに対して顕著な同様性を持つ長さがほぼ１０ｋｂの正−センス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。元のＨＣＶ単離体（ＨＣＶ−１）は３’末端においてポリ（Ａ）テイルを含有するほぼ９．４ｋＢゲノムを有した（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５）。ＨＣＶ−１配列は３４１塩基の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３，０１１アミノ酸のポリプロテインをコードする長いオープンリーディングフレームおよび約２７塩基の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を含んだ。図１におけるＨＣＶゲノムおよびポリプロテインの模式図参照。
ＨＣＶゲノム（図１参照）は、ＰｅｓｔｉｖｉｒｕｓおよびＦｌａｖｉｖｉｒｕｓ属のメンバーのゲノムに対して顕著な同様性を持つ長さがほぼ１０ｋｂの正−センス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。元のＨＣＶ単離体（ＨＣＶ−１）は３’末端においてポリ（Ａ）テイルを含有するほぼ９．４ｋＢゲノムを有した（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５）。ＨＣＶ−１配列は３４１塩基の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、３，０１１アミノ酸のポリプロテインをコードする長いオープンリーディングフレームおよび約２７塩基の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を含んだ。図１におけるＨＣＶゲノムおよびポリプロテインの模式図参照。
ウイルスＲＮＡゲノムは宿主翻訳装置によって単一ポリプロテイン産物として翻訳され、これは、次いで、タンパク質分解プロセッシングに付されて、ウイルスタンパク質を生じる。各遺伝子型のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の長さは特徴的に異なる。例えば、タイプ１単離体におけるオープンリーディングフレームは長さがほぼ９，４００リボヌクレオチドであり、他方、タイプ２単離体のそれは典型的には９，０９９ヌクレオチドであって、タイプ３単離体のそれは典型的には９，０６３ヌクレオチドである（Ｂｕｋｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，１５：４１−６３）。
ＨＣＶゲノム構造／組織化はＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のそれと非常に似ている。ほとんどのｆｌａｖｉｖｉｒｕｓタンパク質の公知の機能と合致して、Ｎ末端ＨＣＶタンパク質は同様な構造であり（Ｃ（キャプシド／コア）、Ｅ１およびＥ２エンベロープタンパク質を含む）、ＮＳ２（メタロプロテアーゼ、ＮＳ３（セリン−プロテアーゼ／ヘリカーゼ）、ＮＳ４およびＮＳ５（ＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼ）を含めたＣ末端非構造タンパク質はウイルス複製において機能すると考えられる。ＨＣＶ ＲＮＡゲノムおよびコードされたポリペプチドの組織化を示す模式図を図１に掲げる。
プロトタイプＨＣＶ単離体（今日ＨＣＶ １ａといわれる）の同定および特徴付けに続いて、世界中からの他の単離体が同定され（継続して同定され）ている。配列の比較は、これらのユニークな単離体はＨＣＶゲノムの全長にわたって３５％と高いヌクレオチド非同一性によって相互と異なり得る（Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：３３１−３４１）。配列の変動はウイルスゲノム全体で観察され、いくつかの領域は他よりも大きな変動を示す。例えば、一般的には、高い配列保存は５’−ＵＴＲ領域に観察され；逆に、エンベロープ（Ｅ）領域を含むいくつかの領域は超可変ヌクレオチド配列を示す。
ＨＣＶタイピング命名法
ＨＣＶタイピング命名法の理解が、本発明の議論に先立って必要である。歴史的には、研究者はいくつかの分類系および命名法を用いて種々のＨＣＶ株を特徴付けてきたが、その結果、科学文献において困難を生じた。コンセンサスＨＣＶ遺伝子型／サブタイプ命名法系がいまや採用された（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｌｅｔｔｅｒ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９：１３２１−１３２４；また、Ｚｅｉｎ（２０００）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５；Ｍａｅｒｔｅｎｓ ａｎｄ Ｓｔｕｙｖｅｒ（１９９７）「Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ」，ｐ．１８２−２３３，Ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ａｎｄ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ（編），Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄも参照されたい）。この系に従うと、ＨＣＶ単離体は、遺伝子型といわれる主要な遺伝子の群へのヌクレオチド配列の発散に基づいて分類される。これらの遺伝子型は、一般に、その発見の順序で（アラビア数字で）ナンバリングされる。遺伝子型内で相互により密接に関連するＨＣＶ株はサブタイプといわれ、これは、一般にはその発見の順番に、小文字文字が割り当てられる。個体単離体内で見出される遺伝的変種は疑似種といわれる。ＨＣＶの疑似種は、おそらくは、宿主中でのウイルス複製の間における突然変異の蓄積からの結果である。
ＨＣＶタイピング命名法の理解が、本発明の議論に先立って必要である。歴史的には、研究者はいくつかの分類系および命名法を用いて種々のＨＣＶ株を特徴付けてきたが、その結果、科学文献において困難を生じた。コンセンサスＨＣＶ遺伝子型／サブタイプ命名法系がいまや採用された（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｌｅｔｔｅｒ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９：１３２１−１３２４；また、Ｚｅｉｎ（２０００）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５；Ｍａｅｒｔｅｎｓ ａｎｄ Ｓｔｕｙｖｅｒ（１９９７）「Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ」，ｐ．１８２−２３３，Ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ａｎｄ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ（編），Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄも参照されたい）。この系に従うと、ＨＣＶ単離体は、遺伝子型といわれる主要な遺伝子の群へのヌクレオチド配列の発散に基づいて分類される。これらの遺伝子型は、一般に、その発見の順序で（アラビア数字で）ナンバリングされる。遺伝子型内で相互により密接に関連するＨＣＶ株はサブタイプといわれ、これは、一般にはその発見の順番に、小文字文字が割り当てられる。個体単離体内で見出される遺伝的変種は疑似種といわれる。ＨＣＶの疑似種は、おそらくは、宿主中でのウイルス複製の間における突然変異の蓄積からの結果である。
いずれかの２つのＨＣＶ単離体の間の関連度合いは、例えば、ゲノムの全長にわたって２つのゲノムの間のヌクレオチド同一性のパーセンテージを測定することによって定量することができる。この関連性分析、およびどのようにして命名法を用いてウイルス単離体関連性を反映するかの１つの例は図２に示される（Ｚｅｉｎ（２０００）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５から適合）。Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４，Ｌｅｔｔｅｒ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９：１３２１−１３２４）によって提案された命名法を用い、遺伝子型、サブタイプおよび疑似種の間の非関連性の増大する程度が、完全なゲノムにわたってのヌクレオチド配列同一性のパーセンテージにおいて観察できる。図２中の表は、疑似種であるＨＣＶ単離体が関連性の最大程度を共有し、遺伝子型内の同一サブタイプの単離体が、やはりその遺伝子型内の異なるサブタイプの単離体よりも大きな配列同一性を共有するという提案を反映している。
別法として、ＨＣＶ単離体の間の関連性は、例えば、図３に示されたように、ゲノムのより小さなドメインにわたってゲノム同一性を調べることによって定量することができる。この比較はウイルスＮＳ５オープンリーディングフレーム（プロトタイプＨＣＶ遺伝子型１ａ単離体におけるヌクレオチド位置７９７５−８１９６）に由来する２２２ヌクレオチドセグメントを用いる。配列同一性のこの比較は、１つのサブタイプのＨＣＶ単離体が、いずれかの他の遺伝子型からの単離体に対するよりは、その同一遺伝子型の他のサブタイプに対してより密接に関連するというＳｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４，Ｌｅｔｔｅｒ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９：１３２１−１３２４）の提案をやはり支持する。
現在、１１のＨＣＶ遺伝子型が世界中で認識されている。しかしながら、異なる遺伝子型の間の進化的（系統発生）関連性が再度調べられ、ＨＣＶ単離体が分類され／帰属される認識された遺伝子型の数は再度評価すべきである公表された提案がある。いくつかの報告は、ＨＣＶ遺伝子型のサブセットが他のより距離がある関連遺伝子型に対してよりも相互に対してより密接に関連することを示唆しており、これは、修飾されたＨＣＶ命名法に反映させるべきである。１１の遺伝子型は６つのＨＣＶクレードに再度グループ分けすることができることが提案されている。クレードのグループ分けは遺伝子型の間の系統発生関係を反映し、そこでは、遺伝子型１、２、４および５は全て区別されるクレードを表すが、遺伝子型３および１０は単一のクレード３に入れられ、遺伝子型６、７、８、９および１１は単一のクレード６に入れられる（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４３（１２）：２４９３−２５０３；Ｚｅｉｎ（２０００）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｃｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５）。
全ての１１の遺伝子型を含むほぼ７８のＨＣＶサブタイプが世界中で知られている。これらのサブタイプのいくつかの要約を図４に示す。この表はいくつかの（全てではない）ＨＣＶタイプ、特に、頻繁な臨床的な単離体のように見えるサブタイプのリストを提供する。当分野で知られたプロトタイプおよび／または代表的な単離体の名称を掲げる。
多くのＨＣＶ単離体がその全体が配列決定されている。図５は、臨床的に関連するＨＣＶ単離体のいくつかの５’−ＵＴＲにおける３３のヌクレオチドドメインのコンセンサス配列を示す表を掲げる。ＨＣＶタイプ１ａヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド位置をダッシュ記号で示す。ＨＣＶタイプ１ａとは異なるヌクレオチド位置をヌクレオチドの変化で示す。
本明細書中におけるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプおよび疑似種に対する全ての言及はＳｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４に記載された系に従っており（Ｌｅｔｔｅｒ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９：１３２１−１３２４）、また、例えば、Ｚｅｉｎ（２０００）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５；Ｍａｅｒｔｅｎｓ ａｎｄ Ｓｔｕｙｖｅｒ（１９９７）「Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ」，ｐ．１８２−２３３，Ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ａｎｄ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ（編），Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載されている。
ＨＣＶタイピングの臨床的関連
患者におけるＨＣＶ感染のタイピングは依然として感染の攻撃性についての重要な予言者、ならびに種々の治療計画に応答する感染についての能力である。ＨＣＶ遺伝子型１はより攻撃的な株およびＨＣＶ遺伝子型２または３よりもαインターフェロン（ＩＮＦ−α）処置（およびリバビリンとの組合せ療法）により応答しないようである株を表す（Ｎｏｌｔｅ，「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ６（４）：２６５−２７７［２００１］；Ｄｕｆｏｕｒ 「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｅｗｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００２，ｐ．１０−１４；Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ 「Ｕｓｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙｓ」，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．７，Ｎｕｍｂｅｒ １［Ｆｅｂｕｒａｒｙ ２００３］）。ＨＣＶ感染をタイプ分けする目標は、しばしば、他のＨＣＶタイプで感染されたものとは反対にＨＣＶ遺伝子型１に感染した患者を同定することである。さらに、公知のＨＣＶサブタイプの拡大するリストの同定に関しては、臨床的および研究的目的双方のためのＨＣＶ系統発生の複雑性を識別できる単純なＨＣＶタイピング方法に対する当分野における要望が存在する。また、同時にＨＣＶ負荷情報（例えば、コピー数およびウイルスゲノム定量）を提供するＨＣＶタイピング方法に対する当分野における要望も存在する。
患者におけるＨＣＶ感染のタイピングは依然として感染の攻撃性についての重要な予言者、ならびに種々の治療計画に応答する感染についての能力である。ＨＣＶ遺伝子型１はより攻撃的な株およびＨＣＶ遺伝子型２または３よりもαインターフェロン（ＩＮＦ−α）処置（およびリバビリンとの組合せ療法）により応答しないようである株を表す（Ｎｏｌｔｅ，「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ６（４）：２６５−２７７［２００１］；Ｄｕｆｏｕｒ 「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｅｗｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００２，ｐ．１０−１４；Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ 「Ｕｓｅ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｓｓａｙｓ」，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．７，Ｎｕｍｂｅｒ １［Ｆｅｂｕｒａｒｙ ２００３］）。ＨＣＶ感染をタイプ分けする目標は、しばしば、他のＨＣＶタイプで感染されたものとは反対にＨＣＶ遺伝子型１に感染した患者を同定することである。さらに、公知のＨＣＶサブタイプの拡大するリストの同定に関しては、臨床的および研究的目的双方のためのＨＣＶ系統発生の複雑性を識別できる単純なＨＣＶタイピング方法に対する当分野における要望が存在する。また、同時にＨＣＶ負荷情報（例えば、コピー数およびウイルスゲノム定量）を提供するＨＣＶタイピング方法に対する当分野における要望も存在する。
実質的な領域的差がＨＣＶタイプの分布に存在する。ＨＣＶサブタイプ１ａおよび１ｂは合衆国および欧州において最も普通のサブタイプである。日本においては、サブタイプ１ｂはＨＣＶ感染の場合の７３％までを担う。ＨＣＶサブタイプ２ａおよび２ｂは南米、欧州および日本では比較的普通であり、サブタイプ２ｃは北部イタリアで普通に見出される。ＨＣＶ遺伝子型３ａは欧州および合衆国において静脈内薬物乱用者において特に蔓延している。ＨＣＶ遺伝子型４は北アフリカおよび中近東において優勢なように見え、遺伝子型５および６は、各々、南アフリカおよび香港に限られるようである。ＨＣＶ遺伝子型７、８および９はベトナムの患者においてのみ同定されており、遺伝子型１０および１１はインドネシアからの患者で同定された（Ｎｏｌｔｅ，「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ６（４）：２６５−２７７［２００１］；Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ：Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．７，Ｎｕｍｂｅｒ １［Ｆｅｂｕｒａｒｙ ２００３］；Ｚｅｉｎ「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５［２０００］参照）。
区別されるＨＣＶ遺伝子型およびサブタイプの地理的クラスタリングのため、ＨＣＶタイピングは所与の集団におけるＨＣＶ突発の源を追跡するにおける有用な疫学マーカーでもあり得る。例えば、ＨＣＶタイピングを用いて、汚染した抗Ｄ免疫グロブリンに対するアイルランド婦人の群におけるＨＣＶ感染の源を追跡した（Ｐｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｎ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ａｎｔｉ−Ｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｒｕｉｎ」 Ｌａｎｃｅｔ ３４５：１２１１−１２１３）。疫学マーカーとしてのＨＣＶタイピングを用いるさらなる例も知られている（例えば、Ｈｏｈｎｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｖ−ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｓｏｕｒｃｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ」，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１３７：２５−３４；およびＢｒｏｎｏｗｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）「Ｐａｔｉｅｎｔ−ｔｏ−ｐａｔｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｌｏｎｏｓｃｏｐｙ」，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３７：２３７−２４０参照）。
ＨＣＶタイピング方法
いずれかの所与の感染で見出されるＨＣＶ単離体は地理的株分布、病気の結果、および抗ＨＣＶ療法に対する応答における差によって変化する。ＨＣＶ遺伝子型を決定するための信頼性のある方法は重要な臨床試験である。さらに、多数のかつ区別されるＨＣＶ種の同定に関しては、ＨＣＶタイピング方法が多数のＨＣＶタイプ（遺伝子型およびサブタイプ）を識別する能力を有することが重要である。例えば、少なくとも５以上の遺伝子型を識別することができるのがＨＣＶゲノタイピングテストで有用である。別法として、少なくとも６以上のサブタイプの間を識別できるのがＨＣＶタイピングで有用である。ＨＣＶタイピングのための核酸塩基の方法を以下にまとめる。
いずれかの所与の感染で見出されるＨＣＶ単離体は地理的株分布、病気の結果、および抗ＨＣＶ療法に対する応答における差によって変化する。ＨＣＶ遺伝子型を決定するための信頼性のある方法は重要な臨床試験である。さらに、多数のかつ区別されるＨＣＶ種の同定に関しては、ＨＣＶタイピング方法が多数のＨＣＶタイプ（遺伝子型およびサブタイプ）を識別する能力を有することが重要である。例えば、少なくとも５以上の遺伝子型を識別することができるのがＨＣＶゲノタイピングテストで有用である。別法として、少なくとも６以上のサブタイプの間を識別できるのがＨＣＶタイピングで有用である。ＨＣＶタイピングのための核酸塩基の方法を以下にまとめる。
ヌクレオチド配列決定
ＨＣＶゲノタイピングおよびサブタイピングについての参照標準は、（例えば、患者からの臨床検体から）ＨＣＶゲノムＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ、続いての系統発生帰属によるＨＣＶゲノムに由来するアンプリコンのヌクレオチド配列決定である。しかしながら、直接的配列決定は、（非放射性試薬を用いる自動配列決定装置の導入に関してさえ）低いスループットおよび特殊化された器具についての要件のため非現実的である。さらに、混合感染の場合のゲノタイピングおよびサブタイピングについての配列決定方法を用いるのは曖昧な結果をもたらしかねない。
ＨＣＶゲノタイピングおよびサブタイピングについての参照標準は、（例えば、患者からの臨床検体から）ＨＣＶゲノムＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ、続いての系統発生帰属によるＨＣＶゲノムに由来するアンプリコンのヌクレオチド配列決定である。しかしながら、直接的配列決定は、（非放射性試薬を用いる自動配列決定装置の導入に関してさえ）低いスループットおよび特殊化された器具についての要件のため非現実的である。さらに、混合感染の場合のゲノタイピングおよびサブタイピングについての配列決定方法を用いるのは曖昧な結果をもたらしかねない。
ＰＣＲベースのＨＣＶゲノタイピング
いくつかのタイピング方法は、タイプ特異的ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ再増幅を用いる。タイピングは、ユニバーサルコンセンサスプライマー（すなわち、ＨＣＶタイプにかかわらずＨＣＶゲノムアンプリコンを生じるプライマー）での一次ＰＣＲ増幅、続いての、タイプ特異的プライマーでのネステッドＰＣＲ、例えば、コア領域内のタイプ特異的プライマーによって達成される。これらのアッセイは、十分なタイプ特異的ＰＣＲアンプリコンを生じて、遺伝子型／サブタイプ帰属をなすためにＰＣＲプライマーの複数の組を必要とする。これらの方法は、ＨＣＶタイピングを達成するのにＰＣＲプライマーの複数の組を必要とし、しばしば、感度および特異性を欠くという欠点を有する（Ｘａｖｉｅｒ ａｎｄ Ｂｕｋｈ（１９９８）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｇｅｎｏｔｙｐｅ」，Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｒｅｖ．，４．１−１９；Ｚｅｉｎ（２０００）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）「Ｔｙｐｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｙｓ ａｎｄ ｔｒａｃｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｓｏｕｒｃｅｓ」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：６７３−６７９；Ｗｉｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ： ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，４４：２７２−２７９）。
いくつかのタイピング方法は、タイプ特異的ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ再増幅を用いる。タイピングは、ユニバーサルコンセンサスプライマー（すなわち、ＨＣＶタイプにかかわらずＨＣＶゲノムアンプリコンを生じるプライマー）での一次ＰＣＲ増幅、続いての、タイプ特異的プライマーでのネステッドＰＣＲ、例えば、コア領域内のタイプ特異的プライマーによって達成される。これらのアッセイは、十分なタイプ特異的ＰＣＲアンプリコンを生じて、遺伝子型／サブタイプ帰属をなすためにＰＣＲプライマーの複数の組を必要とする。これらの方法は、ＨＣＶタイピングを達成するのにＰＣＲプライマーの複数の組を必要とし、しばしば、感度および特異性を欠くという欠点を有する（Ｘａｖｉｅｒ ａｎｄ Ｂｕｋｈ（１９９８）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｇｅｎｏｔｙｐｅ」，Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｒｅｖ．，４．１−１９；Ｚｅｉｎ（２０００）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）「Ｔｙｐｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｙｓ ａｎｄ ｔｒａｃｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｓｏｕｒｃｅｓ」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：６７３−６７９；Ｗｉｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂｙ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｕｓｉｎｇ ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ： ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，４４：２７２−２７９）。
ハイブリダイゼーションベースのＨＣＶゲノタイピング
ＨＣＶ単離体のタイピングは、複数のタイプ特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いることによって達成することができる。このウイルスタイピングは、ユニバーサルプライマーを用いる一次ＰＣＲ増幅、引き続いての、タイプ特異的ハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。タイプ特異的プローブとのこのハイブリダイゼーションは、固定されたハイブリダイゼーション条件で行い、所与のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション複合体の存在または非存在をスコア採りする。アッセイにおけるいずれか１つのプローブは、複数の遺伝子型／サブタイプ内から明確に識別することができず、従って、遺伝子型／サブタイプ帰属を行うのに多数のプローブの使用を必要とする。このアプローチは、ＨＣＶタイピングプロセスで用いるのに複数のプローブを必要とする欠点に悩んでいる。
ＨＣＶ単離体のタイピングは、複数のタイプ特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いることによって達成することができる。このウイルスタイピングは、ユニバーサルプライマーを用いる一次ＰＣＲ増幅、引き続いての、タイプ特異的ハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。タイプ特異的プローブとのこのハイブリダイゼーションは、固定されたハイブリダイゼーション条件で行い、所与のハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション複合体の存在または非存在をスコア採りする。アッセイにおけるいずれか１つのプローブは、複数の遺伝子型／サブタイプ内から明確に識別することができず、従って、遺伝子型／サブタイプ帰属を行うのに多数のプローブの使用を必要とする。このアプローチは、ＨＣＶタイピングプロセスで用いるのに複数のプローブを必要とする欠点に悩んでいる。
ＨＣＶタイプ特異的ハイブリダイゼーションアッセイの１つの適用は、種々の源に記載されているように、ライン−プローブアッセイ（ＬｉＰＡ）である（Ｓｔｕｙｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）「Ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｌｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓｓａｙ」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１０９３−１１０２；Ｓｔｕｙｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０１３４−１０１３８；Ａｎｄｏｎｏｖ ａｎｄ Ｃｈａｕｄｈａｒｙ（１９９５）Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｏｉｌ．，３３（１）：２５４−２５６；Ｓｔｕｙｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４（９）：２２５９−２２６６；Ｓｔｕｙｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８（２）：７０２−７０７；および、例えば、Ｍａｅｒｔｅｎｓ ａｎｄ Ｓｔｕｙｖｅｒ（１９９７）「Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ」，ｐ．１８２−２３３，Ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ（編），Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄにレビューされている。この技術を一体化させる市販のキットはＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓによって生産される（Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；「ＰＲＯＣＥＳＳ ＦＯＲ ＴＹＰＩＮＧ ＨＣＶ ＩＳＯＬＡＴＥＳ」と題されたＭａｄｒｔｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，に対する２００３年４月１５日に発行された米国特許第６，５４８，２４４号；「ＮＥＷ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ Ｃ ＶＩＲＵＳ ＧＥＮＯＴＹＰＥＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥ ＡＳ ＰＲＯＰＨＹＬＡＣＴＩＣ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＤ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＡＧＥＮＴＳ」と題されたＭａｅｒｔｅｎｓ ａｎｄ Ｓｔｕｙｖｅｒによる１９９６年５月９日に発行された公開ＰＣＴ国際出願Ｎｏ．ＷＯ９６／１３５９０；「ＮＥＷ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ Ｃ ＶＩＲＵＳ ＧＥＮＯＴＹＰＥＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥ ＡＳ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＤ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＡＧＥＮＴＳ」と題されたＭａｅｒｔｅｎｓ ａｎｄ Ｓｔｕｙｖｅｒによる１９９４年１１月１０日に公開された公開ＰＣＴ国際出願Ｎｏ．ＷＯ９４／２５６０１）。ライン−プローブアッセイはドットブロットまたはスロットブロットタイプのアッセイにおいて基材（テストストリップ）に固定化された（２１のプローブほども）複数のタイプ特異的プローブを用いる。臨床検体から生じたＨＣＶ ５’−ＵＴＲ領域から由来するＨＣＶアンプリコンは、静的ハイブリダイゼーション条件下で種々のプローブに同時にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション複合体の得られたパターンはウイルスのタイプを明らかにする。
このライン−プローブアッセイは、前記アッセイにおけるいずれかの１つのプローブは遺伝子型帰属をなすことができないので、試料中のＨＣＶ遺伝子型および／またはのＨＣＶサブタイプを決定するのに複数のプローブの使用を必要とする欠点に悩んでいる（事実、２１のプローブほども）。
幾つかのレポートは、１つのプローブ（または少数のプローブ）を利用して、ＨＣＶ感染を少数のサブタイプのうちの１つに分類するＨＣＶタイピング方法を用いる。これらのレポートで用いるプローブは、ハイブリダイゼーション条件を操作することによって複数の遺伝子型／サブタイプにハイブリダイズできる点で「タイプ特異的」ではない。しかしながら、当分野で報告されたプローブのこれらのタイプ（例えば、Ｓｃｈｒｏｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０（６）：２０４６−２０５０；Ｂｕｌｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８（１２）：２１４７−２１５４）は、それらが識別できる遺伝子型／サブタイプの数が限定されている。
エンドヌクレアーゼ切断（ＲＦＬＰ）ベースのＨＣＶゲノタイピング
ＨＣＶのタイピングは、伝統的な制限断片長多形（ＲＦＬＰ）アッセイの異形によっても試みられてきた。このＨＣＶアッセイは、遺伝子型特異的切断部位を認識する制限エンドヌクレアーゼでのユニバーサルＰＣＲアンプリコンの消化を用いる（例えば、Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）「Ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｃ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ ｂｙ ｄｉｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２１０５−２１１２；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｌｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６９：４７３−４７５参照）。タイプ特異的制限部位はＮＳ５および５’−ＵＴＲドメインで起こることが知られている。ゲノタイピング／サブタイピングでのこのアッセイの使用は、制限部位の変化をもたらす限定された数の多形遺伝子座のため制限される。
ＨＣＶのタイピングは、伝統的な制限断片長多形（ＲＦＬＰ）アッセイの異形によっても試みられてきた。このＨＣＶアッセイは、遺伝子型特異的切断部位を認識する制限エンドヌクレアーゼでのユニバーサルＰＣＲアンプリコンの消化を用いる（例えば、Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）「Ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｃ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ ｂｙ ｄｉｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２１０５−２１１２；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｌｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６９：４７３−４７５参照）。タイプ特異的制限部位はＮＳ５および５’−ＵＴＲドメインで起こることが知られている。ゲノタイピング／サブタイピングでのこのアッセイの使用は、制限部位の変化をもたらす限定された数の多形遺伝子座のため制限される。
本発明は、ＨＣＶタイピングのための組成物および方法を提供し、さらに、当分野で知られた他のＨＣＶタイピング法よりも優れた利点を有するＨＣＶタイピングのための組成物および方法を提供する。本発明はＨＣＶ単離体をタイピングする方法を提供し、そこでは、前記方法は、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型および／または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプを識別できる単一ＨＣＶタイピングプローブを用いる。さらに、本発明は、同時に、（例えば、ＨＣＶに感染した患者からの）ＨＣＶ単離体をタイプ分けでき、ならびに試料中のＨＣＶゲノム材料を定量できる（例えば、ウイルス負荷またはコピー数を決定する）方法を提供する。また、本発明によって教示される組成物および方法は、本発明の記載を読めば明らかである他の利点も提供する。
本発明は、ＨＣＶタイピング、例えば、ゲノタイピングおよび／またはサブタイピングのための組成物および方法を提供し、ここに、前記方法はＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプ帰属を行うのに単一のタイピングプローブのみを必要とする。本発明の組成物および方法を用いて、ＨＣＶ試料を（例えば、遺伝子型１、２、３、４、５または６から選択される）少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型の１つに帰属させ、または（例えば、サブタイプ１ａ／ｂ／ｃ、２ａ／ｃ、２ｂ、３ａ、４ａ，５ａまたは６ａから選択される）少なくとも６つのサブタイプの１つにＨＣＶ試料を帰属させることができ、本発明の方法はＨＣＶタイプ帰属をなすのに単一のタイピングプローブのみを使用する。また、本発明の方法は混合ＨＣＶ感染の場合にも用いることができ、そこでは、試料に存在する各ＨＣＶ種をＨＣＶタイプ（遺伝子型またはサブタイプ）に帰属する。本発明は、遺伝子型またはサブタイプ帰属をなすのに複数のプローブの使用を必要とする、あるいは単一のプローブが５以上の遺伝子型または６以上のサブタイプ内から識別できない当分野で現在知られたＨＣＶタイピングのための方法よりも利点を提供する。
いくつかの実施形態において、試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプを決定するための本発明の方法は以下の工程、（ａ）試料からのＨＣＶゲノムの部分を増幅し、それにより、少なくとも１つのアンプリコンを生じさせ；（ｂ）前記アンプリコンを第一のプローブ（ＨＣＶタイピングプローブ）とハイブリダイズさせて、標的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここに、（ｉ）第一のプローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、あるいは部分的に相補的であり；（ｉｉ）ハイブリダイゼーション複合体の領域の相補性または部分的相補性は、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；および（ｉｉｉ）第一のプローブおよび少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのサブタイプを含むハイブリダイゼーション複合体は、ＨＣＶ遺伝子型またはＨＣＶサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有し；（ｃ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーションの特性を判定し；次いで，（ｄ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性に基づき、標的ハイブリダイゼーション複合体の測定された識別ハイブリダイゼーション特性をＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプに相関させることを有する。
この方法を用い、同定されるＨＣＶ遺伝子型は遺伝子型１、２、３、４、５および６から選択することができる。同定されるＨＣＶサブタイプは遺伝子型１、２、３、４、５および６のいずれのサブタイプでもあり得る。例えば、ＨＣＶサブタイプは１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａから選択することができる。しかしながら、本発明は、本明細書中に列挙したＨＣＶタイプに限定されることを意図しない。というのは、本発明の組成物および方法はいずれのＨＣＶタイプにも適用できるからである。
幾つかの実施形態において、アッセイでテストされる試料はヒト血液またはヒト血清を含むか、またはそれに由来する。
これらの方法のいくつかの実施形態において、ＨＣＶ遺伝子材料を増幅する工程はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせた逆転写（ＲＴ）によるものである。このＰＣＲは、例えば、配列番号３９および４０のヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いることができる。いくつかの態様において、ＰＣＲは、複数のＣ型肝炎ウイルス遺伝子型からＰＣＲアンプリコンを生じるプライマーを用いる。
種々の実施形態において、ＨＣＶタイピングプローブを増幅工程の間に存在させ、あるいは別法として、増幅工程の後に加える。いくつかの実施形態において、ＨＣＶタイピングプローブはＨＣＶゲノムの５’−ＵＴＲまたはＮＳ５領域内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、あるいは部分的に相補的である。例えば、タイピングプローブは配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含む。タイピングプローブはＦＲＥＴドナー、ＦＲＥＴクエンチャーまたは双方を含むことができる。いくつかの態様において、タイピングプローブはＦＲＥＴドナー部分を含む。他の態様において、ハイブリダイジング工程は、ＦＲＥＴドナータイピングプローブを可溶性ＦＲＥＴクエンチャーと混合することを含む。可溶性ＦＲＥＴクエンチャーは、例えば、チアジン色素とすることができる。タイピングプローブの化学構造は特に限定されず、例えば、前記プローブは天然に生じるヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、１つ以上の非天然塩基、非天然ヌクレオチド間結合、非天然ヌクレオチド骨格またはそのいずれかの組合せを含むヌクレオチドオリゴマーとすることができる。
ＨＣＶタイピングプローブはＨＣＶ標的（典型的には、ＨＣＶアンプリコン）とでハイブリダイゼーション複合体を形成する。このハイブリダイゼーション複合体は、ＨＣＶタイプ（例えば、ＨＣＶ遺伝子型）にしたがってユニークである特性を有する。このハイブリダイゼーション複合体は種々の特性のいずれかによって特徴付けることができ、これらの特性を用いて、異なるＨＣＶタイプを含む複合体から前記複合体を識別することができる。したがって、そのような特性は識別ハイブリダイゼーション特性といわれる。いくつかの態様において、識別ハイブリダイゼーション特性は温度依存性ハイブリダイゼーション特性である。例えば、温度依存性ハイブリダイゼーション特性は融解温度（Ｔm）であり得る。Ｔmを識別特性として用いる場合、測定工程はある範囲の温度で標的ハイブリダイゼーション複合体を検出し、それにより、標的ハイブリダイゼーション複合体のＴmを決定することを含む。
これらの方法を用い、実験試料につき測定されるハイブリダイゼーション特性を、公知のＨＣＶタイプまたは対照試料のハイブリダイゼーション特性と比較することができる。この比較を行うことによって、実験試料をベストフィットマッチに基づいて公知のＨＣＶタイプに帰属させることができる。すなわち、いくつかの実施形態において、相関させる工程は、標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を、タイピングプローブ、および少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーションのプローブと比較することを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＣＶタイピングのための方法はさらにＨＣＶ定量を、好ましくは、同一反応ミックスに組み込み、従って、クローン化された系を可能とすることができる。実験試料におけるＨＣＶ定量のための方法は、ＴａｑＭａｎタイプのプローブを用いて、ＨＣＶ ＲＴ−ＰＣＲアンプリコン蓄積をモニターして、ＣT値を誘導することができる。ＨＣＶ定量は、実験ＣT値を、既知のＨＣＶウイルス負荷の対照試料についてのＣT値と比較してなすことができる。すなわち、ＨＣＶタイピング方法は、さらに、試料中のＨＣＶのウイルス負荷を決定するのに用いることができ、増幅工程は、さらに、アンプリコン蓄積のリアルタイム検出用の試薬を用いてアンプリコンの蓄積速度をモニターし、アンプリコンの蓄積速度をウイルス負荷と相関させることを含む。アンプリコン蓄積のリアルタイム検出用の試薬は、典型的には、アンプリコン定量プローブ、例えば、配列番号４１のヌクレオチド配列を含むアンプリコン定量プローブを含む。アンプリコン定量プローブはＦＲＥＴドナー部分およびＦＲＥＴクエンチャー部分を含むことができ、そこではアンプリコン定量プローブは、塩基対合が起こる条件下でアンプリコンとで定量ハイブリダイゼーション複合体を形成する。この場合、増幅工程は増幅工程の間にドナー部分を検出することを含む。
また、本発明は、ＨＣＶタイピング、例えば、ゲノタイピングおよび／またはサブタイピングのための組成物および方法を提供し、そこでは、前記方法はＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプ帰属をなすのに単一のタイピングプローブのみを必要とし、ＨＣＶアンプリコンを生じさせるのにＲＴ−ＰＣＲ増幅工程を必要としない。これらの実施形態において、試料材料（または任意で試料材料から精製された、またはそれから誘導された材料）をタイピング分析で用いる。試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプを決定するためのこれらの方法は、一般には、工程、（ａ）ＨＣＶに由来する核酸を第一のプローブ（ＨＣＶタイピングプローブ）とハイブリダイズさせ、標的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここに（ｉ）第一のプローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であり；（ｉｉ）ハイブリダイゼーション複合体の領域の相補性または部分的相補性は、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；および（ｉｉｉ）第一のプローブおよび少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプを含むハイブリダイゼーション複合体は、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有し；（ｂ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を測定し、次いで（ｃ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーションの特性に基づき、標的ハイブリダイゼーション複合体の測定された識別ハイブリダイゼーション特性をＣ型肝炎ウイルスのタイプと相関させることを含む。これらの方法で用いられるＨＣＶタイピングプローブは特に限定されず、例えば、タイピングプローブは配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含むことができる。
本発明は、本明細書中で記載するＨＣＶタイピング方法で用いることができるプローブを提供する。これらのプローブは、任意で、本発明の方法でのそれらの使用を容易とする種々の他の成分のいずれかと組み合わせることができる。いくつかの態様において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ（すなわち、ＨＣＶタイピングプローブ）を含む組成物を提供し、ここに、プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；およびここに、プローブおよびＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体は、遺伝子型またはサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有する。そのようなＨＣＶタイピングプローブの例は、限定されるものではないが、配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含むプローブを含む。いくつかの態様において、プローブ／標的ハイブリダイゼーション複合体、識別ハイブリダイゼーション特性は融解温度（Ｔm）である。
ＨＣＶタイピングプローブを含む本発明の組成物は、任意で逆転写酵素、およびＨＣＶゲノムの逆転写の開始に適したプライマーを含むこともできる。ＨＣＶタイピングプローブを含む組成物は、任意で、（ａ）プローブ中のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むＨＣＶアンプリコン；（ｂ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー；または（ｃ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー対のいずれかである核酸を含むこともでき；プライマーおよびプライマー対は熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸および適当なＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液と混合される。
他の態様において、本発明は、標識されたＨＣＶタイピングプローブおよび適当な可溶性クエンチャーを含む組成物を提供し、プローブおよび可溶性クエンチャー上の標識はＦＲＥＴ対を形成する。例えば、本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるＦＲＥＴドナー部分で標識されたプローブ、ここに、プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；およびここに、プローブおよび複数のＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプを含むハイブリダイゼーション複合体は、少なくとも２つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも２つのＨＣＶサブタイプを識別する識別ハイブリダイゼーションプローブを有し；および（ｂ）チアジン色素を含む可溶性ＦＲＥＴクエンチャー、ここに、ＦＲＥＴクエンチャーは、ＦＲＥＴドナー部分を消光することができる；を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、識別ハイブリダイゼーション特性は融解温度（Ｔm）である。いくつかの実施形態において、これらの組成物は、任意で、さらに逆転写酵素、およびＨＣＶゲノムの逆転写の開始に適したプライマーを含む。なお他の実施形態において、ＨＣＶタイピングプローブおよび可溶性クエンチャーを含む組成物は、さらに、（ｃ）（ｉ）プローブ中のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むＨＣＶアンプリコン；（ｉｉ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー；または（ｉｉｉ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー対のいずれかである核酸を含み；ここに、前記プライマーおよびプライマー対は熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および適当なＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液と混合される。
また、本発明は、キット、例えば、少なくとも１つのＨＣＶタイピングプローブを含む診断キットを提供する。これらのキットは、試料中のＨＣＶタイプを決定するのに用いることができる。例えば、いくつかの態様においては、ＨＣＶタイピング診断キットは（ａ）ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的である少なくとも１つの標的プローブ（すなわち、ＨＣＶタイピングプローブ）、標的プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々内で配列不均一性を示し、および標的プローブおよびＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体は異なる識別ハイブリダイゼーション特性を有し；および（ｂ）標的プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を測定するための指示書を含む。これらのキットは、例えば、配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含むＨＣＶタイピングプローブを含有することができる。
いくつかの実施形態において、診断キットはＨＣＶ定量（すなわち、ウイルス負荷の決定）を行うための試薬も含有する。例えば、そのようなキットはさらに（ｃ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー対、ここに、前記アンプリコンは標的プローブ中のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的である核酸配列を含み；および（ｄ）アンプリコン蓄積のリアルタイム検出のためのアンプリコン定量プローブ、ここに、前記アンプリコン定量プローブは、塩基対合が起こる条件下でアンプリコンとで定量ハイブリダイゼーション複合体を形成する；を含むことができる。例えば、増幅プライマー対は配列番号３９および４０のプライマーを含むことができ、アンプリコン定量プローブは配列番号４１のヌクレオチド配列を含むことができる。
いくつかの実施形態において、本発明の診断キットは１つ以上の容器にパッケージされる。いくつかの実施形態において、ＨＣＶタイピングプローブはＦＲＥＴ標識部分を含み、前記キットは、さらに、可溶性ＦＲＥＴクエンチャー、例えば、ＦＲＥＴ標識部分を消光することができるチアジン色素を含む。他の実施形態において、前記キットは、任意でさらに、１つ以上の更なる成分を含有する。例えば、診断キットは、さらに、別法として、あるいはいずれかの組合せにおいて、逆転写酵素、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムからの逆転写酵素開始に適した少なくとも１つのプライマー、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸、標準化試料、陽性対照試料、陰性対照試料、酵素反応に適した緩衝液、試料収集チューブ、増幅反応チューブおよびマルチウェルプレートを含むことができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＨＣＶタイピング方法の種々の態様を取り込み、それらの使用を容易とするシステムを提供する。ＨＣＶハイブリダイゼーション分析（例えば、ＨＣＶタイピングプローブ）を実行するのに必要な試薬に加えて、本発明の一体化されたシステムは、任意で、例えば、コンピュータハードウエア、ソフトウエア、またはＨＣＶタイピングを行うための他の機器を含むことができる。例えば、本発明は、シグナルの検出をＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タイプと相関させるシステムを提供し、ここに、前記システムは、（ａ）シグナルを検出するためのディテクター、ここに、シグナルはハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性に相関し、ハイブリダイゼーション複合体がＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるかまたは部分的に相補的であるプローブおよびＨＣＶヌクレオチド配列を含むアンプリコンを含み；および（ｂ）ディテクターに作用可能式にカップリングされた相関モジュール、ここに、前記相関モジュールは、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合対の識別ハイブリダイゼーション特性を検出する場合に観察されるシグナルと比較することによって、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの１つにシグナルを相関させること；を含む。任意で、本発明のシステムにおいては、識別ハイブリダイゼーション特性は融解温度（Ｔm）であって、相関モジュールは、プローブおよび少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体についての予測されたまたは実験的に決定されたＴm値のデータセットを含み、ここに、データセットはコンピュータリーダブルフォーマットである。
１つの実施形態において、本発明は、もし存在すれば、試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプを決定する方法を提供し、前記方法は、ａ）試料からＨＣＶゲノムの部分を増幅し、それにより、少なくとも１つのアンプリコンを生じさせ；ｂ）前記アンプリコンを第一のプローブとハイブリダイズさせて、標的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここに、ｉ）第一のプローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であり；ｉｉ）ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し、およびｉｉｉ）第一のプローブ、および少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＢサブタイプのヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーション複合体は、ＨＣＶ遺伝子型またはＨＣＶサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有し；ｃ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーションの特性を測定し；ｄ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性に基づいて、標的ハイブリダイゼーション複合体の測定された識別ハイブリダイゼーション特性のＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプと相関させることを含む。
もう１つの実施形態において、本発明は、試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプを決定する方法を提供し、前記方法は、ａ）ＨＣＶに由来する核酸を第一のプローブとハイブリダイズさせて、標的ハイブリダイゼーション複合体を形成させ、ここに、ｉ）前記第一のプローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、あるいは部分的に相補的であり；ｉｉ）ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；およびｉｉｉ）第一のプローブおよび、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプのヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーション複合体は、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有し；ｂ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を測定し；次いで、ｃ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性に基づいて、標的ハイブリダイゼーション複合体の測定された識別ハイブリダイゼーション特性をＣ型肝炎ウイルスタイプに相関させることを含む。
もう１つの実施形態において、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブを含む組成物を提供し、ここに、プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；およびここに、プローブ、およびＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体は遺伝子型またはサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有する。
もう１つの実施形態において、本発明は、ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるＦＲＥＴドナーで標識されたプローブ、ここに、プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの間で配列不均一性を示し；およびここに、プローブ、および複数のＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも２つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも２つのＨＣＶサブタイプを識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有し；およびｂ）チアジン色素を含む可溶性ＦＲＥＴクエンチャー、ここに、前記ＦＲＥＴクエンチャーはＦＲＥＴドナー部分を消光することができる；を含む組成物を提供する。
もう１つの実施形態において、本発明は、ａ）ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的である少なくとも１つの標的プローブ、ここに、標的プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々の間で配列不均一性を示し、および標的プローブＨＣＶ遺伝子型およびサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体は異なる識別ハイブリダイゼーション特性を有し；およびｂ）標的プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を測定するための指示書を含む、試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプを決定するための診断キットを提供する。
もう１つの実施形態において、本発明は、シグナルの検出をＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タイプと相関させるシステムを提供し、前記システムはａ）シグナルを検出するためのディテクター、ここに、前記シグナルはハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーションプローブと相関し、ここに、ハイブリダイゼーション複合体はＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的である、または部分的に相補的であるプローブ、およびＨＣＶヌクレオチド配列を含むアンプリコンを含み；およびｂ）ディテクターに作用可能式にカップリングされた相補性モジュール、ここに、前記相補性モジュールは、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーションの特性に関連する先に測定されたシグナルを比較することによって、シグナルを少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの１つと相関させること；を含む。
もう１つの実施形態において、本発明は、配列番号８〜２７のいずれかのオリゴヌクレオチドを提供する。
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、もちろん変化し得る特定の実施形態に限定されないことは理解されるべきである。また、本明細書中で用いる専門用語は特定の実施形態を記載する目的であり、限定的なことを意図しないことは理解されるべきである。本明細書中および添付の請求の範囲で用いるように、単数の用語および単数形態「ある」および「前記」は、例えば、文脈が明らかに他のことを指示している以外は、複数の言及を含む。従って、例えば、「核酸」への言及は複数の核酸分子も含み；用語「プローブ」の使用は、現実的には、多くのプローブ分子等を含む。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、もちろん変化し得る特定の実施形態に限定されないことは理解されるべきである。また、本明細書中で用いる専門用語は特定の実施形態を記載する目的であり、限定的なことを意図しないことは理解されるべきである。本明細書中および添付の請求の範囲で用いるように、単数の用語および単数形態「ある」および「前記」は、例えば、文脈が明らかに他のことを指示している以外は、複数の言及を含む。従って、例えば、「核酸」への言及は複数の核酸分子も含み；用語「プローブ」の使用は、現実的には、多くのプローブ分子等を含む。
特記しない限り、核酸は５’〜３’の向きに左側から右側に書き、アミノ酸配列はアミノ（Ｎ末端）〜カルボキシ（Ｃ末端）の向きに左側から右側に書く。本明細書内で引用された数値範囲は範囲を定義する数を含み、定義された範囲内で各整数およびいずれかの非整数分数を含む。
特記しない限り、本明細書中で用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等ないずれの方法および材料も本発明のテストを実行するのに用いることができるが、好ましい材料および方法は本明細書中に記載する。本発明を記載し、特許請求するにおいて、以下の用語を後に記載する定義に従って用いる。
本明細書中で用いるように、用語「塩基」とは、相補的塩基または塩基アナログとの対合においてワトソン・クリックタイプの水素結合を形成することができるいずれの窒素含有複素環部分もいう。多数の天然および合成（非天然（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ）、または非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ））塩基、塩基アナログおよび塩基誘導体が知られている。塩基の例はプリンおよびピリミジン、およびその修飾された形態を含む。天然に生じる塩基は限定されるものではないが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ）を含む。本明細書中で用いるように、本発明は天然に生じる塩基に限定する意図はない。というのは、本発明で用いられる多数の非天然（天然に生じない）塩基およびそれらの各非天然ヌクレオチドは当業者に知られているからである。そのような非天然塩基の例は以下に掲げる。
用語「ヌクレオシド」とは、糖、例えば、リボースまたはデオキシリボースのＣ−１’炭素に連結した塩基からなる化合物をいう。
用語「ヌクレオチド」とは、モノマー単位として、またはポリヌクレオチド内のヌクレオシドのリン酸エステルをいう。「ヌクレオチド５’−三リン酸」とは、糖５’−炭素位置に付着した三リン酸エステル基を持つヌクレオチドをいい、時々、「ＮＴＰ」または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と示される。修飾されたヌクレオチドは、典型的には、塩基部分の修飾によって化学的に修飾されたいずれかのヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＧＴＰまたはＣＴＰ）である。修飾されたヌクレオチドは、例えば、限定されるものではないが、メチルシトシン、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、５−ヨード−２’−デオキシウリジンおよび６−チオグアニンを含む。本明細書中で用いるように、用語「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に生じないいずれのヌクレオチドもいう。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴ」または同等な用語は、本明細書中で用いるように、ヌクレオチド塩基の配列に対応させることができるモノマーのポリマー配置、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸等をいう。ポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖とすることができ、例えば、遺伝子配列のセンスまたはアンチセンス鎖に対して相補的とすることができる。ポリヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドの相補的部分とハイブリダイズして、二本鎖を形成することができ、これはホモデュプレックスまたはヘテロデュプレックスであり得る。ポリヌクレオチドの長さはいずれの点においても限定されない。ヌクレオチドの間の結合はヌクレオチドの間のタイプのホスホジエステルの結合またはいずれかのタイプの結合であり得る。「ポリヌクレオチド配列」とは、ポリマーに沿ったヌクレオチドモノマーの配列をいう。「ポリヌクレオチド」はいずれかの特定の長さまたは範囲のヌクレオチド配列に制限されない。というのは、用語「ポリヌクレオチド」はいずれの長さのヌクレオチドのポリマー形態も含むからである。ポリヌクレオチドは生物学的手段（例えば、酵素的）によって生産することができ、あるいは無酵素システムを用いて合成することができる。ポリヌクレオチドは酵素により延長することができ、あるいは酵素により延長できない。
３’−５’ホスホジエステル結合によって形成されたポリヌクレオチドは５’末端および３’末端を有するといわれる。なぜならば、反応してポリヌクレオチドを作成するヌクレオチドモノマーは、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を介して１つの方向にてその隣接するものの３’酸素（ヒドロキシル）に結合するように結合するからである。従って、ポリヌクレオチド分子の５’末端はヌクレオチドのペントース環の５’位置において遊離リン酸基またはヒドロキシル基を有し、他方、ポリヌクレオチド分子の３’末端はペントース環の３’位置において遊離リン酸またはヒドロキシル基を有する。ポリヌクレオチド分子内では、もう１つの位置または配列に対して５’向きである位置または配列は「上流」に位置するといわれ、他方、もう１つの位置に対して３’側である位置は「下流」であるといわれる。この用語は、ポリメラーゼが鋳型鎖に沿って５’〜３’の様式にてポリヌクレオチド鎖を進行させ、延長するという事実を反映する。特に断りのない限り、ポリヌクレオチド配列が表される場合は常に、ヌクレオチドは左から右へ５’〜３’の向きであると理解される。
本明細書中で用いるように、用語「ポリヌクレオチド」は、天然に生じるポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド構造、天然に生じる骨格または天然に生じるヌクレオチド間結合に限定されることを意図しない。当業者であれば、本発明で用いられる、広く種々のポリヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオチド、非天然ホスホジエステル結合およびヌクレオチド間アナログは周知である。そのような非天然構造の非限定的例は非リボース糖骨格、３’−５’および２’−５’ホスホジエステル結合、ヌクレオチド間逆転結合（例えば、３’−３’および５’−５’）および分岐構造を含む。さらに、非天然結合は非天然ヌクレオチド間アナログ、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、メチルホスホネートのようなＣ1−Ｃ4アルキルホスホネート結合、ホスホルアミデート、Ｃ1−Ｃ6アルキル−ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに、ポリヌクレオチドは全部が単一タイプのモノマーサブユニットおよび１つのタイプの結合からなることができるか、あるいは異なるタイプのサブユニットおよび異なるタイプの結合の混合物または組合せからなることができる（ポリヌクレオチドはキメラ分子であり得る）。本明細書中で用いるように、ポリヌクレオチドアナログはそれらが天然に生じるポリヌクレオチドと同様に一本鎖核酸標的にハイブリダイズする点で天然ポリヌクレオチドの必須の性質を保持する。
本明細書中で用いるように、用語「ポリヌクレオチドの配列」、［核酸配列］、「ポリヌクレオチド配列」、および同等または同様なフレーズとは、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序をいう。幾つかの場合において、「配列」とは、より具体的には、各々ヌクレオチドに結合した塩基の順序および同一性をいう。配列は、典型的には、５’〜３’方向で読まれ（書かれ）る。特に断りのない限り、本発明の特定のポリヌクレオチド配列は、任意で、明示的に示された配列に加えて相補的な配列を含む。
本明細書中で用いるように、用語「増幅」、「増幅する」等は、一般には、分子または関連分子の組のコピー数の増加をもたらすいずれのプロセスもいう。それはポリヌクレオチド分子に適用できるので、増幅は、典型的にはポリヌクレオチド（例えば、ウイルスゲノム）の少量から出発する、ポリヌクレオチド分子、またはポリヌクレオチド分子の部分の複数のコピーの生産を意味し、ここに、増幅された材料（例えば、ウイルスＰＣＲアンプリコン）が典型的には検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅は、種々の化学的および酵素的プロセスを含む。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）反応、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）反応、またはリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）の間における１または少数コピーの鋳型ＤＮＡ分子からの複数のＤＮＡコピーの複製は増幅の形態である。増幅は出発分子の厳密な複製に限られない。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いる試料中の限定された量のウイルスＤＮＡからの複数のＤＮＡ分子の創製は増幅の形態である。さらに、転写のプロセスの間における単一ＤＮＡ分子からの複数のＲＮＡ分子の創製もまた増幅の形態である。
幾つかの実施形態において、増幅は、任意でさらなる工程、例えば、限定されるものではないが、標識、配列決定、精製、単離、ハイブリダイゼーション、サイズ分解、発現、検出および／またはクローニングによって行う。
本明細書中で用いるように、用語「ポリメラーゼ鎖反応」（ＰＣＲ）とは、試料中の標的ポリヌクレオチドのセグメントの濃度を増加させるための当分野で周知の増幅のための方法をいい、試料は単一ポリヌクレオチド種、または複数ポリヌクレオチドであり得る。一般には、ＰＣＲプロセスはモル過剰の２以上の延長可能なオリゴヌクレオチドプライマーを所望の標的配列を含む反応混合物に導入することからなり、ここに、プライマーは二本鎖標的配列の対向鎖に対して相補的である。反応混合物をＤＮＡポリメラーゼの存在下で熱的サイクリングのプログラムに付し、その結果、ＤＮＡプライマーが近接する所望の標的配列の増幅がもたらされる。逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ＲＮＡ鋳型および逆転写酵素、または逆転写酵素活性を有する酵素を用いて、まず、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼプライマー伸張の複数サイクルに先立って、一本鎖ＤＮＡ分子を生じさせる。多重ＰＣＲとは、典型的には、２を超えるプライマーを単一反応に含めることによって、単一反応において１を超える増幅された産物を生じるＰＣＲ反応をいう。広く種々のＰＣＲ適用のための方法は当分野で広く知られており、多くの源、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １５，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）に記載されている。
本明細書中で用いるように、表現「非対称ＰＣＲ」とは、それらが不均等となるようにプライマー対におけるプライマーのモル濃度を調整することによるＤＮＡ標的の一本鎖の優先的ＰＣＲ増幅をいう。非対称ＰＣＲ反応は、不均一プライマー濃度の結果として、圧倒的に一本鎖産物および少量の二本鎖産物を生じる。非対称ＰＣＲが進むにつれ、より低い濃度のプライマーが二本鎖ＤＮＡアンプリコンに定量的に取り込まれるが、より高い濃度のプライマーはＤＮＡ合成の起点となり、その結果、一本鎖産物の継続した蓄積が起こる。
本明細書中で用いるように、用語「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、相補的かつ逆平行ＤＮＡ鎖の合成用の鋳型としてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を用いるＤＮＡポリメラーゼ酵素をいう。熱安定性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲ増幅反応に用途を見出す。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素および、事実、いずれかのポリメラーゼ酵素についての適当な反応条件（または反応緩衝液）は当分野において広く知られており、多数の源に記載されている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１−４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ［１９９４；２００４年９月まで補充］参照）。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素のための反応緩衝液は、例えば、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸、塩および緩衝剤を含むことができる。
本明細書中で用いるように、用語「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」とは、ＲＮＡ鎖の合成用の鋳型としてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を用いるＲＮＡポリメラーゼ酵素をいう。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって媒介されるプロセスを「転写」と通常はいう。
本明細書中で用いるように、用語「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、相補的かつ逆平行ＤＮＡ鎖の合成用の鋳型としてリボ核酸（ＲＮＡ）を用いるＤＮＡポリメラーゼ酵素をいう。ＲＮＡ分子のＤＮＡコピーを生じさせるプロセスは、通常「逆転写」または「ＲＴ」および「逆転写酵素」であることを達成する酵素と呼ぶ。幾つかの天然に生じるおよび突然変異したＤＮＡポリメラーゼもまた逆転写活性を保有する。
本明細書中で用いるように、酵素に適用される用語「熱安定性」とは、上昇した温度において（例えば、５５度以上において）その生物学的活性を保有し、または加熱および冷却の反復サイクルに続いてその生物学的活性を保有する酵素をいう。熱安定性ポリヌクレオチドポリメラーゼはＰＣＲ増幅反応において特別な用途を見出す。
本明細書中で用いるように、用語「プライマー」とは、標的配列の相補的プライマー特異的部分と逆平行にハイブリダイズするよう設計された規定された配列を一般に持つ、酵素的に延長可能なオリゴヌクレオチドをいう。さらに、プライマーは鋳型依存的にヌクレオチドの重合を開始して、標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチドを生じる。標的にアニーリングされたプライマーの延長は適当な反応条件において適当なＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを用いる。当業者であれば、重合反応条件および試薬は当分野でよく確立されており、種々の源に記載されていることが周知である。
プライマー核酸は、プライマー伸張が起こるためにはその鋳型配列に対して１００％相補性を有する必要は無く；１００％未満の相補性を持つプライマーはハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ伸張が起こるのに十分であり得る。任意で、プライマー核酸を所望であれば標識することができる。プライマーで用いる標識はいずれの適当な標識とすることもでき、例えば、分光的、光化学、生化学、免疫化学、化学または他の検出手段によって検出することができる。
本明細書中で用いるように、表現「増幅プライマー」とは、一般に、その標的ポリヌクレオチド配列に対してモル過剰であり、鋳型依存的酵素ＤＮＡ合成および標的配列（およびハイブリダイゼーションの部位から下流の配列）の増幅の起点となり、一本鎖アンプリコンを生じるプライマーをいう。
本明細書中で用いるように、表現「増幅プライマー対」とは、それらの標的ポリヌクレオチド配列に対して一般にモル過剰であって、一緒に、鋳型依存性酵素ＤＮＡ合成および標的配列の増幅の起点となって、二本鎖アンプリコンを生じる２つのプライマーの組をいう。
本明細書中で用いるように、用語「アンプリコン」とは、特定の標的核酸の増幅に続いて生じたポリヌクレオチド分子（または集合的に複数の分子）をいう。アンプリコンを生じさせるために用いる増幅方法は、最も典型的には、例えば、ＰＣＲ方法を用いることによりいずれの適当な方法でもあり得る。アンプリコンは、典型的には、限定されるものではないがＤＮＡアンプリコンである。アンプリコンは、一本鎖または二本鎖、あるいはいずれかの濃度比率のその混合物であり得る。
本明細書中で用いるように、表現「アンプリコン増幅のリアルタイム検出」とは、特異的アンプリコンまたはアンプリコンの検出、典型的には、その定量をいう。というのは、アンプリコンは増幅の完了に続いて検出または定量工程の必要性なしで生じる（典型的にはＰＣＲによる）。用語「リアルタイムＰＣＲ」または「キネティックＰＣＲ」とは、ＰＣＲにおいて生じたアンプリコンのリアルタイム検出および／または定量をいう。
アンプリコン蓄積のリアルタイムの検出のための通常の方法は、蛍光性５’−ヌクレアーゼアッセイともいわれる５’−ヌクレアーゼアッセイ、例えば、ＴａｑＭａｎ分析による；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０（１９９１）；およびＨｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４（１９９６）参照。前記ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ手法においては、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応に特異的なアンプリコンを生じさせる。２つのＰＣＲプライマーの間に位置するアンプリコンにおけるヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる、第三のオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）を設計する。前記プローブはＰＣＲ反応で用いるＤＮＡポリメラーゼによって延長できず、典型的には（必要ではないが）、相互に近接した蛍光レポーター色素およびクエンチャー部分で共標識される構造を有することができる。レポーター色素からの発光は、フルオールおよびクエンチャーが近接する場合、それらがプローブ上に存在するので、消光部分によって消光される。いくつかの場合において、プローブは蛍光レポーター色素またはもう１つの検出可能部分のみで標識することができる。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応は５’−３’ヌクレアーゼ活性を保有する熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いる。ＰＣＲ増幅反応の間に、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、鋳型依存的にアンプリコンにハイブリダイズされる標識されたプローブを切断する。得られたプローブ断片はプライマー／鋳型複合体から解離され、次いで、レポーター色素はクエンチャー部分の消光効果から解放される。レポーター色素のほぼ１つの分子が各新しい合成されたアンプリコン分子につき解放され、未消光レポーター色素の検出は、放出された蛍光レポーター色素の量がアンプリコン鋳型の量に直接的に比例するように、データの定量的解釈のための基礎を提供する。
ＴａｑＭａｎアッセイデータの１つの尺度は、典型的には、閾値サイクル（ＣT）として発現される。蛍光レベルは各ＰＣＲサイクルの間に記録され、増幅反応におけるその点まで増幅された産物の量に比例する。ＰＣＲサイクルは、蛍光シグナルがまず統計学的に有意であると記録されると、あるいは蛍光シグナルがいくつかの他の任意レベル（例えば、任意蛍光レベル、またはＡＦＬ）を超える場合には、閾値サイクル（ＣT）である。
５’−ヌクレアーゼアッセイのためのプロトコルおよび試薬は当業者に周知であり、種々の源に記載されている。例えば、５’−ヌクレアーゼ反応およびプローブはＧｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ．に対して２００１年４月１０日に発行された「ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ ＡＳＳＡＹ ＳＹＳＴＥＭ」と題された米国特許第６，２１４，９７９号、Ｇｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ．に対して１９９８年９月８日に発行された「ＲＥＡＣＴＩＯＮ ＭＩＸＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＴＡＲＧＥＴ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ」と題された米国特許第５，８０４，３７５号；Ｇｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ．に対して１９９６年１月３０日に発行された「ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＢＹ ＴＨＥ ５’−３’ ＥＸＯＮＵＸＬＥＡＳＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＯＦ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＳ ＡＣＴＩＮＧ ＯＮ ＡＤＪＡＣＥＮＴＬＹ ＨＹＢＲＩＤＩＺＥＤ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」；Ｇｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ．に対して１９９３年５月１１日に発行された「ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ ＡＳＳＡＹ ＳＹＳＴＥＭ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＯＦ Ａ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ」と題された米国特許第５，２１０，０１５号に記載されている。
リアルタイムアンプリコン検出のための方法における変動もまた知られており、特に、５’−ヌクレアーゼプローブが、増幅反応に存在する二本鎖アンプリコンの量に依存する蛍光を結果としてもたらす二本鎖ＤＮＡインターカレーティング色素によって置き換えられる場合である。例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉに対して２００１年１月９日に発行された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＤＥＶＩＣＥＳ ＦＯＲ ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＤＥＴＥＣＴＯＲ」と題された米国特許第６，１７１，７８５号；およびＨｉｇｕｃｈｉに対して１９９９年１１月３０日に発行された「ＨＯＭＯＧＥＮＥＯＵＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ」と題された米国特許第５，９９４，０５６号参照。
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のような商業的に入手可能なキットおよび機器を用いて行うことができる。好ましい実施形態において、５’ヌクレアーゼアッセイ手法はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システムのようなリアルタイム定量的ＰＣＲデバイスで行われる。前記システムはサーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータからなる。前記システムはサーモサイクラーにて９６ウェルマイクロタイタープレート様式で試料を増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光シグナルが全ての９６ウェルについての光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムに収集され、ＣＣＤカメラで検出される。前記システムは機器を実行するためおよびデータを解析するためのソフトウエアを含む。
本明細書中で用いるように、用語「ハイブリダイゼーション」および「アニーリング」等は互換的に用いられ、典型的には、ハイブリダイゼーション複合体といわれるデュプレックスまたは他のより高次の構造形成をもたらす１つのポリヌクレオチドともう１つのポリヌクレオチド（典型的には、逆平行ポリヌクレオチド）との塩基対合相互作用をいう。逆平行ポリヌクレオチド分子の間の一次相互作用は、ワトソン／クリックおよび／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ−ｔｙｐｅの水素結合による典型的には、塩基特異的な、例えば、Ａ／ＴおよびＧ／Ｃである。２つのポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションを達成するためにそれらの全長にわたって１００％相補性を有するのは要件とされない。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーション複合体は、分子間相互作用から形成できるか、あるいは別法として、分子内相互作用から形成することができる。
本明細書中で用いるように、フレーズ「特異的にハイブリダイズする」、「特異的ハイブリダイゼーション」等とは、アニーリング対が相補性を示し、好ましくは、ハイブリダイゼーション反応における他の潜在的結合パートナーを排除して優先的に結合する複合体をもたらすハイブリダイゼーションをいう。用語「特異的にハイブリダイズする」は、得られたハイブリダイゼーション複合体が１００％相補性を有することを必要とせず；ミスマッチを有するハイブリダイゼーション複合体もまた特異的にハイブリダイズでき、ハイブリダイゼーション複合体を形成できることに注意すべきである。ハイブリダイゼーションの特異性の程度は、識別ハイブリダイゼーション特異性、例えば、ハイブリダイゼーション複合体の融解温度（Ｔm）を用いて測定することができる。
本明細書中で用いるように、フレーズ「塩基対合が起こる条件」とは、相補的ポリヌクレオチドまたは部分的に相補的なポリヌクレオチドが安定なハイブリダイゼーション複合体を形成できるようにするいずれのハイブリダイゼーション条件もいう。
本明細書中で用いるように、用語「ストリンジェント」、「ストリンジェントな条件」、「高ストリンジェンシー」等は、当分野で周知のように、一般的には低イオン強度および高温のハイブリダイゼーション条件を示す。例えば、本明細書に参照により組み込む、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７）参照。一般には、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列を含むハイブリダイゼーション複合体のための熱融解点（Ｔm）よりも約５〜３０℃低くなるように選択される。別法として、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列につきＴmよりも約５〜１５℃低くなるように選択される。Ｔmは相補的（または部分的に相補的）ポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション複合体の５０％が解離するようになる（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。
本明細書中で用いるように、表現「低ストリンジェンシー」は、一般には高いイオン強度およびより低い温度のハイブリダイゼーション条件を示す。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の下では、不完全な相補性を持つポリヌクレオチドはより容易にハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。
本明細書中で用いるように、用語「相補的」または「相補性」は、ワトソン・クリックおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ−タイプの塩基対合則に関連するポリヌクレオチドの逆平行鎖に対する言及で用いられる。例えば、配列５’−ＡＧＴＴＣ−３’は配列５’ＧＡＡＣＴ−３’に対して相補的である。用語「完全に相補的」または「１００％相補的」等とは、逆平行鎖の間の塩基の完全なワトソン・クリック対合を有する相補的配列をいう（ポリヌクレオチドデュプレックスにミスマッチ無し）。しかしながら、相補性は完全である必要はなく；安定なデュプレックスは、例えば、ミスマッチした塩基対合またはマッチしない塩基を含むことができる。用語「部分的相補性」、「部分的に相補的な」、「不完全な相補性」、または「不完全に相補的な」等とは、１００％未満の完全性である逆平行ポリヌクレオチド鎖の間の塩基のいずれかの整列をいう（例えば、ポリヌクレオチドデュプレックス中に少なくとも１つのミスマッチまたはマッチしていない塩基が存在している）。例えば、逆平行ポリヌクレオチド鎖の間の塩基の整列は、少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％、またはその間のいずれかの値であり得る。
さらに、標的ポリヌクレオチドの「相補体」とは、標的ポリヌクレオチドの少なくとも部分と逆平行会合にて合わすことができる（例えば、ハイブリダイズすることができる）ポリヌクレオチドをいう。逆平行会合は、例えば、核酸分子内のヘアピンループの形態である分子内であり得るか、あるいは２以上の一本鎖核酸分子は相互にハイブリダイズする場合のような分子内であり得る。
本明細書中で用いるように、「標的」、「標的ポリヌクレオチド」、「標的配列」等とは、相補的ポリヌクレオチド、例えば、標識されたプローブまたはＤＮＡポリメラーゼプライマーとのハイブリダイゼーションの対象である特異的ポリヌクレオチド配列をいう。ポリヌクレオチドとその標的とのアニーリングの結果として形成されたハイブリダイゼーション複合体を「標的ハイブリダイゼーション複合体」ともいう。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中で形成することができ、（従って可溶性である）、またはハイブリダイゼーション複合体の１つ以上の成分を固相に付着させることができる（例えば、ドットブロットに、ビーズシステムに付着させ、標的ハイブリダイゼーション複合体の除去または単離を容易にし、あるいはマイクロアレイにおけるものである）。標的配列の構造は限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、そのアナログ、またはその組合せからなることができ、一本鎖または二本鎖であり得る。標的ポリヌクレオチドは、例えば、限定されるものではないが、原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルスを含むいずれかの生きた、または一旦生きていた生物、ならびに合成および／または組換え標的配列を含むいずれかの源に由来することができる。例えば、本明細書中に記載したように、ウイルスゲノム配列に由来するＰＣＲアンプリコンは標的として働くことができる。
いくつかの態様において、ハイブリダイゼーション複合対中の標的ポリヌクレオチドは「鋳型」として働き、ここに、延長可能なポリヌクレオチドプライマーは鋳型に結合し、相補的ポリヌクレオチドの合成用のパターンとして鋳型の塩基配列を用いてヌクレオチド重合を開始させる。
本明細書中で用いるように、用語「プローブ」とは、典型的には、注目する標的核酸にハイブリダイズできるポリヌクレオチドをいう。典型的には、限定されるものではないが、プローブは、前記プローブ（および、従って、その標的）が検出され、可視化され、測定され、および／または定量され得るように、適当な標識またはレポーター部分と会合させる。標識されたプローブのための検出系は、限定されるものではないが、蛍光、（例えば、ＦＲＥＴ対検出系を用いる場合の）蛍光消光、酵素活性、吸光度、分子量、放射能、ルミネセンスまたはレポーターの特異的結合を可能とする結合条件（例えば、レポーターが抗体である場合）を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、注目する核酸ヌクレオチド配列に対する結合特異性を有する、ポリヌクレオチドよりはむしろ抗体であり得る。本発明はいずれかの特定のプローブ標識またはプローブ検出系に限定されることを意図しない。プローブで用いられるポリヌクレオチドの源は限定されず、非酵素系において合成により生じさせることができるか、あるいは生物学的（例えば、酵素的）系（例えば、細菌細胞中）を用いて生産されるポリヌクレオチド（またはポリヌクレオチドの部分）であり得る。
典型的には、プローブは核酸に含まれる特異的標的配列に十分に相補的であって、限定されるものではないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のような選択されたハイブリダイゼーション条件下で標的配列とで安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でプローブを用いて行われるハイブリダイゼーションアッセイは、特異的標的配列の選択的検出を可能とする。
本明細書中で用いるように、用語「標識」または「レポーター」は、その最も広い意味においては、それと会合するものを検出可能であるか、またはその検出を可能とするいずれの部分または特性もいう。例えば、標識を含むポリヌクレオチドは検出可能である（いくつかの態様においては、プローブといわれる）。理想的には、標識されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション複合体の検出を可能とする。いくつかの態様において、例えば、標識はポリヌクレオチドに（共有結合により、または非共有結合により）付着される。種々の態様において、標識は、別法として、あるいは組み合わせて、（ｉ）検出可能なシグナルを提供することができ；（ｉｉ）第二の標識と相互作用して、第二の標識、例えば、ＦＲＥＴによって提供される検出可能なシグナルを修飾することができ；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、例えば、デュプレックス形成を安定化させることができ；（ｉｖ）捕獲機能、例えば、疎水性アフィニティー、抗体／抗原、イオン複合体化を付与することができ、または（ｖ）電気泳動移動度、疎水性、親水性、溶解度、またはクロマトグラフィー挙動のような物理的特性を変化させることができる。標識はそれらの構造およびそれらの作用メカニズムが広く変化する。
標識の例は、限定されるものではないが、（例えば、クエンチャーまたは吸収体を含めた）蛍光標識、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、質量修飾基、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ等を含む）酵素等を含む。さらに説明するために、蛍光標識は、フルオレセインファミリーの色素のような負に荷電した色素、またはローダミンファミリーの色素のような電荷が中性である色素、またはシアニンファミリーの色素のような正に荷電した色素を含むことができる。フルオレセインファミリーの色素は、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮおよびＺＯＥを含む。ローダミンファミリーの色素は、例えば、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡを含む。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、およびＴＡＭＲＡは、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から商業的に入手可能であり、テキサスレッドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から商業的に入手可能である。シアニンファミリーの色素は、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７を含み、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）から商業的に入手可能である。
本明細書中で用いるように、用語「ＦＲＥＴ」（蛍光共鳴エネルギー移動）および同等な用語は、一般には、ドナー分子からフォトンの発光なしでエネルギーがドナー分子からアクセプター分子へ移動する２つの色素分子の電子状態の間の動的距離依存性相互作用をいう。ＦＲＥＴの効率は色素の間の分子間分離の逆に依存し、これは、それを、生物学的高分子の寸法に匹敵する距離にわたって有用とする。一般的には、ＦＲＥＴは、慣用的な光学顕微鏡観察の限界を超える空間的分解能でもって、イメージング、動的分析および／または共局所化分子の定量または単一分子における立体配座変化を可能とする。一般には、ＦＲＥＴは（ａ）ドナーおよびアクセプター分子が近接しなければならない（典型的には、例えば、１０〜１００Å）、（ｂ）アクセプターの吸収スペクトルがドナーの蛍光発光スペクトルと重ならなければならない、および（ｃ）ドナーおよびアクセプターの遷移二極の向きがほぼ平行でなければならないことを必要とする。
ほとんどのＦＲＥＴ適用においては、ドナーおよびアクセプター色素は異なり、その場合、ＦＲＥＴはアクセプターの感作された蛍光の出現によって、またはドナー蛍光の消光によって検出することができる。いくつかの場合において、ドナーおよびアクセプターが同一であり、ＦＲＥＴが得られた蛍光脱分極によって検出することができる。ＦＲＥＴ系における単一のドナー／アクセプター分子の使用は、例えば、「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＴＨＥ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＥＮＺＹＭＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＡＭＰＬＥＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題された２００４年５月２０日に公開された、Ｐａｃｋａｒｄ ａｎｄ Ｋｏｍｏｒｉｙａによる公開された米国特許出願第２００４／００９６９２６号に記載されている。
ＦＲＥＴは、分子近接性の変化によって特徴付けられる種々の生物学的現象を調査するための重要な技術となった。ＦＲＥＴ技術が多くの生物学的実験室において今日普及しており、限定されるものではないが、核酸ハイブリダイゼーションの検出、リアルタイムＰＣＲアッセイおよびＳＮＰ検出、タンパク質の構造および立体配座、タンパク質複合体の空間的分布および組立、受容体／リガンド相互作用、イムノアッセイ、単一分子のプロービング相互作用、核酸の構造および立体配座、突然変異を検出するためのプライマー延長アッセイ、自動ＤＮＡ配列決定、脂質の分布および輸送、膜融合アッセイ（膜融合の脂質混合アッセイ）、膜ポテンシャル検知、発蛍光性プロテアーゼ基質、および環状ＡＭＰおよび亜鉛についてのインジケーターを含む種々の生物学的系で用いるのに適合されてきた。
本明細書中で用いるように、用語「ＦＲＥＴドナー」とは、典型的には、十分に近接した適当なＦＲＥＴアクセプターに移動させることができる、放射線、例えば、蛍光またはルミネセント放射の検出可能な発光を生じる部分をいう。発現「ＦＲＥＴドナー」は「ＦＲＥＴ標識」または「ＦＲＥＴ標識部分」と互換的に用いることができる。
本明細書中で用いるように、用語「クエンチャー」、「クエンチャー部分」、「アクセプター」、「アクセプター部分」および「発光モディファイアー」および同様なおよび同等な用語が、一般には、放射線、例えば、限定されるものではないが、蛍光またはルミネセント放射の、この放射線を発光するであろう源からの検出可能な発光を減少させ、および／またはそれを低下させることができる部分をいう。一般には、クエンチャーとは、発光を低下させることができるいずれの部分も言う。消光の程度は、消光効果が、いずれの検出機器を用いての最小限検出可能であることを除いて、それ自体は制限されない。いくつかの態様において、クエンチャーは源から発せられた検出可能な放射線を少なくとも５０％、別法として少なくとも８０％、別法としてかつ最も好ましくは少なくとも９０％だけ低下させる。
いくつかの実施形態において、クエンチャーはドナーからの蛍光発光の低下をもたらし、従って、ドナー／クエンチャーはＦＲＥＴ対を形成し、クエンチャーは「ＦＲＥＴクエンチャー」または「ＦＲＥＴアクセプター」といわれ、ドナーは「ＦＲＥＴドナー」である。
用語「クエンチャー」はＦＲＥＴクエンチャーに限定されることを意図しない。例えば、消光は、限定されるものではないが、光電子移動、光結合電子移動、近くに位置したフルオロフォアの間のダイマー形成、一過性励起状態相互作用、衝突消光、または非蛍光基底状態種の形成を含むいずれのタイプのエネルギー移動も含むことができる。いくつかの実施形態において、クエンチャーとは光発光を低下させることができる分子をいう。フルオロフォアおよびクエンチャーの間のスペクトル重複について要件はない。本明細書中で用いるように、「消光」は動的（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ−Ｄｅｘｔｅｒエネルギー移動等）、および静的（基底状態複合体）を含むいずれのタイプの消光も含む。別法として、依然として、クエンチャーは蛍光色素からの吸収されたエネルギーを光以外の形態、例えば、熱として消散させることができる。
いくつかの実施形態において、いくつかのクエンチャーはＦＲＥＴドナー発光から区別できる波長において、または前記区別できるシグナルタイプを用い、およびそのクエンチャーに特徴的であり、従って、この点において、クエンチャーは「標識」でもあり得る波長において、またはそのようなシグナルタイプにおいてＦＲＥＴドナーから吸収されたエネルギーを再度発することができる。
蛍光プローブ系の使用についての一般的議論については、例えば、Ｊｏｓｅｐｈ Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，第２版 Ｊｕｌｙ１（１９９９）によるＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓによって公表されたＲｉｃｈａｒｄ Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版（１９９６）参照。
本明細書中で用いるように、表現「可溶性アクセプター」、「可溶性クエンチャー」、「可溶性発光モディファイアー」等とは、いずれかの他の分子に結合しておらず、大いに可溶性であるか、あるいはそうでなければいずれかの他の分子または固相に結合しないアクセプター部分をいう。例えば、いくつかのチアジン色素、例えば、ニューメチレンブルーを可溶性クエンチャーとして用いることができる。幾つかの実施形態において、可溶性クエンチャーは可溶性ＦＲＥＴクエンチャーであり、ここに、可溶性ＦＲＥＴクエンチャーは、ＦＲＥＴドナーも含む機能的ＦＲＥＴ対の一部である。
本明細書中で用いるように、用語「チアジン（ｔｈｉａｚｉｎｅ）色素」および「チアジン（ｔｈｉａｚｉｎ）色素」（これらの用語が同義であって、当分野においては互換的に用いられる）とは、１つの硫黄原子、１つの窒素原子、および４つの炭素原子からなる環を含む有機化学化合物のクラスのいずれかをいう。可溶性クエンチャーとして用いることができるチアジン色素の例は、例えば、メチレンブルー（Ｃ16Ｈ18ＣｌＮ3Ｓ）、メチレングリーン（Ｃ16Ｈ17ＣｌＮ4Ｏ2Ｓ）、チオニン（Ｃ12Ｈ10ＣｌＮ3Ｓ）、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ（Ｃ15Ｈ16Ｎ3ＳＣｌ）、ニューメチレンブルー（Ｃ18Ｈ22ＣｌＮ3Ｓ）、メチレンバイオレットベルンスゼン、アズールＡ（Ｃ14Ｈ14ＣｌＮ3Ｓ）、アズールＢ（Ｃ15Ｈ16ＣｌＮ3Ｓ）、アズールＣ、１，９−ジメチルメチレンブルー、トルイジンブルーＯ、およびメチレンバイオレットベルンズセンを含む。これらの化合物のいくつかの化合物を図８に示す。
本明細書中で用いるように、表現「ＦＲＥＴ対」および同様なおよび同等な用語とは、ドナーおよびアクセプターが相互に対して適当に近接している場合にＦＲＥＴが観察されるように、ＦＲＥＴドナー部分およびＦＲＥＴアクセプター部分の対合をいう。一般に、限定されるものではないが、ドナー部分およびアクセプター部分は注目する種々の分子（例えば、ポリヌクレオチドプローブ）に結合される。
他の試薬および検出／イメージング機器と共に、広く種々の色素、フルオロ、クエンチャーおよび蛍光タンパク質がＦＲＥＴ分析で用いるために開発されており、広く商業的に入手可能である。当業者であれば、いずれの特定の分析で用いるためにも適切なＦＲＥＴプロトコル、試薬および機器を認識する。
ＦＲＥＴで通常用いられる分子は、例えば、限定されるものではないが、フルオロセイン、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ローダミン、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、およびＥＤＡＮＳを含む。蛍光色素が標識またはクエンチャーであるかは、その励起および発光スペクトルによって、およびそれが対となる蛍光色素によって規定される。例えば、ＦＡＭは４８８ｎｍの波長で光によって最も効果的に励起され、５００〜６５０ｎｍのスペクトル、および５２５ｎｍの発光最大を持つ光を発する。ＦＡＭは、その励起最大５１４ｎｍにおいて有する、例えば、クエンチャーとしてのＴＡＭＲＡとで用いる適当なドナー標識である。蛍光色素から吸収されたエネルギーを消散する非蛍光または暗いクエンチャーの例はＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって市販されるＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）を含む。前記Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）は置換されたまたは置換されていないアリールまたはヘテロアリール化合物、またはその組合せから選択される少なくとも３つの基を含む構造であり、ここに、残基の少なくとも２つは外環ジアゾ結合を介して連結されている（例えば、本明細書に参照により組み込む、Ｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．によって２００１年１１月１５日に公開された、「ＤＡＲＫ ＱＵＥＮＣＨＥＲＳ ＦＯＲ ＤＯＮＯＲ−ＡＣＣＥＰＴＯＲ ＥＮＥＲＧＹ ＴＲＡＮＳＦＥＲ」と題された国際公開Ｎｏ．ＷＯ ０１−８６００１参照）。クエンチャーの例は、例えば、Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．に対して２００２年１０月１５日に発行された「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＰＲＯＢＥＳ ＢＥＡＲＩＮＧ ＱＵＥＮＣＨＡＢＬＥ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ ＬＡＢＥＬＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＥ ＴＨＥＲＥＯＦ」と題された米国特許第６，４６５，１７５号にも提供されている。
本明細書中で用いるように、「部分」または「基」とは、大きな分子または複合体の部分または構成要素部分をいう。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは標識部分を含むことができる。
本明細書中で用いるように、「識別ハイブリダイゼーション特性」とは、もう１つの複合体またはいずれかの数の他の複合体から１つの複合体を識別するのに用いることができるハイブリダイゼーション複合体のいずれかの特性をいう。１つの一本鎖核酸分子は種々の標的分子との多数のハイブリダイゼーション複合体に参画することができ、ここに、ヌクレオチド塩基ミスマッチ（もしあれば）の数、位置およびタイプは変化する。識別ハイブリダイゼーション特性の例は、例えば、限定されるものではないが、融解分析（例えば、Ｔm分析）、ＨＭＡ（ヘテロデュプレックス移動度分析；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）３８：４７７−４８２）、ＤＨＰＬＣ（変性ＨＰＬＣ）、ＣＦＬＰ（切断断片長多形；Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９７）３５：３１５６−３１６２）、ＴＧＣＥ（熱的グラジエント毛細管電気泳動）；ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ突然変異検出キット、ＳＳＣＰ（一本鎖立体配座多形）を含む。
本明細書中で用いるように、「温度依存性ハイブリダイゼーション特性」とは、ハイブリダイゼーション複合体のいずれの定量的温度依存性特徴も言う。例えば、融解温度（Ｔm）は温度依存性識別ハイブリダイゼーション特性である。しかしながら、温度依存性ハイブリダイゼーション特性はＴmに限定されない。例えば、ホモデュプレックスまたはヘテロデュプレックスにおける二本鎖ポリヌクレオチドまたは核酸塩基オリゴマー（例えば、ハイブリダイゼーション複合体）の集団の２５％が一本鎖に解離される温度（Ｔ25）もまたハイブリダイゼーション複合体の規定する特徴である。同様に、ホモデュプレックスまたはヘテロデュプレックスにおける二本鎖ポリヌクレオチドまたは核酸塩基オリゴマー（例えば、ハイブリダイゼーション複合体）の集団の７５％が一本鎖に解離される温度（Ｔ75）もまたハイブリダイゼーション複合体の規定する特性である。別法として、いずれかの規定された温度におけるハイブリダイゼーション複合体の解離のパーセンテージは定量的温度依存性ハイブリダイゼーション特性である。別法として、依然として、（融解曲線と反対に）「アニーリング曲線」を用いて、ハイブリダイゼーション複合体を特徴付けすることができる。アニーリング曲線分析においては、標的およびプローブポリヌクレオチド鎖の挙動は（融解曲線分析で用いられる上昇温度とは反対に）温度を低下させつつ観察される。ハイブリダイゼーション複合体の解離またはアニーリングの程度を測定する方法は当業者に周知である。
本明細書中で用いるように、用語「Ｔm」は「融解温度」に言及するのに用いられる。融解温度は、ホモデュプレックスまたはヘテロデュプレックスにおける二本鎖ポリヌクレオチドまたは核酸塩基オリゴマー（例えば、ハイブリダイゼーション複合体）の集団の１／２が一本鎖に解離するようになる温度である。デュプレックスポリヌクレオチドのＴmの予測は、塩基配列ならびにオリゴマー結合の構造および配列特徴および性質を含めた他の因子を考慮する。Ｔmを予測し、実験的に決定するための方法は当分野で知られている。例えば、Ｔmは融解曲線によって伝統的には決定され、そこでは、デュプレックス核酸分子を制御された温度プログラムで加熱し、デュプレックス中の２つの一本鎖の会合／解離の状態をモニターし、２つの鎖が完全に解離する温度に到達するまでプロットする。Ｔmはこの融解曲線から読む。別法として、Ｔmはアニーリング曲線によって決定することができ、そこでは、デュプレックス核酸分子を、２つの鎖が完全に解離する温度まで完全に加熱する。次いで、温度を制御された温度プログラムで降下させ、デュプレックスにおける２つの一本鎖の会合−解離の状態をモニターし、２つの鎖が完全にアニールする温度に到達するまでプロットする。Ｔmはこのアニーリング曲線から読む。
本明細書中で用いるように、用語「試料」は最も広い意味で用いられ、分析に供するいずれの材料も言う。用語「試料」は典型的には生物学的起源のいずれのタイプの材料も言い、例えば、動物または植物から得られたいずれのタイプの材料も言う。試料は、例えば、血液または血清のようないずれの流体または組織とすることもでき、さらに、ヒト血液またはヒト血清であり得る。試料は培養された細胞または組織、微生物（原核生物または真核生物）の培養、または（生きたまたは一旦生きていた）生物学的材料から生産された、またはそれから由来するいずれかの画分または産物であり得る。任意で、試料は精製し、部分的に精製し、未精製、豊富化または増幅したものとすることができる。試料が精製されたまたは豊富化された場合、試料は主として１つの成分、例えば、核酸を含むことができる。より具体的には、例えば、精製または増幅された試料は全細胞ＲＮＡ、全細胞ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、またはそこから由来する増幅された産物を含むことができる。
本発明の方法で用いる試料はいずれの源からのものとすることもでき、限定されるものではない。そのような試料は、限定されるものではないが、例えば、皮膚、血漿、血清、全血、血液産物、脊髄液、唾液、腹腔液、リンパ液、水性または硝子体液、滑液、尿、涙、血球、血液産物、精子、精液、膣液、肺滲出物、漿膜液、器官、気管支肺胞洗液、腫瘍、パラフィン包埋組織等を含めた個体または複数個体から単離されたある量の組織または流体であり得る。試料は、限定されるものではないが、細胞培養基における細胞、組換細胞、細胞成分の増殖から得られる条件培地を含むインビトロ細胞培養の構成要素および成分を含むこともできる。
本明細書中で用いるように、用語「ゲノム」とは、（ウイルスを含む）生物によって保有された遺伝子的情報または遺伝物質、すなわち、生物またはウイルスの全遺伝補充物をいう。ゲノムのサイズは、一般には、（一本鎖ゲノムを記載する場合は）ヌクレオチドまたは塩基、あるいは（二本鎖ゲノムを記載する場合は）塩基対のその合計数として与えられる。ゲノムはＲＮＡまたはＤＮＡを含むことができる。ゲノムは線状、環状とすることができ、および／または染色体のような区別されるユニット上に存在することができる。
本明細書中で用いるように、表現「配列不均一性」とは、異なる源に由来する２以上の相同ヌクレオチド配列の間の塩基配列発散をいう。配列発散は塩基対不適合（ミスマッチ）、ギャップ、挿入および／またはゲノム再編成において反映され得る。本明細書中で用いるように、１つのＨＣＶゲノム、またはゲノムの部分は第２の（またはそれ以上の）ＨＣＶゲノム（またはその部分）と整列させることができ、配列不均一性につき分析することができる。例えば、ウイルスゲノムの収集は、もしそれらが、例えば、５’−ＵＴＲ、または５’−ＵＴＲの部分において、特定のドメイン中の配列発散を示すならば、配列不均一性を示す。
本明細書中で用いるように、表現「Ｃ型肝炎ウイルスタイプ」とは、そのゲノム組織化（例えば、系統発生分析）に基づいて、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のカテゴリー化をいう。ＨＣＶ単離体の特定のタイプカテゴリーへのカテゴリー化は他のＨＣＶ単離体へのそのゲノムの関連性および他のＨＣＶ単離体へのその比較的低い関連性を反映する。本明細書中で用いるように、ＨＣＶタイピング命名法はＳｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｌｅｔｔｅｒ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９：１３２１−１３２４によって提案された広く適合される命名法に合致する。また、Ｚｅｉｎ（２０００）「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ １３（２）：２２３−２３５；Ｍａｅｒｔｅｎｓ ａｎｄ Ｓｔｕｙｖｅｒ（１９９７）「Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ」，ｐ．１８２−２３３，Ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ａｎｄ Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ（編），Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ）も参照されたい。Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ｅｔ ａｌ（１９９４）の系は公知のＨＣＶ単離体を１１のＨＣＶ遺伝子型、すなわち、遺伝子型１〜１１の内の１つに入れる。各遺伝子型は、さらに、同一遺伝子型の株内の関連性を反映するグルーピングといわれるサブタイプに小分けされる。ＨＣＶサブタイプは遺伝子型、例えば、サブタイプ１ａ、サブタイプ１ｃ、サブタイプ６ａ等に従って小文字ローマ文字によって書かれる。個々の単離体内で見出される遺伝的変種を疑似種といわれる。全ての１１の遺伝子型を含むほぼ７８のＨＣＶサブタイプは世界中で知られており；サブタイプの数は静的ではなく；より多くのＨＣＶ単離体が調べられ、配列決定されるにつれ、さらなるサブタイプ（およびおそらくは遺伝子型）も認識できるようである。
本明細書中で用いるように、用語「ウイルスタイプ」とは遺伝子型またはサブタイプいずれかを言うことができる。本明細書中で用いるように、用語「ＨＣＶタイプ」はＨＣＶ遺伝子型またはＨＣＶサブタイプを意味することができるのに注意されたい。本明細書中で用いるように、用語「ＨＣＶタイピング」は実験的（例えば、未知のタイプ）ＨＣＶを公知の遺伝子型（例えば、１、２、３、４、５または６、またはそのサブセット）に割り当てる、または実験的ＨＣＶを公知のサブタイプ（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ等、またはそのサブセット）に割り当てることを意味する。対照的に、当分野で通常用いられているように、用語「ＨＣＶゲノタイピング」は、最も頻繁には、ＨＣＶのいずれかのサブタイプ、例えば、最も典型的には、１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ等の１つにＨＣＶを割り当てることを言うのに注意されたい。しかしながら、本明細書中で用いるように、用語「ゲノタイピング」とは１、２、３、４、５または６のみへの割り当てをいう。
いくつかのレポート（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４３（１２）：２４９３−２５０３）は、ウイルスゲノム組織化がウイルスクレードの創製によって最良に表され、いくつかのＨＣＶ遺伝子型が他のＨＣＶ遺伝子型よりも相互により密接に関連するという観察を反映すると提唱している。この系においては、クレード１、２、４および５は遺伝子型１、２、４および５に対応し、他方、クレード３は遺伝子型３および１０を含み、クレード６は遺伝子型６、７、８、９および１１を含む。本発明の記載はクレード命名法を用いない。
本明細書中で用いるように、表現「機能的プローブ」とはＨＣＶタイピングプローブを言い、ここに、そのプローブが少なくとも５つの異なるＨＣＶ遺伝子型（例えば、１、２、３、４、５および６から選択される遺伝子型）または少なくとも６つの異なるＨＣＶサブタイプ（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａから選択されるサブタイプ）とでハイブリダイゼーション複合体を形成した場合、いくつかのハイブリダイゼーション特性の異なる値または規定する特徴は各ＨＣＶタイプに対応して区別することができ、したがって、プローブは各ＨＣＶタイプを識別することができる。
本明細書中で用いるように、表現「非機能的プローブ」とはＨＣＶタイピングプローブを言い、そこでは、そのプローブが少なくとも５つの異なるＨＣＶ遺伝子型（例えば、１、２、３、４、５および６から選択される遺伝子型）または少なくとも６つの異なるＨＣＶサブタイプ（例えば、１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａから選択されるサブタイプ）とでハイブリダイゼーション複合体を形成する場合、いくつかのハイブリダイゼーション特性の異なる値または規定する特徴を各ハイブリダイゼーション複合体につき区別することができず、従って、プローブはＨＣＶ遺伝子型またはＨＣＶサブタイプの各々を区別することができない。
本明細書中で用いるように、表現「に由来する」とは、特定の試料、分子、生物、あるいは特定の分子または生物からの情報から単離された、またはそれを用いて作成された成分をいう。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスに由来する核酸分子はＨＣＶゲノムの分子であり得、あるいは別法として、ＨＣＶゲノムからの転写体であり得る。
本明細書中で用いるように、表現「ウイルス負荷」、「ウイルス負担」、「ウイルスコピー数」および同等または同様な表現は、試料中のウイルスゲノムの定量的評価をいう。ウイルス負荷は試料容量の単位当たりのウイルス粒子（例えば、ビリオン）の数として表すことができる。別法として、ウイルス負荷は容量の単位当たりの試料中のウイルスゲノム粒子の数として表すことができる。例えば、試料中のＨＣＶのウイルス負荷は試料容量の単位当たりのＲＮＡゲノム分子の数として表すことができる。
本明細書中で用いるように、用語「サブ配列」、「断片」または「部分」等とは、完全な配列までの、かつそれを含む、より大きな配列（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）のいずれかの部分をいう。サブ配列の最小長は、最小長がその意図された機能に鑑みて有用であろう以外は、一般には制限されない。例えば、ポリヌクレオチド部分はウイルスゲノムから増幅して、アンプリコンを生産することができ、これは、今度は、ポリヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション反応で用いることができる。従って、この場合には、増幅された部分はポリヌクレオチドプローブに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さとすべきである。ポリヌクレオチドの部分はいずれの長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０または２００ヌクレオチド以上の長さとすることもできる。
本明細書中で用いるように、用語「モニターする」とは、周期的または連続的監視、テスト、データ収集および／または定量をいう。モニタリングは自動化することができ、モニタリングの間に集めた情報（例えば、データセット）は印刷することができ、あるいはコンピュータリーダブルおよび／またはコンピュータストアラブルフォーマットとして編集することができる。
本明細書中で用いるように、用語「相関する」とは、２以上の変数、値または存在の間の関係を作り出すことをいう。２つの変数が相関するならば、それらの変数の内の１つの同定を用いて、残りの変数の値を決定することができる。
本明細書中で用いるように、用語「キット」は、試料のプロセス、方法、アッセイ、分析または操作を容易とする製品の組合せに言及するのに用いる。キットは前記キットをどのようにして用いるかを記載する書面による指示書（例えば、本発明の方法を記載する指示書）、前記方法で必要な化学試薬または酵素、プライマーおよびプローブ、ならびにいずれかの他の成分を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明はＲＴ−ＰＣＲを使用する「閉じたチューブ」ＨＣＶタイピングのためのキットを提供する。これらのキットは、例えば、限定されるものではないが、試料収集（例えば、血液試料の収集）のための試薬、血液からのＲＮＡの収集および精製のための試薬、逆転写酵素、逆転写に適したプライマー、およびＨＣＶアンプリコンを生産するための第一鎖および第二鎖ｃＤＮＡ合成、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および遊離デオキシビボヌクレオチド三リン酸を含むことができる。いくつかの実施形態において、逆転写酵素活性および熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を含む酵素は同一酵素、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＺＯ５ポリメラーゼまたはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓポリメラーゼである。
（例えば、患者からの試料中の）ＨＣＶ単離体のタイピングは、療法のための最も適切なコースを決定するにおいて価値ある臨床的ツールである。感染におけるＨＣＶのタイプ（遺伝子型および／またはサブタイプ）を知ることもまた、疫学的分析（例えば、特定のＨＣＶ勃発の源および／または拡大の判断）を含めた他の利点も有する。
ＨＣＶタイピングのための現在の方法は種々の制限に直面している。当分野における現在の制限を克服し、現在満たされていない要求を満足する組成物および方法を提供し、およびさらなる利点を有するタイピング方法を提供するためのＨＣＶタイピング用の改良された方法を提供する目的で、本出願はＨＣＶタイピング分析のための組成物および方法を提供し、ここに、本明細書中に記載される方法は試料中のＨＣＶを少なくとも５つの遺伝子型の１つ、または少なくとも６つのサブタイプの１つに帰属させるのに単一プローブのみを必要とする（例えば、６つの最も普通のＨＣＶサブタイプ単離体）。ＨＣＶ含有試料を、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型から、または少なくとも６つのサブタイプから選択されるＨＣＶタイプに帰属させるための単一プローブの使用が、当分野で現在知られた方法よりも優れた利点を提供する。
単一タイピングプローブを用いるＨＣＶタイピング
本発明は、ＨＣＶタイピングのための組成物および方法を提供し、そこでは、用いる前記方法はＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの帰属を行うのにただ１つの単一プローブを用いる。本発明の組成物および方法を用いて、ＨＣＶを、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型１、２、３、４、５または６から選択される）の１つに帰属させ、あるいはＨＣＶを、少なくとも６つのサブタイプ（例えば、サブタイプ１ａ／ｂ／ｃ、２ａ／ｂ／ｃ、３ａ、４ａ、５ａまたは６ａから選択される）の１つに帰属させることができる。また、本発明の方法は、混合ＨＣＶ感染の場合に用いることができ、試料に存在する各ＨＣＶ種はＨＣＶタイプ（遺伝子型またはサブタイプ）に帰属される。
本発明は、ＨＣＶタイピングのための組成物および方法を提供し、そこでは、用いる前記方法はＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの帰属を行うのにただ１つの単一プローブを用いる。本発明の組成物および方法を用いて、ＨＣＶを、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型１、２、３、４、５または６から選択される）の１つに帰属させ、あるいはＨＣＶを、少なくとも６つのサブタイプ（例えば、サブタイプ１ａ／ｂ／ｃ、２ａ／ｂ／ｃ、３ａ、４ａ、５ａまたは６ａから選択される）の１つに帰属させることができる。また、本発明の方法は、混合ＨＣＶ感染の場合に用いることができ、試料に存在する各ＨＣＶ種はＨＣＶタイプ（遺伝子型またはサブタイプ）に帰属される。
本発明、すなわち、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型の１つ、または少なくとも６つのサブタイプの１つから選択される遺伝子型への帰属を行うために単一プローブを用いることに関する組成物および方法が、遺伝子型またはサブタイプ帰属を行うのに複数のプローブの使用を必要とし、あるいはここにプローブが５つの遺伝子型または６つのサブタイプを超える中から識別できない、当分野で現在知られたＨＣＶタイピングのための方法よりも優れた利点を提供する。
一般に、１つの態様において、本発明のＨＣＶタイピング方法は後に概説する工程を含む。
（Ａ）任意で、試料からのＨＣＶゲノムの部分の増幅
いくつかの実施形態において、未知タイプのＣ型肝炎ウイルスを含む試料を（増幅工程の必要なしで）タイピング分析で直接用いる。この場合、ＨＣＶゲノム材料、または別法としてＨＣＶ転写体は、任意で、例えば、いずれかの適当な核酸単離技術を用いて試料から単離することができる。その単離された材料は引き続いての分析で用いることができる。非常に低いコピー数での核酸（の、例えば、蛍光検出）の分析のための技術は、当分野で知られており、本発明で用途を見出す。例えば、Ｍｉｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，「ＰＣＲ−Ｌｅｓｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｂｅｓ」，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｐａｐｅｒｓ，２２２ｎｄ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，合衆国（２００１年８月２６日〜３０日）参照。
いくつかの実施形態において、未知タイプのＣ型肝炎ウイルスを含む試料を（増幅工程の必要なしで）タイピング分析で直接用いる。この場合、ＨＣＶゲノム材料、または別法としてＨＣＶ転写体は、任意で、例えば、いずれかの適当な核酸単離技術を用いて試料から単離することができる。その単離された材料は引き続いての分析で用いることができる。非常に低いコピー数での核酸（の、例えば、蛍光検出）の分析のための技術は、当分野で知られており、本発明で用途を見出す。例えば、Ｍｉｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，「ＰＣＲ−Ｌｅｓｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｐｒｏｂｅｓ」，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｐａｐｅｒｓ，２２２ｎｄ ＡＣＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，合衆国（２００１年８月２６日〜３０日）参照。
いくつかの実施形態において、ＨＣＶ増幅工程は、任意で、タイピング分析に先立って使用する。この増幅は、典型的には、非対称ＲＴ−ＰＣＲ反応によるものであり、そこでは、増幅された領域は、各タイプ（遺伝子型またはサブタイプ）の仮定アンプリコンが他のタイプに対してユニークなヌクレオチド配列を示すように、十分な変動性のドメインを含む。増幅される領域は特に制限されず、ウイルスゲノムのいずれかの適当な部分からのものとすることができる。増幅された領域は高度に保存された領域（例えば、５’−ＵＴＲ領域）または超可変領域（例えば、ＨＣＶポリメラーゼをコードするＮＳ５Ｂ領域）であると認識されているものに存在できる。別法として、コアまたはＥ１領域を用いることもできる。いくつかの実施形態において、ＨＣＶアンプリコンを作り出すのに用いられるＰＣＲプライマーは「ユニバーサルプライマー」であり、そこでは、プライマーはＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプに関わらずアンプリコンを生じさせるであろう。ユニバーサルＨＣＶアンプリコンを生じさせるのに適したユニバーサルタイプＨＣＶプライマー（およびＨＣＶ特異的ＰＣＲキット）は広く知られており、やはり商業的に入手可能である（例えば、Ｒｏｃｈｅ ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（商標）ＨＣＶ ＭＯＮＩＴＯＲテストキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ参照）。他の実施形態において、プライマーの２以上の組を用いることができる。
ＰＣＲ反応で用いられるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではない。ＰＣＲアンプリコンはＨＣＶ ＲＮＡゲノム材料から生じるので、ＰＣＲ反応は、ＲＴ活性も有する熱安定性ポリメラーゼを用いる１工程逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ反応であり得る（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．株ＺＯ５，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。別法として、ＲＴ−ＰＣＲは２つの異なる酵素を用いる段階的反応であり得、１つはｃＤＮＡを生じさせるための逆転写工程であり、他方は増幅工程のためである。ある実施形態において、ＰＣＲ増幅プライマーの１つは、ＨＣＶ ｃＤＮＡ第一鎖を作り出すためのＲＴ活性の起点となるよう働く。ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ試薬および方法は当分野で広く知られたルーチン的なものである。
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、任意で、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを、他のデオキシリボヌクレオチドよりも高いモル濃度で含有することができる。これは、外因性ＤＮＡでのＰＣＲの交差汚染を妨げるのに有用な、ｄＵＴＰ含有アンプリコンの創製で用いることができる。ｄＵＴＰ含有アンプリコンを利用する系においては、ＨＣＶ逆転写および増幅に先立っての、ウラシルＮ−グルコシラーゼ（ＵＮＧ）ヌクレアーゼ消化、引き続いての、ＵＮＧ不活化は、他のｄＵＴＰ含有ポリヌクレオチドからの交差−汚染を排除することができる。そのような系は当分野で通常用いられており、種々の源から入手可能である（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）参照）。
１つの態様において、試料は患者からの血液または血液産物（例えば、血漿）試料であり、ここに、患者がＨＣＶ感染を有することが判明しているか、あるいはＨＣＶ感染を有する疑いがあるものである。典型的には、要件ではなく、試料はＨＣＶゲノム材料を含有するであろう試料のＲＮＡ成分を豊富化する目的で少なくとも部分的に精製される。いずれの適当なＲＮＡ精製方法も用いることができ、全ＲＮＡ精製またはポリＡ ＲＮＡ精製いずれかであり得る。好ましくは、ＲＮＡを豊富化するのに用いられる方法は、高スループット方法またはロボット系で用いるのに適したように提供できる迅速な方法である。例えば、ＱＩＡｍｐ（登録商標）ウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｎ．Ｖ．Ｖｅｎｌｏ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）および高純粋ＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。
（Ｂ）標的ハイブリダイゼーション複合体を形成するための、ＨＣＶ材料と第一のプローブとのハイブリダイジング
次いで、ＨＣＶ材料（例えば、単離された資料材料、またはＲＴ−ＰＣＲ増幅から生じたＨＣＶアンプリコン）をＨＣＶタイピングプローブとのハイブリダイゼーション反応で用いて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。ＨＣＶタイピングプローブは、（ｉ）プローブ配列はＨＣＶアンプリコン内のヌクレオチド配列に対して少なくとも部分的に相補的であり、ここに、少なくとも非ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な相補性があり；（ｉｉ）ハイブリダイゼーション複合体の領域の相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性（例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの差）を示し；（ｉｉｉ）タイピングプローブ、および少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのウイルスサブタイプを含むハイブリダイゼーション複合体は、残りのタイプから各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有することを含めた、種々の考慮でもって設計される。
次いで、ＨＣＶ材料（例えば、単離された資料材料、またはＲＴ−ＰＣＲ増幅から生じたＨＣＶアンプリコン）をＨＣＶタイピングプローブとのハイブリダイゼーション反応で用いて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。ＨＣＶタイピングプローブは、（ｉ）プローブ配列はＨＣＶアンプリコン内のヌクレオチド配列に対して少なくとも部分的に相補的であり、ここに、少なくとも非ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な相補性があり；（ｉｉ）ハイブリダイゼーション複合体の領域の相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性（例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの差）を示し；（ｉｉｉ）タイピングプローブ、および少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのウイルスサブタイプを含むハイブリダイゼーション複合体は、残りのタイプから各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有することを含めた、種々の考慮でもって設計される。
従って、プローブが特定のＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプとでハイブリダイゼーション複合体を形成する場合、得られたハイブリダイゼーション複合体は、その特定の遺伝子型またはサブタイプに特徴的であって、他の遺伝子型またはサブタイプとで形成することができるハイブリダイゼーション複合体の特性とは異なるユニークな特性を有する。
いくつかの実施形態において、識別ハイブリダイゼーション特性が融解温度（Ｔm）である。Ｔmのイン・シリコ予測および実験的決定のための方法は当業者に周知である。しかしながら、本発明は唯一の識別ハイブリダイゼーション特性としてのＴmの使用に制限されることは意図されない。他の技術も、ハイブリダイゼーション複合体の間の差を識別するのに用いることができる。例えば、識別ハイブリダイゼーション特性はＴ25またはＴ75であり得る。他の実施形態において、（例えば、ＨＣＶタイピングプローブを含む）異なるハイブリダイゼーション複合体は、ヘテロデュプレックス移動度分析（ＨＭＡ）、変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）、切断断片長多形（ＣＦＬＰ）または熱的グラジエント毛細管電気泳動（ＴＧＣＥ）を用いることによって相互から識別することができる。加えて、異なる識別ハイブリダイゼーション特性を組み合わせて、ハイブリダイゼーション複合体の分解能を増強させることができる。機能的プローブの例は図６に掲げる。
図６および実施例６に示すように、配列の一部として蛍光標識をやはり示すプローブ配列が供される。例えば、図６における文字「Ｆ」は標識「ＦＡＭ」を示す。しかしながら、これらのプローブの塩基配列はＦＡＭ標識に制限されることを意図しない。当業者であれば、当分野で知られた種々の標識のいずれかはこれらのプローブの塩基配列の関係での用途を見出すことを認識する。
本発明で用いられるように、用語ハイブリダイゼーションは可溶性−相ハイブリダイゼーションに制限されることを意図しない。当業者であれば、種々の代替ハイブリダイゼーション方法は本発明で用途を見出すことを認識する。例えば、固相ハイブリダイゼーション技術は、膜、ろ紙、ビーズ、ゲル等を含めた種々の表面で行うことができる。ハイブリダイゼーションプローブは、固相の表面に共有結合、または非共有結合させることができる。別法として、捕獲オリゴヌクレオチドが、ＨＣＶハイブリダイゼーション複合体の形成に関与しないハイブリダイゼーションプローブの部分にハイブリダイズすることができ、あるいはハイブリダイゼーションプローブのそのような部分に対して特異的な捕獲抗体を固相に付着させることができる。
（Ｃ）ハイブリダイゼーション複合体のハイブリダイゼーション特性の測定
一旦ＨＣＶアンプリコンおよびＨＣＶタイピングプローブの間のハイブリダイゼーション複合体が形成されれば、識別ハイブリダイゼーション特性が測定される。１つの態様において、前記したように、ハイブリダイゼーション特性はＴmであって、Ｔm融解曲線分析を行う。しかしながら、本発明は識別特性としてＴmの使用に限定されることを意図しない。事実、単独、または組み合わせられた、他の特性の使用（測定）は、特に、高スループット適用で有利であり得る。
一旦ＨＣＶアンプリコンおよびＨＣＶタイピングプローブの間のハイブリダイゼーション複合体が形成されれば、識別ハイブリダイゼーション特性が測定される。１つの態様において、前記したように、ハイブリダイゼーション特性はＴmであって、Ｔm融解曲線分析を行う。しかしながら、本発明は識別特性としてＴmの使用に限定されることを意図しない。事実、単独、または組み合わせられた、他の特性の使用（測定）は、特に、高スループット適用で有利であり得る。
いくつかの実施形態において（例えば、Ｔmが識別特性として用いられる場合）、ＲＴ−ＰＣＲ反応、プローブ／標的ハイブリダイゼーション反応およびＴmの測定は、ＲＴ−ＰＣＲ反応の開始後にさらに試薬を加える必要なしで単一の「閉じたチューブ」系で行う。閉じたチューブ系においては、各工程で必要な全ての試薬は分析の着手からチューブに存在させる。例えば、閉じたチューブＲＴ−ＰＣＲおよびＴm系はＲＮＡ試料、ユニバーサルＲＴ−ＰＣＲプライマー、（好ましくはＲＴ活性を持つ）ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、適当なＨＣＶタイピングプローブ（任意で、プローブが１つ以上の適当なＦＲＥＴ成分で標識されている場合）および、任意で可溶性ＦＲＥＴクエンチャーを含有するであろう。ある実施形態において、閉じたチューブＲＴ−ＰＣＲおよびＴm系は適当なサーモサイクラーに入れることができ、ＲＴ−ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションおよびＴm融解曲線分析の進行は、反応および分析の異なる段階用の反応容器を移動させる必要なしで、単に、反応容器の温度を制御することによって制御される。同様に、いくつかの実施形態において、サーモサイクラーは、融解／アニーリング曲線分析蛍光モニタリングが反応容器を移動させることなく行うことができるように、適当な蛍光分光計とカップリングさせる。
本発明はＴmの決定用のいずれかの特定の方法に制限されることを意図しない。Ｔmの実験的決定のための方法は当分野で広く知られており、種々の源、例えば、Ｌｉｅｗ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｙ Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ａｍｐｌｉｃｏｎｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０（７）：１１５６−１１６４（２００４）；Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｗｉｔｔｗｅｒ 「Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｂｙ Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０（１０）：１７４８−１７５４（２００４）；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｌｏｓｅｄ−Ｔｕｂｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ａ Ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｄｙｅ」，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０（８）：１３２８−１３３５（２００４）；およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ＨＬＡ ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｄｅｎｔｉｔｙ」，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６４：１５６−１６４（２００４）に記載されている。融解曲線分析の機器は種々の製造業者から商業的に入手可能である。異なる融解曲線機器は異なる感度を有することができることは認識されている。例えば、１つの機器はＴmを±０．５℃まで分解することができ、他方、異なる装置はＴmを±０．１℃まで分解することができる。従って、０．２℃の分離でもって各ＨＣＶタイプのＴm値を理論的に生じさせることができる１つのＨＣＶタイピングプローブを、Ｔm機器の１つのメークおよびモデルで効率的に用いることができるが、必要な感度を有しないもう１つのＨＣＶ機器ではできない。
（Ｄ）測定されたハイブリダイゼーション特性（例えば、Ｔ m ）とＨＣＶタイプとの相関
一旦ハイブリダイゼーション特性が（Ｃ）に記載されたように測定されたならば、その情報を用いて、測定されたハイブリダイゼーション特性の値に基づいて、ＨＣＶタイプを試料中のＨＣＶに帰属させる。例えば、Ｔmが測定された識別特性である場合、標準化されたＴm値のテーブルを、実験試料の分析に先立ってアセンブルする。標準化されたＴmのテーブルは、実験試料の分析で用いる同一ハイブリダイゼーション条件下で各ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプについて予め決定されたＴm値からなるであろう。一旦実験試料についてのＴm値が測定されたならば、その値をＴm値の標準化されたテーブルと比較する。標準化されたおよび実験試料についての同一または近い同一値は、その標準タイプおよび実験タイプの間の対応性を示す。
一旦ハイブリダイゼーション特性が（Ｃ）に記載されたように測定されたならば、その情報を用いて、測定されたハイブリダイゼーション特性の値に基づいて、ＨＣＶタイプを試料中のＨＣＶに帰属させる。例えば、Ｔmが測定された識別特性である場合、標準化されたＴm値のテーブルを、実験試料の分析に先立ってアセンブルする。標準化されたＴmのテーブルは、実験試料の分析で用いる同一ハイブリダイゼーション条件下で各ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプについて予め決定されたＴm値からなるであろう。一旦実験試料についてのＴm値が測定されたならば、その値をＴm値の標準化されたテーブルと比較する。標準化されたおよび実験試料についての同一または近い同一値は、その標準タイプおよび実験タイプの間の対応性を示す。
別法として、各ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの標準化された試料を実験試料と平行して分析することができ、ＨＣＶタイプ帰属は、アッセイの時点で測定された標準値（例えば、Ｔm値）と実験値とを比較することを基づいてなすことができる。
いくつかの実施形態において、ＨＣＶタイピングについての方法はＨＣＶウイルス負荷を決定するための方法にカップリングされる。同一アッセイにおける定性的（タイピング）および定量的（ウイルス濃度）ＨＣＶ分析の組合せは、患者を治療している臨床化にとって大いに有益である。ＨＣＶ定量のための方法は当分野で周知であり、例えば、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲ（商標）ＨＣＶ ＭＯＮＩＴＯＲキット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）。これらの商業的システムは、典型的には、ＰＣＲ反応でＴａｑＭａｎ−タイププローブを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応においてユニバーサルＨＣＶアンプリコンのリアルタイム蓄積をモニターする。
ＰＣＲアンプリコン蓄積の速度は、ＴａｑＭａｎプローブ蛍光によってモニターして、試料中のＲＮＡゲノム出発材料の量に直接比例する。適当なＨＣＶ濃度標準をＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応に含めることによって、どれくらい多くのＨＣＶゲノム分子が出発反応に存在するかを決定することができる。その知識でもって、実験試料中のＨＣＶゲノム粒子の濃度を外挿することができる。
本発明のいくつかの実施形態において、ＴａｑＭａｎ−タイププローブをＲＴ−ＰＣＲ反応ミックスに含め、ＰＣＲアンプリコンのリアルタイム蓄積をモニターする。その情報から、試料中のＨＣＶゲノムの濃度を計算する。ある実施形態において、ＨＣＶ定量を閉じたチューブの系においてＨＣＶゲノタイピングとカップリングさせ、そこでは、ＴａｑＭａｎ−タイププローブを、ＲＴ−ＰＣＲ増幅およびハイブリダイゼーション特徴付け（例えば、Ｔm融解曲線分析）のための全ての試薬を含有する反応ミックスに含める。定量的ＨＣＶ分析をＨＣＶタイピングとカップリングさせる場合、非対称ＰＣＲ反応は、典型的には、ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応で用いられる。その場合、ＴａｑＭａｎ−タイプ検出プローブは、限定的アンプリコン鎖に相補的であるように設計され、ＨＣＶタイピングプローブは、豊富な過剰なアンプリコン鎖に対して相補的であるように設計される。さらに、ＴａｑＭａｎ定量プローブは、前記プローブがいずれかのＨＣＶタイプのゲノムにハイブリダイズするように、ＨＣＶアンプリコンの保存された領域にハイブリダイズするように設計される。ある実施形態において、プローブは同等な親和性でもって全てのＨＣＶタイプアンプリコン配列にハイブリダイズするであろう。ウイルス負荷の計算は、蛍光誘導体プロット（例えば、第一の誘導体または第二の誘導体プロット）を用いて、なすことができる。
本発明のＨＣＶタイピングプローブの設計
一般に、本発明のＨＣＶタイピングプローブは以下のガイドラインを用いて設計される：
一般に、本発明のＨＣＶタイピングプローブは以下のガイドラインを用いて設計される：
１）少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で不均一性を示すＨＣＶゲノム候補標的の同定
ハイブリダイゼーションのためのＨＣＶ標的配列は特に制限されない。プローブを、十分な不均一性（例えば、５’−ＵＴＲ）を有し、ＨＣＶゲノム中のより可変なドメイン内に存在する比較的保存されたドメインにハイブリダイズすることができる。適当なプローブ標的が同定される場合、適切なユニバーサル増幅プライマーの使用も考えられ、そこでは、ＨＣＶアンプリコンはプローブ標的配列を含有しなければならないが、また、プローブ標的配列に近接する配列は、ＨＣＶタイプに関わらずＨＣＶアンプリコンを生じさせるであろうユニバーサルＰＣＲプライマーの使用を可能とするのに十分に保存されていなければならない。不均一性の領域にハイブリダイズするだろう候補ＨＣＶタイピングプローブが設計される。
ハイブリダイゼーションのためのＨＣＶ標的配列は特に制限されない。プローブを、十分な不均一性（例えば、５’−ＵＴＲ）を有し、ＨＣＶゲノム中のより可変なドメイン内に存在する比較的保存されたドメインにハイブリダイズすることができる。適当なプローブ標的が同定される場合、適切なユニバーサル増幅プライマーの使用も考えられ、そこでは、ＨＣＶアンプリコンはプローブ標的配列を含有しなければならないが、また、プローブ標的配列に近接する配列は、ＨＣＶタイプに関わらずＨＣＶアンプリコンを生じさせるであろうユニバーサルＰＣＲプライマーの使用を可能とするのに十分に保存されていなければならない。不均一性の領域にハイブリダイズするだろう候補ＨＣＶタイピングプローブが設計される。
種々の商業的プログラムがハイブリダイゼーションプローブの設計のために広く入手可能である。そのような商業的に入手可能なプログラムの例はＶｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、およびＩｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）からのＴm利用性ツールを含む。本発明はプローブ配列を設計するためのいずれかの特定のソフトウェアの使用に制限されることを意図しない。
本発明のＨＣＶタイピングプローブが、いずれか１つのＨＣＶタイプと同一である（１００％相補性）ヌクレオチド配列を有することは要件ではない。本発明のＨＣＶタイピングプローブは、各ＨＣＶゲノムタイプに対して意図的に１００％相補性未満であるヌクレオチド配列を有することができる。その場合は、プローブがＨＣＶタイプの各々の間で識別できるようにするそのプローブの所望のハイブリダイゼーション特性を与える目的で望ましいであろう。例えば、得られたハイブリダイゼーション複合体Ｔmを変化させる目的で、ミスマッチを意図的にプローブに設計することができる。機能的ＨＣＶタイピングプローブの例は、図６に掲げる。
２）候補タイピングプローブ配列をイン・シリコでテストする。
一旦候補プローブ配列が同定されれば、その配列を、任意で、既知のＨＣＶタイプ配列の各々にハイブリダイズする場合の識別特性を呈するその能力につきイン・シリコでテストする。例えば、候補プローブ配列が同定された場合、イン・シリコモデリングを用いて、そのプローブおよび既知のＨＣＶタイプの各々における相補的標的での仮定ハイブリダイゼーション複合体Ｔmを予測することができる。効果的なプローブ候補は、ＨＣＶタイプの各々が効果的であって、十分に識別される特性（例えば、Ｔm）を呈しなければならない。
一旦候補プローブ配列が同定されれば、その配列を、任意で、既知のＨＣＶタイプ配列の各々にハイブリダイズする場合の識別特性を呈するその能力につきイン・シリコでテストする。例えば、候補プローブ配列が同定された場合、イン・シリコモデリングを用いて、そのプローブおよび既知のＨＣＶタイプの各々における相補的標的での仮定ハイブリダイゼーション複合体Ｔmを予測することができる。効果的なプローブ候補は、ＨＣＶタイプの各々が効果的であって、十分に識別される特性（例えば、Ｔm）を呈しなければならない。
種々の商業的プログラムが、特定のハイブリダイゼーション複合体Ｔmの予測のために広く入手できる。例えば、Ｖｉｓｕａｌ ＯＭＰ（ＤＮＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）、およびＩｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）からのＴm有用性ツール。本発明は、Ｔmを予測するためのいずれかの特定のソフトウェアの使用に制限されることを意図しない。種々のプローブのための予測された（および実験的に観察された）Ｔm値の例を図７に示す。
候補ＨＣＶタイピングプローブのイン・シリコテストは、効果的 ｖｓ 効果的でないプローブを同定するにおいて初期のガイダンスのためのものである。イン・シリコスクリーニングは、ＨＣＶタイピングプローブのハイブリダイゼーション特性を実験的にテストし、測定する工程に進める前に厳格には必要とされない。さらに、Ｔm値のイン・シリコ予測は近似的なものに過ぎず、実験的観察および確認が必要であることが理解される。
３）候補プローブをインビトロでテストする。
プローブ設計における最後の工程として、タイピングプローブを、各ＨＣＶタイプを識別するその能力につきインビトロでテストする。この工程は、プローブ挙動を予測するにおいて１００％の精度を有しないイン・シリコの予測の結果を確認するのに必要である。Ｔm値が決定されるいくつかの実施形態において、プローブは、各ＨＣＶタイプに対応するヌクレオチド配列を有する（化学的に合成された）人工合成ＨＣＶ標的での融解曲線分析で用いる。タイピングプローブおよび各ＨＣＶ合成鋳型を含む核ハイブリダイゼーション複合体についてのＴmを実験的に決定する。ＨＣＶアンプリコンを生じるためのＲＴ−ＰＣＲ反応はこれらのアッセイで必要とされない。機能的（成功した）プローブは、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々について異なるかつ識別可能なＴm値を生じるプローブである。合成（化学的に合成された）ＨＣＶ鋳型を用いるＴm値の実験的決定は実施例１に記載される。これらのプローブは、ＨＣＶ合成鋳型の各々での実験的に観察されたＴmの十分な分離を示した。
プローブ設計における最後の工程として、タイピングプローブを、各ＨＣＶタイプを識別するその能力につきインビトロでテストする。この工程は、プローブ挙動を予測するにおいて１００％の精度を有しないイン・シリコの予測の結果を確認するのに必要である。Ｔm値が決定されるいくつかの実施形態において、プローブは、各ＨＣＶタイプに対応するヌクレオチド配列を有する（化学的に合成された）人工合成ＨＣＶ標的での融解曲線分析で用いる。タイピングプローブおよび各ＨＣＶ合成鋳型を含む核ハイブリダイゼーション複合体についてのＴmを実験的に決定する。ＨＣＶアンプリコンを生じるためのＲＴ−ＰＣＲ反応はこれらのアッセイで必要とされない。機能的（成功した）プローブは、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々について異なるかつ識別可能なＴm値を生じるプローブである。合成（化学的に合成された）ＨＣＶ鋳型を用いるＴm値の実験的決定は実施例１に記載される。これらのプローブは、ＨＣＶ合成鋳型の各々での実験的に観察されたＴmの十分な分離を示した。
確認テストの第２のレベルを任意で用いることができる。例えば、前記した人工鋳型を用いるＴm融解曲線分析を適合させて、化学的に合成された人工鋳型の代わりに既知のＨＣＶ単離体からの（例えば、インビトロ転写によって酵素的に合成された）合成転写体を用いることができる。例えば、人工転写体は、既知の遺伝子型およびサブタイプのＨＣＶゲノムインサートを運ぶプラスミドからインビトロ転写によって生産させることができる。
予測されたおよび実験的に観察されたＴm値の間の比較の例を図７に示す。実験的に観察されたＴm値は、インビトロ転写されたＨＣＶゲノム材料からのＲＮＡ鋳型から生じたＲＴ−ＰＣＲアンプリコンを用いる融解分析実験で得られた。
プローブおよびプライマーの合成
また、本発明は、多数のプローブおよびプライマー、例えば、ＨＣＶタイピングプローブ、ＨＣＶ定量（ＴａｑＭａｎ（登録商標）−タイプ）プローブおよびＨＣＶ増幅プライマー（ＲＴ−ＰＣＲで用いるためのもの）も提供する。これらのプローブおよびプライマーを作成するのに用いられる方法は何らか制限されていることは意図されない。当業者であれば、広く種々の化学合成戦略、およびプローブおよびプライマーを生産するための試薬に良く精通している。
また、本発明は、多数のプローブおよびプライマー、例えば、ＨＣＶタイピングプローブ、ＨＣＶ定量（ＴａｑＭａｎ（登録商標）−タイプ）プローブおよびＨＣＶ増幅プライマー（ＲＴ−ＰＣＲで用いるためのもの）も提供する。これらのプローブおよびプライマーを作成するのに用いられる方法は何らか制限されていることは意図されない。当業者であれば、広く種々の化学合成戦略、およびプローブおよびプライマーを生産するための試薬に良く精通している。
また、本発明のＨＣＶタイピングプローブおよびプライマーは天然に生じるヌクレオチド構造または天然に生じる塩基（例えば、アデニン、グアニン、チニン、シトシン、およびウラシル）に制限されることを意図しない。核酸に典型的には見出される天然に生じる複素環塩基に加えて、非天然核酸アナログもまた本発明で用いられる。非天然アナログは天然で生じない複素環または他の修飾された塩基を含む。特に、多くの天然に生じない塩基は、例えば、Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７４：１７９０，Ｇｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：９７１−９７６、およびＳｅｅｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８２：１６４０に記載されている。さらに説明すると、融解温度（Ｔm）モディファイアーとして作用するヌクレオチドで用いられるある種の塩基が任意で含まれる。例えば、これらのいくつかは７−デアザプリン（例えば、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン等）、ピロロ［３，４−ｄ］ピリミジン、プロピニル−ｄＮ（例えば、プロピニル−ｄＵ、プロビニル−ｄＣ等）等を含む。例えば、Ｓｅｅｌａに対して１９９９年１１月２３日に発行された、「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ７−ＤＥＡＺＡ−２’−ＤＥＯＸＹＧＵＡＮＯＳＩＮＥ ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ」と題された米国特許第５、９９０、３０３号参照。他の代表的な複素環塩基は、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン；２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの８−アザ誘導体；アデニン、グアニン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６―クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシンおよびキサンチンの７−デアザ−８−アザ誘導体；６−アザシトシン；５−フルオロシトシン；５−クロロシトシン；５−ヨードシトシン；５−ブロモシトシン；５−メチルシトシン；５−プロピニルシトシン；５−ブロモベニルウラシル；５−フルオロウラシル；５−クロロウラシル；５−ヨードウラシル；５−ブロモウラシル；５−トリフルオロメチルウラシル；５−メトキシメチルウラシル；５−エチニルウラシル；５−プロピルウラシル、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、７−デアザアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、７−デアザグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄマンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシン、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ｗｙブトキシ、シウドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６−ジアミノオプリン、および５−プロピニルピリミジン等を含む。さらに説明すると、修飾されたオリゴヌクレオチドの他の例は１つ以上のロックされた核酸（ＬＮＡ（商標））モノマー（Ｅｘｉｑｏｎ Ａ／Ｓ、Ｖｅｄｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋからのライセンス下で、例えば、Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｔｄ．、Ｌａｎａｒｋｓｈｉｒｅ Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手可能なＬＮＡ（商標）モノマーを含むオリゴヌクレオチド）を含む。これらのようなヌクレオチドアナログは、例えば、Ｋｏｃｈｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．に対して２００３年１０月２８日に発行された「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ（登録商標） ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」と題された米国特許第６、６３９、０５９号、Ｓｋｏｕｖに対して２００１年１０月１６日に発行された「ＯＮＥ ＳＴＥＰ ＳＡＭＰＬＥ ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＯＦ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＩＮ ＣＯＭＰＬＥＸ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＡＭＰＬＥＳ」と題された米国特許第６、３０３、３１５号、および２００３年５月１５日に公開された、Ｋｏｃｈｋｉｎｅ ｅｔ ａｌ．による「ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＯＦ ［２．２．１］ＢＩＣＹＣＬＯ（登録商標） ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ」と題された米国特許出願公開Ｎｏ．２００３／００９２９０５に記載されている。
オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは当分野で知られたいずれかの技術を用いて調製することができる。ある実施形態において、例えば、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２によって記載された固相ホスホルアミダイト方法に従うことを含めた、いずれかの核酸合成方法を用いて化学的に合成される。さらに説明すると、オリゴヌクレオチドはトリエステル方法を用いて合成することもできる（例えば、Ｃａｐａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（９）：ｅ４０ ａｎｄ Ｅｌｄｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（１９９４）「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ ｂｙ ａ ｔｒｉｅｓｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１０）：１７９７−１８０４参照）。また、当分野で知られた他の合成技術を利用することもでき、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８に記載されているような自動化シンセサイザーの使用を含む。広く種々の機器が自動化オリゴヌクレオチド合成のために商業的に入手可能である。マルチ−ヌクレオチド合成アプローチ（例えば、トリ−ヌクレオチド合成等）もまた任意で利用される。さらに、プライマー核酸は、任意で、種々の修飾を含む。ある実施形態において、例えば、プライマーは、例えば、引き続いてのアンプリコンクローリング等を容易とするために制限部位リンカーを含む。さらに説明すると、プライマーを任意で修飾して、例えば、Ｗｉｌｌに対して１９９９年１２月１４日に発行された「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＰＲＩＭＥＲＳ」と題された米国特許第６、００１、６１１号に記載されたように増幅反応の特異性を改良する。また、プライマーおよびプローブは本明細書中に記載された、またはそうでなければ当分野で知られた種々の他の修飾で合成することもできる。
本発明の反応混合物、方法、および他の態様で利用されるプローブは、典型的には、標識されて、プローブ−標的ハイブリダイゼーションデュプレックスの検出を可能とする。標識は、当分野で知られた種々の技術によって直接的または間接的にオリゴヌクレオチドに付着させることができる。説明すると、用いる標識のタイプに応じて、標識は（オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブの５’または３’末端）または非末端ヌクレオチドに付着させることができ、種々のサイズおよび組成のリンカーまたはスペーサーアームを通じて間接的に付着させることができる。商業的に入手可能なホスホルアミダイト試薬を用い、適切に保護されたホスホルアミダイトを介して５’または３’末端いずれかにおいて官能基（例えば、チオールまたは第一級アミン）を含有するオリゴヌクレオチドを生産することができ、例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（編）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｏｏｋｓ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）に記載されているプロトコルを用いてそのようなヌクレオチドを標識することができる。
実質的にいずれの核酸（標準または非標準、標識されたまたは標識されていない）を、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ），Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ），Ｐｒｏｌｉｇｏ ＬＬＣ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）、および多くの他のもののような種々の商業的源のいずれかから慣用的または標準的に注文することができる。
標識
また、本発明は、本発明と組み合わせて用いる多数のプローブ、例えば、ＨＣＶタイピングプローブおよびＨＣＶ定量（ＴａｑＭａｎ−タイプ）プローブを提供する。プローブとして、これらの分子は、典型的には、適当な標識を含む。標識、標識検出システムまたは標識検出および定量のための機器はとにかく制限されることを意図しない。当業者であれば、適切に標識されたポリヌクレオチドを生産するための広く種々の標識戦略および試薬に良く精通している。
また、本発明は、本発明と組み合わせて用いる多数のプローブ、例えば、ＨＣＶタイピングプローブおよびＨＣＶ定量（ＴａｑＭａｎ−タイプ）プローブを提供する。プローブとして、これらの分子は、典型的には、適当な標識を含む。標識、標識検出システムまたは標識検出および定量のための機器はとにかく制限されることを意図しない。当業者であれば、適切に標識されたポリヌクレオチドを生産するための広く種々の標識戦略および試薬に良く精通している。
標識は、別法として、または組み合わせて：（ｉ）検出可能なシグナルを供することができ；（ｉｉ）第二の標識と相互作用して、前記第二の標識例えば、ＦＲＥＴによって供される検出可能なシグナルを修飾することができ；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、すなわち、デュプレックス形勢を安定化させることができ；（ｉｖ）捕獲機能、すなわち、疎水性親和性、抗体／抗原、イオン複合体化を付与することができ、または（ｖ）電気泳動移動度、疎水性、親水性、溶解性、またはクロマトグラフィー挙動のような物理的特性を変化させることができる。標識は公知の標識、結合、連結基、試薬、反応条件、および分析および精製方法を使用する非常に多数の公知の技術のうちのいずれか１つを用いて達成することができる。標識は検出可能な蛍光、化学発光、または生物発光シグナルを発生させ、または消光する発光性または光吸収性化合物を含む（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．ｉｎ Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．３−２８）。
実質的にいずれの標識部位も任意で利用して、当分野でよく知られた技術によってプローブおよび／またはプライマーを標識する。いくつかの実施形態において、例えば、標識は蛍光色素（例えば、ローダミン色素、例えば、Ｒ６Ｇ、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ等、米国特許第５、３６６、８６０号；第５、８４７、１６２号；第５、９３６、０８７号；第６、０５１、７１９号；第６、１９１、２７８号参照）、フルオレセイン色素（例えば、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＦＡＭ等；６−カルボキシフルオロセイン；２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオロセイン；米国特許第５、１８８、９３４号；第６、００８、３７９号；第６、０２０、４８１号）、ベンゾフェノキサジン（米国特許第６、１４０、５００号）、ハロフルオロセイン色素、シアニン色素（例えば、ＣＹ３、ＣＹ３．５、ＣＹ５、ＣＹ５．５、ＣＹ７等、Ｋｕｂｉｓｔａによる公開された国際出願Ｎｏ．ＷＯ ９７／４５５３９参照）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）色素（例えば、ＦＬ、５３０／５５０、ＴＲ、ＴＭＲ等）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）色素（例えば、４８８、５３２、５４６、５６８、５９４、５５５、６５３、６４７、６６０、６８０等）、ジクロロローダミン色素、エネルギー移動色素（例えば、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ１色素、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ２色素、ＢＩＧＤＹＥ（商標）ｖ３色素等）、Ｌｕｃｉｆｅｒ色素（例えば、Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ等）、ＣＡＳＣＡＤＥ ＢＬＵＥ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ等を含む。蛍光色素のさらなる例は、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第９版（２００３）およびその最新版に供されている。蛍光色素は、一般に、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）等を含めた種々の商業的供給業者から容易に入手可能である。
ＦＲＥＴ標識技術はリアルタイムアンプリコン定量に、および核酸プローブハイブリダイゼーションをモニターするために通常用いられる。いくつかの好ましい実施形態において、ＦＲＥＴ標識系は本発明のプローブと共に用いられる。本発明はいずれかの特定のＦＲＥＴ対系に限定されることを意図しない。当業者であれば、本発明のプローブで用いることができる広い範囲のＦＲＥＴ標識を認識するであろう。ドナーおよびアクセプターの蛍光エネルギー−移動色素対は、例えば、米国特許第５、８６３、７２７号；第５、８００、９９６号；第５、９４５、５２６号、ならびに検出可能なシグナルを発生させることができるいずれかの他の蛍光標識を含む。
蛍光色素が標識またはクエンチャーであるかは、一般には、その励起および発光スペクトル、およびそれが対合する蛍光色素によって規定される。プローブおよびプライマーにおいてクエンチャー部位として通常用いられる蛍光分子は、例えば、フルオロセイン、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ローダミン、Ｒ６Ｇ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＤＡＢＣＹＬ、およびＥＤＡＮＳを含む。これらの化合物の多くは先に言及した商業的供給業者から入手することができる。蛍光色素から吸収されたエネルギーを消散する非蛍光または暗いクエンチャーの例はＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）またはＢＨＱ（商標）を含み、これらはＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から商業的に入手可能である。他のクエンチャーはＩｏｗａ Ｂｌａｃｋクエンチャー（例えば、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ（商標）およびＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ（商標））およびＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）ダーククエンチャー（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を含む。
本明細書中に掲げる実施例は、ＦＲＥＴドナー部位で標識され、可溶性クエンチャーと組み合わせて用いられるＨＣＶタイピングプローブを記載する。しかしながら、本発明はプローブ立体配置のそれらのタイプに制限されることを意図しない。例えば、本発明のＨＣＶタイピングプローブはプローブの分子ビーコンタイプとすることができ、ここに、前記プローブが当分野で知られたようにドナーおよびクエンチャー部位を共に含む。別法として、本発明のＨＣＶタイピングプローブはＴａｑＭａｎタイププローブとすることができ、ここに、前記プローブはドナーおよびクエンチャー部位を共に含む（しかし、介入ステム構造を必ずしも有さず、エキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼによって切断されない）。
別法として、本発明のドナー−標識ＨＣＶタイピングプローブは、可溶性クエンチャーの代わりにクエンチャー−標識アンカープローブと組み合わせて用いることができる。このシナリオにおいて、アンカープローブは、ＨＣＶタイピングプローブに直ぐに隣接した保存されたＨＣＶ領域にハイブリダイズするように設計され、ここに、アンカープローブは適当なクエンチャー部位で標識される。双方のプローブがそれらの各標的にハイブリダイズされると、ＦＲＥＴドナー消光が起こる。融解曲線分析の間の条件の間に、ＨＣＶタイピングプローブは、結局は、その標的配列から解離し、ＨＣＶアンプリコンに結合したアンカープローブのみが残り、その結果、ドナー蛍光が増加する。アンカープローブＦＲＥＴ系は当分野で知られており、例えば、Ｓｃｈｒｏｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、（２００２）Ｊｏｕｒ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４０（６）：２０４６−２０５０に記載されている。
他の標識は、例えば、ビオチン、弱い蛍光標識（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９（７）：３９３８．Ｂａｂｅｎｄｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１７（１）：１、およびＪａｎｋｏｗｉａｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１６（３）：３０４）、非蛍光標識、比色標識、化学発光標識（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎａｌｙｓｔ．１２８（５）：４８０およびＲｏｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １８（２）：７２，ラーマン標識、電気化学標識、生物発光標識（Ｋｉｔａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７７（３）：３３３，Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１４（２）：２０６およびＭａｅｄａ（２００３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．３０（６）：１７２５）、および、例えば、２００３年１１月２１日に出願された米国特許出願第１０／７１９、２５７号を含む。
標識のもう１つのクラスはデュプレックス、例えば、インターカレーター、従たる溝バインダー、および架橋官能基を増強し、安定化し、または影響するハイブリダイゼーション−安定化部位である（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｇａｉｔ，Ｍ．編，「ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」 ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５−８１）。
標識のさらにもう１つのクラスは特異的または非特異的捕獲による分子、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、および他のハプテンの分離または固定化に影響する（Ａｎｄｒｕｓ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ｉｎ ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３９−５４）。
非放射性標識方法、技術、および試薬は、Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏにレビューされている。
いくつかの実施形態において、本発明で用いられる２つのタイプのプローブ、すなわち、ＨＣＶタイピングプローブおよびＨＣＶ定量プローブは同一標識、例えば、フルオレセイン標識を用いる。これは種々の利点を提供する。というのは、ＨＣＶ定量アッセイおよびＨＣＶタイピングアッセイは同一ディテクター、例えば、蛍光分光光度計で読むことができるからである。しかしながら、本発明はそのタイプの立体配置に制限されることを意図しない。例えば、２つの異なるプローブは、同一ではない発光スペクトル（または蛍光および非蛍光標識系のような異なる標識系さえを）有する２つの異なる蛍光標識を用いることができる。
可溶性クエンチャー技術の使用
いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴ標識系は、本発明のプローブ、例えば、ＴａｑＭａｎ−タイプのプローブおよびＨＣＶ定量プローブと共に用いられる。しかしながら、本発明はＦＲＥＴドナー／クエンチャー系の使用に制限されることを意図しない。事実、ＦＲＥＴ系は、単に、本発明に用途を見出す可能なエネルギー移動系のサブセットであり（例えば、非蛍光エネルギー移動系は当分野で知られている）、本発明はいずれかの特定のＦＲＥに制限されない。いくつかの実施形態において、可溶性クエンチャーを用いるＦＲＥＴ系が利用される。
いくつかの実施形態において、ＦＲＥＴ標識系は、本発明のプローブ、例えば、ＴａｑＭａｎ−タイプのプローブおよびＨＣＶ定量プローブと共に用いられる。しかしながら、本発明はＦＲＥＴドナー／クエンチャー系の使用に制限されることを意図しない。事実、ＦＲＥＴ系は、単に、本発明に用途を見出す可能なエネルギー移動系のサブセットであり（例えば、非蛍光エネルギー移動系は当分野で知られている）、本発明はいずれかの特定のＦＲＥに制限されない。いくつかの実施形態において、可溶性クエンチャーを用いるＦＲＥＴ系が利用される。
本明細書中で用いるように、表現「可溶性アクセプター」または「可溶性クエンチャー」などとは、いずれかの他の分子に付着させず、かつかなり可溶性であるか、またはそうでなければいずれかの他の分子または固相に結合されないアクセプター部位をいう。いくつかの実施形態において、可溶性クエンチャーはＦＲＥＴ対の一部であり得、ここに、可溶性クエンチャーはＦＲＥＴクエンチャーであって、機能的ＦＲＥＴ対においてＦＲＥＴドナーと相互作用することができる。例えば、臭化エチジウムおよびいくつかのチアジン色素、例えば、メチレンブルー、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、チオニン、およびニューメチレンブルーを可溶性クエンチャーとして用いることができる。
チアジン色素可溶性クエンチャーは、二本鎖核酸に結合することによって作用するが、一本鎖核酸に対する低下した親和性を有する。いずれかの特定の理論に拘束されるつもりはないが、支配的な結合態様はインターカレーションを介するものであるが、配列の関係およびハイブリダイゼーション条件に応じて、従たるおよび主たる溝結合も可能であると考えられている（Ｒｏｈｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：２８６０−２８６６；およびＴｕｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６：７５４８−７５５６参照）。従って、標的ポリヌクレオチドとでハイブリダイゼーション複合体を形成するプローブに結合した蛍光ドナー標識は、プローブ上のドナー部位に対するクエンチャーの近接性により二本鎖核酸に対する親和性を有する可溶性クエンチャーをインターカレーティングすることによって、消光効果に従う。もしハイブリダイゼーション複合体を含有する溶液が（融解曲線分析におけるように）加熱されれば、プローブは、結局は、標的ポリヌクレオチドから解離され、それにより、核酸に対するクエンチャーの親和性を低下させ、その結果、プローブドナーに対する可溶性クエンチャーの近接性が低下し、ドナーからの蛍光が増加する。従って、反応におけるハイブリダイゼーション複合体の形成／解離は、可溶性ＦＲＥＴクエンチャーを有するＦＲＥＴ系の使用によってモニターすることができる。
特定のＨＣＶタイピング反応で用いられる可溶性クエンチャーの濃度は制限されず、効果的な濃度の範囲は当業者に明らかであろう。例えば、チアジン色素可溶性クエンチャーを用いる場合、いくつかの実施形態において、５μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬによって規定され、それを含む範囲が考えられる。いくつかの実施形態において、好ましい範囲は１０〜５０μｇ／ｍＬであり、あるいは１０〜２５μｇ／ｍＬである。別法として、依然として、チアジン色素可溶性クエンチャーの２５μｇ／ｍＬの濃度が用いられる。
閉じた系対開いた系のタイピングアッセイ
また、本発明は、ＨＣＶタイピングのための方法を提供し、また、同時ＨＣＶタイピングおよびＨＣＶ定量のための方法を提供する。ある実施形態において、ＨＣＶタイピングおよびＨＣＶタイピング／定量のための反応は「閉じたチューブ」システムである（実施例３および５参照）。
また、本発明は、ＨＣＶタイピングのための方法を提供し、また、同時ＨＣＶタイピングおよびＨＣＶ定量のための方法を提供する。ある実施形態において、ＨＣＶタイピングおよびＨＣＶタイピング／定量のための反応は「閉じたチューブ」システムである（実施例３および５参照）。
閉じたチューブシステムにおいては、各工程で必要な全ての試薬は分析の開始からチューブに存在させる。対照的に、「開いたチューブ」システムはＨＣＶタイピング分析の開始後における試薬またはさらなる成分の添加を必要とする。閉じたチューブシステムは開いたチューブシステムよりもある種の利点を有する。というのは、閉じたチューブのシステムはオペレーターの介入の必要性を低下させ、かなり平行した迅速なスループットを可能とするからである。また、閉じたチューブシステムは「キット」のような商業的適用ではかなり好ましい。というのは、キットの使用者に供される指令書はより簡単であり、より少数の工程を含み、かつ前記方法は、ユーザー−エラーまたは汚染が導入されかねない可能な機会がより少ないからである。幾つかの状況において、開いたチューブシステムは、例えば、不適合試薬の使用を可能とするのに有利であり得る。
例えば、本発明の幾つかの好ましい実施形態において、ＨＣＶタイピングおよびＨＣＶ定量同時分析は閉じたチューブシステムとして実行される。そのようなシステムにおいては、反応チューブ（または反応ウェルまたはチャンバー）は、開始から、例えば、ＨＣＶアンプリコンを生じさせるためのユニバーサルＲＴ−ＰＣＲプライマー、ＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド、ＨＣＶアンプリコン定量のためのＴａｑＭａｎ（登録商標）−タイプのプローブ、可溶性ＨＣＶタイピングプローブ（任意で、ここに、前記プローブは適当なＦＲＥＴ成分で標識されている）、および可溶性ＦＲＥＴクエンチャーを含むであろう。これらの試薬をチューブに入れて、反応は、ＨＣＶアンプリコン生産、ＨＣＶアンプリコン蓄積のリアルタイムモニタリング、およびＨＣＶタイプ同定のためのＨＣＶ融解曲線Ｔm分析に必要な全ての成分を有する。
キットおよび製品
本発明は製品、例えば、キット、特に、診断キットおよびＨＣＶゲノタイピングのためのキットを提供する。これらのキットは、本明細書中に記載された方法を用い、ＨＣＶ感染のタイピングに必要な材料を提供する。これらのキットは、ウイルスのタイプ（例えば、遺伝子型またはサブタイプ）に基づいて種々の処置に対する特定のＨＣＶ感染の応答性を予測するのに診療所においてＨＣＶタイピング情報を用いることができる臨床家のために用途を見出す。本発明は、本発明の方法、例えば、試料中のＨＣＶをタイピングするための方法を提供する。これらの方法を行うための材料および試薬は、本発明の実行を容易とするためにキットに供することができる。
本発明は製品、例えば、キット、特に、診断キットおよびＨＣＶゲノタイピングのためのキットを提供する。これらのキットは、本明細書中に記載された方法を用い、ＨＣＶ感染のタイピングに必要な材料を提供する。これらのキットは、ウイルスのタイプ（例えば、遺伝子型またはサブタイプ）に基づいて種々の処置に対する特定のＨＣＶ感染の応答性を予測するのに診療所においてＨＣＶタイピング情報を用いることができる臨床家のために用途を見出す。本発明は、本発明の方法、例えば、試料中のＨＣＶをタイピングするための方法を提供する。これらの方法を行うための材料および試薬は、本発明の実行を容易とするためにキットに供することができる。
いくつかの実施形態において、キットは診断キットであり、ここに、前記キットにより可能とされた方法を実行することから得られた情報を用いて、患者から採取された試料におけるＨＣＶ感染のタイプを同定する。
ある実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されたような、ＲＴ−ＰＣＲを使用する「閉じたチューブ」ＨＣＶゲノタイピングに適したキットを提供する。他の実施形態において、本発明は、ＨＣＶ定量と共にＲＴ−ＰＣＲを使用する閉じたチューブのＨＣＶタイピングに適したキットを提供する。
本発明のキットは、本明細書中に記載された方法で用いる合成オリゴヌクレオチドのいずれかまたは全てを提供することができる。例えば、前記キットは、ＨＣＶ ＲＮＡ分子からの逆転写の起点となって、ＨＣＶ ｃＤＮＡを生じさせるのに適したオリゴヌクレオチドプライマーを提供することができる。前記キットは、ＨＣＶゲノムのいずれかの適当な部分、例えば、５’−ＵＴＲドメイン中の配列の増幅に適した増幅プライマーを提供することができる。本発明は、本発明のキットに含めることができる適当なＨＣＶ増幅プライマーを提供する。本発明は本明細書中に引用されたプライマーに制限されないと理解される。というのは、いずれの他の適当な増幅プライマーもまた用途を見出すだろうからである。
本発明のキットは、ＨＣＶタイピング融解曲線分析に適したオリゴヌクレオチドプローブを含めることができる。本発明は、多数の適当なプローブ、例えば、図６に提供される機能的プローブを提供する。しかしながら、本発明のキットは図６に提供された機能的プローブに制限されないのは理解される。というのは、本発明はさらなる適当なプローブの同定および合成のためのガイダンスを供するからである。本発明のキットで提供されたプローブは標識することができ、または未標識とすることができる。任意で、本発明のキットで提供されたＨＣＶタイピングプローブは、当分野で知られているように、適当なＦＲＥＴドナー部位で標識することができる。任意で、本発明のキットで提供されたＨＣＶタイピングドナーは、ドナーおよびクエンチャー部位を共に含むＴａｑＭａｎ−タイププローブであり得る（この場合、可溶性クエンチャーは必要ではないであろう）。任意で、本発明のキットは適当な可溶性クエンチャー、例えば、ニューメチレンブルーのようなチアジン色素を含むことができる。任意で、いずれかの適当なＦＲＥＴ対系が本発明のキットで提供され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、ＨＣＶアンプリコン定量に適したオリゴヌクレオチドプローブ、例えば、ＨＣＶアンプリコン内に位置したＨＣＶ塩基配列に特異的なＴａｑＭａｎ−タイプのプローブを含むことができる。例えば、本発明は配列番号４１のＨＣＶプローブを提供する。しかしながら、本発明のキットはこの１つの定量プローブに制限されないと理解される。というのは、当業者であれば、本発明（および本発明のキット）がいずれかの適当な定量プローブを含むことができるのを認識するだろうからである。
加えて、本発明のキットは、例えば、限定されるものではないが、試料収集および／または試料増幅（例えば、血液試料からのＲＮＡの単離）のための装置および試薬、試料チューブ、ホールダー、トレイ、ラック、皿、プレート、キットユーザーに対する指令書、溶液、緩衝液または他の化学試薬、標準化、正規化のために用いられる適当な試料、および／または対照試料（例えば、陽性対照、陰性対照またはキャリブレーション対照）を含むこともできる。本発明のキットは、例えば、蓋を有する容器中にて便宜な貯蔵および出荷のためにパッケージングすることもできる。キットの成分はキット内の１つ以上の容器中で供することができ、成分は別々の容器中にパッケージすることができるか、あるいはいずれかの様式で組合すことができる。いくつかの実施形態において、本発明のキットは、適当な蛍光分光光度計で読むことができるマルチウェルプレートのような、複数試料の高スループット分析を容易とするための材料を提供することができる。
本発明の検出／相関システム
いくつかの実施形態において、本発明は、シグナルの検出をＣ型肝炎ウイルスタイプに相関させるための一体的システムを提供する。前記システムは収集されたデータを解釈し、分析するための機器および手段を含むことができ、特に、ここに、ＨＣＶタイプを誘導する手段はアルゴリズムおよび／または電子的に貯蔵された情報（例えば、収集された蛍光データ、所定のＨＣＶタイプ相関など）を含む。一体化されたシステムの各部分は機能的に相互連結しており、ある場合には、物理的に結合している。いくつかの実施形態において、一体化されたシステムは自動化され、そこでは、ＨＣＶタイピング分析の開始後にオペレーターによる試料または機器のいずれの操作についても要件はない。
いくつかの実施形態において、本発明は、シグナルの検出をＣ型肝炎ウイルスタイプに相関させるための一体的システムを提供する。前記システムは収集されたデータを解釈し、分析するための機器および手段を含むことができ、特に、ここに、ＨＣＶタイプを誘導する手段はアルゴリズムおよび／または電子的に貯蔵された情報（例えば、収集された蛍光データ、所定のＨＣＶタイプ相関など）を含む。一体化されたシステムの各部分は機能的に相互連結しており、ある場合には、物理的に結合している。いくつかの実施形態において、一体化されたシステムは自動化され、そこでは、ＨＣＶタイピング分析の開始後にオペレーターによる試料または機器のいずれの操作についても要件はない。
本発明のシステムは機器を含むことができる。例えば、本発明は蛍光ディテクター（例えば、蛍光分光光度計）のようなディテクターを含むことができる。ディテクターまたは複数ディテクターは本発明と組み合わせて用いて、例えば、（Ｔmを測定している場合の融解曲線分析の間における）ＨＣＶタイピングプローブとＨＣＶ標的アンプリコンとのハイブリダイゼーションをモニターし／測定し、任意で、（例えば、ＴａｑＭａｎ−タイプのプローブでの）ＨＣＶ定量の間にＨＣＶアンプリコンの蓄積を測定することができる。ディテクターは、ＨＣＶタイピングアッセイの高スループット能力を容易とするためのマルチウェルプレートリーダーの形態とすることができる。
いくつかの実施形態において、一体化されたシステムは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ反応の相の間に、またはＴmが測定されるべき場合の融解分析の間に、反応の温度を制御する目的で、サーマルサイクリングデバイス、またはサーモサイクラーを含む。いくつかの実施形態において、サーマルサイクリングデバイスおよびディテクターは一体化された機器であり、ここに、サーマルサイクリングおよび発光検出（例えば、蛍光検出）は同一デバイスで行われる。
分光光度計操作パラメーター（例えば、励起の波長および／または検出された発光の波長）を収集し、および／またはディテクターから収集されたデータ（例えば、融解曲線分析の間の蛍光測定）を貯蔵するために、ディテクター、例えば、蛍光分光光度計をコンピューターに連結することができる。前記コンピューターはサーマルサイクリングデバイスに作用可能式に連結して、システムにおける温度、タイミング、および／または温度変化の速度を制御することもできる。一体化されたコンピューターは「相関モジュール」を含むこともでき、ここでは、ディテクターから収集されたデータを分析し、試料のＨＣＶタイプを（電子的に）決定する。いくつかの実施形態において、相関モジュールは、ディテクターからの蛍光の予備に基づいてＴmを計算し、さらに、蛍光およびＴmのデータに基づいて未知の試料のＨＣＶタイプを誘導するコンピュータープログラムを含む。いくつかの実施形態において、相関モジュールは未知の試料のハイブリダイゼーション特性（例えば、Ｔm）を、既知のＨＣＶタイプについての値のデータベース（またはテーブル）と比較して、未知の試料のハイブリダイゼーション特性および未知の試料のＨＣＶタイプの間の相関を行う。
いくつかの実施形態において、システムにおける相関モジュールはＨＣＶのタイプを決定し、そこでは、タイプは５つの遺伝子型の１つ、または６つのサブタイプの１つから選択される。相関モジュールは、特徴の中でも、既知のＨＣＶタイプを含むハイブリダイゼーション複合体のハイブリダイゼーション特性についての実験的に予め決定された値を含むことができ、あるいは相関モジュールは既知のＨＣＶタイプを含むハイブリダイゼーション複合体のハイブリダイゼーション特性についての予測された値を含むことができる。別法として、相関モジュールは、未知のタイプのＨＣＶに関する実験試料と同時に得られた既知のＨＣＶタイプを含むハイブリダイゼーション複合体のハイブリダイゼーション特性についての実験的に決定された値に依拠することができる。
適当な相関モジュールおよび適当なプローブでもって、本発明のシステムはタイプを試料中のＨＣＶに帰属させ、ここに、前記タイプは５を超える遺伝子型から、好ましくは、１１つ以上もっと多くの遺伝子型から選択される。例えば、用いる機器に依存して、特定のハイブリダイゼーション複合体のＴmは可変程度の精度でもって決定することができる。例えば、１つの製造業者からのいくつかのＴm装置（組み合わせたサーマルサイクリング装置およびカップリングされた蛍光分光光度計は±１．０℃の精度を有することができ、他方、異なる製造業者からの第二の装置は±０．１℃の精度を有することができる。より感度の良い装置の使用は、もしＴm値が一緒に近くでクラスターとなっていれば、多数のＨＣＶタイプの識別を可能とする。同様に、適当な感度の装置を用い、試料中のＨＣＶのタイプを決定することができる潜在能力があり、ここに、７８以上と多くの既知のＨＣＶサブタイプがあるので、タイプは６をはるかに超えるサブタイプに帰属させることができる。
本発明のシステムは、ハイブリダイゼーション複合体の唯一の識別ハイブリダイゼーション特性としてのＴmの使用に制限されない。例えば、ＨＭＡ（ヘテロデュプレックス移動度分析）、ＤＨＰＬＣ（変性ＨＰＬＣ）、ＣＦＬＰ（切断断片長多形）、ＴＧＣＥ（熱的グラジエント毛細管電気泳動）；ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ヌクレアーゼ突然変異検出キット、およびＳＳＣＰ（一本鎖立体配座多形）は、全て、異なる特性を持つハイブリダイゼーション複合体を識別するのに用いることができ、従って、１つ以上のタイプ命名をＨＣＶ試料に帰属させるのに用いることができる。
本発明の典型的なシステムは１つ以上のＨＣＶタイピングプローブ（例えば、図６で提供された機能的プローブ参照）、１つ以上のＨＣＶ定量プローブ（例えば、配列番号４１の定量プローブ）、ＨＣＶ増幅に適したプライマー、（一体化されたサーマルサイクリング機器の有りまたは無しにて）適当なディテクター、相関モジュールを備えたコンピューター、およびシステムユーザーのための（電子的または印刷された）指令書を含むことができる。典型的には、前記システムは、ＨＣＶタイピングプローブおよび／またはＨＣＶ定量プローブの組からの１つ以上のシグナル出力を検出するように配置されたディテクターを含む。いくつかの実施形態において、ＨＣＶタイピングプローブおよびＨＣＶ定量プローブは同一シグナル出力を有し（従って、同一ディテクターを用いることができる）。いくつかの実施形態において、前記システムは、さらに、ＨＣＶタイピングまたはＨＣＶタイピング／定量分析で用いる試薬を含有することができる。これらは、限定されるものではないが、ＲＴ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、適当な緩衝液、汚染制御試薬（例えば、ｄＵＴＰおよび／またはＵＮＧヌクレアーゼ）、安定化剤、ｄＮＴＰ、可溶性クエンチャーなどの１つ以上を含むことができる。キットは、本発明の１つ以上のシステムと組み合わせて操作するように供給することができる。
光電子増倍管、分光光度計、ＣＣＤアレイ、スキャンニングディテクター、フォトチューブおよびフォトダイオード、顕微鏡ステーション、ガルボ−スキャン、ミクロ流体核酸増幅検出アプライアンスなどを含めた、広く種々のシグナル検出装置が入手可能である。ディテクターの正確な立体配置は、部分的には、ＨＣＶタイピングおよび／または定量プローブと共に使用される標識のタイプに依存するであろう。蛍光、リン光、放射能、ｐＨ、電荷、吸光度、ルミネセンス、温度、磁性などを検出するディテクターを用いることができる。典型的なディテクターの実施形態は光（例えば、蛍光）ディテクターまたは放射能ディテクターを含む。例えば、光発光（例えば、蛍光発光）または他のプローブ標識はマーカー対立遺伝子の存在または非存在の指標である。蛍光検出は、通常、増幅された核酸の検出で用いられる（しかしながら、上流および／または下流操作をアンプリコンで行うこともでき、これは他の検出方法を含むこともできる）。一般に、ディテクターはプローブ標識からの１つ以上の（例えば、光）発光を検出する。
ディテクターは、任意で、増幅反応からの１つまたは複数のシグナルをモニターする。例えば、ディテクターは、ＨＣＶ定量（ＴａｑＭａｎ−タイプ）プローブに関するように、「リアルタイム」増幅アッセイ結果に対応する光学シグナルをモニターすることができる。
検出されたシグナルをＨＣＶタイプ（例えば、遺伝子型またはサブタイプ）に相関させるシステム指令書もまた本発明の特徴である。例えば、指令書は、検出されたシグナルおよびＨＣＶタイプの間の相関を含む少なくとも１つの早見表を含むことができる。指令書の正確な形態は、システムの構成要素に依存して変化することができ、例えば、指令書はシステムの１つ以上の一体化されたユニット（例えば、マイクロプロセッサー、コンピューターまたはコンピューターリーダブル媒体）におけるシステムソフトウェアとして存在させることができ、あるいはディテクターに作用可能式にカップリングされた１つ以上のユニット（例えば、コンピューターまたはコンピューターリーダブル媒体）にて存在させることができる。前記したように、１つの典型的な実施形態において、システム指令書は検出されたシグナルおよびＨＣＶタイプの間の相関を含む少なくとも１つの早見表を含む。指令書は、典型的には、例えば、ユーザーが試料分析の結果を見ることができ、パラメーターをシステムに入力することができるようにするために、ユーザーインターフェースにシステムを供給する指示書も含む。
システムは、典型的には、例えば、自動システムにおいて、本発明の方法によって検出されたコンピューターリーダブルデータを貯蔵しまたは伝達するための構成要素を含む。コンピューターリーダブル媒体は、コンピューターコードの貯蔵のための、キャッシュメモリー、メインメモリーおよび貯蔵メモリーおよび／または他の電子データ貯蔵構成要素（ハードドライブ、フロッピー（登録商標）ドライブ、貯蔵ドライブなど）を含むことができる。本発明の方法によってＨＣＶタイプを表すデータもまた、イントラネットまたはインターネットまたはその組合せのようなネットワークにわたる伝達媒体に具体化されたコンピューターデータシグナルにて電子的に、光学的にまたは磁気的に伝達することができる。前記システムは、別法として、ワイアレス、ＩＲ、または他の利用可能な伝達代替物を介してデータを伝達することもできる。
操作の間に、システムは、典型的には、患者からの血液または血液産物のような、分析すべき試料を含む。試料を含む材料を単離し、または部分的に精製し、または精製することができる。いくつかの態様において、試料材料はＲＮＡ、ポリＡ ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅されたｃＤＮＡなどを含む。
本発明の関係でフレーズ「相関させるシステム」とは、コンピューターにエンターされるデータがコンピューターに対して外部である物体またはプロセスまたは特性、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、およびコンピューター内で入力シグナルの異なる出力シグナルへの変換を引き起こすプロセスに対応するシステムをいう。換言すれば、入力データ、例えば、ＴＭ融解曲線からの蛍光読みは出力データ、例えば、遺伝子型またはサブタイプのようなＨＣＶタイプに変換される。コンピューター内のプロセスは、指令の組、またはそれにより陽性増幅またはハイブリダイゼーションシグナルが一体化されたシステムによって認識され、ＨＣＶタイプとして個々の試料に帰属される「プログラム」である。さらなるプログラムは個々の試料の同一性を表現型値、例えば、統計学的方法に相関させる。加えて、計算するための多数のプログラム、例えば、ＧＵＩインターフェースのためのＣ／Ｃ＋＋、Ｄｅｌｐｈｉおよび／またはＪａｖａ（登録商標）プログラム、および関連ＨＣＶタイピングまたはＨＣＶ定量相関のチャーティングまたは創製早見表のための生産性ツール（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌおよび／またはＳｉｇｍａＰｌｏｔ）がある。本発明の一体化されたシステムの関係での他の有用なソフトウェアツールはＳＡＳ、Ｇｅｎｓｔａｔ、Ｍａｔｌａｂ、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ、およびＳ−Ｐｌｕｓのような統計学的パッケージ、およびＱＵ−ＧＥＮＥのような遺伝子モデリングパッケージを含む。さらに、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃのようなさらなるプログラミング言語もまた本発明の一体化されたシステムで適切に使用される。
例えば、特定のＨＣＶタイプに帰属されたＨＣＶタイピングプローブＴm値はコンピューターリーダブル媒体に記録することができ、それにより、ＴmをユニークなＨＣＶタイプ（またはＨＣＶタイプのサブセット）に対応させるデータを確立することができる。コンピューターリーダブル媒体にデータを記録するのに適した、いずれのファイルまたはホールダーも、カスタムメイドまたは（例えば、ＯｒａｃｌｅまたはＳｙｂａｓｅから）商業的に入手可能であるかを問わず、本発明の関係でデータベースとして許容することができる。本明細書中に記載されたＨＣＶタイプ分析に関するデータは、同様に、コンピューターアクセシブルデータベースに記録することができる。任意で、ＨＣＶタイプを決定するのに用いられるアッセイ（または複数アッセイ）の１つ以上の態様を自動化する一体化されたシステムを用い、ＨＣＶタイピングデータを得ることができる。そのようなシステムにおいて、ＨＣＶタイプに対応する入力データをディテクター、例えば、アレイ、スキャナー、ＣＣＤ、または他の検出デバイスから、中央プロセッシングユニットに接近可能なコンピューターリーダブル媒体中のファイルに直接リレーすることができる。次いで、ＴmおよびＨＣＶタイプの間の相関をコードする（典型的には、１つ以上のプログラムに埋められた）システム指令の組を計算デバイスによって実行して、ＴmおよびＨＣＶタイプの間の相関を同定することができる。
典型的には、システムは、例えば、ファイルを選択し、データを検索し、Ｔm値などのテーブルをレビューするためのキーボード、マウス、タッチスクリーンなどのようなユーザー入力デバイス、および統計学的分析の成果を考慮し、または回収するための出力デバイス（例えば、モニター、プリンターなど）を含むこともできる。
従って、１つの態様において、本発明は、所定のまたは実験的Ｔm値に対応する少なくとも１つのデータ組と共にファイルの組および／またはデータベースを含むコンピューターまたはコンピューターリーダブル媒体を含む一体化されたシステムを提供する。前記システムは、ユーザーが１つ以上のこれらのデータベースを選択的に考慮するのを可能とするユーザーインターフェースも含む。加えて、ワードプロセッシングソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄ（商標）またはＣｏｒｅｌ ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ（商標））およびデータベースまたはスプレッドシートソフトウェア（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（商標）、Ｃｏｒｅｌ Ｑｕａｔｔｒｏ Ｐｒｏ（商標）のようなスプレッドシートソフトウェア、またはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ａｃｃｅｓｓ（商標）またはＰａｒａｄｏｘ（商標）のようなデータベースプログラム）のような標準テキスト操作ソフトウェアをユーザーインターフェース（例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ（登録商標），Ｕｎｉｘ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ（登録商標）システムのような標準操作システムにおけるＧＵＩ）と組み合わせて用いて、対立遺伝子に対応する性質のストリング、またはデータベースの他の特徴を操作することができる。
前記システムは、任意で、例えば、ロボットデバイスを取り込む試料操作用の構成要素を含む。例えば、源から目的地へ、例えば、マイクロタイタープレートからアレイ基剤へ溶液（例えば、試料）を移すためのロボット液体制御アーマチャーを、任意で、デジタルコンピューターに（または一体化されたシステム中のさらなるコンピューター）に連結させる。データをデジタルコンピューターにエンターして、ロボット液体制御アーマチャーによる高スループット液体移動を制御しおよび、任意で、アーマチャーによる固体支持体への移動を制御するための入力デバイスは一体化されたシステムの特徴であり得る。多くのそのような自動ロボット流体取り扱いシステムは商業的に入手可能である。例えば、典型的には、例えば、ロボティクスおよび流体取り扱いモジュールを含む種々のＺｙｍａｔｅシステムを利用する種々の自動システムがＣａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）から入手できる。同様に、例えば、マイクロタイタートレイ操作のための種々の実験室的システムで用いられる通常のＯＲＣＡ（登録商標）ロボットもまた、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から商業的に入手可能である。慣用的なロボティクスに対する代替物として、流体取り扱いおよび検出を行うためのミクロ流体システムが、今日、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）およびＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から広く入手可能である。
従って、本発明のＨＣＶタイピングのためのシステムは、高スループット液体制御ソフトウェア、サーモサイクラー制御ソフトウェア、マーカーラベルからのデータを分析するためのイメージ分析ソフトウェア、データ解釈ソフトウェア、デジタルコンピューターに作用可能式に連結された目的地へ源から溶液を移動させるためのロボット液体制御アーマチャー、データをデジタルコンピューターにエンターして、ロボット液体制御アーマチャーによる高スループット液体移動を制御するための入力デバイス（例えば、コンピューターキーワード）および、任意で、標識されたプローブからの標識シグナルをデジタル化するためのイメージスキャナーの１つ以上を備えたデジタルコンピューターを含むことができる。イメージスキャナーはイメージ分析ソフトウェアとインターフェースして、ＨＣＶ増幅の間に、またはＨＣＶ融解曲線分析の間に、例えば、核酸プローブ標識強度の測定を供し、ここに、プローブ標識強度測定をデータ解釈ソフトウェアによって解釈して、標識プローブが標的にハイブリダイズするか、およびそのハイブリダイズする程度を示す。次いで、そのように誘導されたデータを試料強度と相関させて、特定の試料中のＨＣＶタイプを決定し、任意で、試料中のＨＣＶの負荷（例えば、濃度）を決定する。
まとめると、本発明は、従って、もし存在すれば、試料（例えば、ヒト血液またはヒト血清）中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプを決定するための方法に指向され、前記方法はａ）試料からのＨＣＶゲノムの部分を増幅し、それにより、少なくとも１つのアンプリコンを生じさせ；ｂ）アンプリコンを第一のプローブとハイブリダイズさせて、標的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここに：ｉ）第一のプローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であり；ｉｉ）ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；および、ｉｉｉ）第一のプローブ、および少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型、または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプのヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーション複合体は、ＨＣＶ遺伝子型またはＨＣＶサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有し；ｃ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を測定し、次いで、ｄ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性に基づいて、標的ハイブリダイゼーション複合体の測定された識別ハイブリダイゼーション特性をＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプと相関させることを含む。
前記本発明の方法の好ましい実施形態では、第一のプローブは配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含み、および／または第一のプローブは増幅工程の間に存在し、あるいは別法として、増幅工程の後に加える。さらに、第一のプローブのヌクレオチド配列は、ＨＣＶゲノムの５’−ＵＴＲまたはＮＳ５領域内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、あるいは部分的に相補的であるのが好ましい。第一のプローブは、好ましくは、ＦＲＥＴドナー、ＦＲＥＴクエンチャー、または双方を含む。第一のプローブはＦＲＥＴドナー部位を含み、ハイブリダイジング工程が第一のプローブを可溶性ＦＲＥＴクエンチャーと混合することを含むのがさらに好ましい。可溶性ＦＲＥＴクエンチャーは、例えば、チアジン色素である。
ＨＣＶ遺伝子型は、特に、遺伝子型１、２、３、４、５および６から選択され，ＨＣＶサブタイプは遺伝子型１、２、３、４、５および６のいずれかのサブタイプから、あるいは１ａ、１ｂ、１ｃ、２ａ、２ｂ、２ｃ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａから選択される。増幅の工程は、例えば、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって行われる。好ましくは、ＰＣＲは、配列番号３９および４０のヌクレオチド配列を含むプライマー対を用いる。
識別ハイブリダイゼーション特性は、通常、ＨＣＶのタイプを決定するための前記方法においては温度依存性ハイブリダイゼーション特性（例えば、融解温度（Ｔm））である。本発明の前記方法の測定工程は、ある範囲の温度において標的ハイブリダイゼーション複合体を検出し、それにより、標的ハイブリダイゼーション複合体のＴmを決定することを含む。本発明の方法の相関工程は、標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を、第一のプローブ、および少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性についての先に決定された値と比較することを含む。本発明の前記方法は、さらに、増幅工程の間におけるアンプリコンの蓄積の速度をモニターし、次いで、アンプリコン蓄積の速度をウイルス負荷と相関させることによって、試料中のＨＣＶのウイルス負荷を決定することを含む。前記モニタリング工程は、好ましくは、アンプリコン定量プローブを用いて行われる。アンプリコン定量プローブは配列番号４１および／またはＦＲＥＴドナー部位およびＦＲＥＴクエンチャー部位のヌクレオチド配列を含むのがさらに好ましい。そのような場合、増幅工程は、増幅工程の間にＦＲＥＴドナー部位によって発せられたシグナルを検出することを含む。
本発明のもう１つの実施形態は、試料（例えば、ヒト血液またはヒト血清）中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプを決定するための方法であり、前記方法は、ａ）ＨＣＶに由来する核酸を第一のプローブとハイブリダイズさせて、標的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここに：ｉ）前記第一のプローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、あるいは部分的に相補的であり；ｉｉ）ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は、少なくとも５つのＨＣＶゲノムまたは少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；および、ｉｉｉ）第一のプローブ、および少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプのヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーション複合体は、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有し；ｂ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を測定し；次いで、ｃ）標的ハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性に基づいて、標的ハイブリダイゼーション複合体の測定された識別ハイブリダイゼーション特性をＣ型肝炎ウイルスのタイプと相関させることを含む。前記方法の１つの好ましい実施形態では、第一のプローブは配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含む。
本発明のもう１つの主題は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブを含む組成物であり、ここに、プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶゲノムまたは少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；およびここに、プローブ、およびＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体は、遺伝子型またはサブタイプの各々を識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有する。前記組成物のプローブは、好ましくは、配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含む。識別ハイブリダイゼーション特性は融解温度（Ｔm）である。好ましい組成物は逆転写酵素、およびＨＣＶゲノムの逆転写の開始に適したプライマーを含む。
さらに好ましい組成物は、ａ）プローブ中のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むＨＣＶアンプリコン；ｂ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー；またはｃ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー対のいずれかである核酸を含み；ここに、プライマーおよびプライマー対は熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸および適当なＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液と混合される。もう１つのさらに好ましい組成物はａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチドに対して相補的であるか、または部分的に相補的であるＦＲＥＴドナー部位を持つプローブ、ここに、プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの間で配列不均一性を示し；およびここに、プローブおよび複数のＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプを含むハイブリダイゼーション複合体は少なくとも２つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも２つのＨＣＶサブタイプを識別する識別ハイブリダイゼーション特性を有し；およびｂ）チアジン色素を含む可溶性ＲＦＥＴクエンチャー、ここに、ＦＲＥＴクエンチャーはＦＲＥＴドナー部位を消光することができる；を含む。後者の組成物のプローブは、例えば、配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含む。識別ハイブリダイゼーション特性は、好ましくは、融解温度（Ｔm）である。
前記組成物は、逆転写酵素、およびＨＣＶゲノムの逆転写の開始に適したプライマーを含むことによってさらに修飾することができよう。本発明によると、前記組成物の好ましい実施形態はｃ）ｉ）プローブ中のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むＨＣＶアンプリコン；ｉｉ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー；またはｉｉｉ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー対のいずれかである核酸を含み；ここに、プライマーおよびプライマー組が熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸および適当なＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液と混合される。
本発明は、さらに、ａ）ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的である少なくとも１つの標的プローブ、ここに、標的プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々の間で配列不均一性を示し、および標的プローブ、およびＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体は異なる識別ハイブリダイゼーション特性を有し；およびｂ）標的プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性を測定するための指令書を含む、試料（例えば、ヒト血液またはヒト血清）中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプを決定するための診断キットに指向される。前記キットの標的プローブは、好ましくは、配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含む。前記診断キットは、さらにｃ）ＨＣＶアンプリコンを生じさせることができる増幅プライマー対、ここに、前記アンプリコンは標的プローブ中のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含み；およびｄ）アンプリコン定量プローブを含む。前記キットの増幅プライマー対は、好ましくは、配列番号３９および４０のプライマーを含む。前記キットのもう１つの好ましい実施形態は、アンプリコン定量プローブが配列番号４１のヌクレオチド配列を含むものである。前記キットの１つ以上の構成要素は１つ以上の容器にパッケージされるであろう。前記キットの標的プローブは、好ましくは、ＦＲＥＴ標識部位を含み、ここに、前記キットはチアジン色素を含む可溶性ＦＲＥＴクエンチャーを含む。診断キットは、さらに、逆転写酵素、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムからの逆転写酵素開始に適した少なくとも１つのプライマー、熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、遊離デオキシリボヌクレオチド三リン酸、標準化試料、陽性対照試料、陰性対照試料、酵素反応に適した緩衝液、試料収集チューブ、増幅反応チューブおよびマルチウェルプレートから選択される１つ以上のさらなる構成要素を含む。
本発明のもう１つの目的はシグナルの検出とＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タイプとを相関させるシステムであり、前記システムは、ａ）シグナルを検出するためのディテクター、ここに、前記シグナルはハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性と相関し、ここに、ハイブリダイゼーション複合体はＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または部分的に相補的であるプローブ、およびＨＣＶヌクレオチド配列を含むアンプリコンを含み；およびｂ）ディテクターに作用可能式にカップリングされた相関モジュール、ここに、相関モジュールは、シグナルを、ＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体の識別ハイブリダイゼーション特性に関連する先に測定されたシグナルと比較することによって、シグナルを、少なくとも１つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの１つと相関させる；を含む。識別ハイブリダイゼーション特性が融解温度（Ｔm）であって、相関モジュールが、プローブ、および少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体についての予測されたまたは実験的に測定されたＴm値のデータセットを含み、ここに、データセットがコンピューターリーダブルフォーマットである適当なシステムが好ましい。
実施例
以下の実施例は説明のために掲げるが、特許請求される発明を限定するものではない。当業者であれば、特許請求された発明の範囲から逸脱することなく、改変することができる種々の非臨界的パラメーター、および利用することができる代替試薬を認識するであろう。
以下の実施例は説明のために掲げるが、特許請求される発明を限定するものではない。当業者であれば、特許請求された発明の範囲から逸脱することなく、改変することができる種々の非臨界的パラメーター、および利用することができる代替試薬を認識するであろう。
実施例１
合成ＨＣ部位標的配列を用いるＨＣＶプローブ融解曲線分析（ＨＣＶタイピング）
本実施例は、（表１に示された）１つのＨＣＶタイピングプローブ、および６つの異なるＨＣＶタイプに由来する６つの合成鋳型を用いる融解曲線分析を記載する。少なくとも５つの遺伝子型および少なくとも６つのサブタイプを識別するためのこのプローブの有効性を評価した。
合成ＨＣ部位標的配列を用いるＨＣＶプローブ融解曲線分析（ＨＣＶタイピング）
本実施例は、（表１に示された）１つのＨＣＶタイピングプローブ、および６つの異なるＨＣＶタイプに由来する６つの合成鋳型を用いる融解曲線分析を記載する。少なくとも５つの遺伝子型および少なくとも６つのサブタイプを識別するためのこのプローブの有効性を評価した。
適当なＨＣＶタイピングプローブのコレクションを設計し、合成した。これらのプローブの各々は、少なくとも５つの異なる遺伝子型および少なくとも６つの異なるサブタイプの間で配列不均一性を示す、ＨＣＶゲノムの５’−ＵＴＲ内のドメインにハイブリダイズする（図５参照）。プローブＡＧ０２０３Ａを分析で用いた（図６に掲げたプローブ配列；および配列番号８参照）。プローブは単一のフルオレセイン（ＦＡＭ）標識を含んだ。このプローブは、別法として、種々のＨＣＶタイプに対応する６つの異なる合成一本鎖鋳型の各々とハイブリダイズした。これらの合成鋳型の配列は図５に示されたＨＣＶタイプコンセンサス配列の逆構成要素であり；これらの合成鋳型は以下の表１に示される。
プローブを以下の条件下で６つの別々の反応において６つの合成鋳型の各々にアニールさせた。
本反応混合物は融解分析のみで用いたが、それはＲＴ−ＰＣＲ ＨＣＶタイピング分析を刺激するためのさらなる成分も含有した。例えば、遊離ヌクレオチド、増幅プライマー、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）ヌクレアーゼ、ＺＯ５ポリメラーゼおよびＥＤＴＡは融解分析で必要なかったが、そうでなければ、ＲＴ−ＰＣＲ反応で存在させるであろう。
融解分析では、種々のハイブリダイゼーション混合物を２分間で９５℃まで加熱し、続いて、２０℃まで冷却してアニーリングさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させた。次いで、ハイブリダイゼーション複合体を含有する反応をほぼ７６サイクルで加熱し、ここに、各サイクルは３０秒間で温度１℃を上昇させる。蛍光を各３０秒のサイクルの最後に５０ミリ秒測定した。融解反応を９６ウェルマイクロタイタープレートで実行し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＲＴＭ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて蛍光をモニターした。蛍光は、２０ｎｍのバンド幅にて４８５ｎｍにおける励起フィルター、および１０ｎｍバンド幅にて５２０ｎｍの発光フィルターを用い、本実験（およびＦＡＭ−標識プローブを用いる全ての実験）で測定した。
ミックス中のハイブリダイゼーション複合体の形成／解離を、ＦＲＥＴ系を用いることによってモニターした。プローブに共有結合したＦＡＭ標識は適当なドナー発光を与えた。消光作用は可溶性ＦＲＥＴアクセプターニューメチレンブルーによって供された（図８参照）。ニューメチレンブルーは、チアジン色素構造に基づいた可溶性クエンチャーのファミリーのメンバーである。ニューメチレンブルークエンチャーは二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性を有し、それにより、プローブが標的とのデュプレックス構造である場合、プローブ上の蛍光標識に対するその近接性により消光効果をもたらす。しかしながら、可溶性クエンチャーは一本鎖ＤＮＡに対する親和性を低下させた。従って、プローブを含むハイブリダイゼーション複合体を含有する溶液を加熱し、結局は解離させる場合、核酸に対するクエンチャーの親和性は低下し、蛍光が増加する。前記ニューメチレンブルー可溶性クエンチャーは、一般に、０〜２５μｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度で用いた。可溶性クエンチャーの最適濃度は経験的に決定した。重要なことには、Ｔm値の分解能（すなわち、種々のＨＣＶタイプの間のＴm値の間のより大きな分離）は、可溶性クエンチャー濃度を変化させることによっていくつかのＨＣＶタイピングプローブで改良することができるのが観察された。
蛍光データは、（サーマルサイクル数の関数である）温度の関数として蛍光値をプロットすることによってグラフにより示すことができる。この場合、図９において、蛍光値はパーセント蛍光であり、ここに、パーセント蛍光は、実験的に測定された蛍光を、いずれものＨＣＶ標的配列の非存在下で、かついずれもの可溶性クエンチャーの非存在下で、一本鎖ＡＧ０２０３Ａプローブのみを含有する対照チューブ中での蛍光値と比較することによって決定され、ここに、対照チューブは実験チューブと同一温度におけるものである。
図９に示すように、６つの別々の実験（１つは、ＡＧ０２０３Ａプローブおよび各ＨＣＶ合成鋳型を用いる各融解分析についての実験）の結果を同一プロットに重ねた。分かるように、各プローブ／鋳型複合体は加熱に際して区別される解離プロフィールを与えた。
図９におけるデータは、同一データの第一微分プロットを用いることによってより容易に解釈し（定量する）ことができる。図１０は、第一微分プロットとしての図９におけるデータを示す。各曲線のピークは、特定のハイブリダイゼーション条件におけるハイブリダイゼーション複合体のＴmを表す。分かるように、各ＨＣＶ遺伝子型についてのＴmはグラフ上で容易に識別することができる。
合成鋳型をｄＴの代わりにｄＵを用いて合成した以外は、同一プローブおよびＨＣＶ合成鋳型を用いることによってこの分析を反復した。これは潜在的に有用な実験適用である。というのは、それはＵＮＧヌクレアーゼシステムを用いることによって実験の間でキャリー−オーバー汚染の排除を可能とするからである。その実験からの結果は、テストした６つのＨＣＶ遺伝子型合成鋳型の間の同等に成功した区別を示した（１ａ、２ａ／ｃ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａ；データは示さず）。
６つの遺伝子型を成功して識別したＡＧ０２０３Ａプローブに加えて、前記したように、同一５’−ＵＴＲ領域にハイブリダイズする合計３９の他のプローブもまた設計し、テストした。それらの３９のプローブのうち、２０は、Ｔm差に基づいて、６つの異なるＨＣＶ遺伝子型（１ａ、２ａ／ｃ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａ）を実験的に区別することができ（図６においては「機能的プローブ」と呼ぶ）。３９のプローブのうち１８は、それらは６つの遺伝子型を識別することができるというイン・シリコ予測にもかかわらず、合成鋳型またはＲＴ−ＰＣＲ−作成アンプリコンいずれかを使用する実験において全ての６つのＨＣＶ遺伝子型の間を識別することができなかった。（非機能的プローブともいわれる）これらの成功しなかったプローブ配列のいくつかの例もまた図６に掲げる。図６におけるプローブのいくつかについての予測されたおよび実験的に観察されたＴm値の比較を図７に示す。実験的に観察されたＴm値は、インビトロ転写されたＨＣＶゲノム材料からのＲＮＡ鋳型から生じたＲＴ−ＰＣＲアンプリコンを用いて融解分析実験で得られた。
図６に掲げた成功したプローブ配列の比較は、相対的融解挙動（および、その結果としての、Ｔm）が配列の長さを変化させることによって、または修飾された塩基（例えば、５−プロピニル−ｄＵおよび５−Ｍｅ−ｄＣ）を加えることによって修飾することができることを示す。例えば、ＨＣＶタイピングプローブＡＧ０３０７ＤおよびＡＧ０３０７Ｎは、共に、５−プロピニル−ｄＵおよび５−Ｍｅ−ｄＣを含有し、双方のプローブは少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型および少なくとも６つのＨＣＶサブタイプを効果的に分解する。
実施例２
タイピング試薬のＰＣＲ後添加と共にＲＴ−ＰＣＲ ＨＣＶアンプリコンを用いるＨＣＶプローブ融解曲線（ＨＣＶタイピング）
本実施例は、ＲＴ−ＰＣＲによって生じたＨＣＶアンプリコンを用い、続いて、ＨＣＶタイピング融解曲線試薬を加える融解曲線ＨＣＶタイピング分析を記載する。このシステムは「開いたチューブ」システムと考えられる。というのは、実験は、（タイピングプローブを含めた）タイピング試薬を加えるのにＲＴ−ＰＣＲ反応産物への接近を必要とするからである。実施例１で首尾よく用いられたＡＧ０２０３Ａ−ＦＡＭプローブを本実施例で用いる。少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つの異なるＨＣＶサブタイプを識別するためのこのプローブの有効性は、ＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅によって生じたテスト物質を用いて評価した。
タイピング試薬のＰＣＲ後添加と共にＲＴ−ＰＣＲ ＨＣＶアンプリコンを用いるＨＣＶプローブ融解曲線（ＨＣＶタイピング）
本実施例は、ＲＴ−ＰＣＲによって生じたＨＣＶアンプリコンを用い、続いて、ＨＣＶタイピング融解曲線試薬を加える融解曲線ＨＣＶタイピング分析を記載する。このシステムは「開いたチューブ」システムと考えられる。というのは、実験は、（タイピングプローブを含めた）タイピング試薬を加えるのにＲＴ−ＰＣＲ反応産物への接近を必要とするからである。実施例１で首尾よく用いられたＡＧ０２０３Ａ−ＦＡＭプローブを本実施例で用いる。少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つの異なるＨＣＶサブタイプを識別するためのこのプローブの有効性は、ＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅によって生じたテスト物質を用いて評価した。
ＲＴ−ＰＣＲによってＨＣＶアンプリコンを生じさせるための鋳型ＲＮＡは、タイプ１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａに対応するＨＣＶゲノム材料インサートを運ぶプラスミドからのインビトロ転写によって誘導した。これらのインサートの配列は、タイプ２ａを除いて、図５に記載された各タイプの各々のコンセンサス配列に対応する。ＨＣＶタイプ２ａクローン化インサートは、ＡＧ０２０３Ａ−ＦＡＭプローブによって標的化された５’−ＵＴＲドメインにおいて１つのヌクレオチド変異を有するタイプ２ａ疑似種変種である。このタイプ２ａ変種の５’−ＵＴＲ配列の関連部分は図５および配列番号４２に掲げる。ＨＣＶゲノム配列を単離し、サブクローンするのに用いる材料は患者試料であった。インビトロ転写に続き、オリゴ−ｄＴ−セファロースクロマトグラフィーによってＲＮＡを精製した。各プラスミドインサートの遺伝子型／サブタイプは配列決定を含めた他のアッセイを用いて先に確認した。
用いたＲＴ−ＰＣＲ条件は以下の通りであった：
ＲＴ−ＰＣＲサーマルサイクリング条件は図１８に示す。反応を５０℃におけるＵＮＧ脱汚染工程で開始して、ｄＵ含有ポリヌクレオチドによるいずれのキャリー−オーバー汚染も排除した。次いで、逆転写酵素反応を５９℃で行い、そこでは、ＰＣＲ増幅プライマーの１つは逆転写の起点ともなる。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、示されたＨＣＶタイプの各々に対応するクローン化されたＨＣＶゲノム材料を運ぶプラスミドのインビトロ転写に由来するＲＮＡ転写体を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応で用いた増幅プライマーを示す。
ＲＴ−ＰＣＲ反応は非対称反応であり、ここに、増幅プライマーの１つは反対プライマーよりも５倍過剰であり、その結果、ＨＣＶタイピングプローブにハイブリダイズするであろうＨＣＶゲノム鎖の増幅の過剰豊富性がもたらされた。示されたプライマーでの増幅は、ほぼ２００塩基アンプリコンを生じた。
ＲＴ−ＰＣＲサーマルサイクリングプログラムに続き、以下の試薬を融解分析開始の前に反応に加えた。ＥＤＴＡを反応に加えて、Ｍｇを隔離し、それにより、ＺＯ５ポリメラーゼを不活化した。
ＡＧ０２０３Ａ−ＦＡＭプローブを、種々のＨＣＶタイプに対応する６つの異なるＨＣＶアンプリコンの各々での融解曲線分析で用いた。融解分析は、実施例１に記載されたのと同一サーマルサイクリングおよび蛍光測定条件を用いた。
融解分析の収集された蛍光データを、図１１に示すように、温度の関数としての生蛍光のプロットにてグラフで示す。６つの別々の実験（ＡＧ０２０３Ａプローブおよび各ＨＣＶアンプリコンを用いる各融解分析のための実験）の結果を同一プロットに重ねた。理解できるように、各プローブ／鋳型は過熱に際して区別される解離プロフィールを与えた。
図１２は、温度の関数としての第一微分プロットを用いて提示された図１１におけるデータを示す。図１２における各曲線のピークはそれらの特定のハイブリダイゼーション条件におけるハイブリダイゼーション複合体のＴmを表す。理解できるように、各ＨＣＶ遺伝子型についてのＴmを微分し、グラフ上で他のピーク（Ｔm値）と区別することができる。
この分析は、全て、同一ＲＴ−ＰＣＲ条件および融解曲線分析を用い、同一ＨＣ部位 ＲＴ−ＰＣＲアンプリコンおよびプローブＡＧ０５０３Ａ、ＡＧ０３０５Ｂ、ＡＧ０５０３Ｄ、ＡＧ０５０３Ｅ、ＡＧ０５０３Ｆ、ＡＧ０５０３Ｇ、およびＡＧ０５０３Ｈを用いて反復した。この分析からの結果は、プローブＡＧ０５０３Ｄ、ＡＧ０５０３ＥおよびＡＧ０５０３Ｆを用いる、６つのＨＣＶ遺伝子型（１、２、３、４、５および６）およびサブタイプ（１ａ／ｂ、２ａ／ｃ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａ）の間の成功した識別を示した。プローブＡＧ０５０３Ａ、ＡＧ０３０５Ｂ、ＡＧ０５０３ＧおよびＡＧ０５０３ＨはＨＣＶタイプ２ａおよび３ａの間を区別することができなかった。
実施例３
閉じたチューブシステムにおけるＲＴ−ＰＣＲ ＨＣＶアンプリコンを用いるＨＣＶプローブ融解曲線（ＨＣＶタイピング）
本実施例は融解曲線ＨＣＶタイピング分析を記載し、ここに、ＨＣＶ標的材料はＲＴ−ＰＣＲ増幅反応によって生じたアンプリコンであり、さらに、ここに、ＲＴ−ＰＣＲおよび融解曲線分析は、試薬のいずれのさらなる操作、例えば、ＨＣＶタイピングプローブの添加の必要性なしで単一反応ミックス中で行われる。このシステムは「閉じたチューブ」システムと考えられる。というのは、反応混合物は外部サーモサイクリング条件および蛍光測定以外のいずれのさらなる操作も必要としないからである。多数のプローブをこの分析で用いた。ＲＴ−ＰＣＲによって生じた種々のＨＣＶアンプリコンを識別するための種々のプローブの効率を評価した。
閉じたチューブシステムにおけるＲＴ−ＰＣＲ ＨＣＶアンプリコンを用いるＨＣＶプローブ融解曲線（ＨＣＶタイピング）
本実施例は融解曲線ＨＣＶタイピング分析を記載し、ここに、ＨＣＶ標的材料はＲＴ−ＰＣＲ増幅反応によって生じたアンプリコンであり、さらに、ここに、ＲＴ−ＰＣＲおよび融解曲線分析は、試薬のいずれのさらなる操作、例えば、ＨＣＶタイピングプローブの添加の必要性なしで単一反応ミックス中で行われる。このシステムは「閉じたチューブ」システムと考えられる。というのは、反応混合物は外部サーモサイクリング条件および蛍光測定以外のいずれのさらなる操作も必要としないからである。多数のプローブをこの分析で用いた。ＲＴ−ＰＣＲによって生じた種々のＨＣＶアンプリコンを識別するための種々のプローブの効率を評価した。
ＲＴ−ＰＣＲによってＨＣＶアンプリコンを生じさせるための鋳型ＲＮＡは、遺伝子型１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａに対応するＨＣＶゲノム材料インサートを運ぶプラスミドからインビトロ転写によって誘導した。インビトロ転写に続き、オリゴ−ｄＴ−セファロースクロマトグラフィーによってＲＮＡを精製した。
単一遺伝子型／融解分析反応は以下のように確立された：
非対称ＲＴ−ＰＣＲ反応は前記反応ミックスを用い、図１８に示したサーマルサイクリング条件で実施した。これらのサーマルサイクリング条件の結果、ＨＣＶアンプリコンがＲＴ−ＰＣＲ増幅されたが、また、融解曲線分析に直接進行した。図１３に記載された実験において、ＡＧ０２０３Ａ−ＦＡＭプローブを、別法として、種々のＨＣＶタイプに対応する６つの異なるＨＣＶアンプリコンの各々で融解曲線分析にて用いた。融解分析は、実施例１に記載したのと同一のサーマルサイクリングおよび蛍光測定条件を用いた。
融解分析の収集された蛍光データは、温度の関数としての蛍光の第一微分プロットにて図１３にグラフで示す。６つの別々のＲＴ−ＰＣＲおよび融解分析（全てＡＧ０２０３Ａ−ＦＡＭプローブを用いる各ＨＣＶゲノムアンプリコンについてのもの）の結果を同一プロットに重ねた。理解できるように、各プローブ／アンプリコンは区別されるＴmを与えた。
同一ＲＴ−ＰＣＲ条件および融解曲線分析パラメーターを用いるこの閉じたチューブＨＣＶゲノタイピングシステムにおいて他のプローブも用いた。さらなるプローブの結果を、第二の微分プロットを用いる図４（プローブＡＧ０３０７Ｍ；配列番号１４）および図１５（プローブＡＧ０３０７Ｄ；配列番号１３）に示す。これらの２つのプローブ配列も図６に掲げる。これらの図面で理解できるように、これらの２つのプローブは、サーマルサイクリングおよび蛍光測定機器の精度内で識別できるＨＣＶタイプの各々でＴm値を生じた。
実施例４
ＨＣＶタイピングプローブ融解曲線に対する標的コピー数（ウイルス負荷）の効果
本実施例は、ウイルス標的鋳型濃度の広い範囲にわたってＨＣＶタイピングアッセイの精度を確認するように設計した。（ウイルス鋳型およびＨＣＶタイピングプローブを含む）ＨＣＶハイブリダイゼーション複合体融解温度（Ｔm値）に対する変化させるＨＣＶ鋳型濃度（コピー数）の効果を分析した。
ＨＣＶタイピングプローブ融解曲線に対する標的コピー数（ウイルス負荷）の効果
本実施例は、ウイルス標的鋳型濃度の広い範囲にわたってＨＣＶタイピングアッセイの精度を確認するように設計した。（ウイルス鋳型およびＨＣＶタイピングプローブを含む）ＨＣＶハイブリダイゼーション複合体融解温度（Ｔm値）に対する変化させるＨＣＶ鋳型濃度（コピー数）の効果を分析した。
１つの実験において、ＨＣＶサブタイプ１ａ ＲＴ−ＰＣＲアンプリコン標的での融解分析において、プローブＡＧ０２０３Ａ−ＦＡＭを用いた。標的のコピー数を反応当たり１，０００コピー〜反応当たり１，０００，０００コピーの範囲で変化させ、他方、遺伝子型プローブの濃度は一定のままとした。アッセイは、２５μｇ／ｍＬの濃度におけるメチレンブルー可溶性クエンチャーを用いた。ＲＴ−ＰＣＲおよび融解曲線分析は、実施例３に記載したのと同一プロトコルを用いて組み合わされた閉じたチューブのシステムで行った。
この分析の結果は図１６に示す。この図面で理解できるように、Ｔm値は、鋳型濃度における１，０００倍範囲の関数として比較的小さな１．２５℃間隔にわたって変化し、ここに、より小さな標的濃度においてＴmの小さな減少がある。以前観察された異なるＨＣＶタイプの間のかなり大きなＴm差を考慮すると、この変動は十分に許容される範囲内にあった。
図１６に示された実験は、遺伝子型５ａおよび６ａに対応する含まれたＨＣＶ標的まで拡大し、これは、複数ＨＣＶタイプを用いてＴmに対する鋳型濃度（すなわち、コピー数）の効果を評価するために行った。このより広い実験において、プローブＡＧ０２０３Ａ−ＦＡＭを再度用いた。反応当たり１０3、１０4、１０5および１０6コピーであった４つの鋳型濃度を用いて、各ＨＣＶタイプをテストした。ＲＴ−ＰＣＲおよび融解曲線分析は、実施例３に記載したのと同一プロトコルを用い、組み合わされた閉じたチューブのシステムで行った。メチレンブルー可溶性クエンチャーは２５μｇ／ｍＬで用いた。この融解分析からの結果を図１７に示す。図１７に示されたグラフは図１６に示された実験のより広い図面である。
理解できるように、１つのＨＣＶタイプ内の各濃度のＴmはわずかに変化したが、異なるタイプの融解点は全て十分に識別された。Ｔmは入力標的ＲＮＡコピー数に幾分依存するが、示された３つの遺伝子型は標的濃度の４つのｌｏｇ範囲にわたって容易に識別される。
実施例５
単一の閉じたチューブアッセイシステムにおける同時ＨＣＶタイピングおよびウイルス定量
本実施例は、単一の閉じたチューブ反応におけるＨＣＶウイルス負荷（すなわち、ＨＣＶ定量）およびＨＣＶタイプの同時測定のための方法を記載する。
単一の閉じたチューブアッセイシステムにおける同時ＨＣＶタイピングおよびウイルス定量
本実施例は、単一の閉じたチューブ反応におけるＨＣＶウイルス負荷（すなわち、ＨＣＶ定量）およびＨＣＶタイプの同時測定のための方法を記載する。
ＨＣＶタイピングは、すなわち、ＲＴ−ＰＣＲ反応においてＨＣＶアンプリコンを生じさせ、続いて、（図６に掲げたような）適当なＨＣＶタイピングプローブを用いて融解曲線分析を行うことによって実施例３に記載したようにして達成される。ＨＣＶ定量は、（インビトロ転写産物に由来する）ＨＣＶ ＲＮＡ試料からのＲＴ−ＰＣＲによって生じたＨＣＶアンプリコンの蓄積をモニターする５’−ヌクレアーゼアッセイで用いるのに適したプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）を含めることによって同一反応チューブで行う。このアプローチは、一旦反応ミックスが作成されたならば、いずれの精製工程または補充的成分の添加も必要としない「閉じたチューブ」のシステムとして理想的には適用することができる。
単一の閉じたチューブ定量／タイピング／融解分析反応は以下のように確立した：
最初の実験において、ＲＴ−ＰＣＲ、ＨＣＶ定量およびＨＣＶタイピング（融解曲線）を組み合わせた「閉じたチューブ」反応を、前記したように確立した。前記反応は、反応当たり１，０００（１０3）〜１，０００，０００（１０6）コピーの範囲の４つの異なる鋳型濃度においてＨＣＶサブタイプに対応する単一ＲＴ−ＰＣＲ鋳型を用いた。反応で用いたサーマルサイクリングプログラムは図１８に掲げる。
実験から収集された蛍光データを図１９に示す。蛍光データはサイクル数の関数として相対的蛍光として示す。相対的蛍光は、各サイクルにおける観察された蛍光値を、（基礎またはバックグラウンド蛍光と考えられる）サイクル１０〜１５の間で測定された蛍光値の各々を平均することによって得られた蛍光値で割ることによって計算される。このグラフは任意の蛍光レベル（ＡＦＬ）も示す。蛍光シグナルがいくつかの任意レベル（ＡＦＬ）を超えるＰＣＲサイクルは閾値サイクル（ＣT）である。入力コピー数はＣTに逆比例する。
Ｒｔ−ＰＣＲはインビトロ転写によって生じたＨＣＶタイプ１ａ ＲＮＡ鋳型を用いた。前記反応は増幅プライマーＳＴ２８０ＡＴＢＵＡ１（配列番号３９）およびＳＴ７７８ＡＡＴＢＡ１（配列番号４０）、およびＴａｑＭａｎプローブＳＴ６５０ＡＡＦＢＨＱ２（配列番号４１）も含んだ。非対称ＲＴ−ＰＣＲ反応は、前記反応ミックスを用い、かつ図１８に示されたサーマルサイクリング条件で実行した。ＴａｑＭａｎプローブを含めると、ＲＴ−ＰＣＲの間に蓄積のリアルタイムモニタリングおよびＨＣＶアンプリコンの定量を可能とした。ＴａｑＭａｎプローブからの蛍光は、５８℃の相における５０サイクルで各ＰＣＲ増幅サイクルの間に５０ミリ秒の間測定した。
ＲＴ−ＰＣＲからのＨＣＶアンプリコンの生成に続き、サーマルサイクリングは融解曲線分析に直接進めた。ＨＣＶタイピング融解曲線分析はニューメチレンブルー可溶性クエンチャーと共にＡＧ０３０８Ｆ ＨＣＶタイピングプローブを用いた。各コピー数分析の結果を、図１９における合計４つのプロットに対して、同一グラフ上に重ねる。グラフで理解できるように、各ＨＣＶ １ａ鋳型濃度は区別されるＣT値を与えた。
図２０は、第一微分プロットを用い、図１９に記載したのと同一の閉じたチューブの組み合わせたＲＴ−ＰＣＲ、ＨＣＶ定量およびＨＣＶタイピング（融解曲線）分析の結果を含むグラフを掲げる。図２１は、第二の微分プロットを用いる、図１９に記載したのと同一の閉じたチューブの組み合わせたＲＴ−ＰＣＲ、ＨＣＶ定量およびＨＣＶタイピング（融解曲線）分析の結果を含むグラフを掲げる。この第二の微分プロットにおいては、各鋳型濃度に対することなるＣT値を明瞭に識別することができた。ＨＣＶサブタイプ１ａを各試料で用いたので、融解温度（Ｔm）は各試料について同一またはほとんど同一である。各ハイブリダイゼーション複合体のＴmは、グラフがｙ−軸上の０と交わる点において、（サイクル数５０後の）グラフの融解曲線部分におけるサイクル数から２６を差し引くことによって決定することができる。
図２２は、各々が反応当たり１０6コピーの鋳型濃度を用い、ＨＣＶサブタイプ１ａ／ｂ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａおよび６ａに対応するＲＴ−ＰＣＲ鋳型を用いる「閉じたチューブ」の組み合わせたＲＴ−ＰＣＲ、ＨＣＶ定量およびＨＣＶタイピング（融解曲線）分析の結果を含むグラフを掲げる。データは、サイクル数の関数として第一微分プロットで示される。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、前記したように、ＨＣＶ ＲＮＡ鋳型、増幅プライマーＳＴ２８０ＡＴＢＵＡ１（配列番号３９）およびＳＴ７７８ＡＡＴＢＡ１（配列番号４０）、およびＴａｑＭａｎプローブＳＴ６５０ＡＡＦＢＨＱ２（配列番号４１）を用いた。ゲノタイピング融解曲線分析は、２５μｇ／ｍＬで用いたニューメチレンブルー可溶性クエンチャーと共にＡＧ０３０８Ｆ ＨＣＶタイピングプローブ（配列番号１６）を用いた。各サブタイプ分析の結果を、合計６つのプロットにつき、同一グラフに重ねる。
図２３は、第二の微分プロットを用いる、同一の閉じたチューブの組み合わせられたＲＴ−ＰＣＲ、ＨＣＶ定量およびＨＣＶゲノタイピング（融解曲線）分析の結果を含むグラフを掲げる。
図２４は、図２３に示されたグラフのＨＣＶタイピング融解曲線部分の詳細な図を掲げる。各ハイブリダイゼーション複合体のＴmは、グラフがｙ−軸上の０と交わる点において、（サイクル数５０後の）グラフの融解曲線部分におけるサイクル数から２６を差し引くことによって決定することができる。第二の微分プロットのこの拡大された部分で理解できるように、各ＨＣＶタイプは明瞭に分解されたＴm値を与える。
この同一分析は、前記したように、１０の他のＨＣＶタイピングプローブ（後にリストする）および同一の試薬およびサーマルサイクリング条件を用いて首尾よく反復された。
これらのプローブは、閉じたチューブのＨＣＶ定量およびＨＣＶタイピング分析において、少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型ならびに少なくとも６つのＨＣＶサブタイプを区別することができたことが観察された。
これらの実験で理解できるように、単一の閉じたチューブの反応系においてＨＣＶ定量分析をＨＣＶタイピングと組み合わされることが可能であり、ここに、ＲＴ−ＰＣＲ、定量（ＴａｑＭａｎ）分析およびＨＣＶタイピング（融解分析）に必要な全ての試薬は、修飾（例えば、精製またはさらなる成分）を必要としない１つの反応混合物に含める。これらの反応の進行はサーマルサイクリング条件によって調節され、適当な反応容器の使用は、試料アリコットを除去することなく反応容器において直接的に蛍光の読みを可能とする。
実施例６
ヌクレオチド配列
本実施例は、本発明の記載で引用されたヌクレオチド配列を掲げる。以下の表２に掲げた配列は、例のみを掲げるつもりであり、本発明が表２において以下に掲げられた配列に断じて限定されることは意図されない。
ヌクレオチド配列
本実施例は、本発明の記載で引用されたヌクレオチド配列を掲げる。以下の表２に掲げた配列は、例のみを掲げるつもりであり、本発明が表２において以下に掲げられた配列に断じて限定されることは意図されない。
明瞭性および理解の目的で、これまでの発明を幾分詳細に記載してきたが、当業者には、この開示を読むと、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態および詳細の種々の変化をなすことができるのは明らかであろう。例えば、前記した全ての技術および装置は種々の組合せで用いることができる。本出願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の書類は、あたかも各個々の刊行物、特許、特許出願および／または他の書類がここに引用して全ての目的で個々に一体化されるよう示されるのと同一程度まで、ここに引用してその全体が全ての目的で一体化される。
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- もし存在すれば、試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプ及びＨＣＶウイルス負荷を決定する単一の閉じたチューブ方法であって：
ａ）試料からのＨＣＶゲノムの部分を非対称ＰＣＲにより増幅し、それにより、限定的アンプリコン鎖及び過剰なアンプリコン鎖を生じさせ；
ｂ）前記限定的アンプリコン鎖を定量プローブとハイブリダイズさせて、前記限定的アンプリコン鎖を定量し、
ｃ）前記過剰なアンプリコン鎖をＨＣＶタイピングプローブとハイブリダイズさせて、標的ハイブリダイゼーション複合体を形成し、
ｉ）前記ＨＣＶタイピングプローブはＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるかまたは部分的に相補的であり；
ｉｉ）前記ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；そして
ｉｉｉ）前記ＨＣＶタイピングプローブおよび前記少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または前記少なくとも６つのＨＣＶサブタイプのヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーション複合体は、ＨＣＶ遺伝子型またはＨＣＶサブタイプの各々を識別する温度依存性ハイブリダイゼーション特性を有し；
ｄ）前記標的ハイブリダイゼーション複合体の温度依存性ハイブリダイゼーション特性を測定し；そして、
ｅ）前記標的ハイブリダイゼーション複合体の温度依存性ハイブリダイゼーション特性に基づいて、標的ハイブリダイゼーション複合体の測定された温度依存性ハイブリダイゼーション特性をＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプと相関させる；
ことを含む、方法。 - 前記ＨＣＶタイピングプローブのヌクレオチド配列がＨＣＶゲノムの５’−ＵＴＲまたはＮＳ５領域内のヌクレオチド配列に対して、相補的であるかまたは部分的に相補的である、請求項１に記載の方法。
- 前記ＨＣＶタイピングプローブが配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含む請求項１に記載の方法。
- 定量プローブ及びＨＣＶタイピングプローブを含む、試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプ及びＨＣＶウイルス負荷を決定するための組成物であって、ここで、前記定量プローブは、非対称ＰＣＲで増幅することにより生じる限定的アンプリコン鎖とハイブリダイズするものであり、前記ＨＣＶタイピングプローブは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチドに対して相補的であるかまたは部分的に相補的である、配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含み、ここで、プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；そして前記プローブおよびＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体は、遺伝子型またはサブタイプの各々を識別する温度依存性ハイブリダイゼーション特性を有する、含む組成物。
- ａ）定量プローブ、ここで当該定量プローブは、非対称ＰＣＲで増幅することにより生じる限定的アンプリコン鎖とハイブリダイズするものである；
ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるかまたは部分的に相補的であるＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）ドナー部分で標識されたＨＣＶタイピングプローブ、ここで前記プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプ内で配列不均一性を示し；そして前記プローブおよび複数のＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプを含むハイブリダイゼーション複合体は、少なくとも２つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも２つのＨＣＶサブタイプを識別する温度依存性ハイブリダイゼーション特性を有し、ここで、当該ＨＣＶタイピングプローブは配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含む；および
ｃ）チアジン色素を含む可溶性ＦＲＥＴクエンチャー、ここで前記ＦＲＥＴクエンチャーはＦＲＥＴドナー部分を消光することができる；
を含む組成物。 - 試料中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のタイプ及びＨＣＶウイルス負荷を決定するための診断キットであって：
ａ）ＨＣＶゲノム内のヌクレオチド配列に対して相補的であるかまたは部分的に相補的である少なくとも１つのＨＣＶタイピングプローブ、ここで前記プローブの領域の相補性または部分的相補性は少なくとも５つのＨＣＶ遺伝子型または少なくとも６つのＨＣＶサブタイプの各々内で配列不均一性を示し、そしてここで前記プローブおよびＨＣＶ遺伝子型またはサブタイプの各々を含むハイブリダイゼーション複合体は異なる温度依存性ハイブリダイゼーション特性を有し、ここで、当該ＨＣＶタイピングプローブは配列番号８〜２７から選択される核酸配列を含む；
ｂ）標的プローブを含むハイブリダイゼーション複合体の温度依存性ハイブリダイゼーション特性を測定するための指示書；および
ｃ）アンプリコン定量プローブ、ここで当該定量プローブは、非対称ＰＣＲで増幅することにより生じる限定的アンプリコン鎖とハイブリダイズするものである、
を含む、キット。 - ｄ）ＨＣＶタイピングプローブにおける核酸配列に対して相補的であるかまたは部分的に相補的である核酸配列を含む、ＨＣＶアンプリコンを創製することができる増幅プライマー対をさらに含む、請求項６に記載の診断キット。