CN112662822A - 一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的引物组、试剂及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的引物组、试剂及其方法，所述引物组包括特异性引物PSR‑FPVF和PSR‑FPVR，加速引物PSR‑FPVF FJ和PSR‑FPVF RJ，特异性引物PSR‑FPVF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，特异性引物PSR‑FPVR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，加速引物PSR‑FPVF FJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，加速引物PSR‑FPVF RJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。通过该引物组构建的PSR检测方法操作简单，对检测仪器要求低，极大缩短了检测时间，67℃恒温条件下45min内即可完成，扩增结束后向体系中加入终浓度为20×SYBR Green I核酸染料，在可见光下肉眼即可判定检测结果，极大提高了检测效率。

Description

一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的引物组、试剂及 其方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的引物组、试剂及其方法。

背景技术

猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)又称猫泛白细胞减少症病毒或猫瘟病毒，可引起一种猫的急性高度接触性传染病。FPV属细小病毒科，单股无囊膜的DNA病毒。FPV可经唾液等分泌物直接进行传播，在室内环境也可以经衣服、鞋子等媒介物间接传播，所以家猫极易感染FPV，其中幼龄猫的感染率可高达90%以上。FPV引起的症状与肠道冠状病毒等其他病毒感染的症状十分相似，因此，建立一种快速、准确、特异和灵敏的检测方法对于FPV的诊断和治疗有重要意义。

目前，最常用的病毒检测方法为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR），以及在PCR原理基础上衍生出了荧光定量PCR、巢氏 PCR 等技术。但这一系列PCR技术无法摆脱反应热循环的限制，且需要复杂的变温仪器和熟练的实验人员，导致检测成本高，检测时间长。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的引物组、试剂及其方法。

本发明采用的技术方案之一为：

一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的引物组，所述引物组包括特异性引物PSR-FPVF和PSR-FPVR，加速引物PSR-FPVF FJ和PSR-FPVF RJ，特异性引物PSR-FPVF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，特异性引物PSR-FPVR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，加速引物PSR-FPVF FJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，加速引物PSR-FPVF RJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

具体核苷酸序列表如下所示：

5’-CTGTCAGCACACTTTACACTTAAGTACTGATTCTGGTTGGA-3’（SEQ ID NO.1）

5’-CTGTCAGCACACTTTACACTCCTGTGCTGTCGTCACTGTGG-3’（SEQ ID NO.2）

5’-TGTCTGTCTTGATACTTC-3’（SEQ ID NO.3）

5’-CAGCACACTTTACACTG-3’（SEQ ID NO.4）

本发明采用的技术方案之二为：

一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的试剂，所述试剂包括上述特异性引物和加速引物。

进一步地，本发明一个实施例中，所述试剂还包括：10×Bst buffer，Bst X DNA聚合酶，dNTP Mix，MgSO₄，甜菜碱，DNA模板，灭菌水。

进一步地，本发明一个实施例中，所述试剂还包括SYBR Green I核酸染料。

本发明采用的技术方案之三为：

本发明提供的试剂在制备检测猫细小病毒的检测产品中的应用。

本发明采用的技术方案之四为：

一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的检测方法，采用特异性引物PSR-FPVF和PSR-FPVR，加速引物PSR-FPVF FJ和PSR-FPVF RJ进行PSR恒温扩增反应，检测待检测样品中的FPV。

进一步地，所述检测方法具体包括以下步骤：

S1：提取待检测样品中的FPV基因组核酸并测定浓度、计算拷贝数；

S2：以提取的FPV基因组核酸为模板，构建PSR反应体系：10×Bst buffer 2.5μL，Bst X DNA聚合酶 8U，10mM each的dNTP Mix 1.75μL，2-14mmol/L的MgSO₄ 1.5μL，0.2-1.6mol/L甜菜碱4.8μL，特异性引物PSR-FPVF和PSR-FPVR各1μL，加速引物PSR-FPV-FJ和PSR-FPV-RJ各1μL，DNA模板1μL，用灭菌水补至25μL；

S3：将PSR反应体系进行恒温反应；每次反应均设灭菌水为阴性对照；

S4：反应完成后加入SYBR Green I核酸染料进行显色反应，若为绿色，则说明待检测样品为阳性，若为橙色，则说明待检测样品为阴性。

步骤S4中的SYBR Green I核酸染料的终浓度为20×；

进一步地，其中一个实施例中，所述恒温反应的温度为67℃

本发明的有益效果：

本发明的试剂采用Bst X DNA聚合酶，该酶缺失了5'-3'和3'-5'的核酸外切酶活性，比传统的Bst DNA聚合酶具有更强的链置换活性，其热稳定性高，抗逆性好，对非离子表面活性剂和高盐环境的耐受性更高。

本发明所述方法与传统的PCR检测方法相比，操作简单，对检测仪器要求低，只需要离心机、水浴锅等简单设备便可直接完成扩增，降低了检测成本，极大缩短了检测时间，67℃恒温条件下45min内即可完成，扩增结束后向体系内加入终浓度为20×SYBR Green I核酸染料，在可见光下肉眼即可判定检测结果，极大提高了检测效率。

且本发明的PSR检测方法特异性良好，对FCoV和FNV均呈阴性。PSR检测的灵敏度为6.75×10³拷贝/μL，比常规PCR检测灵敏度略低10倍。

利用本发明的方法进行组内组间重复试验，结果显示组内与组间检测结果一致，均为阳性，重复性好。应用本发明PSR方法对50份疑似感染FPV的猫粪便样品进行检测，结果显示PSR方法检测结果与常规PCR方法检测结果基本一致，表明本研究建立的PSR方法可用于检测FPV临床样品，本方法简便、廉价、特异性强、灵敏度和重复性高，且可见光下肉眼即可判定结果，适合市县级宠物医院FPV感染的快速诊断。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例的 PSR反应温度（A）、Mg²⁺浓度（B）、甜菜碱浓度（C）条件的筛选和PSR产物酶切鉴定结果（D）；

图2是本发明实施例的引入加速引物可提高PSR扩增效率；

图3是本发明实施例的 PSR法特异性试验和可视化检测结果；

图4是本发明实施例的PSR法和PCR法检测FPV灵敏度比较。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例采用的FPV、FCoV、FNV粪便样品均为2018-2020年间采集于兰州市部分宠物医院。病毒核酸提取试剂盒、10000×SYBR Green I、Bst X DNA聚合酶、10×BstBuffer、MgSO₄溶液均购自北京索莱宝科技有限公司；甜菜碱购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；dNTP Mix(10mM each)、2×Taq Master Mix(Dye Plus)均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

实施例1

1.引物设计

应用Oligo 6.0软件针对FPV NS1基因的保守区域设计1对PCR引物：FPV-F和FPV-R，扩增片段大小约为403bp，在该扩增片段内依据PSR原理设计1对PSR特异性引物：PSR-FPVF、PSR-FPVR，和1对PSR加速引物：PSR-FPV-FJ、PSR-FPV-RJ。PSR扩增产物为一系列梯形条带。所有引物由北京擎科生物科技有限公司西安分公司合成。具体引物名称及序列见表1。

表1 检测FPV的PCR和PSR引物

2.核酸提取和拷贝数计算

利用病毒核酸提取试剂盒分别将FPV阳性样品、猫冠状病毒（FCoV）阳性样品和猫诺如病毒（FNV）阳性样品提取病毒核酸，使用超微量分光光度计测定FPV核酸浓度，并计算其拷贝数。以FPV基因组DNA作为后续实验的反应模板，保存于-80℃冰箱。

3.PSR反应体系的构建及优化

以提取的FPV基因组核酸为模板，构建如下PSR反应体系：10×Bst buffer 2.5μL，Bst X DNA聚合酶 8U，dNTP Mix(10mM each) 1.75μL，MgSO₄(100mmol/L) 1.5μL，甜菜碱(4.17mol/L) 4.8μL，PSR-FPVF和PSR-FPVR引物各1μL，PSR-FPV-FJ和PSR-FPV-RJ引物各1μL，DNA模板1μL，用灭菌水补至25μL。65℃下恒温反应90min，结束后进行电泳观察。每次实验均设以灭菌水为模板的阴性对照。

为了对反应体系进行优化：

基于上述PSR反应体系，利用方阵法进行退火温度(70℃、67℃、64℃、61℃、58℃)、反应时间(45min、60min、75min、90min)、MgSO₄浓度(2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8mmol/L、10 mmol/L、12 mmol/L、14 mmol/L)和甜菜碱浓度(0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.8mol/L、1.2mol/L、1.6mol/L)的筛选，确定最优的反应条件。同时，以最优条件进行试验，在反应结束后取10μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。其余扩增产物内加入终浓度为20×SYBR Green I核酸染料，观察反应管是否发生颜色变化。

结果如下：

以提取的FPV基因组DNA为模板，利用方阵法优化PSR检测方法，首先使用PSR-FPVF和PSR-FPVR引物在不同温度下（58℃、61℃、64℃、67℃、70℃）分别进行PSR恒温扩增90min。结果见图1A，从图中可以看出，当反应90 min，反应温度为67℃时，梯状条带最清晰图。以67℃为最优反应温度进行PSR扩增，结果见图1B，结果表明在设立的MgSO₄浓度梯度中6mmol/L MgSO₄为最优反应浓度。再以67℃、6mmol/L MgSO₄为反应条件进行PSR扩增，优化甜菜碱浓度，结果见图1C，结果显示甜菜碱浓度变化对反应结果影响差异不明显，故取中间浓度0.8mol/L作为甜菜碱最佳浓度。

为验证PSR扩增的梯度条带为FPV特异性靶基因，我们选取靶基因上唯一的酶切位点Sca I对PSR产物进行酶切鉴定，结果见图1D，电泳结果显示，在100bp处可见唯一一条预期目标基因条带，该条带切胶回收后送于测序公司，测序结果显示，本PSR法扩增产物为特异性FPV基因片段。

实施例2

为了验证加速引物PSR-FPVF FJ和PSR-FPVF RJ对实验结果的影响，设置四组反应体系，第一组不加任何加速引物，第二组只加PSR-FPVF FJ，第三组只加PSR-FPVF RJ，第四组同时加入PSR-FPVF FJ和PSR-FPVF RJ。检测方法采用实施例1优化后的结果。

结果见图2，第一组未引入加速引物组在反应75 min时可观察到清晰的梯状条带，引入加速引物组在反应45min时便有PSR扩增产物，但同时引入两条加速引物组的第四组在反应45min时电泳条带比引入单条加速引物组的第二、三组都明亮，说明引入两条加速引物组提高了PSR扩增效率，把检测时间缩减到45min。

实施例3

以实施例提取的FPV、FCoV和FNV基因组核酸为模板，利用实施例1的检测方法并加入加速引物PSR-FPVF FJ和PSR-FPVF RJ，进行特异性试验，同时设立以灭菌水为模板的阴性对照。

结果见图3，结果显示，灭菌水、FCoV和FNV三组均未发生基因扩增，而FPV、FPV+FCoV、FPV+FNV、FPV+FCoV+FNV四组有基因扩增，见图3A，反应结束后加入终浓度为20×SYBRGreen I核酸染料，在可见光下肉眼观察，发现灭菌水、FCoV和FNV三组为橙色，FPV、FPV+FCoV、FPV+FNV、FPV+FCoV+FNV四组的颜色由橙色变为绿色，这说明SYBR Green I染色结果与电泳结果一致，见图3B（由于说明书附图不能提供彩色附图，图中没有示出绿色和橙色，但是实际实验中肉眼可区分出绿色和橙色）。因此说明建立的PSR检测方法不仅具有良好的特异性，而且可用肉眼直观判读结果。

实施例4

将所提取的FPV基因组DNA进行10倍梯度稀释，以稀释的各浓度的病毒基因组为模板进行PSR和PCR扩增， PCR体系成分占比为：2×Taq Master Mix(Dye Plus)12.5μL、常规引物FPV-F和FPV-R各1μL、DNA模板1μL，用水补齐至25μL。扩增程序：94℃初始变性4min； 94℃ 30 S、51℃ 30 S、72℃ 30 S ，35个循环；72℃延伸8 min。反应结束后PCR扩增组进行琼脂糖凝胶电泳检测，PSR反应管中加入SYBR Green I核酸染料观察反应液的颜色变化，比较两种检测方法的灵敏度。

其中，常规引物FPV-F的核苷酸序列SEQ ID NO.5所示，常规引物FPV-R的核苷酸序列SEQ ID NO.6所示；

具体核苷酸序列如下：

5’-ATGGTTGGTGACTCTTTGTT-3’（SEQ ID NO.5）

5’-TACATTTGATTGACACTTCC-3’（SEQ ID NO.6）

结果见图4，结果显示，提取的FPV基因组DNA计算出拷贝数后进行10倍梯度稀释，即从6.75×10⁸拷贝/μL稀释到6.75×10¹拷贝/μL，再以各浓度的病毒基因组为模板进行PSR和PCR扩增，结果显示，PSR法可检测到的病毒DNA最低值6.75×10³拷贝/μL，见图4A（由于说明书附图不能提供彩色附图，图中没有示出绿色和橙色，但是实际实验中肉眼可区分出绿色和橙色），PCR法可检测的最低值6.75×10²拷贝/μL，见图4B，这表明本研究建立的PSR检测方法虽比PCR法敏感度低10倍，但仍具有可接受的敏感性。

实施例5 临床实验

利用建立的PSR方法和常规PCR方法分别对取自兰州的50份疑似感染FPV猫粪便样品进行检测，同时设立阴阳性对照，反应结束后对检测结果进行分析。

对50份疑似感染FPV猫粪便样品、2份FPV阳性猫粪便样品进行PSR和PCR检测。结果显示，2份阳性样品PSR和PCR检测均为阳性，而50份猫粪便样品中，PSR检测出42份为阳性，阳性率为84%，PCR检测出44份为阳性，阳性率为88%，两种检测方法的结果基本相符。表明建立的PSR检测方法能够进行临床应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 甘肃农业大学

<120> 一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的引物组、试剂及其方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtcagcac actttacact taagtactga ttctggttgg a 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgtcagcac actttacact cctgtgctgt cgtcactgtg g 41

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtctgtctt gatacttc 18

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagcacactt tacactg 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggttggtg actctttgtt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacatttgat tgacacttcc 20

Claims (8)

1.一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括特异性引物PSR-FPVF和PSR-FPVR，加速引物PSR-FPVF FJ和PSR-FPVF RJ，特异性引物PSR-FPVF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，特异性引物PSR-FPVR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，加速引物PSR-FPVF FJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，加速引物PSR-FPVF RJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述引物组。

3.根据权利要求2所述的基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：10×Bst buffer，Bst X DNA聚合酶，dNTP Mix，MgSO₄，甜菜碱，DNA模板，灭菌水。

4.根据权利要求2所述的基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的试剂，其特征在于，所述试剂还包括SYBR Green I核酸染料。

5.一种权利要求2-4任一所述的试剂在制备检测猫细小病毒的检测产品中的应用。

6.一种基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的检测方法，其特征在于，采用特异性引物PSR-FPVF和PSR-FPVR，加速引物PSR-FPVF FJ和PSR-FPVF RJ进行PSR恒温扩增反应，检测待检测样品中的FPV。

7.根据权利要求6所述的基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的检测方法，其特征在于，包括：

S1：提取待检测样品中的FPV基因组核酸并测定浓度、计算拷贝数；

S2：以提取的FPV基因组核酸为模板，构建PSR反应体系：10×Bst buffer 2.5μL，Bst XDNA聚合酶 8U，10mM each的dNTP Mix 1.75μL，2-14mmol/L的MgSO₄ 1.5μL，0.2-1.6mol/L甜菜碱4.8μL，特异性引物PSR-FPVF和PSR-FPVR各1μL，加速引物PSR-FPV-FJ和PSR-FPV-RJ各1μL，DNA模板1μL，用灭菌水补至25μL；

S3：将PSR反应体系进行恒温反应；每次反应均设灭菌水为阴性对照；

S4：反应完成后加入SYBR Green I核酸染料进行显色反应，若为绿色，则说明待检测样品为阳性，若为橙色，则说明待检测样品为阴性。

8.根据权利要求7所述的基于聚合酶螺旋反应检测猫细小病毒的检测方法，其特征在于，所述恒温反应的温度为67℃。

Images