CN110398481A - 一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其制备方法和应用，由两个发夹DNA探针、链霉亲和素蛋白修饰的量子点组成，其中一个发夹DNA探针为生物素标记的捕获探针，另一个发夹DNA探针为荧光团花菁5标记的信号探针，两个发夹DNA探针组装在链霉亲和素蛋白修饰的量子点(SA‑QDs)表面，形成单个量子点荧光纳米传感器。在检测癌细胞中的内源性microRNA和患者血液样本中的循环microRNA中具有应用，具有高选择性。

Description

一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
微小RNA(microRNA)是小的、单链、非蛋白质编码的RNA，广泛存在于植物和动物中。作为基因表达的转录后调节因子，microRNA参与多种正常的生理过程，如细胞增殖，分化和死亡。同时，microRNA的异常表达水平与各种人类疾病密切相关，如神经退行性疾病，心脏病，阿尔茨海默病和癌症。此外，最近的研究表明，血液中存在的循环microRNA被认为是稳定的生物标志物，可用于癌症和其他疾病的非侵入式诊断和预后。因此，开发有效的microRNA检测方法对于基础生物医学研究和疾病诊断都具有重要意义。
Northern blot是microRNA检测的金标准，但是其操作非常繁琐、样品消耗大且检测灵敏度不高。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)可极大地提高microRNA检测灵敏度，但需要精确控制热循环的反应温度。为了避免热循环，已经开发了多种等温扩增方法以在恒定温度下进行microRNA检测，包括滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导的等温扩增(LAMP)和指数扩增反应(EXPAR)。然而，它们需要昂贵且不稳定的酶、复杂的引物/模板设计和存在较高的背景信号。此外，现有的microRNA检测通常使用有机荧光团作为信号输出分子，具有宽发射带和信号输出光化学稳定性差等缺点，极大地限制了它们在常规实践中的适用性和准确性。
作为传统有机染料的替代品，半导体量子点(QD)具有一系列优越的特性包括宽激发波长、窄和尺寸可调的发射波长、高量子产率、长荧光寿命和良好的光稳定性，被认为是理想的荧光标记。到目前为止，已发展多种基于量子点组装体用于生物分子检测。一些典型的例子包括麦芽糖结合蛋白-β-环糊精-QSY9-QD组装体用于麦芽糖检测，适配体修饰的量子点用于凝血酶检测，QD/共轭聚合物/染料标记的DNA组装体用于DNA检测，Tb-QDs复合物用于多重microRNA检测等。然而，这些量子点生物传感器通常灵敏度较低(高于纳摩尔每升)，因此仍然需要额外的酶催化信号放大步骤来实现足够的灵敏度，用以检测低浓度的靶标分子。例如，DNA聚合酶辅助的RCA联合QD标记技术用于人血管内皮生长因子(VEGF)检测，检测限为1埃摩尔每升；使用DNA功能化QD和核酸外切酶刺激的靶标回收策略用于DNA检测，检测限为1皮摩尔每升，DNA聚合酶和内切酶辅助的两步EXPAR与QDs标记相结合用于microRNA检测，检测限为0.1埃摩尔每升。然而，这些方法使用酶催化的信号放大将不可避免地增加检测成本、使方案设计复杂化和降低检测准确度。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的一个目的是提供一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其制备方法和应用。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器，由两个发夹DNA探针、链霉亲和素蛋白修饰的量子点(SA-QDs)组成，其中一个发夹DNA探针为生物素标记的捕获探针，另一个发夹DNA探针为荧光团花菁5(Cy5)标记的信号探针，两个发夹DNA探针组装在SA-QDs表面，形成单个量子点荧光纳米传感器。
捕获探针和信号探针双链体通过链霉亲和素-生物素相互作用组装在链霉亲和素修饰的量子点表面，形成SA-QDs/DNA/Cy5纳米复合物。
依靠SA-QDs/DNA/Cy5纳米复合物中SA-QDs与Cy5的荧光共振能量转移，对于荧光分子Cy5的选择，虽然现有技术已有多种可与量子点发生荧光共振能量转移的荧光染料分子，如TAMRA/Cy3/Texas Red/罗丹明等，但发明人通过对比试验研究发现，SA-QDs/Cy5这一对组合在本发明所述方法中的荧光共振能量转移(FRET)效率更高。
在一些实施例中，所述发夹捕获探针长度为54nt，其碱基序列为：5'-ATA AGC TAGCTA GGTTTCAACATC TAG CTTATC AGA CCGATGTTG AAA CCTAGC-3'。生物素标记的发夹捕获探针为5'-ATA AGC TAG CTA GGTTTCAACATC TAG CTTATC AGA CCGATGTTG AAA CCTAGC-Biotin-3'
在一些实施例中，所述发夹信号探针长度为52nt，其碱基序列为：5'-TCAACATC AGTCTGATAAGCT AGA TGTTGAAAC CTA GCTAGCTTATCAGAC T-3'。荧光团花菁5(Cy5)标记的信号探针5'-Cy5-TCAACATC A GTCTGATAAGCT AGA TGTTGAAAC CTA GCTAGCTTATCAGAC T-3'
在一些实施例中，量子点为605QDs。所述量子点为streptavidin-coated CdSe/ZnSQDs，最大发射波长为605纳米。当量子点为605QDs，所形成的链霉亲和素蛋白修饰的量子点即为SA-605QDs。
在一些实施例中，单个量子点荧光纳米传感器还包括反应缓冲溶液，组成为三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化钠、氯化钾。
优选的，反应缓冲溶液的浓度为0.04-0.06毫克每毫升；优选的，反应缓冲液的组成为18-22毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，135-145毫摩尔每升的氯化钠，4-6毫摩尔每升的氯化钾；优选的，pH为7.5。
第二方面，单个量子点荧光纳米传感器的制备方法，具体步骤为：
1)将捕获探针和信号探针分别在反应缓冲液中孵育，分别得到发夹结构的捕获探针和信号探针；
2)将发夹结构的捕获探针和信号探针混合进行孵育，然后加入链霉亲和素蛋白修饰的量子点后继续孵育，得到单个量子点荧光纳米传感器。
孵育为发夹结构的探针的目的是将直线型探针转变为具有检测功能的发夹状探针。
在一些实施例中，反应缓冲液由18-22毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，135-145毫摩尔每升的氯化钠，4-6毫摩尔每升的氯化钾，缓冲液的pH为7.5。在一些实施例中，步骤1)的孵育条件为：90-100℃下孵育4-6分钟。在一些实施例中，发夹结构的捕获探针溶液、发夹结构的信号探针溶液、反应缓冲液、链霉亲和素蛋白修饰的量子点的体积比为19-21：1.7-1.9：2：1：2；发夹结构的捕获探针溶液的浓度为2微摩尔每升，发夹结构的信号探针溶液的浓度为2微摩尔每升。在一些实施例中，步骤2)的第一次孵育的条件为：37℃下孵育2.5-3.5小时；第二次孵育的条件为：37℃下孵育4-6分钟。
第三方面，上述单个量子点荧光纳米传感器在检测癌细胞中的内源性microRNA或患者血液样本中的循环microRNA中的应用。
第四方面，单个量子点荧光纳米传感器检测循环microRNA的方法，具体步骤为：
(1)将待测样品加入所述纳米传感器的反应体系中进行反应；
(2)向步骤(1)中加入链霉亲和素蛋白修饰的量子点进行孵育反应；
(3)对Cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的microRNA。
在一些实施例中，所述步骤(1)中反应温度为36-38℃，反应时间为2.5-3.5h。在一些实施例中，所述步骤(2)中孵育反应温度为36-39℃，反应时间为6-13min。
Cy5的荧光信号检测方法为全内角反射荧光技术(TIRF)的单分子检测系统，其原理是通过全内反射荧光成像对单个荧光信号分子进行成像，然后对荧光分子的数目进行统计，实现对靶标浓度的定量。
所述步骤(1)中纳米传感器的反应体系中由发夹结构的捕获探针和信号探针组成。
本发明所述纳米传感器检测方法的原理为：本发明技术方案首先设计了两个发夹DNA探针(即生物素标记的捕获探针和荧光团Cy5标记的信号探针)。捕获探针/信号探针双链体通过链霉亲和素-生物素相互作用组装在链霉亲和素修饰的量子点表面，形成605QD/DNA/Cy5纳米复合物。在该复合物中，由于605QD和Cy5可忽略的发射串扰以及605QD的发射和Cy5激发之间的显着光谱重叠，605QD用作荧光共振能量转移的供体，且Cy5用作荧光共振能量转移的受体。理论上，DNA中相邻碱基之间的距离约为0.34纳米，链霉亲和素修饰的605QD的最大半径为7.5纳米。605QD/DNA/Cy5纳米复合物中的605QD与Cy5之间的距离估算为10.22纳米，在荧光共振能量转移(FRET)的范围内(605QD/Cy5对的2R0＝13.88纳米)。在靶microRNA的存在下，它可以与捕获探针的toehold 1结构域结合形成microRNA/捕获探针双链体，并导致捕获探针的toehold 2结构域的暴露。然后，信号探针可以通过toehold 2与捕获探针结合引链迁移反应，形成捕获探针/信号探针双链体，并释放microRNA。游离microRNA可以与新的捕获探针结合，以催化捕获探针/信号探针双链体的下一轮自组装。捕获探针/信号探针双链体可进一步组装在量子点表面，形成605QD/DNA/Cy5纳米复合物，诱导有效的荧光共振能量转移FRET发生，信号可通过基于全内反射荧光成像(TIRF)的单分子检测灵敏且容易地检测到。相反，在没有microRNA的情况下，没有捕获探针/信号探针双链体形成，只有捕获探针可以组装在量子点的表面，因此不会发生FRET。该生物传感器中，microRNA本身作为有效催化剂，扩增原始靶标信号以提高测定灵敏度，从而避免使用任何昂贵且不稳定的酶，为发展简单、可靠和高灵敏度的生物传感应用提供崭新的平台。
本发明的有益效果：
1.本发明制备得到的纳米传感器用于检测循环microRNA时，microRNA本身作为有效催化剂通过催化QD/DNA/Cy5纳米结构的组装来扩增原始靶信号，整个过程避免了复杂的检测设计和繁琐的信号放大步骤，同时利用单分子检测技术分析时间短，样品消耗少的优点，提高了检测的简便性，并有效降低了假阳性信号的产生；
2.本发明充分利用了单分子检测的高信噪比以及基于单个量子点的荧光共振能量转移的纳米传感器的非常低的背景水平，通过结合单分子计数技术和基于单量子点的荧光共振能量转移，实现对靶标的高灵敏度，低检测限为8.16×10-16摩尔每升，与没有信号放大的报道的基于QD的microRNA测定相比，灵敏度提高了6个数量级，所提出单个量子点生物传感器实现高选择性，可识别单碱基靶标错配；
3.本发明还可以进一步应用于准确检测癌细胞中的内源性microRNA和患者血液样本中的循环microRNA，其检测结果与通过标准的qRT-PCR方法获得的结果类似，在microRNA相关疾病诊断中具有巨大潜力，为简单、可靠和高灵敏度的生物传感应用提供新的平台。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器用于循环microRNA检测原理；
图2为琼脂糖凝胶电泳和荧光发射光谱图；(A)：PAGE凝胶电泳分析发夹探针的组装反应；泳道M：DNA标记；泳道1：捕获探针；泳道2：信号探针；泳道3：捕获探针+信号探针；泳道4：捕获探针+信号探针+miR-21。(B)-(D)：1％琼脂糖凝胶电泳分析量子点组装产物。在靶miR-21不存在(泳道1)和存在(泳道2)的情况下QD/DNA/Cy5组装的琼脂糖凝胶分析。605QD的信号(B)，Cy5的信号(C)，605QD和Cy5的共定位信号(D)。(E)：不存在(对照)和存在miR-21时605QD和Cy5的荧光发射光谱，插图显示了650纳米至720纳米的放大荧光光谱；miR-21的浓度为20纳摩尔每升；图2E中G表示Control，H表示miR-21；
图3为在miR-21不存在(A-C)和存在(D-F)的情况下605QD和Cy5的单分子荧光图像。605QD的信号(A和D)，Cy5的信号(B和E)，605QD和Cy5的共定位信号(C和F)；miR-21的浓度为20纳摩尔每升；比例尺为2微米；
图4为Cy5点数与miR-21浓度在10-15摩尔每升到10-7摩尔每升范围内的线性关系；误差棒代表三次实验的标准偏差；
图5为对照组、let-7a、let-7b、let-7c、miR-155、M-miR-21和miR-21(红色柱)对Cy5点数的影响。所有microRNA的浓度均为100纳摩尔每升。误差棒代表三次实验的标准偏差；
图6为分别使用qRT-PCR和量子点生物传感器检测HL-7702、HeLa和A549细胞中的miR-21表达；所有细胞系的数量为1000个。误差棒代表三次实验的标准偏差,qizhong，其中A表示Qrt-PCR，B表示QDnanosensor；
图7为分别使用qRT-PCR和量子点生物传感器检测正常人和肺癌患者血清样品中的循环miR-21；误差棒代表三次实验的标准偏差，图7中每个横坐标对应的两个纵坐标，从左至右依次为Qrt-PCR method、QDnanosensor。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1
循环microRNA的检测及QD/DNA/Cy5纳米复合物的形成：循环microRNA检测包括二个连续的步骤：第一，信号探针与捕获探针在1×反应缓冲液(20毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，140毫摩尔每升的氯化钠，5毫摩尔每升的氯化钾，pH 7.5)中稀释至2微摩尔每升，然后在95℃下孵育5分钟，并缓慢降至室温以形成发卡结构。制备好的发卡结构探针立即使用或置于-20℃备用。第二，60微升反应体系包括指定浓度的miR-21，5.4微升捕获探针(2微摩尔每升)、5.4微升信号探针(2微摩尔每升)、6微升10×反应缓冲液(200毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1.4摩尔每升的氯化钠，50毫摩尔每升的氯化钾，pH 7.5，于37℃反应3小时，然后添加6微升605QDs(50纳摩尔每升)，继续于37℃孵育10分钟，形成605QD/DNA/Cy5纳米结构。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：探针自组装产物用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，电泳缓冲液为1×TBE缓冲液(9毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 7.9，9毫摩尔每升的硼酸，0.2毫摩尔每升的乙二胺四乙酸)；上样后在110伏特恒定电压下电泳50分钟；量子点组装产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，电泳缓冲液为1×TAE缓冲液(40毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-醋酸，2毫摩尔每升的乙二胺四乙酸，pH 8.0)；上样后在在110伏特恒定电压下电泳80分钟；最后通过ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行凝胶成像分析。
荧光测量：50微升反应产物在Hitachi F-7000荧光分光光度计(Tokyo，Japan)上使用痕量石英比色皿测量。激发波长为488纳米，测量550纳米至750纳米范围内的发射光谱，激发和发射的狭缝宽度均为5纳米。
单分子检测及数据分析：在单分子检测之前，首先将反应产物用1×成像缓冲溶液(1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶，0.4％(w/v)的D-葡萄糖，0.04％毫克每毫升的过氧化氢酶，67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾，1毫克每毫升的水溶性维生素E，2.5毫摩尔每升的氯化镁，pH为9.4)稀释25倍。然后直接将10微升样品滴到盖玻片上进行全内反射荧光单分子成像。使用蓝宝石488纳米激光源(50毫瓦,Coherent,USA)激发量子点605QD，通过100×物镜(Olympus，Japan)收集量子点和Cy5产生的光子，最后用AndorIxonDU897EMCCD相机以500毫秒的曝光时间成像。使用image J软件选择600×600像素大小的图像区域进行Cy5荧光团的单分子计数。
qRT-PCR检测：反转录体系为10微升，包括1微升10×反转录缓冲液(500毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，750毫摩尔每升的氯化钾，30毫摩尔每升的氯化镁，100毫摩尔每升的二硫苏糖醇，pH 8.3)，0.5微升dNTP混合物(10毫摩尔每升)，0.5微升反转录引物(1微摩尔每升)，0.25微升反转录酶M-MuLV(200个单位每微升)，指定含量的miR-21样品。反转录反应在42℃下反应45分钟，然后70℃继续反应15分钟终止反应。PCR体系为10微升，包括5微升universal qPCR预混液，0.25微升上游引物(10毫摩尔每升),0.25微升下游引物(10毫摩尔每升)和1微升上述反转录产物。PCR程序如下：95℃反应10秒，60℃反应30秒，循环50次。利用Bio-Rad CFX connect Real-Time System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)进行实时定量检测。
细胞培养及RNA提取：人肺腺癌细胞系(A549)，人宫颈癌细胞系(HeLa)和人肝细胞系(HL-7702)在5％二氧化碳培养箱于37℃培养，培养基为含有10％胎牛血清(FBS)和1％双抗的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)。使用QiagenmiRNeasy RNA提取试剂盒根据说明书从细胞或人血液样品中提取总RNA，并通过NanoDrop2000c分光光度计(ThermoScientific，Wilmington，Delaware，USA)测定总RNA的浓度。
本发明技术方案选择miR-21作为模型靶标以验证所提出的生物传感器的可行性。miR-21是致癌过程的关键调节因子，并且在多种类型的癌症如脑、肝、前列腺和肺癌中被激活。我们首先使用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SYBR Gold作为染色剂来验证靶标诱导的捕获探针和信号探针的组装。如图2A所示，在存在miR-21的情况下，观察到明显的捕获探针/信号探针双链体条带(泳道4)，伴随着捕获探针(泳道1)和信号探针条带的消失(泳道2)，表明miR-21能够催化捕获探针和信号探针的循环杂交以形成稳定的捕获探针/信号探针双链体。相反，在没有miR-21的情况下，没有观察到捕获探针/信号探针双链体条带(泳道3)，表明没有miR-21就不能形成捕获探针/信号探针双链体。
我们采用1％琼脂糖凝胶电泳，通过直接激发605QD来验证靶标诱导的605QD/DNA/Cy5纳米结构的组装。在没有miR-21的情况下，仅观察到具有605QD信号的条带(图2B，泳道1)，并且没有观察到具有Cy5信号的条带(图2C，泳道1)。相反，当存在miR-21时，605QD(图2B，泳道2)和Cy5(2C，泳道2)的条带都可以检测到，且完美共定位(图2D，泳道2)，表明靶标可诱导的605QD/DNA/Cy5结构的自组装及随后从605QD到Cy5的有效FRET。
我们进一步使用荧光发射光谱测量来研究605QD/DNA/Cy5纳米结构组装反应。如图2E所示，在没有miR-21的情况下，没有Cy5标记的信号探针可以组装在量子点的表面上以诱导FRET，因此没有检测到Cy5信号(图2E，黑线)。相反，靶miR-21的存在可诱导605QD/DNA/Cy5纳米结构形成，导致605QD发射信号的减少和Cy5发射信号的增加(图2E，红线)。基于下面等式计算FRET效率(E)为61.73％：E＝1-FmiR-21/F，其中FmiR-21是存在miR-21时605QD的荧光强度，F是指不存在miR-21时605QD的荧光强度。
与传统的荧光测量相比，单分子检测具有超高灵敏度，低样品消耗，高信噪比和短分析时间等显着优势。我们采用基于TIRF成像的单分子荧光成像进一步检测来自单个605QD/DNA/Cy5组装体的信号。如图图3所示，在没有靶microRNA的情况下，仅观察到605QD的信号(图3A)，并且未观察到Cy5信号(图3B)，表明没有形成605QD/DNA/Cy5组装体且没有发生FRET。相反，当存在miR-21时，观察到明显的Cy5信号(图3E)，且与605QD信号完美共定位(图3F)和，表明从QD到Cy5的有效FRET发生。这些结果清楚地证明该量子点生物传感器可用于microRNA检测。
本发明的纳米生物传感器的灵敏度分析：
在优化的实验条件下，我们通过测量不同浓度的靶标miR-21对Cy5点数的影响来测试该生物传感器的灵敏度。如图4所示，Cy5点数随着miR-21浓度在在10-15摩尔每升到10-7摩尔每升范围内的增加而增加且呈良好的线性相关。回归方程为N＝1095.41+65.97log10C，相关系数(R2)为0.998，这里N代表Cy5点数，C代表miR-21浓度。理论检测限计算为8.16×10-16摩尔每升，比没有信号放大基于量子点生物传感器的microRNA检测方法灵敏度提高了6个数量级(1纳摩尔每升)。该灵敏度的显着提高可归因于：(1)靶标引发的催化自组装反应导致的有效信号放大；(2)多个Cy5标记双链体组装到单个量子点上而导致的FRET效率提高；(3)单分子荧光具有高灵敏度和高信噪比。综上说明该技术方案的灵敏度足够高。
特异性分析：我们通过测量包括let-7a、let-7b、let-7c和miR-155在内的四种不相关的microRNA以及单碱基错配的miR-21的信号，进一步测试了该生物传感器的特异性。如图5所示，在let-7a、let-7b、let-7c和miR-155存在时没有产生明显的Cy5信号，类似于没有任何目标的对照。相反，在目标miR-21存在时Cy5信号显著提高，比let-7a、let-7b、let-7c和miR-155产生的信号分别高7.46、7.68、7.94和7.45倍。此外，靶标miR-21的信号甚至比单碱基错配的M-miR-21的信号高3.64倍。由此表明，本技术方案所提出的生物传感器具有单碱基分辨率的高特异性。
细胞中microRNA检测
为了测试本技术方案所提出的生物传感器用于实际样品分析的能力，我们检测了三种不同细胞系中的miR-21表达，包括人肝细胞系HL-7702，人宫颈癌细胞系HeLa和人肺癌细胞系A549。如图6所示，与不存在任何细胞的对照样品相比，在HL-7702，HeLa和A549细胞系中观察到明显的Cy5信号，且信号大小符合A549>HeLa>HL-7702的顺序，这与电化学发光microRNA生物传感器和压力生物传感器获得的结果一致。此外，单分子检测结果与标准的qRT-PCR方法获得的结果类似。这些结果表明本技术方案所提出的生物传感器可以准确地应用于细胞内源microRNA检测。
血液中循环microRNA检测
血清中的循环microRNA被认为是潜在的生物标志物，可用于非侵入式癌症诊断和预后。为了验证本技术方案能否用于血液中循环microRNA检测，我们检测了非小细胞肺癌(NSCLC)患者和正常人血清样品的miR-21表达。如图7所示，5个患者样本血清中的miR-21浓度显着高于5个正常样本，患者和正常样本的中位浓度分别为281.93fM和61.85fM，与之前报道的肺癌患者循环miR-21水平显着增加结果一致。此外，这些结果与通过标准的qRT-PCR方法获得的结果类似。因此，所本技术方案提出的生物传感器可以应用于血液中循环microRNA的准确检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种基于无酶催化自组装的单个量子点荧光纳米传感器及其制备方法和应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ataagctagc taggtttcaa catctagctt atcagaccga tgttgaaacc tagc 54
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cytcaacatc agtctgataa gctagatgtt gaaacctagc tagcttatca gac 53

Claims (10)

1.一种基于无酶催化自组装的，其特征在于：由两个发夹DNA探针、链霉亲和素蛋白修饰的量子点组成，其中一个发夹DNA探针为生物素标记的捕获探针，另一个发夹DNA探针单个量子点荧光纳米传感器为荧光团花菁5标记的信号探针，两个发夹DNA探针组装在链霉亲和素蛋白修饰的量子点表面，形成单个量子点荧光纳米传感器。
2.根据权利要求1所述的单个量子点荧光纳米传感器，其特征在于：所述发夹捕获探针长度为54nt，其碱基序列为：5'-ATA AGC TAG CTA GGTTTCAACATC TAG CTTATC AGACCGATGTTG AAA CCTAGC-3'。
3.根据权利要求1所述的单个量子点荧光纳米传感器，其特征在于：所述发夹信号探针长度为52nt，其碱基序列为：5'-TCAACATC A GTCTGATAAGCT AGA TGTTGAAAC CTAGCTAGCTTATCAGAC T-3'。
4.根据权利要求1所述的单个量子点荧光纳米传感器，其特征在于：量子点为605QDs。
5.根据权利要求1所述的单个量子点荧光纳米传感器，其特征在于：还包括反应缓冲溶液，组成为三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化钠、氯化钾；
优选的，反应缓冲液的组成为18-22毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，135-145毫摩尔每升的氯化钠，4-6毫摩尔每升的氯化钾；优选的，pH为7.5。
6.权利要求1至5任一所述的单个量子点荧光纳米传感器的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
1)将捕获探针和信号探针分别在反应缓冲液中孵育，分别得到发夹结构的捕获探针和信号探针；
2)将发夹结构的捕获探针和信号探针混合进行孵育，然后加入链霉亲和素蛋白修饰的量子点后继续孵育，得到单个量子点荧光纳米传感器；
优选的，反应缓冲液由18-22毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，135-145毫摩尔每升的氯化钠，4-6毫摩尔每升的氯化钾，缓冲液的pH为7.5；
优选的，步骤1)的孵育条件为：90-100℃下孵育4-6分钟；
优选的，发夹结构的捕获探针溶液、发夹结构的信号探针溶液、反应缓冲液、链霉亲和素蛋白修饰的量子点的体积比为19-21：1.7-1.9：2：1：2；发夹结构的捕获探针溶液的浓度为2微摩尔每升，发夹结构的信号探针溶液的浓度为2微摩尔每升；
优选的，步骤2)的第一次孵育的条件为：37℃下孵育2.5-3.5小时；第二次孵育的条件为：37℃下孵育4-6分钟。
7.权利要求1至5任一所述的单个量子点荧光纳米传感器在检测癌细胞中的内源性microRNA或患者血液样本中的循环microRNA中的应用。
8.权利要求1至5任一所述的单个量子点荧光纳米传感器检测循环microRNA的方法，其特征在于：具体步骤为：
(1)将待测样品加入所述纳米传感器的反应体系中进行反应；
(2)向步骤(1)中加入链霉亲和素蛋白修饰的量子点进行孵育反应；
(3)对Cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的microRNA。
9.根据权利要求8所述的检测循环microRNA的方法，其特征在于：步骤(1)中反应温度为36-38℃，反应时间为2.5-3.5h。
10.根据权利要求8所述的检测循环microRNA的方法，其特征在于：步骤(2)中孵育反应温度为36-39℃，反应时间为6-13min。
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