CN113156128B - 一种利用量子点检测草酸的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学检测领域，具体涉及一种利用量子点检测草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制检测溶液，向所述检测溶液中加入二价铜离子溶液和缓冲液，孵育获得第一反应溶液；(2)将量子点溶液加入所述第一反应溶液中，孵育获得第二反应溶液；(3)通过测量荧光光谱检测所述检测溶液中的草酸浓度。本发明提供了一种简单、高灵敏度、快速、低成本地定量、特异性检测草酸含量的方法，在临床诊断(例如，草酸钙尿石症)、环境、化工等领域有广阔的应用前景。
Description
.该申请将可能作为后续专利申请(包括，但不限于，中国发明专利申请、中国实用新型申请、PCT申请、基于巴黎公约的国外申请)的优先权基础。
技术领域
.本发明属于化学检测领域，具体涉及一种利用量子点检测草酸的方法及应用。
背景技术
.尿石症是一种影响全球5％至8.8％的人口的常见疾病，其5年复发率高达50％。尿石症主要包括草酸钙，尿酸钙，并且草酸钙结石是尿石症最常见的类型。当尿草酸水平过饱和时，很容易形成尿石症。尿液中草酸可能来源于饮食或肝脏内源性合成。在临床实践中，测量结石形成者的尿草酸盐含量可识别疾病的病因，例如原发性或继发性高草酸尿石症，为直接饮食指导和药物治疗提供基础。因此，一个简单、准确和快速的方法用于草酸检测在尿结石患者的代谢分析中是非常必要的。近年来，许多草酸分析策略获得了发展，包括比色法，荧光法、电化学分析、高效液相色谱、离子色谱、和气相色谱等。这些方法虽然具有高的准确性，但是大多数方法需要大型昂贵仪器和专业人员的参与才能进行操作，或者其分析通量不足，需要繁琐的分析步骤，导致分析速度不快。相比之下，比色法和荧光法展示出一定的优势，如检测灵敏度相对高一些、分析速度相对快、可以用于实现实时分析。然而，现有基于比色法和荧光法的草酸分析方法依然存在着灵敏度偏低和成本偏高等不足之处。
.本发明旨在提供一种基于量子点的选择性识别特点来检测结石患者尿液样品中草酸含量的方法及策略，能够弥补目前临床诊断及检测上的不足。目前该领域尚未有公开的专利及报道利用量子点来检测尿液中的草酸含量。
发明内容
.有鉴于此，本发明的目的之一在于提供了一种利用量子点检测草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制检测溶液，向所述检测溶液中加入二价铜离子溶液和缓冲液，孵育获得第一反应溶液；(2)将量子点溶液加入所述第一反应溶液中，孵育获得第二反应溶液；(3)通过测量荧光光谱检测所述检测溶液中的草酸浓度。
.进一步地，所述二价铜离子溶液包含CuSO4、Cu(NO3)2和CuCl2中的一种或多种。
.进一步地，所述量子点溶液包含CdTe和/或CdSe。
.进一步地，所述检测溶液中的草酸浓度范围为大约0.1μM-10mM。
.进一步地，所述二价铜离子溶液的浓度范围为大约1-100μmM。
.进一步地，所述量子点溶液的体积为大约1-100μL。
.进一步地，所述孵育获得第一反应溶液和所述孵育获得第二反应溶液都是在室温下进行的，反应时间均为大约1–5分钟。
.进一步地，当所述检测溶液中的所述草酸浓度不低于大约10μM时，可以用裸眼识别所述检测溶液的颜色变化。
.进一步地，当所述检测溶液中的所述草酸浓度在大约0.1μM～10mM范围内时，所述草酸浓度增加，所述检测溶液的荧光信号降低，并且满足线性方程。
.进一步地，所述线性方程为Y＝-ALogC–B，线性相关系数为大约0.99。
.进一步地，所述线性方程的检测下限为大约0.1μM。
.进一步地，所述检测溶液为尿液。
.进一步地，所述尿液在检测前先用高纯水稀释。
.本发明的目的之一在于提供了一种可视化检测尿液中草酸浓度的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中包含二价铜离子溶液和量子点溶液。
.进一步地，，所述二价铜离子溶液包括CuSO4、Cu(NO3)2和CuCl2中的一种或多种。
.进一步地，所述二价铜离子溶液的浓度范围为大约1-100μmM。
.进一步地，所述量子点溶液包含CdTe和/或CdSe。
.进一步地，所述量子点溶液的体积为大约1-100μL。
.进一步地，所述缓冲液的PH值为中性。
.进一步地，所述缓冲液为MOPS缓冲液。
.进一步地，所述测量荧光光谱的条件为：在大约365nm光的激发下，并且测量可见光范围内进行。
.进一步地，所述测量荧光光谱在400–700nm的范围内进行。
.本发明有益效果
.本发明提供了一种简单、高灵敏度、快速、低成本地定量检测草酸含量的方法。可以在10分钟(甚至少于6分钟)内完成检测，该体系成功用于10微摩尔每升草酸的可视化读取，且检测下限低至120纳摩尔每升。就灵敏度和特异性而言，本发明提供的检测方法的荧光分析结果完全满足现有临床诊断的需求。
.本发明提供的方法可以用于特异性地检测结石病人尿液样品中草酸的含量，且其与临床诊断结果一致。同时表明该方法具有的灵敏、低成本、易于操作的特点，具有良好的临床应用和家庭便携式诊断的应用潜力。此外，本方法也可以用于环境、化工、医药等领域内的草酸检测。
.本发明创造性地利用了量子点的高发光效率，高稳定性和易于合成等技术优势，并通过挖掘发光量子点和金属阳离子间的特有阳离子交换反应进一步地扩展了量子点的应用范围。本发明实验显示量子点和金属阳离子间的阳离子交换反应具有快速响应(例如，在一些实施例中，仅需要几秒钟)，反应条件温和(例如，在一些实施例中，仅需室温)、高反应灵敏度(可实现纳摩尔每升水平金属离子检测)、以及颜色改变显著等技术特点，让本发明可以用于对时间要求较高的实时分析。具体地，本发明创造性地利用了草酸作为还原剂将Cu2+还原成Cu+，同时结合量子点具有的选择性阳离子交换反应的特性，将发光量子点的应用拓展到了实时、特异性地监测草酸浓度中。
附图说明
.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
.图1是通过量子点选择性阳离子交换反应的草酸可视化定量示意图。
.图2是CdTe量子点的表征和实验可行性验证。(a)量子点的TEM图。(b)量子点的紫外吸收和荧光发射光谱图。(c)抗坏血酸对量子点荧光信号的影响。(d)在Cu2+存在时，抗坏血酸对量子点荧光信号的影响。(e)草酸对量子点荧光信号的影响。(f)不同条件下荧光信号。误差线源于三次重复测量。除了CdTe，鉴于[3].Te和Se属于同一主族，具有相近的性质，因此本发明在实验中采用了CdSe作为量子点来进行检测，实验结果与采用CdTe量子点类似。
.图3是实验条件优化图。(a)草酸和Cu2+反应时间。(b)量子点和Cu+反应时间。(c)和(d)量子点体积。误差线源于三次重复测量。
.图4是草酸的分析性能图。(a)可视化照片。(b)和(c)100纳摩尔每升至10毫摩尔每升草酸浓度范围内，荧光发射图谱和荧光信号值。(d)和(e)草酸分析的特异性。误差线源于三次重复测量。
.图5为(a)尿液样品分析示意图.(b)36个尿结石病人的临床影像结果.(c)临床尿液样品中草酸浓度检测结果。(d)不同尿液样品的直立显微镜图像和草酸浓度。非结石样品(1,2,3)，结石相关血尿样品(4,5,6)，结晶样品(7：草酸钙和尿酸结晶；8：草酸钙结晶；9：尿酸结晶)。10:9个尿液样品的草酸浓度。
具体实施方式
.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
.除非另外指定，否则术语“包含有”和“包含”及其在语法上的变化是用来表示“开放式”或者“包括”的语言，从而它们包括列举的技术特征但也允许包括另外的没有列举的技术特征。
.如在本说明书中使用的，术语“大约”(例如，线性相关系数大约为0.99)，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
.在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值(例如，二价铜离子溶液的二价铜离子浓度范围为大约1–100μmM)。例如，范围1-6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
.实施例1
.1.草酸分析
.向包含5微升CuSO4(例如，1-100μmM)和50微升MOPS缓冲液(100毫摩尔每升NaNO3,2.5毫摩尔每升Mg(NO3)2,pH 7.4)的溶液中加入40微升含有不同浓度草酸的检测溶液(例如，草酸浓度为0.1μM-10mM)，在室温下孵育(例如，1–5分钟)完成还原反应。随后，将1–100微升量子点(CdTe和/或CdSe)加入至以上溶液中，并在室温下孵育(例如，1–5分钟)。最后，使用高纯水将以上溶液稀释至200微升。在365纳米光激发下，通过测量570-720纳米范围内荧光光谱实现草酸定量。
.2.尿液前处理
.本发明研究团队从四川大学华西医院收集了36个结石病人和11个健康人的24小时尿液。所以尿液在收集48小时内完成测量，且所有样品在检测前被使用高纯水稀释200倍。随后步骤与1)部分描述一致，检测溶液为尿液。
.3.用还原剂进行验证
.本发明还在反应体系中加入抗坏血酸作为还原剂验证量子点的选择性识别现象。将0-1毫摩尔每升范围内的抗坏血酸加入至量子点中，检测荧光信号。
.结果分析：
.1)草酸分析的传感原理如图1所示。在该体系中，我们发现CdTe量子点可以选择性/特异性地识别Cu2+和Cu+的现象。
.2)用抗坏血酸对这一现象进行验证。众所周知，抗坏血酸使用最为广泛的还原剂，在大量现有应用中其展示出杰出的还原Cu2+为Cu+的水平。将0-1毫摩尔每升范围内的抗坏血酸加入至量子点中，并发现抗坏血酸的还原性对量子点的荧光信号并未产生显著影响(图2C)。随后，将抗坏血酸和Cu2+反应混合物加入至量子点中时，随着抗坏血酸浓度增加，溶液的荧光信号在逐渐降低(图2D)。因此，实验结果表明Cu2+和Cu+均可淬灭量子点，且Cu+的淬灭效果显著优于Cu2+，以上即为草酸分析实验的核心。
.实施例2
.草酸检测可行性分析
.使用透射电子显微镜，紫外吸收-可见光谱仪和荧光分光光度计对量子点进行了多方面的表征。合成的量子点具有类球形且平均粒径为4纳米(图2a)。在580纳米处和647纳米处观测到量子点的紫外吸收和荧光发射特征峰(图2b)。
.随后，检测草酸对量子点荧光信号的影响。在0至1毫摩尔每升范围内，草酸对量子点的荧光信号没有显著影响(图2E)，展示出相似与抗坏血酸的低干扰信号。
.相比于草酸对量子点的影响，Cu2+对量子点荧光信号展示出明显的淬灭效果(图2f-d对比于2f-b和c)。将1至100微摩尔每升浓度的草酸加入至Cu2+溶液中时，量子点的荧光信号降低(图2f-e和f相比于2f-d)，以上结果表明图1a所示的选择性/特异性识别反应是真实的，以及图1b所示的草酸检测是可行的(图2f插图所示)。
.实施例3
.本实施例为一优选实施例。优化了影响实验分析性能的条件，包括Cu2+和草酸反应时间、Cu+和量子点反应时间、Cu+和量子点的孵育时间、以及量子点的体积。
.随着反应时间延长，量子点的荧光信号快速下降，表明草酸还原Cu2+可在3分钟内完成(图3a)。Cu+对量子点的淬灭反应是快速的，且可在2.5分钟内完成(图3b)。随着量子点体积增大，有草酸和没有草酸溶液的荧光信号均在增加(图3c)。在1微升量子点时，以上溶液取得最大荧光信号差值(图3d)。因此，在后续实验中，3分钟被用做草酸还原Cu2+，2.5分钟被采纳用于淬灭量子点，以及1微升量子点作为信号分子。
.在已优化的实验条件下，进一步考察草酸的定量能力。在使用荧光仪定量溶液的荧光信号之前，先观察和比较紫外灯下不同溶液的颜色。随着草酸浓度增加，溶液的红色逐渐变浅。最低10微摩尔每升浓度草酸和空白溶液依然具有显著的颜色区别，表明在10微摩尔每升浓度及以上时，使用裸眼就可区分溶液中草酸浓度的变化(图4a)。随后，通过监测每管溶液的荧光信号，对该体系对草酸的定量水平进一步进行了考察。在100纳摩尔每升至10毫摩尔每升范围内，随着草酸浓度增加，溶液荧光信号在逐渐降低，且展现出良好的线性(图4b和4c)。线性方程为Y＝-ALogC-B(R2＝0.995)(在一些实施例中，A可以取值1853，B可以取值3522)，检测下限为0.12微摩尔每升，其远低于尿液中草酸的正常含量(110–460微摩尔每升)。此外，该检测下限优于现有大多数方法，且该方法具有直观读取，分析速度快和低成本的优势(表1)。
.表1本发明的量子点体系与其他体系的比较
.实施例4
.草酸传感器的特异性检测(草酸特异性检测体系)
.使用尿酸中共存的NaCl，KCl、MgCl2、CaCl2、Na2HPO4、NaH2PO4、尿素和葡萄糖等物质作为潜在干扰物，对草酸分析的特异性进行了评估。1毫摩尔每升的高浓度干扰物未引起显著的信号改变。相比之下，10微摩尔每升的草酸引起了明显的荧光信号降低(图4D和4E)。因此，以上结果表明该草酸传感器(也可以被称为草酸特异性检测体系)具有好的选择性/特异性，为用于实际样品中草酸分析奠定了良好的基础。
.实施例5
.结石患者临床尿液样品中草酸含量的检测及草酸钙结石诊断
.为了验证该体系在临床样品中应用的可行性和准确性，我们收集了11个正常人和36个(32个草酸钙结石和4个尿酸结石)结石病人的尿液样品。在使用高纯水对尿液样品稀释200倍后，直接使用量子点检测体系对尿液中草酸含量进行检测(图5a)。如表2所示，11个正常人尿液中草酸含量在正常范围内(少于400微摩尔每升)。然而，32个草酸钙结石病人尿液样品中草酸含量均高于400微摩尔每升，其与临床影像结果一致(图5b)。值得注意的是该体系可成功区分不同类型的结石，如草酸钙和尿酸结石(图5c)，在用于检测草酸钙结石时可以不受到尿酸结石的影响。此外，血尿样品未对该草酸检测体系产生显著影响(图5d-4,5,6)。且对于结晶样品，该体系可以成功检测出是否存在草酸钙结石症(图5d-7,8,9)。因此，该体系可被成功用于准确驾车临床样品中草酸含量，在短的分析时间和低的分析成本优势下，其展示出高的临床诊断潜力。
.表2结石病人和非结石病人尿液中草酸浓度(微摩尔每升)
*傅里叶变换红外光谱。
.本发明涉及到的参考文献及资料列举如下：
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.上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (16)
1.一种利用量子点检测草酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制草酸检测溶液，向所述草酸检测溶液中加入二价铜离子溶液和缓冲液，孵育获得第一反应溶液，其中所述草酸作为还原剂将二价铜离子还原为Cu+；
（2）将CdTe和/或CdSe量子点溶液加入所述第一反应溶液中，孵育获得第二反应溶液，其中所述Cu+对所述CdTe和/或CdSe量子点发生优于二价铜离子的猝灭反应；
（3）通过测量荧光光谱检测所述检测溶液中的草酸浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二价铜离子溶液包含CuSO4 、Cu(NO3)2和CuCl2中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测溶液中的草酸浓度范围为0.1 μM-10 mM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二价铜离子溶液的浓度范围为1-100 μmM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述量子点溶液的体积范围为1-100 μL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育获得第一反应溶液和所述孵育获得第二反应溶液都是在室温下进行的，反应时间均为1–5分钟。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述检测溶液中的所述草酸浓度不低于10μM时，可以用裸眼识别所述检测溶液的颜色变化。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述检测溶液中的所述草酸浓度在0.1μM~10mM的范围内时，所述草酸浓度增加，所述检测溶液的荧光信号降低，并且满足线性方程。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述线性方程为Y=-ALogC – B，线性相关系数为0.99。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述线性方程的检测下限为0.1μM。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测溶液为尿液。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述尿液在检测前先用高纯水稀释。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的PH值为中性。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为MOPS缓冲液。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测量荧光光谱的条件为：在365nm光的激发下，并且测量可见光范围内进行。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述测量荧光光谱在400–700nm的范围内进行。
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