KR102465706B1 - Dna 주형 구리 나노입자 기반 fret 센서 및 이를 이용한 표적 핵산 분자의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서 및 이를 이용한 표적 핵산 분자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서 및 이를 이용한 표적 핵산 분자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
DNA 템플릿 구리 나노 입자 (CuNP)는 DNA 템플릿을 사용하여 합성한 형광 금속 나노 물질이다. CuNP는 은 및 금 나노 클러스터와 같은 다른 DNA 템플릿 형광 금속 나노 물질보다 빠르게 대기 조건에서 5분 내로 준비될 수 있다. 또한 여기 및 방출 파장이 각각 340nm 및 620nm Stoke 's shift가 크다. 그러나 CuNP의 형광은 30 분 미만으로 유지되어 광범위한 적용을 제한한다. 본원 발명의 연구자들은 아스코르빈산과 구리 이온의 양을 조절하여 CuNP의 형광 안정성을 향상시키는 새로운 전략을 구상하였다. 상기 아이디어는 분자 이미징에 사용되는 CuNP의 잠재력을 확장한다.
두 가지 다른 파장의 신호에 의존하는 비율계 형광 바이오 센서는 단일 파장에서 작동하는 바이오 센서보다 환경 조건의 변화에 더 견고하고 저항력이 있기 때문에 주목을 받았다. CuNP는 표적 분자와 상호 작용하여 CuNP의 형광을 일으키는 DNA 주형 서열을 생성하여 표적 분자의 검출에 사용되었다. 그러나 온도에 대한 CuNP의 민감도는 시간 또는 위치에 따라 신호 변동을 유발할 수 있어 문제가 된다. 따라서 이러한 환경 변동에 강한 비율 측정 분석 시스템에 대한 요구가 증가하고 있다.
DNA 템플릿 구리 나노 입자 (CuNP)는 표적 검출에 사용된다. 그러나 이를 사용한 바이오 센서는 비율 계량형 바이오 센서보다 정확도가 낮다. 본원 발명은 CuNP를 이용한 비율 계량법의 효과를 조사한 결과, CuNP가 Cy5와 함께 형광 공명 에너지 전달(FRET)를 사용하여 비율 측정 대상 검출을 위한 프로브로 기능할 수 있고, 상기 방법을 이용하여 높은 민감도와 특이성을 가진 microRNA의 검출할 수 있음을 확인하였으며, PCR 증폭과 함께 이 방법을 사용하여 표적 microRNA인 miR-21가 0.93 aM (약 12 개 사본)의 검출 한계로 성공적으로 검출되는 것을 확인하였다. 또한 FRET을 이용한 microRNA의 측정은 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR) 정량적 역전사 PCR로 얻은 결과와 일치하는 것을 확인하였다. 본 발명은 CuNP를 사용하여 FRET을 통해 miRNA를 민감하게 검출할 수 있으므로, 기존 검사 기법의 단점을 극복할 수 있으며, miRNA를 높은 민감도 및 특이성으로 검출할 수 있어 miRNA를 탐지하는데 유망한 플랫폼이 될 수 있다.
이에 본 발명자들은, CuNP를 이용한 비율 계량법의 효과를 조사한 결과, CuNP가 Cy5와 함께 형광 공명 에너지 전달(FRET)를 사용하여 비율 측정 대상 검출을 위한 프로브로 기능할 수 있고, 상기 방법을 이용하여 높은 민감도와 특이성을 가진 microRNA의 검출할 수 있음을 확인하였으며, PCR 증폭과 함께 이 방법을 사용하여 표적 microRNA인 miR-21가 0.93 aM (약 12개)의 검출 한계로 성공적으로 검출되는 것을 확인하였다. CuNP를 사용하여 FRET을 통해 mirRNA를 민감하게 검출할 수 있으므로, 기존 검사 기법의 단점을 극복할 수 있으며, mirRNA를 높은 민감도 및 특이성으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (1) 표적 핵산 분자의 제 1 영역에 특이적으로 결합하고 3' 말단에 헤어핀 구조를 포함하는 제 1 프로브; 및 (2) 상기 표적 핵산 분자의 제 2 영역에 특이적으로 결합하고 형광단(fluorophore)와 접합된 제 2 프로브; 을 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 이용하여, 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 표적 핵산 분자의 제 1 영역에 특이적으로 결합하고 3' 말단에 헤어핀 구조를 포함하는 제 1 프로브; 및 (2) 상기 표적 핵산 분자의 제 2 영역에 특이적으로 결합하고 형광단(fluorophore)와 접합된 제 2 프로브; 을 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 이용하여, 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (1) 표적 핵산 분자의 제 1 영역에 특이적으로 결합하고 3' 말단에 헤어핀 구조를 포함하는 제 1 프로브; 및 (2) 상기 표적 핵산 분자의 제 2 영역에 특이적으로 결합하고 형광단(fluorophore)와 접합된 제 2 프로브; 을 포함하는, 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 제공할 수 있다.
본 발명은 DNA 템플릿 구리 나노 입자 (CuNP)가 표적 분자의 FRET 기반 비율 표적 핵산 분자를 검출하는 방법에 관한 것이다. CuNP 기반 FRET 시스템의 구성을 위해 620 nm에서 CuNP에서 방출 파장이 648 nm에서 Cy5의 여기 파장에 가깝기 때문에 CuNP에 대한 FRET 쌍으로 Cy5를 선택하였다. 3'끝에 헤어핀 구조를 가진 CuNP 프로브 및 5'말단이 Cy5로 변형된 Cy5 프로브를 포함하는 2개의 DNA 프로브를 설계하였다. CuNP 및 Cy5 프로브는 프로브가 표적 서열의 다른 부분에 혼성화되도록 표적 특이적 DNA 서열을 포함하도록 설계되어 CuNP 프로브의 헤어핀 구조와 Cy5 프로브의 Cy5 부분을 매우 근접하게 배치하였다 (도 1). 아스코르브산 나트륨과 구리 이온을 첨가하면 CuNP는 340nm 파장에서 여기되고 FRET 과정을 통해 Cy5에 에너지를 전달하여 660nm에서 Cy5의 형광을 발한다. 표적 서열이 없을 때 620 nm에서 CuNP의 형광만이 관찰되었다 (도 2).
CuNP 기반 FRET 시스템을 사용하여 표적 서열을 검출하는 능력을 확인하기 위해, MIR-21의 농도 의존적으로 형광 신호를 확인한 결과, MIR-21의 농도에 다라서 형광 신호도 변화하는 것을 확인하였다 (도3A). 도 3B에 표시된 것처럼 FRET 비율 (R)은 검출 한계가 2.88 nM인 4-100 nM의 동적 선형 범위를 따라 MIR-21의 농도에 따라 증가하였다. miR-21의 FRET 비율 만이 음성 대조 군보다 높은 반면에 다른 비 표적 miRNA(miR-122, miR-141, miR-155, miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-375 및 miR-429)의 경우는 음성 대조군과 비슷하여 표적 검출을 위해 제안된 FRET 시스템의 높은 서열 특이성을 확인하였다 (도 3C).
실제 샘플에서 적은 양의 miR-21을 검출할 수 있는지 확인하였다. FRET 비율은 도 3A 및 3B에서 볼 수 있는 추세와 유사하게 표적 miR-21의 농도에 따라 증가하였다. PCR 증폭의 도움으로 동적 범위와 검출 한계가 각각 10 aM-100 pM의 범위와 0.93 aM (12 개 사본)의 한계로 크게 향상되었다. CuNP 기반 FRET 시스템을 사용한 miRNA 측정은 miRNA 분석을 위한 최고의 표준 방법인 qRT-PCR (r2 = 0.9435; 도 4C)과 강한 상관 관계를 나타내었다.
발명에서 용어 FRET (형광공명에너지전이, fluorescence resonance energy transfer)는 단파장 형광 물질인 공여체 (donor)가 외부에서 에너지를 흡수하면, 상기 공여체의 여기 에너지가 빛 에너지로 방출되는 대신, 소정의 거리 안에 위치한 장파장 형광 물질인 수용체 (acceptor)가 발광 없이 전달되어, 수용체의 장파장 형광만이 방출되는 현상을 의미한다. FRET에 의한 수용체 형광의 발생 또는 공여체 방출광의 소멸현상 (photobleaching)이 나타나려면 상기 공여체와 수용체가 매우 짧은 거리 (10 nm 미만)에 위치해야 한다. 특정 파장의 빛을 내는 형광 물질인 상기 공여체와 이 발광 에너지와 공명을 일으켜 에너지를 흡수할 수 있는 형광 물질인 상기 수용체가 소정의 거리 이내로 가까워지면, 외부에서 상기 공여체를 여기시키기 위해 조사된 빛 에너지가 상기 공여체로부터 상기 수용체로 발광 없이 전달되어 공여체의 고유한 파장의 발광이 감소하고, 공여체로부터 에너지를 전달받은 수용체가 자신의 고유한 파장대의 빛을 발광하는 FRET 현상이 일어난다.
발명에서 용어 "프로브(probe)"는 유전자 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 일반적으로 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double stranded DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 표지될 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 상기 제 1 영역 및 상기 제 2 영역 간의 거리는 15bp 이하인 것을 특징으로 할 수 있고, 바림직하게는 10bp 이하일 수 있고, 더 바람직하게는 0bp 일 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, CuNP 프로브의 CuNP와 Cy5 프로브 내의 Cy5 사이의 거리에 의한 FRET 효율에 미치는 영향을 평가하였다. FRET 쌍 사이의 거리가 증가함에 따라 FRET 효율이 감소하여 0 뉴클레오티드의 거리가 CuNP와 Cy5 사이에서 FRET의 가장 높은 효율을 초래한다는 것을 확인하였다 (도 2D).
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 제 1 프로브는 서열 번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 구체적으로 서열 번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 제 2 프로브는 서열 번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으며, 구체적으로 서열 번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 형광단(fluorophore)은 Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, Alexa 680, 로다민(rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, TRITC, Fluor X, DAB, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodify 630/650, Bodify 650/665, Calfluor orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, Quantum dots, DNA-templated silver nanoclusters 및 Protein-templated gold nanoclusters로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 형광단은 상기 표적 핵산 분자 제 1 영역에 특이적으로 결합하고 3' 말단에 헤어핀 구조를 포함하는 제 1 프로브의 5'-말단에 연결된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 형광 수용체 물질은 구체적으로 황색 형광 물질 또는 증강된 적색 형광 물질일 수 있으며, 상기 적색 형광 물질이 상기 표적 핵산 분자의 5'-말단에 융합되어 FRET 쌍 (FRET pair)를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 표적 핵산 분자는 miRNA, mRNA, RNA 또는 DNA일 수 있다.
본 발명의 일 양태로, 하기의 단계를 포함하는 표적 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
(i) 대상 시료에서 표적 핵산을 분리하는 단계;
(ii) 상기 분리된 표적 핵산을 역전사 반응 (reverse transcription)을 수행하여 cDNA을 합성하는 단계;
(iii) 상기 (ii)단계의 cDNA를 비대칭 PCR(Asymmetric PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(iv) 상기 PCR 증폭 생산물에 상기 서술한 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서와 접촉시켜 발생한 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 신호를 측정하여 표적 핵산 분자 검출하는 단계.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 (ii)단계의 역전사 반응(reverse transcription)은 서열 번호 8의 염기서열로 이루어진 헤어핀 프라이머를 이용하여 수행될 수 있으며, 구체적으로 서열 번호 8의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 상기 (iii)단계의 비대칭 PCR(Asymmetric PCR)은 서열 번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 수행할 수 있으며, 구체적으로 서열 번호 9 및 서열번호 10의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 상기 (iii) 단계 이후 상기 표적 핵산 분자의 농도에 따른 상기 FRET 센서의 FRET 비율의 변화를 측정하여 표적 핵산 분자를 정량하는 단계; 를 추가할 수 있다. 예를 들어, 상기 FRET 비율의 변화는, 표적 핵산 분자의 농도가 X일 때의 620 nm를 측정한 값에 표적 핵산 분자의 농도가 X일 때의 660 nm를 측정한 값을 하기와 값은 식으로 계산될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다:
[계산식 2]
본 발명의 일 양태로, 상기 서술한 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 포함하는 표적 핵산 분자의 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 발명의 CuNP를 이용한 비율 계량법은 CuNP가 Cy5와 함께 형광 공명 에너지 전달(FRET)를 사용하여 비율 측정 대상 검출을 위한 프로브로 기능하여, 높은 민감도와 특이성을 가진 microRNA의 검출할 수 있는 효과가 있다. 또한 qPCR과 다르게 실시간 형광 모니터링이 필요 없이 정량을 할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 CuNP를 사용한 FRET의 비율 계량적 바이오 센서에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 CuNP 기반 FRET 시스템을 이용하여 miRNA를 검출한 결과로서, (A)는 340 nm 빛에 의해 여기 될 때 각 샘플의 형광 방출 스펙트럼 결과이고, (B)는 혼성화 복합체 형성을 위한 겔 전기 영동 분석 결과이다: 1μM MIR-21 (레인 1), 1μM CuNP 프로브 (레인 2), 1μM Cy5 프로브 (레인 3), 1μM CuNP 프로브 및 1μM Cy5 프로브 (레인 4), 1μM MIR-21, 1 μM CuNP 프로브 및 1 μM Cy5 프로브 (레인 5). Cy5 프로브 (11-mer)는 너무 짧아 Greenstar로 명확하게 염색할 수 없었다. (C) FRET 효율에 대한 CuNP와 Cy5 사이의 거리 효과를 확인한 결과이다. 동일한 1μM CuNP 프로브와 1μM Cy5 프로브를 사용했지만 FRET 쌍 사이의 거리를 조절하기 위해 표적 (MIR-21 및 5-20 뉴클레오티드 프로브, 표 1)을 변경하였다. ΔFRET 비율은 타겟 존재시의 FRET 비율에서 타겟 (대조군) 부재시의 FRET 비율을 빼서 계산하였다. 0: miR-21, 5: 5 nt 프로브, 10:10 nt 프로브, 15:15 nt 프로브, 20:20 nt 프로브; 여기서 nt는 프로브에 걸쳐 가변적인 뉴클레오티드의 수를 나타내며 표적과 혼성화 될 때 CuNP 프로브와 Cy5 프로브 사이의 거리를 나타낸다.
도 3은 CuNP 기반 FRET 시스템의 민감도와 특이성을 확인한 결과이다. (A)는 340 nm 빛에 의해 여기 될 때 MIR-21의 서로 다른 농도의 존재에서 상대 형광 방출 스펙트럼을 확인한 결과이다. 상대 형광 강도는 각 파장의 형광 강도를 620 nm의 형광 강도로 나누어 계산하였다. (B)는 MIR-21의 다른 농도에서 FRET 비율의 표준 곡선을 계산한 결과이다. (C) 다양한 miRNA의 존재 하에서 FRET 비율을 확인한 결과이다. a: miR-21, b: miR-122, c: miR-141, d: miR-155, e: miR-200a, f: miR-200b, g: miR-200c, h: miR-375, i: miR-429, con: control.
도 4는 PCR 증폭과 CuNP 기반 FRET 시스템을 결합하여 확인한 결과로서, (A)는 340 nm 빛에 의해 여기 될 때 miR-21의 다른 농도가 존재하는 경우의 상대 형광 방출 스펙트럼을 확인한 결과이다. 상대 형광 강도는 각 파장의 형광 강도를 620 nm의 형광 강도로 나누어 계산하였다. (B)는 miR-21의 다른 농도에서 FRET 비율의 표준 곡선을 계산한 결과이다. (C)는 CuNP 기반 FRET 및 qRT-PCR 시스템을 사용한 측정 간의 상관 관계를 계산한 결과이다.
도 2는 본 발명의 CuNP 기반 FRET 시스템을 이용하여 miRNA를 검출한 결과로서, (A)는 340 nm 빛에 의해 여기 될 때 각 샘플의 형광 방출 스펙트럼 결과이고, (B)는 혼성화 복합체 형성을 위한 겔 전기 영동 분석 결과이다: 1μM MIR-21 (레인 1), 1μM CuNP 프로브 (레인 2), 1μM Cy5 프로브 (레인 3), 1μM CuNP 프로브 및 1μM Cy5 프로브 (레인 4), 1μM MIR-21, 1 μM CuNP 프로브 및 1 μM Cy5 프로브 (레인 5). Cy5 프로브 (11-mer)는 너무 짧아 Greenstar로 명확하게 염색할 수 없었다. (C) FRET 효율에 대한 CuNP와 Cy5 사이의 거리 효과를 확인한 결과이다. 동일한 1μM CuNP 프로브와 1μM Cy5 프로브를 사용했지만 FRET 쌍 사이의 거리를 조절하기 위해 표적 (MIR-21 및 5-20 뉴클레오티드 프로브, 표 1)을 변경하였다. ΔFRET 비율은 타겟 존재시의 FRET 비율에서 타겟 (대조군) 부재시의 FRET 비율을 빼서 계산하였다. 0: miR-21, 5: 5 nt 프로브, 10:10 nt 프로브, 15:15 nt 프로브, 20:20 nt 프로브; 여기서 nt는 프로브에 걸쳐 가변적인 뉴클레오티드의 수를 나타내며 표적과 혼성화 될 때 CuNP 프로브와 Cy5 프로브 사이의 거리를 나타낸다.
도 3은 CuNP 기반 FRET 시스템의 민감도와 특이성을 확인한 결과이다. (A)는 340 nm 빛에 의해 여기 될 때 MIR-21의 서로 다른 농도의 존재에서 상대 형광 방출 스펙트럼을 확인한 결과이다. 상대 형광 강도는 각 파장의 형광 강도를 620 nm의 형광 강도로 나누어 계산하였다. (B)는 MIR-21의 다른 농도에서 FRET 비율의 표준 곡선을 계산한 결과이다. (C) 다양한 miRNA의 존재 하에서 FRET 비율을 확인한 결과이다. a: miR-21, b: miR-122, c: miR-141, d: miR-155, e: miR-200a, f: miR-200b, g: miR-200c, h: miR-375, i: miR-429, con: control.
도 4는 PCR 증폭과 CuNP 기반 FRET 시스템을 결합하여 확인한 결과로서, (A)는 340 nm 빛에 의해 여기 될 때 miR-21의 다른 농도가 존재하는 경우의 상대 형광 방출 스펙트럼을 확인한 결과이다. 상대 형광 강도는 각 파장의 형광 강도를 620 nm의 형광 강도로 나누어 계산하였다. (B)는 miR-21의 다른 농도에서 FRET 비율의 표준 곡선을 계산한 결과이다. (C)는 CuNP 기반 FRET 및 qRT-PCR 시스템을 사용한 측정 간의 상관 관계를 계산한 결과이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 실험의 재료 및 방법
모든 DNA 염기 서열은 하기 표 1과 같다. Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, USA) 및 Bionics (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 염화나트륨 (NaCl)과 아스코르브산 나트륨 (sodium ascorbate)은 Samchun Chemical (Seoul, Korea)에서 구입하였다. Copper sulfate (CuSO4) 및 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Moloney murine leukemia virus (M-MLV) reverse transcriptase 및 deoxynucleoside triphosphates (dNTPs)은 Enzynomics (Daejeon, Korea)에서 구입하였다. Taq DNA polymerase은 iNtRON Biotechnology (Seongnam, Korea)에서 구입하였다. Greenstar, deionized water 및 diethylpyrocarbonate-treated water을 Bioneer (Daejeon, Korea)에서 구입하였다.
| Name |
Sequence (5'
 |
Length | Sequence Number |
| CuNP probe | TCAACATCAGTATATATATATATATATATTTTTTATATATATATATATATAT | 52 | 서열 번호 1 |
| Cy5 probe | Cy5-CTGATAAGCTA | 11 | 서열 번호 2 |
| MIR-21 | TAGCTTATCAGACTGATGTTGA | 22 | 서열 번호 3 |
| 5 nt probe* | TAGCTTATCAGCCCCCACTGATGTTGA | 27 | 서열 번호 4 |
| 10 nt probe* | TAGCTTATCAGCCCCCCCCCCACTGATGTTGA | 32 | 서열 번호 5 |
| 15 nt probe* | TAGCTTATCAGCCCCCCCCCCCCCCCACTGATGTTGA | 37 | 서열 번호 6 |
| 20 nt probe* | TAGCTTATCAGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCACTGATGTTGA | 42 | 서열 번호 7 |
| Hairpin primer | GTCGTATCCACACGTCCCAGGCTCCAATTCCGTGTGGATACGACTCAACA | 50 | 서열 번호 8 |
| Forward primer | TCGCCTAGCTTATCAGACTGA | 21 | 서열 번호 9 |
| Reverse primer | CACGTCCCAGGCTCCA | 16 | 서열 번호 10 |
| miR-21 | Uagcuuaucagacugauguuga | 22 | 서열 번호 11 |
| miR-122 | Uggagugugacaaugguguuug | 22 | 서열 번호 12 |
| miR-141 | Caucuuccaguacaguguugga | 22 | 서열 번호 13 |
| miR-155 | Uuaaugcuaaucgugauagggguu | 24 | 서열 번호 14 |
| miR-200a | Caucuuaccggacagugcugga | 22 | 서열 번호 15 |
| miR-200b | Caucuuacugggcagcauugga | 22 | 서열 번호 16 |
| miR-200c | Cgucuuacccagcaguguuugg | 22 | 서열 번호 17 |
| miR-375 | Gcgacgagccccucgcacaaacc | 23 | 서열 번호 18 |
| miR-429 | Uaauacugucugguaaaaccgu | 22 | 서열 번호 19 |
* nt는 뉴클레오티드를 나타낸다. 기울임 꼴 문자는 길이가 가변적인 프로브 부분을 나타내며, 이는 대상에 혼성화 될 때 CuNP와 Cy5 사의 거리를 변경하였다.
실시예 2. CuNP 기반 FRET의 실험 설계
CuNP 기반 FRET 시스템의 구성을 위해 620 nm에서 CuNP에서 방출 파장이 648 nm에서 Cy5의 여기 파장에 가깝기 때문에 CuNP에 대한 FRET 쌍으로 Cy5를 선택하였다. 도 1과 같이, 본 발명은 2개의 DNA 프로브를 설계하였다: 3'끝에 헤어핀 구조를 가진 CuNP 프로브, 여기서 스템(stem)은 CuNP의 형성에 사용되는 아데닌-티민 반복 서열이고, 및 5'말단이 Cy5로 변형된 Cy5 프로브. CuNP 및 Cy5 프로브는 프로브가 표적 서열의 다른 부분에 혼성화되도록 표적 특이적 DNA 서열을 포함하도록 설계되어 CuNP 프로브의 헤어핀 구조하였다. 생성된 PCR 생산물은 (10μL)은 사용된 아스코르브산 나트륨의 농도가 4mM인 것을 제외하고는 실시예 3와 같이 분석하였다. 비대칭 RT-PCR 완료 후 CuNP 기반 FRET 시스템을 사용하여 제품을 분석하였다. 본원 발명이 miRNA 분석을 위한 표준 방법인 qRT-PCR과 결과가 유사한 지 확인하기 위해 qRT-PCR을 하기와 같이 수행하였다. cDNA는 실시예 3과 같이 수행하여 준비하였다. 1μL cDNA는 1X SYBR green I이 추가로 사용된 것을 제외하고는 유사하게 qRT-PCR을 수행하였다. PCR은 95 ℃에서 30초 동안 인큐베이션하도록 프로그래밍한 다음 37번의 온도 사이클 (10 초 동안 95 ℃, 15 초 동안 54 ℃, 20 초 동안 72 ℃)을 수행하였다. PCR 증폭 중 SYBR green의 형광 신호는 실시간 PCR 검출 시스템 (CFX Connect, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 측정하였다.
miR-21의 농도 변화에 따른 형광 신호의 차이는 도 4A 및 도 4B와 같다. FRET 비율은 도 3A 및 3B에서 볼 수 있는 추세와 유사하게 표적 miR-21의 농도에 따라 증가하였다. PCR 증폭의 도움으로 동적 범위와 검출 한계가 각각 10 aM-100 pM의 범위와 0.93 aM (12 개 사본)의 한계로 크게 향상되었다. CuNP 기반 FRET 시스템을 사용한 miRNA 측정은 miRNA 분석을 위한 최고의 표준 방법인 qRT-PCR (r2 = 0.9435; 도 4C)과 강한 상관 관계를 나타냈고, 이는 제안된 FRET 시스템이 매우 정확하다는 것을 보여준다.
독특한 형광 특성을 가진 CuNP가 표적 분자의 FRET 기반 비율 측정에 사용될 수 있다는 것을 확인하였다. Cy5를 CuNP의 FRET 쌍으로 선택하여 표적 miRNA를 검출하였다. 미량의 표적 miRNA도 검출하기 위해 PCR 증폭과 결합하여 수행하였다. CuNP 및 Cy5의 FRET 쌍을 기반으로 한 새로운 비율 측정 방법을 사용하여 높은 민감도와 특이성을 가진 대상 miRNA의 농도를 결정할 수 있다.
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP
<120> DNA-templated Cu nanoparticle based FRET sensor and method for
detecting target nucleic acid molecule using the same
<130> 1068478
<160> 19
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CuNP probe
<400> 1
tcaacatcag tatatatata tatatatatt ttttatatat atatatatat at 52
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cy5 probe
<400> 2
ctgataagct a 11
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MIR-21
<400> 3
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5 nt probe
<400> 4
tagcttatca gcccccactg atgttga 27
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 10 nt probe
<400> 5
tagcttatca gccccccccc cactgatgtt ga 32
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15 nt probe
<400> 6
tagcttatca gccccccccc ccccccactg atgttga 37
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20 nt probe
<400> 7
tagcttatca gccccccccc cccccccccc cactgatgtt ga 42
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hairpin primer
<400> 8
gtcgtatcca cacgtcccag gctccaattc cgtgtggata cgactcaaca 50
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 9
tcgcctagct tatcagactg a 21
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 10
cacgtcccag gctcca 16
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-21
<400> 11
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-122
<400> 12
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-141
<400> 13
caucuuccag uacaguguug ga 22
<210> 14
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-155
<400> 14
uuaaugcuaa ucgugauagg gguu 24
<210> 15
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-200a
<400> 15
caucuuaccg gacagugcug ga 22
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-200b
<400> 16
caucuuacug ggcagcauug ga 22
<210> 17
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-200c
<400> 17
cgucuuaccc agcaguguuu gg 22
<210> 18
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-375
<400> 18
gcgacgagcc ccucgcacaa acc 23
<210> 19
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR-429
<400> 19
uaauacuguc ugguaaaacc gu 22
Claims (11)
- (1) 표적 핵산 분자의 제 1 영역에 특이적으로 결합하고 3' 말단에 헤어핀 구조 및 구리 나노 입자를 포함하는 제 1 프로브; 및
(2) 표적 핵산 분자의 제 2 영역에 특이적으로 결합하고 형광단(fluorophore)와 접합된 제 2 프로브; 을 포함하는,
표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서로,
상기 제 1 영역 및 상기 제 2 영역 간의 거리는 0bp인 것을 특징으로 하는 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 제 1 프로브는 서열 번호 1의 염기서열로 이루어진, 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서.
- 제 1항에 있어서, 상기 제 2 프로브는 서열 번호 2의 염기서열로 이루어진, 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서.
- 제 1항에 있어서, 상기 형광단(fluorophore)은 Cy3, Cy5, Cy5.5, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, Alexa 680, 로다민(rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, TRITC, Fluor X, DAB, ROX, Texas Red, Orange green 488X, Orange green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodify 630/650, Bodify 650/665, Calfluor orange 546, Calfluor red 610, Quasar 670, Quantum dots, DNA-templated silver nanoclusters 및 Protein-templated gold nanoclusters로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서.
- 제 1항에 있어서, 상기 표적 핵산 분자는 miRNA, mRNA, RNA 또는 DNA인, 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서.
- (i) 대상 시료에서 표적 핵산을 분리하는 단계;
(ii) 상기 분리된 표적 핵산을 역전사 반응 (reverse transcription)을 수행하여 cDNA을 합성하는 단계;
(iii) 상기 (ii)단계의 cDNA를 비대칭 PCR(Asymmetric PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(iv) 상기 PCR 증폭 생산물에 제 1항의 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서와 접촉시켜 발생한 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 신호를 측정하여, 표적 핵산 분자 검출하는 단계;
를 포함하는, 표적 핵산 분자를 검출하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 (ii)단계의 역전사 반응(reverse transcription)은 서열 번호 8의 염기서열로 이루어진 헤어핀 프라이머를 이용하여 수행하는, 표적 핵산 분자를 검출하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 (iii)단계의 비대칭 PCR(Asymmetric PCR)은 서열 번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 수행하는, 표적 핵산 분자를 검출하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 (iii) 단계 이후 상기 표적 핵산 분자의 농도에 따른 상기 FRET 센서의 FRET 비율의 변화를 측정하여 표적 핵산 분자를 정량하는 단계; 를 추가하는, 표적 핵산 분자를 검출하는 방법.
- 제 1항, 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 표적 핵산 분자의 검출용 FRET 센서를 포함하는, 표적 핵산 분자의 검출용 조성물.
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220091052A KR20220091052A (ko) | 2022-06-30 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR101392970B1 (ko) * | 2011-05-16 | 2014-05-08 | 한국생명공학연구원 | 민감도와 특이도가 향상된 표적 핵산의 검출방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8067208B2 (en) * | 2005-06-30 | 2011-11-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Probes and methods for hepatitis C virus typing using multidimensional probe analysis |
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- 2020-12-23 KR KR1020200182177A patent/KR102465706B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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Also Published As
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|---|---|
| KR20220091052A (ko) | 2022-06-30 |
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