CN114540526B - 对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法。所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，所述引物包括8条引物，所述探针包括2条探针。本发明基于多重PCR，利用不对称扩增方法扩增出大量的带有特定标签序列的长链单链DNA产物，结合通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析技术，实现单管/闭管双通道的5种疟原虫快速检测及分型。同时，亦可通过内标指示体系正常与否及标本采集质量。检测体系5个检测对象检测下限均为10拷贝数/反应，体系特异性好，选择能力强。该方法有助于输入性疟原虫快速检测和分型，对外防输入疟疾和保持沿海经济持续发展具有重要意义。

Description

对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法。
技术背景
疟疾是一种由疟原虫寄生于人体引起的急性发热性疾病，主要通过受感染的按蚊叮咬或经输血、母婴传播，是目前全球广泛关注的三大疾病之一。因发作时患者会感觉“发冷”、全身发抖，俗称“打摆子”。据估计，2017年，疟疾已遍及全球90多个国家和地区，约有2.19亿人患有疟疾，并有超过43.5万人因此死亡，其中绝大多数来自于非洲地区。在美国，每年约有1700例疟疾，以从南非、南亚为主的高危疟疾传播国家返回的旅行者和移民居多。2021年6月30日，世界卫生组织宣布中国获得无疟疾认证，标志着中国再没有疟疾本土病例。随着我国国际化进程不断加快，出国人员逐渐增加，境外输入已成为中国疟疾的主要来源方式。
疟原虫进入人体后在肝脏中繁殖，继而感染并破坏血红细胞，不断繁殖、不断破坏，导致人体发病。症状主要表现为周期性规律发作，全身发冷、发热、多汗，长期多次发作后，可引起贫血和脾肿大。凶险型疟疾可出现因脑、肝、肾、心、肺、胃、肠等受损引起的各种综合征，病情严重者会出现谵妄、昏迷和休克等症状，如诊断不及时或治疗不当，可危及生命。对包括无症状的寄生虫携带者进行早期准确诊断对于有效的疾病管理至关重要。同时，为达到全球根除疟疾目标，从根本上中断疟疾传播，敏感的诊断测试在提供准确的流行病学信息以指导做出相应的变化具有重要的作用。
长期以来人们认识到自然界中有四种疟原虫感染人类，包括：恶性疟原虫，间日疟原虫，卵形疟原虫和三日疟原虫。近年来，几乎所有的东南亚国家都有报道诺氏疟原虫（Plasmodium knowlesi）感染的疟疾病例，越来越多的证据表明，诺氏疟原虫已成为该地区主要的疟原虫种类。诺氏疟原虫是一种自然感染东南亚猕猴的高致病性疟疾寄生虫，也会感染人类，导致从动物传染给人类的疟疾（“人畜共患”疟疾），具有低致热阈值、成年人感染的严重致病风险至少与感染恶性疟原虫的相一致，通过镜检难以区分，常被误诊为恶性疟原虫或间日疟原虫，其真实发病率远远被低估。据报道，在马来西亚，许多病例因未提早认识到诺氏疟原虫致病而误诊，导致用药延迟，死亡率很高。因此，提高对诺氏疟原虫的认识并及早准确诊断，有助于临床医生提供最佳的治疗方案，据估计可降低诺氏疟原虫疟疾病死率六倍，有助于改善对这种新型寄生虫的监测。
目前可用于鉴定疟原虫属的诊断工具包括病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学检查是病原体确诊的“金标准”，包括涂片染色法、动物接种分离法或细胞培养法查找虫体等。血清诊断已成为当今广泛应用的诊断手段，方法种类较多，主要有间接血凝试验（IHA）、间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及免疫色谱侧向流动测定（又称为快速诊断测试，RDT）。但病原学、血清学检测方法存在耗时较长，灵敏度低，甚至敏感的RDT也与显微镜具有相似的局限性，对病原体繁殖不活跃或者潜伏期感染的样本，有漏检的风险。已有资料证明因检测灵敏度不够无法筛查出感染了恶性疟原虫的无症状携带者。同时，上述检测方法检测通量低，难以实现自动化结果分析，不同寄生虫间存在交叉反应性等因素均有可能影响检测结果。分子生物学技术核酸检测诊断为病原生物的检测提供了快速、高效、灵敏的诊断新方法。PCR技术以其高敏感性、高特异性等特点，被广泛应用于生命科学的各个领域。Okell等人发现，对于恶性疟原虫，与PCR相比，显微镜检测低估了50.8％的患病率，并且这种差异在低传播环境中变得更加显着。现已有应用于多种血液寄生虫的核酸检测报道，并显示出较高的敏感性和较强的特异性。如PCR-电泳，PCR-酶联免疫吸附测定（PCR-ELISA），巢式PCR-高分辨率熔解分析（nPCR-HRM）等。其中，Kimura等人以SSU rRNA为靶基因建立的巢式PCR是截止到目前最受广泛应用于恶性疟、间日疟、卵形疟和三日疟的标准检测方法。在该方法中，用针对来自疟原虫物种的小亚基rRNA基因的保守序列设计通用引物进行第一次PCR，然后用针对来自每种人类疟原虫物种的特定基因序列设计内部引物进行第二次PCR。该方法具有良好的分析灵敏度，但PCR扩增步骤繁琐，需要多次开盖操作，容易因受污染而产生假阳性。2004年，Mathieu等人以18S rRNA为靶基因开发了一个三管的多重实时PCR检测上述4种疟原虫，该方法虽说避免了开管检测，但通量低，采用多管检测加大了样本需求量和试剂成本，操作仍较多。同时，已报道以18S rRNA为靶基因的PCR方法容易在诺氏疟和间日疟发生交叉反应。近年来，国内外新兴了一些快速检测疟原虫的方法，如LAMP检测诺氏疟、恶性疟和间日疟，RPA检测诺氏疟原虫。但这些方法均存在检测通量低，引物探针设计困难等缺点。
探针熔解曲线分析技术（Probe melting curve analysis，PMCA）是通过实时监测温度变化过程中，因探针与靶序列杂交形成的熔点（即Tm值）不同而导致荧光强度的变化，得到的荧光强度随着温度变化的曲线，即探针熔解曲线。它是一种后PCR检测技术，在完成PCR程序后添加一个温度梯度的荧光检测步骤，不需要重新开管检测和更多的人工操作。可根据Tm值的差异区分不同的靶序列或检测同一靶序列的多位点组成信息，若同时使用不同荧光基团标记的探针，就能实现多色荧光检测，将两者结合就可以大大提高单个反应同时检测多个靶序列数目的能力。
本研究通过引入固定荧光探针，采用特异性引物对不对称扩增不同型别疟原虫，其中，限制性引物包含5’端为因与荧光探针不同杂交程度而具有不同Tm值的靶序列、3’端为特异性引物序列的较长链寡核苷酸，利用PCR扩增和闭管模式的探针熔解曲线分析实现常见输入疟原虫的快速诊断和分型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明首先提供了对五种输入性疟原虫分型检测的引物和探针，所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，所述引物包括8条引物，所述探针包括2条探针；
所述8条引物为：
用于特异扩增恶性疟原虫的限制性引物Pf-R：
5’-CCATTAGAACCCTTAAGCTACTCCACGGTACTGAAGGAAGCAATCTAAAAGTCA -3’；
用于特异扩增间日疟原虫的限制性引物Pv-R：
5’-CCATTACTTGCCTTATACTACTCCACCAATCTAAGAATAAACTCCGAAGAGAAAATT -3’；
用于特异扩增三日疟原虫的限制性引物Pm-R：
5’-CCATTACTACCCTTATACTACTCCACGGAAGCTATCTAAAAGAAACACTCATATATAAGAAT -3’；
用于特异扩增卵形疟原虫的限制性引物Po-R：
5’-CCTATCTCTTAACCTCCACTGCTTTCACCAATCTAAGAAATTTCCCCRAAAGGAATT-3’；
用于特异扩增诺氏疟原虫的限制性引物Pk-R：5’-CCTATCTCGTAACCTCCACCCCTTTCACCTAAGAGTTCTAATCTCCGGAGAGAAAAGAA-3’；
用于特异扩增疟原虫属的过量性引物P-F：5’-ACGATCAGATACCGTCGTAATCTT -3’；
人源内参限制性引物RNaseP-R：5’-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCACTTGGGTGTGACCCTGAAGACTC-3’，
人源内参过量性引物RNaseP-F：5’-CCATCAACCACGCCATCAACAT-3’；
所述2条探针为：
通用荧光探针U1：5’-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-3’；
通用荧光探针U2：5’-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-3’。
进一步的，上述2条探针为碱基淬灭或自身淬灭；其中，
碱基淬灭的荧光探针为：
U1：5’FAM-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-P 3’；
U2：5’HEX-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-P 3’；
自身淬灭的荧光探针为：
U1：5’FAM-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-BHQ1 3’；
U2：5’HEX-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-BHQ1 3’。
本发明还提供了上述的引物和探针在制备检测五种输入性疟原虫并分型的试剂盒中的用途；其中，所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫。
本发明还提供了一种用于检测五种输入性疟原虫并分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针；所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫。
本发明还提供了一种用于非疾病诊断治疗目的的五种输入性疟原虫的分型检测方法，所述方法包括如下步骤：
（1）提取待测样本的DNA；
（2）使用上述的引物和探针对步骤（1）获得的DNA进行荧光定量PCR；
（3）获得并分析熔解曲线；
其中，所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫。
本发明的显著优点在于：
相较于传统疟原虫分子检测方法，本方法检测对象增加了近年来报道的具有人传染性的诺氏疟原虫。仅用2条通用荧光探针在2.5个小时左右实现了5种疟原虫快速分型，重复性高。同时，核酸提取后只需单管/闭管进行操作，避免了多管检测或者开管操作，节省成本，避免污染。该方法灵敏度高，特异度强，选择性好，适合于临床多种疟原虫快速分型，对输入性疟疾的防控和治疗具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明所述方法的检测原理图。
图2为本发明所述检测方法的灵敏度结果图。
图3为本发明所述检测方法的特异性结果图。
图4为本发明所述检测方法选择性结果图。
图5为本发明所述检测方法的临床标本检测示意图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步详细描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1.模板DNA的提取
（1）样本的采集，包括全血样本，具体采集方法如下：
使用含EDTA抗凝剂的采血管采集血液标本2ml，采集后颠倒混匀，使采血管内壁上的抗凝剂充分与血液混合；
（2）将上述采集好的全血样本按照市售常规核酸提取试剂盒说明书进行提取。
实施例2. 用于输入性疟原虫快速诊断和分型的引物、探针及检测体系
用于扩增恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫的引物对由多条针对不同型别的限制性引物和一条同源序列的过量性引物组成。其中，限制性引物包括5’端Tag标签（加粗带下划线序列）和3’端疟原虫特异性序列。具体地，
用于特异扩增恶性疟原虫的限制性引物Pf-R：
5’-CCATTAGAACCCTTAAGCTACTCCACGGTACTGAAGGAAGCAATCTAAAAGTCA -3’；
用于特异扩增间日疟原虫的限制性引物Pv-R：
5’-CCATTACTTGCCTTATACTACTCCACCAATCTAAGAATAAACTCCGAAGAGAAAATT -3’；
用于特异扩增三日疟原虫的限制性引物Pm-R：
5’-CCATTACTACCCTTATACTACTCCACGGAAGCTATCTAAAAGAAACACTCATATATAAGAAT -3’；
用于特异扩增卵形疟原虫的限制性引物Po-R：
5’-CCTATCTCTTAACCTCCACTGCTTTCACCAATCTAAGAAATTTCCCCRAAAGGAATT-3’；
用于特异扩增诺氏疟原虫的限制性引物Pk-R：
5’-CCTATCTCGTAACCTCCACCCCTTTCACCTAAGAGTTCTAATCTCCGGAGAGAAAAGAA-3’；
同时，用于特异扩增疟原虫属的过量性引物：
P-F：5’-ACGATCAGATACCGTCGTAATCTT -3’。
此外，为了检验标本质量以及指示扩增体系正常与否，引入人源内参基因RNaseP。具体地，用于扩增人源内参基因的引物对：
人源内参限制性引物RNaseP-R：
5’-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCACTTGGGTGTGACCCTGAAGACTC-3’，
人源内参过量性引物RNaseP-F：5’-CCATCAACCACGCCATCAACAT-3’。
用于荧光探针熔解曲线分析的通用荧光探针序列为：
U1：5’-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-3’；
U2：5’-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-3’。
所述的通用荧光探针既可以是碱基淬灭（G碱基可用于淬灭荧光，只需在探针一端标记荧光基团），也可以是自身淬灭（荧光基团和淬灭基团分列探针两端）。 具体地，碱基淬灭的通用荧光探针为：
U1：5’ FAM-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-P 3’；
U2：5’ HEX-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-P 3’。
自身淬灭的通用荧光探针为：
U1：5’ FAM-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-BHQ1 3’；
U2：5’ HEX-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-BHQ1 3’。
通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析检测体系总体积为25 μL。具体地，检测体系为：1×Taq HS buffer，MgCl2 4 mM ，dNTP（A/G/C/T）200 μM ，U1 0.2 μM，U2 0.2 μM，过量性引物各0.8 μM，限制性引物各0.04 μM，TaKaRa Taq HS 1.5 U（5 U/μl），模板2 μL，其余用DEPC水补足。
上述反应体系在具有熔解曲线分析功能的荧光定量PCR仪上运行。具体地，扩增反应条件为：95℃预变性3 min；95℃ 15 s，64℃ 45 s，共50个循环；熔解曲线分析条件为：95℃变性1 min，30℃杂交1 min，然后由30℃缓慢上升至85℃，每上升0.5℃采集一次FAM和HEX荧光信号，通过荧光通道和Tm值判断感染的具体疟原虫型别。检测原理如图1所示。具体的判断标准为：在有内标信号基础上对FAM通道和HEX通道的熔解峰Tm值进行判读并与事先设定好的Tm值对应的疟原虫进行比对（FAM通道：恶性疟原虫Tm=46℃，间日疟原虫Tm=52℃，三日疟原虫Tm=58℃。HEX通道：卵形疟原虫Tm=46℃，诺氏疟原虫Tm=59℃，人源RNaseP Tm=70℃。Tm值误差允许在1℃范围内）；而无内标信号，则无法判读。
实施例3. 通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析体系灵敏度考察—碱基淬灭探针
为考察通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析体系检测不同疟原虫灵敏度，我们首先合成了5种分别带有特异保守序列的pUC57载体的疟原虫质粒和1种带有RNaseP基因保守序列的pUC57载体的质粒。
具体地，恶性疟原虫Pf特异保守序列为：
5’-CTTTTTTCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGCTTGGGGACATTCGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACGAACAACTGCGAAAGCATTTGTCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGTTAAAAATAAAAGTCATCTTTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTCAGTACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACTAG-3’，
间日疟原虫Pv特异保守序列为：
5’-TGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGCTTGGGGGCATTTGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACAAACAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGCTTTGGATGAAAGATTTTAAAATAAGAATTTTCTCTTCGGAGTTTATTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTGCCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTCGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACTAGTTTAAGACAAGA-3’，
三日疟原虫Pm特异保守序列为：
5’-AATAGGAGTAGCTTGGGGGCATTTGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACAAGCAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAAAAATAAAAGAGACATTCATATATATGAGTGTTTCTTTTAGATAGCTTCCTTCAGTACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAGGATTG-3’，
卵形疟原虫Po特异保守序列为：
5’-TCTTATTTTGGCTTAGTTACGATTAATAGGAGTAGCTTGGAGGCATTTGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACAAACAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGTTTTGGATGAAAGATTTTTAAATAAGAAAATTCCTTTCGGGGAAATTTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTACCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACTAGTTTA-3’，
诺氏疟原虫Pk特异保守序列为：
5’-GGGGGCATTTGTATTCAGATGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTTCTGGAGACAAACAACTGCGAAAGCATTTGCCTAAAATACTTCCATTAATCAAGAACGAAAGTTAAGGGAGTGAAGACGATCAGATACCGTCGTAATCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGCTTTGGATGAAAGATTTTAAAATAAGAGTTTTTCTTTTCTCTCCGGAGATTAGAACTCTTAGATTGCTTCCTTCAGTGCCTTATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGCGAGTATTCGCGCAAGCGAGAAAGTTAAAAGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCTTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACTAGTTTAAGACAAGAGTAG -3’，
人源内参基因RNaseP保守序列为：
5’-GGGTCAGAACGCGTGCTCTGAGATCTACATTCACGGCTTGGGCCTGGCCATCAACCACGCCATCAACATCGCGCTGCAGCTGCAGGCGGGCAGCTTCGGGTCCTTGCAGGTGGCTGCCAATACCTCCACCGTGGAGCTTGTTGATGAGCTGGAGCCAGAGACCGACACACGGGAGCCACTGACTCGGATCCGCAACAACTCAGCCATCCACATCCGAGTCTTCAGGGTCACACCCAAGTAATTGAAAAGACACTCCTCCAGAATTCGGCACGAGGTGGGACTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTTGTTGCTATCAATCATAT-3’。
然后通过10倍梯度稀释（105、104、103、102、101、100、）、每个梯度3次重复的不同浓度的质粒进行体系不同对象灵敏度考察，并以无核酸酶水为阴性对照。根据熔解曲线信号的有无，判定体系不同检测对象的检测下限，即为体系检测对象的灵敏度。
实际检测结果表明（图2），本发明检测体系对不同检测对象的灵敏度均为10拷贝数/反应。
实施例4. 通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析检测体系特异度考察—碱基淬灭探针
为考察通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析体系检测特异情况，选取临床检测结果为巴贝斯虫、伯氏疏螺旋体、基孔肯雅热病毒、人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和新冠病毒阳性而疟原虫阴性的标本作为上述检测体系特异性考察对象，并以无核酸酶水为阴性对照。根据熔解曲线信号的有无，判定体系整体检测特异度。
实际检测结果表明（图3），本发明检测体系特异度良好，除了阳性对照，体系检测结果未出现其它非特异信号。
实施例5. 通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析检测体系选择能力考察—碱基淬灭探针
为考察通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析体系选择能力情况，我们选取了同一通道相邻较近的恶性疟原虫和间日疟原虫作为体系选择能力的考察对象。具体地，以102拷贝数/ μL为初始模板浓度，按一定比例（0:100、1:99、3:97、5:95、10:90、20:80、50:50、80:20、90:10、95:5、97:3、99:1、100:0）制备恶性疟原虫和间日疟原虫混合感染模板用于体系选择性考察，并以无核酸酶水为阴性对照。
实际检测结果表明（图4），本发明检测体系选择性良好，能够准确区分不同混合感染比例的包括恶性疟原虫和间日疟原虫在内的5种疟原虫。
实施例6.临床样本检测—碱基淬灭探针
采集医院检验科人血液样本数份，提取血液中基因组DNA，采用通用型二维标记探针介导的熔解曲线分析体系进行检测。结果如图5所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建医科大学孟超肝胆医院（福州市传染病医院）
<120> 对五种输入性疟原虫分型检测的引物、探针及方法
<130>
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccattagaac ccttaagcta ctccacggta ctgaaggaag caatctaaaa gtca 54
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccattacttg ccttatacta ctccaccaat ctaagaataa actccgaaga gaaaatt 57
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccattactac ccttatacta ctccacggaa gctatctaaa agaaacactc atatataaga 60
at 62
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctatctctt aacctccact gctttcacca atctaagaaa tttccccraa aggaatt 57
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctatctcgt aacctccacc cctttcacct aagagttcta atctccggag agaaaagaa 59
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgatcagat accgtcgtaa tctt 24
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctatctctc aacctccacc cctttcactt gggtgtgacc ctgaagactc 50
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccatcaacca cgccatcaac at 22
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccattacaac ccttatacta ctccac 26
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cctatctctc aacctccacc cctttcac 28
<210> 11
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cttttttctt attttggctt agttacgatt aataggagta gcttggggac attcgtattc 60
agatgtcaga ggtgaaattc ttagattttc tggagacgaa caactgcgaa agcatttgtc 120
taaaatactt ccattaatca agaacgaaag ttaagggagt gaagacgatc agataccgtc 180
gtaatcttaa ccataaacta tgccgactag gtgttggatg aaagtgttaa aaataaaagt 240
catctttcga ggtgactttt agattgcttc cttcagtacc ttatgagaaa tcaaagtctt 300
tgggttctgg ggcgagtatt cgcgcaagcg agaaagttaa aagaattgac ggaagggcac 360
caccaggcgt ggagcttgcg gcttaatttg actcaacacg gggaaactca ctag 414
<210> 12
<211> 412
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tggcttagtt acgattaata ggagtagctt gggggcattt gtattcagat gtcagaggtg 60
aaattcttag attttctgga gacaaacaac tgcgaaagca tttgcctaaa atacttccat 120
taatcaagaa cgaaagttaa gggagtgaag acgatcagat accgtcgtaa tcttaaccat 180
aaactatgcc gactaggctt tggatgaaag attttaaaat aagaattttc tcttcggagt 240
ttattcttag attgcttcct tcagtgcctt atgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg 300
cgagtattcg cgcaagcgag aaagttaaaa gaattcggaa gggcaccacc aggcgtggag 360
cttgcggctt aatttgactc aacacgggaa aactcactag tttaagacaa ga 412
<210> 13
<211> 413
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aataggagta gcttgggggc atttgtattc agatgtcaga ggtgaaattc ttagattttc 60
tggagacaag caactgcgaa agcatttgcc taaaatactt ccattaatca agaacgaaag 120
ttaagggagt gaagacgatc agataccgtc gtaatcttaa ccataaacta tgccgactag 180
gtgttggatg atagagtaaa aaataaaaga gacattcata tatatgagtg tttcttttag 240
atagcttcct tcagtacctt atgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg cgagtattcg 300
cgcaagcgag aaagttaaaa gaattgacgg aagggcacca ccaggcgtgg agcttgcggc 360
ttaatttgac tcaacacggg gaaactcact agtttaagac aagagtagga ttg 413
<210> 14
<211> 413
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tcttattttg gcttagttac gattaatagg agtagcttgg aggcatttgt attcagatgt 60
cagaggtgaa attcttagat tttctggaga caaacaactg cgaaagcatt tgcctaaaat 120
acttccatta atcaagaacg aaagttaagg gagtgaagac gatcagatac cgtcgtaatc 180
ttaaccataa actatgccga ctaggttttg gatgaaagat ttttaaataa gaaaattcct 240
ttcggggaaa tttcttagat tgcttccttc agtaccttat gagaaatcaa agtctttggg 300
ttctggggcg agtattcgcg caagcgagaa agttaaaaga attgacggaa gggcaccacc 360
aggcgtggag cttgcgctta atttgactca acacggggaa actcactagt tta 413
<210> 15
<211> 397
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gggggcattt gtattcagat gtcagaggtg aaattcttag attttctgga gacaaacaac 60
tgcgaaagca tttgcctaaa atacttccat taatcaagaa cgaaagttaa gggagtgaag 120
acgatcagat accgtcgtaa tcttaaccat aaactatgcc gactaggctt tggatgaaag 180
attttaaaat aagagttttt cttttctctc cggagattag aactcttaga ttgcttcctt 240
cagtgcctta tgagaaatca aagtctttgg gttctggggc gagtattcgc gcaagcgaga 300
aagttaaaag aattgacgga agggcaccac caggcgtgga gcttgcggct taatttgact 360
caacacggga aaactcacta gtttaagaca agagtag 397
<210> 16
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gggtcagaac gcgtgctctg agatctacat tcacggcttg ggcctggcca tcaaccacgc 60
catcaacatc gcgctgcagc tgcaggcggg cagcttcggg tccttgcagg tggctgccaa 120
tacctccacc gtggagcttg ttgatgagct ggagccagag accgacacac gggagccact 180
gactcggatc cgcaacaact cagccatcca catccgagtc ttcagggtca cacccaagta 240
attgaaaaga cactcctcca gaattcggca cgaggtggga cttcagcatg gcggtgtttg 300
cagatttgga cctgcgagcg ggttctgacc tgaaggctct gcgcggactt gtggagacag 360
ccgctcacct tggctattca gttgttgcta tcaatcatat 400

Claims (4)

1.对五种输入性疟原虫分型检测的引物和探针，其特征在于：所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫，所述引物包括8条引物，所述探针包括2条探针；
所述8条引物为：
Pf-R：
5’-CCATTAGAACCCTTAAGCTACTCCACGGTACTGAAGGAAGCAATCTAAAAGTCA-3’；
Pv-R：
5’-CCATTACTTGCCTTATACTACTCCACCAATCTAAGAATAAACTCCGAAGAGAAAATT-3’；
Pm-R：
5’-CCATTACTACCCTTATACTACTCCACGGAAGCTATCTAAAAGAAACACTCATATATAAGAAT-3’；
Po-R：
5’-CCTATCTCTTAACCTCCACTGCTTTCACCAATCTAAGAAATTTCCCCRAAAGGAATT-3’；
Pk-R：
5’-CCTATCTCGTAACCTCCACCCCTTTCACCTAAGAGTTCTAATCTCCGGAGAGAAAAGAA-3’；
P-F：5’-ACGATCAGATACCGTCGTAATCTT-3’；
RNaseP-R： 5’-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCACTTGGGTGTGACCCTGAAGACTC-3’，
RNaseP-F：5’-CCATCAACCACGCCATCAACAT-3’；
所述2条探针为：
U1：5’-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-3’；
U2：5’-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-3’。
2.根据权利要求1所述的对五种输入性疟原虫分型检测的引物和探针，其特征在于：所述2条探针为碱基淬灭或自身淬灭；
碱基淬灭的荧光探针为：
U1：5’FAM-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-P 3’；
U2：5’HEX-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-P 3’；
自身淬灭的荧光探针为：
U1：5’FAM-CCATTACAACCCTTATACTACTCCAC-BHQ1 3’；
U2：5’HEX-CCTATCTCTCAACCTCCACCCCTTTCAC-BHQ1 3’。
3.如权利要求1所述的引物和探针在制备检测五种输入性疟原虫并分型的试剂盒中的用途；其中，所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫。
4.一种用于检测五种输入性疟原虫并分型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针；所述五种输入性疟原虫包括恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫。
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