CN113462753A - 点击化学介导的单量子点纳米传感器及检测miRNAs的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种点击化学介导的单量子点纳米传感器,包括:DNA探针1和DNA探针2,DNA探针1的一端与DNA探针2的一端能够通过点击化学反应连接,连接后的DNA探针1和DNA探针2能够与待测miRNAs互补;DNA探针3和DNA探针4,DNA探针3的一端与DNA探针4的一端能够通过点击化学反应连接,连接后的DNA探针3和DNA探针4能够与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补;捕获探针和报告探针,捕获探针和报告探针能够同时与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补,报告探针连接荧光团;单量子点,单量子点能够与捕获探针自组装连接,且单量子点能够与所述荧光团产生荧光共振能量转移。
Description
技术领域
本发明属于生物分析技术领域,涉及点击化学介导的单量子点纳米传感器及检测miRNAs的方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
MicroRNAs(miRNAs)是一大类22nt长度的非编码内源性小RNA分子,由大约70个碱基大小的单链RNA前体在Dicer酶加工的协助下产生。Microrna(miRNAs)在基因转录后调控中起着关键作用,其异常表达可能会干扰正常的基因调控网络诱发各种疾病,因此准确检测miRNAs对早期临床诊断至关重要。然而,miRNAs的独特特性(如低丰度、短存活时间、体积小和相似的成员序列)使其难以准确检测。
传统的miRNAs检测方法包括微阵列、下一代测序和Northern blotting。微阵列具有成本低、通量高的特点,但数据分析复杂且灵敏度低。下一代测序可以实现高通量RNA测序,但不能用于绝对定量分析。Northern blotting是测定miRNAs的标准方法,但它涉及大量的样品消耗,费时,灵敏度较差。另外,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)可以大大提高检测灵敏度,但将miRNAs转化为cDNA的逆转录步骤不可避免地增加了探针设计的复杂性和实验成本。据发明人了解,最近的研究中,连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)被引入到miRNAs检测中,以实现高特异性和高灵敏度,而无需将目标RNA酶逆转录成相应的cDNA。但是,发明人研究发现,传统的酶依赖型LCR的酶连接效率通常较低(一般为50%)。此外,连接酶的酶活性可能受到环境因素和反应介质的干扰,导致重现性差。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明的目的是提供点击化学介导的单量子点纳米传感器及检测miRNAs的方法与应用,该纳米传感器不涉及任何酶的逆转录、铜催化剂和连接酶,具有优异的选择性、高灵敏度,甚至可以区分单碱基失配。本发明基于该纳米传感器的检测方法能够在即使在单细胞水平上也能准确量化miRNAs,并且能够区分健康人群和癌症患者组织中miRNAs的表达。
为了实现上述目的,本发明的技术方案为:
一方面,一种点击化学介导的单量子点纳米传感器,包括:
DNA探针1和DNA探针2,DNA探针1的一端与DNA探针2的一端能够通过点击化学反应连接,连接后的DNA探针1和DNA探针2能够与待测miRNAs互补;
捕获探针和报告探针,所述捕获探针和报告探针能够同时与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补,所述报告探针连接荧光团;
单量子点,所述单量子点能够与捕获探针自组装连接,且所述单量子点能够与所述荧光团产生荧光共振能量转移。
本发明在待测miRNAs存在的情况下,DNA探针1和DNA探针2与待测miRNAs互补,此时DNA探针1和DNA探针2相距较近,容易进行点击化学反应,然后利用点击化学反应的方法将DNA探针1和DNA探针2连接,从而解决传统酶连接效率较低的问题,通过捕获探针和报告探针与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补,使得捕获探针和报告探针的连接,再通过单量子点能够与捕获探针自组装连接,使得报告探针的荧光团靠近单量子点,从而产生荧光共振能量转移,进而实现对待测miRNAs的检测。而当待测miRNAs不存在时,DNA探针1和DNA探针2由于没有待测miRNAs的互补定位,使得DNA探针1和DNA探针2相距较远,无法进行点击化学反应,从而无法使DNA探针1和DNA探针2连接,进而不产生荧光共振能量转移的荧光信号。
为了增加纳米传感器对待测miRNAs的检测灵敏度,纳米传感器中还包括DNA探针3和DNA探针4,DNA探针3的一端与DNA探针4的一端能够通过点击化学反应连接,连接后的DNA探针3和DNA探针4能够与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补。通过点击化学介导的三环连接酶链反应(LCR)扩增实现连接后的DNA探针1和DNA探针2数量的增加,从而使得更多的捕获探针和报告探针通过互补连接,从而增加荧光共振能量转移的荧光信号,进而增加对待测miRNAs的检测灵敏度。
为了增加纳米传感器对待测miRNAs的检测特异性,纳米传感器还包括剪切酶,所述剪切酶能够消化杂质DNA链,所述杂质DNA链为没有连接硫代磷酸酯的DNA,DNA探针2的另一端连接硫代磷酸酯。通过剪切酶的消化,从而消除假阳性,从而提高检测特异性。
另一方面,一种检测miRNAs的方法,提供上述点击化学介导的单量子点纳米传感器;
将含有待测miRNAs的样品与DNA探针1、DNA探针2进行杂交反应,然后进行点击化学反应;
将点击化学反应后物料与捕获探针、报告探针、单量子点进行孵育,然后进行荧光检测。
为了提高检测灵敏度,上述方法中,将含有待测miRNAs的样品与DNA探针1、DNA探针2、DNA探针3和DNA探针4进行杂交反应,同时进行点击化学反应。
为了提高检测的特异性,上述方法中,采用剪切酶处理点击化学反应后物料,然后与捕获探针、报告探针、单量子点进行孵育。
第三方面,一种上述点击化学介导的单量子点纳米传感器在制备检测癌细胞制剂中的应用。
第四方面,一种miRNAs的检测试剂盒,包括上述点击化学介导的单量子点纳米传感器、缓冲溶液。
本发明的有益效果为:
1.本发明开发了基于单量子点(QD)的共振能量转移(FRET)纳米传感器,基于无铜和无酶循环点击化学介导的三环连接酶链反应(LCR)扩增,准确检测miRNA。(1)高效的无铜、无酶点击化学连接可以将目标miRNA-155转化为探针1-2连接产物,消除了酶的逆转录、铜催化剂和连接酶的参与;(2)引入连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)扩增技术,可以保证高特异性,甚至能够识别一个碱基突变;(3)将QD-寡核苷酸-Cy5纳米传感器与单分子检测相结合,使该检测具有较高的灵敏度;(4)探针1-2连接产物可防止Exo I和Exo III催化消化,使本检测具有较好的特异性。
2.本发明以miRNA-155为待测miRNA进行实验表明,荧光团计数与miRNA-155浓度在1×10-16至1×10-9M范围内的7个数量级的对数之间具有良好的线性相关性出的检出限为3.87×10-17M,优于集成荧光测量法。与无标记荧光检测法相比,此FRET纳米传感器的灵敏度提高了5684.75倍,与纳米光子开关荧光法相比,提高了2583.98倍,与肽核酸电化学法相比,提高了300.52倍,与基于纳米结构的电化学分析相比,提高了258.40倍。灵敏度的提高可归因于以下四个因素:(1)点击反应介导的连接反应的高效率可产生大量的探针1-2连接产物和探针3-4连接产物以引发三环LCR扩增反应,(2)三环LCR的高扩增效率可以产生大量的探针1-2个连接产物,(3)改进的FRET效率是由于单量子点-寡核苷酸-荧光团纳米传感器中的单个单量子点/多个荧光团受体引起的,以及(4)单分子检测具有高信噪比和接近零背景的特征。
3.本发明通过实验表明,提供的点击化学介导的单量子点纳米传感器具有良好的选择性,并具有区分单碱基不匹配的能力。这种纳米传感器的高特异性可以归因于以下两个因素:(1)点击反应介导的连接反应和三环LCR扩增的特异性高,(2)通过Exo III/Exo I介导的过量DNA探针1、3和4和探针3-4连接产物的消化消除假阳性。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例的点击化学介导的单量子点纳米传感器检测microRNA-155的原理示意图;
图2为本发明实施例原理验证结果图,A为通过以SYBR Gold为指示剂进行非变性PAGE分析LCR反应,泳道1,miRNA-155;泳道2,DNA探针1+DNA探针3;泳道3,DNA探针2+DNA探针4;泳道4,DNA探针1+DNA探针2+DNA探针3+DNA探针4;第5泳道,miRNA-155+DNA探针1+DNA探针2+DNA探针3+DNA探针4,miRNA-155的浓度为500nM,每个DNA探针均为2μM;B为不存在miRNA-155和存在miRNA-155时的荧光发射光谱测量;插图显示了从660到690nm放大的荧光光谱,每个DNA探针的浓度为100nM,miRNA-155的浓度为10nM;C为不存在miRNA-155和存在miRNA-155时QD的荧光寿命曲线,在605nm的发射通道中测量了其寿命;
图3为本发明实施例不同浓度miRNA-155产生的Cy5计数,插图显示Cy5计数与miRNA-155浓度的对数之间的线性关系,每个DNA探针的浓度为100nM。误差棒是由三个独立实验得出的标准推导;
图4为本发明实施例荧光检测结果图,A由不同浓度的miRNA-155在0(对照)至10-8M范围内诱导的荧光发射光谱,插图显示了从660nm至680nm放大的荧光光谱,B为在488nm激发波长下,QD的F0-F与miRNA-155浓度的对数之间线性关系,每个DNA探针的浓度为100nM。误差棒是从三个独立实验获得的标准推导;
图5为本发明实施例特异性检测的结果图,A为比较10nM let-7a、10nM miRNA-141、10nM miRNA-210、10nM miRNA-214分别产生的Cy5计数,B为分别测量10nM单碱基错配miRNA 1、10nM单碱基错配miRNA 2、10nM单碱基错配miRNA 3、10nM单碱基错配miRNA 4、10nM miRNA-155产生的Cy5计数,每个DNA探针的浓度为100nM,误差棒显示了三个独立实验的标准差。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有基于酶连接检测方法存在酶连接效率较低的问题,本发明提出了点击化学介导的单量子点纳米传感器及检测miRNAs的方法与应用。
本发明的一种典型实施方式,提供了一种点击化学介导的单量子点纳米传感器,包括:
DNA探针1和DNA探针2,DNA探针1的一端与DNA探针2的一端能够通过点击化学反应连接,连接后的DNA探针1和DNA探针2能够与待测miRNAs互补;
捕获探针和报告探针,所述捕获探针和报告探针能够同时与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补,所述报告探针连接荧光团;
单量子点,所述单量子点能够与捕获探针自组装连接,且所述单量子点能够与所述荧光团产生荧光共振能量转移。
本发明在待测miRNAs存在的情况下,DNA探针1和DNA探针2与待测miRNAs互补,此时DNA探针1和DNA探针2相距较近,容易进行点击化学反应,然后利用点击化学反应的方法将DNA探针1和DNA探针2连接,从而解决传统酶连接效率较低的问题,通过捕获探针和报告探针与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补,使得捕获探针和报告探针的连接,再通过单量子点能够与捕获探针自组装连接,使得报告探针的荧光团靠近单量子点,从而产生荧光共振能量转移,进而实现对待测miRNAs的检测。而当待测miRNAs不存在时,DNA探针1和DNA探针2由于没有待测miRNAs的互补定位,使得DNA探针1和DNA探针2相距较远,无法进行点击化学反应,从而无法使DNA探针1和DNA探针2连接,进而不产生荧光共振能量转移的荧光信号。
为了增加纳米传感器对待测miRNAs的检测灵敏度,该实施方式的一些实施例中,还包括DNA探针3和DNA探针4,DNA探针3的一端与DNA探针4的一端能够通过点击化学反应连接,连接后的DNA探针3和DNA探针4能够与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补。通过点击化学介导的三环连接酶链反应(LCR)扩增实现连接后的DNA探针1和DNA探针2数量的增加,从而使得更多的捕获探针和报告探针通过互补连接,从而增加荧光共振能量转移的荧光信号,进而增加对待测miRNAs的检测灵敏度。
为了增加纳米传感器对待测miRNAs的检测特异性,该实施方式的一些实施例中,还包括剪切酶,所述剪切酶能够消化杂质DNA链,所述杂质DNA链为没有连接硫代磷酸酯的DNA,DNA探针2的另一端连接硫代磷酸酯。通过剪切酶的消化,从而消除假阳性,从而提高检测特异性。
通过点击化学反应的过程,一般为通过两个基团或化合物进行,例如通过叠氮化物(N3)和二苯环辛炔(DBCO)可以进行点击化学反应,同时由于环辛炔分子中大量的环间张力,反应非常迅速,分子中环间张力的释放驱动了快速反应,环辛炔与叠氮化物选择反应,在温和温度和压力条件下生成三唑的位置异构体混合物,该反应不需要金属催化剂,没有明显的细胞毒性,因而采用N3和DBCO的反应可以进行无铜催化的点击化学反应。具体的,DNA探针1的一端连接N3,则DNA探针2的一端连接DBCO;DNA探针1的一端连接DBCO,则DNA探针2的一端连接N3。同样的,对于DNA探针3和DNA探针4来说,DNA探针3的一端连接N3,则DNA探针4的一端连接DBCO;DNA探针3的一端连接DBCO,则DNA探针4的一端连接N3。
该实施方式的一些实施例中,所述剪切酶为Exo I和/或Exo III。
该实施方式的一些实施例中,单量子点为605QDs,荧光团为Cy5。
单量子点能够与捕获探针通过链霉亲和素与生物素的结合进行自组装,该实施方式的一些实施例中,单量子点表面连接链霉亲和素,捕获探针连接生物素。
当待测miRNAs为miRNA-155时,DNA探针1的序列为:ACC CCT ATC AC;
DNA探针2的序列为:GAT TAG CAT TAA TTT;
DNA探针3的序列为:GTG ATA GGG GT;
DNA探针4的序列为:AAA TTA ATG CTA ATC;
捕获探针的序列为:GTG ATA GGG GT;
报告探针的序列为:AAA TTA ATG CTA ATC。
本发明的另一种实施方式,提供了一种检测miRNAs的方法,提供上述点击化学介导的单量子点纳米传感器;
将含有待测miRNAs的样品与DNA探针1、DNA探针2进行杂交反应,然后进行点击化学反应;
将点击化学反应后物料与捕获探针、报告探针、单量子点进行孵育,然后进行荧光检测。
本发明所述的检测miRNAs的方法优选以非疾病的诊断与治疗为目的。
为了提高检测灵敏度,该实施方式的一些实施例中,将含有待测miRNAs的样品与DNA探针1、DNA探针2、DNA探针3和DNA探针4进行杂交反应,然后进行点击化学反应。
为了提高检测的特异性,该实施方式的一些实施例中,采用剪切酶处理点击化学反应后物料,然后与捕获探针、报告探针、单量子点进行孵育。采用剪切酶进行消化处理,能够消除假阳性从而提高检测的特异性,处理过程包括消化反应过程和终止反应过程,消化反应过程的温度为35~39℃,终止反应过程的温度为75~85℃;消化反应的时间为35~45分钟,终止反应的时间为15~25分钟。
该实施方式的一些实施例中,杂交反应的温度为80~90℃,点击化学反应的温度为20~30℃。当同时加入DNA探针1、DNA探针2、DNA探针3和DNA探针4时,进行若干次热循环反应;一次热循环反应为先在80~90℃的环境中进行反应,然后在20~30℃的环境中进行反应;热循环反应的次数为40~60次。80~90℃温度下反应的时间为20~35s,20~30℃温度下反应的时间为145~155s。
该实施方式的一些实施例中,孵育的温度为室温。本发明所述室温是指室内环境的温度,一般为15~30℃。孵育时间为15~25分钟。
该实施方式的一些实施例中,荧光检测中激发波长为487~489nm,采用604~606nm和/或669~671nm处的发射强度进行数据分析。
本发明的第三种实施方式,提供了一种上述点击化学介导的单量子点纳米传感器在制备检测癌细胞制剂中的应用。
本发明的第四种实施方式,提供了一种miRNAs的检测试剂盒,包括上述点击化学介导的单量子点纳米传感器、缓冲溶液。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
材料和试剂。除miRNA-155外,所有高效液相色谱(HPLC)纯化的寡核苷酸(如表1所示)均由生工生物技术有限公司(中国上海)合成。miRNA-155由TaKaRa Bio合成。(中国大连Inc.)核酸外切酶I(Exo I),10×Exo I反应缓冲液(670mM甘氨酸-KOH,67mM MgCl2、100mM2-巯基乙醇(β-ME),pH 9.5),核酸外切酶III(Exo III),10×NEBuffer 1(100mM Bis-Tris-丙烷-HCl,100mM MgCl2、10mM DTT,pH 7),RNase抑制剂购自New England Biolabs(美国,马萨诸塞州,伊普斯威奇)。氯化镁(MgCl2),硫酸铵((NH4)2SO4)购自Sigma-AldrichCompany(美国,密苏里州,圣路易斯)。Tris-HCl购自Invitrogen Corporation(美国,加利福尼亚州,卡尔斯巴德)。涂有链霉亲和素的605量子点(QD)购自Thermo FisherScientific(美国,马萨诸塞州)。焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水(无RNase)购自BeyotimeBiotechnology Co.Ltd.(中国上海)。磷酸盐缓冲液(PBS)和SYBR Gold购自LifeTechnologies(美国,加利福尼亚州,卡尔斯巴德)。人宫颈癌细胞系(HeLa细胞),人肝细胞系(HL-7702细胞),人乳腺腺癌细胞系(MCF-7细胞)购自中国科学院细胞系(中国上海)。非小细胞肺癌(NSCLC)患者和健康人的组织样本从广东医科大学附属医院(广东镇江)获得,并经广东医科大学附属医院伦理委员会批准进行实验。
表1 寡核苷酸序列
DNA探针2中,“*”代表硫代磷酸酯基团。
下划线表示不匹配的单碱基。
循环点击化学介导的三环LCR扩增。循环点击化学介导的三环LCR扩增是在20μL反应体系中进行的,其中包含2μL PBS(0.1M NaCl,pH 7.4),0.5μL RNase抑制剂,400nM DNA探针1、400nM DNA探针2、400nM DNA探针3、400nM DNA探针4和一定量的目标miRNA-155。反应进行50个热循环,85℃下进行30s,25℃下进行150s。
Exo I和Exo III处理。三环LCR后,将36U Exo I,36U Exo III,2μL 10×Exo I反应缓冲液和2μL 10×NEBuffer I添加到10μL反应混合物中,最终体积为20μL以消化过量的DNA探针1、3和4,以及探针3-4连接产物。消化反应在37℃下进行40分钟,然后在80℃下终止20分钟。
杂交反应。杂交反应在含有100mM Tris-HCl(pH=8.0),10mM(NH4)2SO4、3mMMgCl2、100nM Cy5标记的报告探针,100nM生物素化捕获探针和10μL经过Exo I、Exo III处理后的探针1-2连接产物的溶液中进行。在室温下处理20分钟后,获得三明治杂交体(Cy5标记的报告探针与生物素化的捕获探针的摩尔比保持为1:1)。随后,将链霉亲和素包被的605QD加入到溶液中,终浓度为2.78nM,随后在室温下旋转10分钟以形成605QD-寡核苷酸-Cy5纳米结构。
凝胶电泳分析。三环LCR扩增反应后,在1×TBE缓冲液(9mM硼酸、0.2mM EDTA、9mMTris-HCl、pH 7.9)中,110V恒压、室温下,用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析产物。用SYBR Gold作为荧光指示剂,用1×SYBR Gold对凝胶进行染色,并使用ChemiDoc MP成像系统(美国,加利福尼亚州,赫拉克勒斯)进行显像。
荧光检测。使用F-7000荧光测量光谱仪(日立,日本)在激发波长为488nm处测量荧光光谱,在550~750nm处扫描发射光谱。采用605nm处(605QDs的最大发射量)和670nm处(Cy5的最大发射量)的发射强度进行数据分析。
原理见图1。该检测包括(1)miRNA驱动的点击化学介导的三环LCR扩增,(2)基于单量子点的FRET测量。本实施例使用miRNA-155作为模型靶标。miRNA-155在多种癌症过程中过度表达,包括人类宫颈癌和乳腺癌。DNA探针1和2是专门设计用来启动点击化学介导的连接反应的。DNA探针1在3'端包含叠氮(N3)修饰,探针2在3'端分别用一些硫代磷酸酯和5'端用二苯并环辛炔(DBCO)进行了修饰。当目标miRNA-155出现时,与DNA探针1和探针2杂交,形成三明治杂交,使两个探针中的DBCO和N3基团靠近,在pH=7.4的PBS溶液中完成点击化学连接。所得探针1-2的连接产物可以用作后续三环LCR反应的模板。然后在85℃变性会释放目标miRNA-155,该靶标可与新的DNA探针1和DNA探针2杂交,通过85℃和25℃的热循环引发环状点击化学连接反应,产生大量的1-2个探针产品。随后,本实施例分别引入了与DNA探针1和2互补的DNA探针3和4。DNA探针3在5'端修饰一个N3,DNA探针4在3'端修饰一个DBCO。第一个循环得到的探针1-2连接产物可以作为DNA探针3、4的模板,通过点击反应介导连接得到探针3-4连接产物。85℃变性释放探针3-4连接产物,探针1-2连接产物将不断与新探针3、探针4杂交,通过85℃和25℃的热循环启动循环连接反应,产生大量探针3-4连接产物(图1,第二循环)。第二个循环中获得的探针3-4连接产物可以作为游离DNA探针1和2的新模板,通过循环点击反应介导的温度为85℃和25℃的热循环,获得丰富的新探针1-2连接产物(图1,第三个循环)。随后加入的Exo III和Exo I可以消化过量的DNA探针1、3和4以及探针3-4连接产物,但是由于DNA探针2的硫代磷酸酯修饰,探针1-2的连接产物不能被消化。可以防止Exo III和Exo I的消化。剩余的探针1-2连接产物可以与生物素化的捕获探针和Cy5修饰的报告探针杂交以获得三明治杂交结构,它可以自组装到链霉亲和素官能化的605QDs上,通过链霉亲和素与生物素的相互作用获得QD寡核苷酸–Cy5纳米结构,诱导QD供体和Cy5受体之间有效的FRET,从而诱导Cy5的发射。可以通过定量Cy5信号来测量miRNA-155的浓度。当目标miRNA-155缺失时,由于两个DNA探针相距较远,N3与DBCO之间不会发生点击化学连接反应。因此,既没有探针1-2连接产物,也没有QD-寡核苷酸-Cy5纳米结构,结果无法检测到Cy5发射。
1、原理的实验验证
本实施例分别进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(图2A)和荧光测量(图2B)来验证该检测。该检测主要依靠miRNA驱动的无酶点击化学连接来启动三环LCR扩增。以SYBR Gold为指示剂的12%非变性PAGE分析LCR扩增产物,见图2A。在没有miRNA-155的情况下,仅观察到两条11bp和15bp的条带(图2A,泳道4),分别与探针1-3杂交产物(图2A,泳道2)和探针2-4杂交产物(图2A,泳道3)相同,表明既没有点击化学连接也没有LCR扩增。相反,miRNA的存在会导致产生一条26bp的独特新条带(图2A,泳道5),这是探针1-2连接产物和探针3-4连接产物的最终杂交产物,表明miRNA-155可以成功启动循环点击化学介导的三环LCR扩增。
本实施例测量了miRNA-155缺失时和存在时QD和Cy5的荧光发射光谱,见图2B。当miRNA-155缺失时,无法启动click反应介导的LCR扩增,也无法在QD表面组装Cy5修饰的报告探针。结果只检测到QD荧光信号,未观察到明显的Cy5荧光信号。相反,miRNA-155的存在可以启动无铜、无酶循环点击化学介导的三环LCR扩增,产生丰富的探针1-2连接产物,可与生物素化的捕获探针和Cy5修饰的报告探针杂交,获得QD-寡核苷酸-Cy5纳米结构。因此,QD到Cy5之间发生了有效的FRET,导致QD荧光信号减少,Cy5荧光信号增加。根据公式1计算FRET效率(E)为59%,
E(%)=(1-FDA/FD)×100% (1)
其中FD和FDA分别是不存在和存在miRNA-155时的QD荧光强度。
为了进一步验证QD-寡核苷酸-Cy5纳米结构中QD和Cy5之间的有效FRET,本实施例进一步测量了QD的荧光寿命,如图2C所示。当没有miRNA-155时,QD的平均寿命为26.44ns,而在miRNA-155存在时,QD的平均寿命降低到9.68ns,表明miRNA-155诱导的QD和Cy5之间的有效FRET。根据等式2,FRET效率(E)计算为63%。
E(%)=(1-τDA/τD)×100% (2),
其中,τDA为存在miRNA-155时QD的荧光寿命,τD为未存在miRNA-155时QD的荧光寿命。所得的FRET效率与集成荧光光谱测量的FRET效率接近(图2B),说明无铜、无酶点击化学介导的单QD纳米传感器可以准确检测miRNA-155。
2、灵敏度检测
本实施例在优化的实验条件下使用基于单量子点的纳米传感器测量不同浓度miRNA-155对Cy5计数的响应的方差。如图3所示,随着miRNA-155浓度从1×10-16M增加到1×10-8M,Cy5计数增加,Cy5计数与miRNA-155浓度在1×10-16M至1×10-9M范围内的7个数量级的对数之间具有良好的线性相关性(图3插图)。回归方程为N=407.72+23.38log10 C(R2=0.9978),其中N为Cy5计数,C为miRNA-155浓度。通过计算对照组加上标准偏差的三倍,计算出的检出限为3.87×10-17M,优于集成荧光测量法,如图4所示。与无标记荧光检测法相比,此FRET纳米传感器的灵敏度提高了5684.75倍,与纳米光子开关荧光法相比,提高了2583.98倍,与肽核酸电化学法相比,提高了300.52倍,与基于纳米结构的电化学分析相比,提高了258.40倍。灵敏度的提高可归因于以下四个因素:(1)点击反应介导的连接反应的高效率可产生大量的探针1-2连接产物和探针3-4连接产物以引发三环LCR扩增反应,(2)三环LCR的高扩增效率可以产生大量的探针1-2个连接产物,(3)改进的FRET效率是由于QD-寡核苷酸-Cy5纳米传感器中的单个QD/多个Cy5受体引起的,以及(4)单分子检测具有高信噪比和接近零背景的特征。
3、特异性检测
本实施例使用四个不相关的miRNA(包括miRNA-141,miRNA-210,let-7a和miRNA-214)评估了提出的纳米传感器的特异性。如图5A所示,10nM目标miRNA-155产生的高Cy5信号,分别比10nM let-7a、10nM miRNA-141、10nM miRNA-210、10nM miRNA-214产生的信号高9.97、10.27、8.81和10.27倍。本实施例进一步使用了错配的miRNA 1(misR-1),错配了miRNA 2(misR-2),错配的miRNA 3(misR-3)和错配的miRNA 4(misR-4),与靶标miRNA-155在不同位置仅存在一个核苷酸差异,以评估这种纳米传感器区分单碱基错配的能力。响应10nM miRNA-155的Cy5信号分别比响应10nM misR-1、10nM misR-2、10nM misR-3、10nMmisR-4的Cy5信号高5.27、6.28、6.23和6.07倍,如图5B所示,这表明该纳米传感器具有良好的选择性,并具有区分单碱基不匹配的能力。这种纳米传感器的高特异性可以归因于以下两个因素:(1)点击反应介导的连接反应和三环LCR扩增的特异性高,(2)通过Exo III/ExoI介导的过量DNA探针1、3和4和探针3-4连接产物的消化消除假阳性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 点击化学介导的单量子点纳米传感器及检测miRNAs的方法与应用
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> RNA
<213> 人工序列
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Claims (10)
1.一种点击化学介导的单量子点纳米传感器,其特征是,包括:
DNA探针1和DNA探针2,DNA探针1的一端与DNA探针2的一端能够通过点击化学反应连接,连接后的DNA探针1和DNA探针2能够与待测miRNAs互补;
捕获探针和报告探针,所述捕获探针和报告探针能够同时与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补,所述报告探针连接荧光团;
单量子点,所述单量子点能够与捕获探针自组装连接,且所述单量子点能够与所述荧光团产生荧光共振能量转移。
2.如权利要求1所述的点击化学介导的单量子点纳米传感器,其特征是,包括DNA探针3和DNA探针4,DNA探针3的一端与DNA探针4的一端能够通过点击化学反应连接,连接后的DNA探针3和DNA探针4能够与连接后的DNA探针1和DNA探针2互补。
3.如权利要求1所述的点击化学介导的单量子点纳米传感器,其特征是,包括剪切酶,所述剪切酶能够消化杂质DNA链,所述杂质DNA链为没有连接硫代磷酸酯的DNA,DNA探针2的另一端连接硫代磷酸酯。
4.如权利要求1所述的点击化学介导的单量子点纳米传感器,其特征是,通过叠氮化物和二苯环辛炔进行点击化学反应。
5.如权利要求1所述的点击化学介导的单量子点纳米传感器,其特征是,所述剪切酶为Exo I和/或Exo III;
或,单量子点为605QDs,荧光团为Cy5;
或,单量子点表面连接链霉亲和素,捕获探针连接生物素。
6.一种检测miRNAs的方法,其特征是,提供权利要求1~5任一所述的点击化学介导的单量子点纳米传感器;
将含有待测miRNAs的样品与DNA探针1、DNA探针2进行杂交反应,然后进行点击化学反应;
将点击化学反应后物料与捕获探针、报告探针、单量子点进行孵育,然后进行荧光检测。
7.如权利要求6所述的检测miRNAs的方法,其特征是,将含有待测miRNAs的样品与DNA探针1、DNA探针2、DNA探针3和DNA探针4进行杂交反应,然后进行点击化学反应;
或,采用剪切酶处理点击化学反应后物料,然后与捕获探针、报告探针、单量子点进行孵育。
8.如权利要求6所述的检测miRNAs的方法,其特征是,杂交反应的温度为80~90℃,点击化学反应的温度为20~30℃;
或,孵育的温度为室温;
或,荧光检测中激发波长为487~489nm,采用604~606nm和/或669~671nm处的发射强度进行数据分析。
9.一种权利要求1~5任一所述的点击化学介导的单量子点纳米传感器在制备检测癌细胞制剂中的应用。
10.一种miRNAs的检测试剂盒,包括权利要求1~5任一所述的点击化学介导的单量子点纳米传感器、缓冲溶液。
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