CN104762400A - 一种人肺细胞中let-7a的单分子检测方法 - Google Patents

一种人肺细胞中let-7a的单分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种人肺细胞中let-7a的单分子检测方法，包括：(1)组装DNA四面体探针，得到DNA四面体溶液；(2)制备硅烷化的玻璃基底，然后将DNA四面体溶液加入基底，孵育，得到DNA四面体基底；(3)let-7a的单分子检测：采用标准加入法进行检测，首先将待测物分别加到具有阶梯度浓度的标准let-7a的Tris-HCl溶液中，制成待测样本；然后加入生物素化的ssDNA探针和链霉亲和素化的量子点，在荧光落射显微镜下进行成像，各自清点荧光点的个数，作出标准曲线方程，计算let-7a的浓度。实验结果表明，该方法对miRNA(let-7a)显示了很好的特异性和灵敏性，检测限为5fM。

Description

一种人肺细胞中let-7a的单分子检测方法
技术领域
本发明属于核酸杂交检测领域，涉及一种检测人肺细胞中let-7a的方法，具体地，本发明涉及一种基于DNA四面体基底和粘性末端介导的链置换反应构建的单分子计数策略检测miRNA的方法。
背景技术
microRNA(简写miRNAs)是一类小的、内源性非编码RNA分子(18-24个碱基)，通过介导mRNA切割或翻译抑制参与基因表达的调控。1,2这种调节性功能使得miRNAs能够调节细胞增殖、分化和凋亡。3,4最近，大量证据表明，miRNA的异常表达与癌症的发生、肿瘤的形成和肿瘤对治疗的应答直接相关。3,5因此，miRNAs已被当做癌症诊断和预防的生物标志物。4,6,7Northern印记法、定量实时PCR技术和微阵列技术是miRNA检测的常用方法，但是这些方法具有灵敏度低、样本制备过程复杂和特异性差的缺点。8-10为此，许多新的方法已经被建立起来，以期提高miRNAs分析的准确性。11-17其中，由于具有灵敏度高和易于操作的优点，荧光法是最常见的一种。14-17然而，由于miRNAs链短、浓度低和序列相似性高，对miRNAs的准确识别仍然是一个挑战。18现有的miRNA识别探针都是线型或构象限制型的，它们与目标物的杂交属于直接杂交方式，即，仅涉及两条单链核酸的杂交。 12,13,16,17,19虽然碱基互补配对是自然界中特异性最高的识别方式之一，这种直接杂交的方式仍然很难实现碱基错配的识别。19,20因此，对miRNAs的选择性检测来说，更加严格的识别是十分必要的。
粘性末端介导的链置换反应(SDR)是由目标物和一段短的单链部分(成为“粘性末端”)杂交触发的一种可调控的无酶杂交反应。21与直接杂交方式不同，粘性末端介导的SDR是通过链迁移过程实现的。也就是说，在探针-目标物反应体系中，有一个额外的竞争者，其结合区域的碱基序列与目标物相同。20-23当无目标物存在时，竞争链可以与探针形成稳定的双链结构，当有目标物存在时，该链即可被替换。这种杂交策略能够区分探针和目标物杂交时自由能的微小变化，能够通过动力学的方式识别单碱基错配。24因此，与目标物有单碱基之差的序列不能触发链迁移过程。与简单的沃森-克里克碱基配对相比，粘性末端介导的SDR能够增强核酸识别的特异性，通过调节粘性末端的长度和序列组成即可实现有效的序列识别。20,21,24
单分子计数是一种新型定量方法，与传统的强度测定法不同，这种方法通过清点目标物的个数进行定量，因此更加适用于超低浓度生物标志物的检测。25,26,27现存的单分子计数方法大都需要将目标物固定在基底上，固定能够起到富集和分离的作用，也能保证目标物 分子静止在视野中，以便长时间观察。28,29,30但是，依赖于固定的单分子计数方法具有两个问题，一个是基底的非特异性吸附问题，能够导致假阳性信号的产生，降低方法的灵敏度。解决这个问题的常用方法是对基底进行封闭，但是封闭剂的使用可能会阻碍目标物与结合位点的靠近，使目标物难以结合到基底上。31,32,33另一个是由于基底上探针分布不均而造成的目标物和探针结合效率低的问题。34为了解决这两个问题，我们课题组构建了一个DNA四面体基底，并对不同基底的QDs吸附问题进行了探究，结果表明，DNA四面体能够有效地抑制QDs的非特异性吸附。35此外，DNA四面体结构还能够有效控制探针的方向和密度， 11,34,35因此，能够实现较低的非特异性吸附和较高的检测效率。35
文献《利用DNA四面体纳米结构单分子定量检测生物分子》建立了与本文相类似的miRNA检测方法，但仅仅对该方法的实验条件进行了优化，并没有实现目标物的定量检测，没有实际应用的价值。而本工作侧重于对miRNA的定量分析及特异性分析，不仅实现了缓冲溶液中标准miRNA的定量，还实现了复杂生物样本中miRNA的定量。
发明内容
为克服现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种基于DNA四面体基底和粘性末端介导的链置换反应构建的单分子计数方法，用于microRNA的高选择性检测，以期提高microRNA定量检测的准确性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种人肺细胞中let-7a的检测方法，具体实施步骤如下：
(1)组装DNA四面体探针，得到DNA四面体溶液； 
(2)制备硅烷化的玻璃基底，然后将DNA四面体溶液加入基底，孵育，然后用PBS缓冲液将多余的DNA四面体洗掉，得到DNA四面体基底； 
(3)let-7a的单分子检测：首先将待测物分别加到含0.1,0.2,0.3,0.4,0.5和0.6pM标准let-7a的Tris-HCl溶液中，制成待测样本；接着，将待测样本分别加入制备好的DNA四面体基底中，37℃进行第一次孵育；PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入生物素化的ssDNA探针(bio-RP)，37℃下进行第二次孵育；PBS-T和PBS缓冲液先后分别清洗三次，加入链霉亲和素化的量子点(QDs)，37℃下进行第三次孵育；采用PBS-T和PBS缓冲液先后分别清洗三次后，加入PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，各自清点荧光点的个数，作出标准曲线方程，通过计算得到let-7a的浓度。
步骤(1)中，DNA四面体探针的组装属于本领域常规技术，一般由四条单链DNA通过自组装而得。本方法中四面体的特点在于，在四面体的一端设计了一个带有粘性末端的发夹结构，其作用是实现miRNA(let-7a)的特异性识别。本发明中的DNA四面体探针由 A-HP，B-NH2，C-NH2和D-NH24条DNA链通过自组装形成，其序列如下：
A-HP：
ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTTAACTATACAACCTACTACCTCATTTTTTTTTGAGGTAGTAGGTTGT(下划线部分为粘性末端)。
B-NH2：
NH2-C6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTC CA ATAC。
C-NH2：
NH2-C6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGC TCTTC。
D-NH2：
NH2-C6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCT CGCAT。
步骤(1)的具体实施方法如下：将四条DNA链(A-HP，B-NH2，C-NH2和D-NH2)稀释到50μM，各取2μL到92μL TM缓冲液中，混匀后，95℃退火2min，冰浴，最终得到的DNA四面体的浓度为1μM。
其中，所述TM缓冲液由Tris、MgCl2和水组成，其中，各组分的浓度为：20mmol L-1Tris，50mmol L-1MgCl2，PH 8.0。
步骤(2)中，硅烷化玻璃基底的具体制备方法如下：首先用铬酸将盖玻片浸泡过夜；再依次用纯水、丙酮、乙醇和纯水超声清洗，每次10min；接着以盐酸：双氧水：纯水＝1:1:1的体积比例对盖玻片进行超声活化；120℃烘干后，将盖玻片置于装有15mL无水甲苯和1mLGOPS的反应釜中(注意盖玻片要直立放置)，95℃反应8h(硅烷化反应)；硅烷化反应完成后，依次用甲苯、乙醇、纯水超声清洗，每次20min；最后用氮气将盖玻片吹干，储存备用。
步骤(2)中，所述孵育的温度是37℃，孵育时间为12～18小时。
步骤(3)中，所述的待测物为人肺细胞的总RNA提取物。其中，人肺细胞的总RNA提取物的制备方法为：利用miRNA Isolation Kit试剂盒对人肺细胞(A549)的总RNA进行提取，利用Tris-HCl缓冲液对其进行稀释后，备用。
步骤(3)中，所述生物素化的ssDNA探针(Bio-ACAACCTACTACCTCA)的序列如SEQ ID NO.5所示。
步骤(3)中，第一次孵育的时间为2h，第二次孵育时间为2h，第三次孵育时间为2h。
步骤(3)的具体实施方法如下：首先，将1μL人肺细胞的总RNA提取物分别加到含0.1,0.2,0.3,0.4,0.5和0.6pM标准let-7a的Tris-HCl溶液中，制成待测样本；接着，将待测样本分别加入制备好的四面体基底中，37℃孵育2h；PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL bio-RP(0.1nM)，37℃孵育2h；PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次，加入50μL QDs(0.1nM)，37℃孵育2h；PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，各自清点荧光点的个数，作出标准曲线方程，所得标准曲线的线性方程为Y＝260.67+1144.29C，R＝0.997，得到总RNA提取物中let-7a浓度,其中Y为荧光点的个数，C为let-7a的浓度，单位为pM。
其中，所述Tris-HCl缓冲液由tris、MgCl2、KCl和水组成，其中，各组分浓度分别为：20mM、5mM和5mM，pH＝7.4。
所述PBS缓冲液由NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4,和水组成，其中，各组分的浓度分别为：0.15mol L-1NaCl，2.4mmol L-1NaH2PO4，7.6mmol L-1Na2HPO4，pH 7.4。
PBS-T缓冲液是由以下质量百分数的物质组成：95.5％PBS缓冲液和0.05％Tween-20，PH 7.4。
本发明的有益效果是：实验结果表明，本发明的方法对miRNA(let-7a)显示了很好的特异性和灵敏性，检测限为5fM。另外，本发明还对人肺细胞的总RNA提取物进行了分析，说明本发明的方法能够用于复杂生物样本中miRNA的定量检测，在生物医学研究和临床早期诊断中具有很大的应用潜力。
附图说明
图1：基于DNA四面体基底和粘性末端介导链置换反应构建的单个miRNA检测方法原理。
图2：DNA四面体的凝胶电泳表征。1-5条带分别是A-HP+B-NH2+C-NH2+D-NH2、B-NH2+C-NH2+D-NH2、B-NH2+C-NH2、B-NH2和maeker(20bp)。
图3：本发明的典型现象图。
图4：本发明的灵敏度考察。
图5：本发明的方法对let家族成员中miRNA特异性检测。
图6：总RNA中样本中let-7a定量分析。
具体实施方式
一、原理
本发明建立了一个特异、灵敏的单分子计数方法，用于miRNA的定量检测，其原理如 图1。首先，本发明设计了一个功能化的DNA四面体探针，该四面体的一角带有一个含粘性末端的发夹结构，另外三个角标记了氨基，通过环氧基-氨基反应，将其固定在硅烷化的玻璃基底上。接着，目标miRNA与发夹结构的粘性末端杂交，触发SDR，打开发夹结构。接下来，bio-RP与打开的发夹结构杂交。加入QDs后，产生荧光。最后，利用倒置显微镜拍摄荧光图片，通过清点荧光点的个数对miRNA进行定量。
二、试剂和材料
Tris(质量分数为99.8％)和DEPC购生工生物工程有限公司(中国，上海)；Tween-20和GOPS购自Sigma-Aldrich公司(美国)；盖玻片(22mm×22mm)购自Cole-Parmer公司(美国)；MirVanaTM链霉亲和素化的QDs(605nm)、miRNA Isolation Kit、DNA链和RNAs购自英潍捷基贸易有限公司(中国，上海)；人肺细胞(A549)购自中科院上海细胞库；其它试剂(分析纯)购自标准供应商。
实验中所有缓冲溶液均用0.1％的DCPC处理过的超纯水制备。PBS缓冲液包含0.15M NaCl、2.4mM NaH2PO4和7.6mM Na2HPO4(PH 7.4)；PBST缓冲液包含PBS和0.05％Tween-20(PH 7.4)；TE缓冲液包含10mM Tris和1.0mM Na2EDTA(PH 8.0)；TM缓冲液包含20mM Tris和50mM MgCl2(PH 8.0)；TAE-Mg缓冲液包含40mM Tris、20mM乙酸、2mM EDTANa·12H2O和12.5mM(CH3COO)2Mg·4H2O；Tris-HCl缓冲液包含20mM、5mM MgCl2、137mM NaCl和5mM KCl(PH 7.4)其它实际若无说明均为常规产品，通过商业途径即可得到。
三、仪器
落射荧光显微镜系统(Olympus Opatical Co.Ltd,Tokyo,Japan)，主要包括倒置显微镜(Olympus IX 81)，卤素灯(Olympus LG-PS2)，倒置荧光显微镜控制单元(Olympus IX2-UCB)，电子多级放大电感耦合器(Electron Multiplying Charge Coupled Device，EMCCD，Cascade 512B,Roper Scientific，Tuscon，AZ.USA)，MetaMorph软件系统(Universal Imaging，Downingtown，PA，USA)；精密光学隔振平台(上海亿奥信息光学科技有限公司，上海)；超声清洗机(Branson-200型，中美合资必能信超有限公司，上海)；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，上海)；DNP-9052型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司，上海)。
实施例1：目标let-7a的单分子检测 
具体步骤如下：
(1)DNA四面体组装： 
将四条DNA链(A-HP，B-NH2，C-NH2和D-NH2)分别稀释到50μM，各取2μL到 92μl TM缓冲液中，混匀后，95℃退火2min，冰浴，得到的DNA四面体溶液，其中所述DNA四面体的的浓度为1μM。
电泳验证：利用9.6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA四面体溶液进行验证。
为了表征DNA四面体的组装，本实施例对其进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，如图2，与其它单链以及缺少一条或两条链的结构相比，DNA四面体运动较慢，这与之前的报道是一致的，证实了DNA四面体结构的成功合成。36,37
(2)DNA四面体基底的构建
首先制备硅烷化的玻璃基底，然后将50μL DNA四面体溶液加入基底，37℃孵育12h，最后用PBS缓冲液将多余的DNA四面体洗掉。 
其中，硅烷化玻璃基底的具体制备方法如下：首先用铬酸将盖玻片浸泡过夜；再依次用纯水、丙酮、乙醇和纯水超声清洗，每次10min；接着以盐酸：双氧水：纯水＝1:1:1的体积比例对盖玻片进行超声活化；120℃烘干后，将盖玻片置于装有15mL无水甲苯和1mLGOPS的反应釜中(注意盖玻片要直立放置)，95℃反应8h(硅烷化反应)；硅烷化反应完成后，依次用甲苯、乙醇、纯水超声清洗，每次20min；最后用氮气将盖玻片吹干，储存备用。
(3)let-7a的单分子检测 
首先，向制备好的基底中加入50μL待测物(对照组加入50μL Tris-HCl溶液)，37℃孵育2h，PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL bio-RP(0.1nM)，37℃孵育2h，PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次，加入50μL QDs(0.1nM)，37℃孵育2h，PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL PBS缓冲液，在落射荧光显微镜下进行成像(结果如图3A，为实验组荧光成像图；图3B为对照组荧光成像图)。
实施例2：方法的灵敏度考察
具体步骤如下：
同实施例1中所述的步骤(1)和(2)。
(3)miRNA检测的灵敏度考察
首先，向制备好的基底中加入50μL不同浓度(1.0pM、0.8pM、0.5pM、0.3pM、0.1pM、0.05pM和0.005pM)的miRNA，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL bio-RP(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL QDs(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，通过清点荧光点的数目对miRNA进行定量。
本发明对缓冲溶液中不同浓度的miRNA进行了检测，如图4，净光斑数随着let-7a浓度的增加而增加，并在5fM-1pM之间呈现良好的线性关系，线性方程为Y＝26.863+1041.898C，线性相关系数为0.998，灵敏度高于或与其它检测方法相当。14,15,39,40
实施例3：方法的特异性考察
具体步骤如下：
同实施例1中所述的步骤(1)和(2)。
(3)miRNA检测的特异性考察
首先，向制备好的四面体基底中加入50μL不同的let-7家族成员miRNA，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL bio-RP(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次，加入50μL QDs(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，通过清点不同目标物产生的荧光点数进行方法的特异性考察。
miRNAs具有同族之间序列相似性高的特点，因此实现miRNA的高选择性检测是一个巨大的挑战。例如，let-7a家族成员之间只有一个或两个碱基之差。为了考察本方法的选择性，分别对let-7家族成员进行了检测，如图5所示，目标物(let-7a)产生的净光斑数与其它成员(let-7b、let-7c和let-7i)产生净光斑数的比例分别是13.1、12.3和20.9，高于其它检测方法，12,14,15说明本方法对let-7a具有很好的特异性，也说明通过引入粘性末端介导的链置换反应，能够实现miRNAs家族之间单碱基错配的识别。
实施例4：方法的精密度和重现性
具体步骤如下：
同实施例1中所述的步骤(1)和(2)。
(3)miRNA的单分子检测 
首先，向制备好的基底中加入50μL不同浓度(1.0pM、0.1pM、0.01pM的miRNA)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液清洗三次后，加入50μL bio-RP(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液清洗三次，加入50μL QDs(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像。
重复性和重现性是衡量分析方法实际可行性的重要参数，因此本发明考察了方法的日内精密度和日间精密度，选择的高中低三个浓度分别是1pM、0.1pM和0.01pM。日内分析的相对标准偏差(n＝3)分别为3.8％、4.4％和3.1％，日间分析分别为3.5％、4.3％和4.6％，均符合方法学要求。
实施例5：方法的实际应用考察
本发明的实际应用考察主要分为两部分：方法的复杂体系加标回收率分析和复杂生物体系中目标物的定量。
具体步骤如下：
(一)方法的复杂体系加标回收率分析
同实施例1中所述的步骤(1)和(2)。
(3)复杂体系(人乳腺癌细胞裂解液)制备
人乳腺癌细胞(MCF-7)使用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，放于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。使用前将培养瓶中生长至亚汇合状态的细胞使用胰蛋白酶消化，处理成单细胞悬液，收集约106个细胞于1.5mL离心管中，4℃下3000rpm离心5min，移去上清液。加入100μL 1.0×10-2mol/L的低渗Tris-HCl溶液，冰上孵育30min使细胞溶胀，用超声波震碎仪使细胞充分破碎。获得的混合液在4℃下12000rpm离心20min，除去细胞碎片，取上清液于-80℃保存备用。
(4)miRNA的加标回收分析
首先，向制备好的人乳腺癌细胞裂解液中加入不同量的标准miRNA，分别制成50μL已知浓度(1.0pM、0.1pM、0.01pM，称为实际浓度)的细胞裂解液溶液。接着将该溶液分别加入制备好的四面体基底中，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL bio-RP(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次，加入50μL QDs(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，各自清点荧光点的个数，并利用实施例2中得到的线性方程进行浓度计算，得出检测浓度。根据下述方程计算加标回收率
通过计算得到，人乳腺癌细胞裂解液中不同浓度(1.0pM、0.1pM、0.01pM)的miRNA加标回收率分别为：97％、102％和92％，RSD分别为4.1％、3.6％和3.0％，均符合方法学要求。
(二)复杂生物体系中目标物(let-7a)的定量检测
具体步骤如下：
(1)DNA四面体组装： 
将四条DNA链(A-HP，B-NH2，C-NH2和D-NH2)分别稀释到50μM，各取2μL到92μl TM缓冲液中，混匀后，95℃退火2min，冰浴，得到的DNA四面体溶液，其中所述DNA四面体的的浓度为1μM。
(2)DNA四面体基底的构建
首先制备硅烷化的玻璃基底，然后将50μL DNA四面体溶液加入基底，37℃孵育12h，最后用PBS缓冲液将多余的DNA四面体洗掉。 
其中，硅烷化玻璃基底的具体制备方法如下：首先用铬酸将盖玻片浸泡过夜；再依次用纯水、丙酮、乙醇和纯水超声清洗，每次10min；接着以盐酸：双氧水：纯水＝1:1:1的体积比例对盖玻片进行超声活化；120℃烘干后，将盖玻片置于装有15mL无水甲苯和1mLGOPS的反应釜中(注意盖玻片要直立放置)，95℃反应8h(硅烷化反应)；硅烷化反应完成后，依次用甲苯、乙醇、纯水超声清洗，每次20min；最后用氮气将盖玻片吹干，储存备用。
(3)复杂生物体系(人肺细胞总RNA的提取)
人肺细胞(A549)使用含质量分数为10％胎牛血清的RPMI 1640培养液培养，放于37℃，5％CO2的饱和湿度培养箱中培养，培养后，利用miRNA Isolation Kit试剂盒(miRNA Isolation Kit试剂盒提取总RNA的方法属本领域常规技术方法)对人肺细胞(A549)的总RNA进行提取，利用Tris-HCl缓冲液对其进行稀释后，备用。
(4)人肺细胞总RNA中let-7a的定量检测
本实例采用标准加入法进行检测。首先将1μL总RNA提取物分别加到含0.1,0.2,0.3,0.4,0.5和0.6pM标准let-7a的Tris-HCl溶液中，制成待测样本。接着，将待测样本分别加入制备好的四面体基底中，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL bio-RP(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次，加入50μL QDs(0.1nM)，37℃孵育2h。PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，各自清点荧光点的个数，作出标准曲线，如图6。
所得标准曲线的线性方程为Y＝260.67+1144.29C，R＝0.997，其中Y为荧光点的个数，C为let-7a的浓度，单位为pM，通过将标准曲线外推，得到总RNA提取物中目标物的量为0.23pM((即令Y＝0，得到C为人肺细胞总RNA中let-7a浓度)，即：5.07×10-15mol/μg(3.05×109个/μg)，与文献报道一致14,15,41。
注：本文中μM是指μmol/L，nM是指nmol/L，fM是指10-12mol/L，pM是指10-9mol/L。图4、5和6纵坐标的单位为个。
总结
基于单分子计数和粘性末端介导的SDR，本发明构建了一个灵敏、特异的miRNA分析方法，并且第一次将粘性末端介导的SDR引入到单分子计数中。首先，DNA四面体基底的引入使方法有了一个较低的背景，在最优条件、无任何扩增策略下，方法的检测限达5fM。 第二，粘性末端介导SDR的引入，使方法显示了很好的特异性，能够准确识别miRNAs家族之间的目标分子。第三，实现了实际样本中miRNA的分析，说明本方法是实际可行的，因此在生物医学研究、早期临床诊断和癌症治疗中具有很大的应用潜力。
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(41)Cheng,Y.；Zhang,X.；Li,Z.；Jiao,X.；Wang,Y.；Zhang,Y.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,3268-3272。

Claims (10)

1.一种人肺细胞中let-7a的单分子检测方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)组装DNA四面体探针，得到DNA四面体溶液；
(2)制备硅烷化的玻璃基底，然后将DNA四面体溶液加入基底，孵育，然后用PBS缓冲液将多余的DNA四面体洗掉，得到DNA四面体基底；
(3)let-7a的单分子检测：首先将待测物分别加到含0.1,0.2,0.3,0.4,0.5和0.6pM标准let-7a的Tris-HCl溶液中，制成待测样本；接着，将待测样本分别加入制备好的DNA四面体基底中，37℃进行第一次孵育；PBS-T和PBS缓冲液先后分别清洗三次后，加入生物素化的ssDNA探针，37℃下进行第二次孵育；PBS-T和PBS缓冲液先后分别清洗三次，加入链霉亲和素化的量子点，37℃下进行第三次孵育；采用PBS-T和PBS缓冲液先后分别清洗三次后，加入PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，各自清点荧光点的个数，作出标准曲线，得到标准曲线方程，通过计算得let-7a的浓度。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：步骤(1)的具体实施方法如下：将四条DNA链A-HP-6，B-NH2，C-NH2和D-NH2稀释到50μM，各取2μL到92ml TM缓冲液中，混匀后，95℃退火2min，冰浴，最终得到的DNA四面体的浓度为1μM，其中，所述A-HP-6，B-NH2，C-NH2和D-NH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、2、3和4所示。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：步骤(2)中，所述孵育的温度是37℃，孵育时间为12～18小时。
4.如权利要求1所述的的检测方法，其特征是：步骤(2)中，硅烷化玻璃基底的具体制备方法如下：首先用铬酸将盖玻片浸泡过夜；再依次用纯水、丙酮、乙醇和纯水超声清洗，每次10min；接着以盐酸：双氧水：纯水＝1:1:1的体积比例对盖玻片进行超声活化；120℃烘干后，将盖玻片置于装有15mL无水甲苯和1mLGOPS的反应釜中，95℃反应8h；硅烷化反应完成后，依次用甲苯、乙醇、纯水超声清洗，每次20min；最后用氮气将盖玻片吹干，储存备用。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：步骤(3)中，所述的待测物为人肺细胞的总RNA提取物，生物素化的ssDNA探针的序列如SEQ ID NO.5所示。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征是：所述人肺细胞的总RNA提取物的制备方法为：利用miRNA Isolation Kit试剂盒对人肺细胞的总RNA进行提取，利用Tris-HCl缓冲液对其进行稀释后，备用。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：步骤(3)中，第一次孵育的时间为2h，第二次孵育时间为2h，第三次孵育时间为2h。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：所述PBS缓冲液的组成为：由NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4,和水组成，其中，各组分的浓度为：0.15mol L-1NaCl，2.4mmol L-1NaH2PO4，7.6mmol L-1Na2HPO4，pH 7.4。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：PBS-T缓冲液是由以下质量百分数的物质组成：95.5％PBS缓冲液和0.05％Tween-20，PH 7.4。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征是：步骤(3)的具体实施方法如下：首先将1μL总RNA提取物分别加到含0.1,0.2,0.3,0.4,0.5和0.6pM标准let-7a的Tris-HCl溶液中，制成待测样本；接着，将待测样本分别加入制备好的四面体基底中，37℃孵育2h；PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL 0.1nM的bio-RP，37℃孵育2h；PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次，加入50μL 0.1nM的QDs，37℃孵育2h；PBS-T和PBS缓冲液分别清洗三次后，加入50μL PBS缓冲液，在荧光落射显微镜下进行成像，各自清点荧光点的个数，作出标准曲线，所得标准曲线的线性方程为Y＝260.67+1144.29C，R＝0.997，通过计算，得到待测物中let-7a的浓度，其中Y为荧光点的个数，C为let-7a的浓度，单位为pM。
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