CN1366067A

CN1366067A - 一种乙型、丙型肝炎双检基因芯片试剂盒及其制备和使用方法

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Publication number: CN1366067A
Application number: CN 01105214
Authority: CN
Inventors: 毛裕民; 谢毅; 吴海; 徐东; 王品; 倪晓龙; 张宏莲
Original assignee: BOHUA GENE CHIP TECHNOLOGY CO LTD SHANGHAI
Current assignee: BOHUA GENE CHIP TECHNOLOGY CO LTD SHANGHAI
Priority date: 2001-01-15
Filing date: 2001-01-15
Publication date: 2002-08-28

Abstract

本发明公开了一种新的乙型、丙型肝炎双检基因芯片诊断试剂盒,此试剂盒的组成成分和制备方法。本发明还公开了此试剂盒用于检测的方法,以及结果的分析方法。本发明还公开了本试剂盒的用途。

Description

一种乙型、丙型肝炎双检基因芯片试剂盒及其制备和使用方法

本发明属于生物医药技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的乙型、丙型肝炎双检试剂盒，以及该试剂盒的组成成分，本发明还涉及该试剂盒的制备和使用方法。

在威胁人类健康的各种疾病中，感染性疾病一直占有重要位置。据世界卫生组织(WHO)99年报告，98年全球死于感染性疾病计1300万人，其占所有死亡人数的比率为25％，仅次于心血管疾病的31％，远高于死于癌症的13％。在各类感染性疾病中，病毒性肝炎是其中最为严重的疾病之一。

到目前为止，病毒性肝炎总共发现了7种：甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎以及TTV肝炎。但以乙型、丙型肝炎流行最广范、危害也最大。乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是由乙型肝炎病毒(HBV)引起，通过血液与体液传播，具有慢性携带状态的传染病，容易发展为慢性肝炎和肝硬化，部分病例可转变为原发性肝细胞癌。丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液和体液传播，占输血后肝炎的70％。

乙型肝炎与丙型肝炎有以下相似之处：

1、乙型、丙型肝炎的传播方式相似，两者均是通过体液、血液、及通过输血、血制品、血液透析及静脉内滥用药物等方式传播。

2、乙型、丙型肝炎的临床表现相似，而且都有无症状病毒携带者。无症状带病毒的供血者，能传播肝炎给受血者。

3、乙型肝炎与丙型肝炎均有向慢性肝炎和肝硬化发展的倾向，也都可以发展为原发性肝细胞癌。

4、乙型肝炎和丙型肝炎可以重叠感染，且重叠感染较单个感染发生重症肝炎和病死的比率要高，表明乙肝与丙肝重叠感染可加剧肝脏的损害。

5、乙型、丙型肝炎都有性接触传播的可能及母婴垂直传播。

目前乙型、丙型肝炎的病原学诊断：

HBV感染的诊断

乙型肝炎病毒(HBV)感染的血清学标志检测物有：表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)、去氧核糖核酸(DNA)和DNA聚合酶(DNAP)等。乙型肝炎病毒的外壳组成蛋白，除了S蛋白外，前-S1蛋白和前-S2蛋白亦可以作为乙型肝炎病毒感染的指标。临床常规应用的为表面抗原及其抗体(HBsAb)、乙肝e抗原及其抗体(HBeAb)及核心抗体(HBcAb)，即所谓″两对半″或称″乙肝五项指标″。其中HBsAg、HBeAg、抗-HBc为乙肝病毒在体内复制的指标，此三项阳性俗称″大三阳″，HBeAg、抗-HBe和抗-HBc三项阳性，俗称为″小三阳″。

对于乙型肝炎的传染性来说，HBV的DNA是否是阳性，滴度多少才是乙肝传染性高低的标准。目前对HBV-DNA的实验诊断主要方法是聚合酶链反应(PCR)以及在PCR基础上发展起来的荧光PCR和荧光定量PCR。在急性和慢性乙型肝炎病人的血清中均可检出HBV-DNA，它的出现表示病毒复制(繁殖)活跃。HBV-DNA转阴，提示病毒复制缓解。HBV-DNA是病毒复制的直接指标，HBV-DNA阳性表示此时传染性强。因此，对乙型肝炎病毒去氧核糖核酸(HBV-DNA)的检测有重要的临床意义。

HCV感染的诊断

目前用于HCV感染的实验诊断方法主要有两种：检测抗-HCV和HCV-RNA。

自1989年美国建立了HCV C_100-3抗体检测系统，才为诊断HCV感染开辟了新途径。但C_100-3抗原-抗体系统的敏感性不高，抗C_100-3出现也太晚，有些病人根本不出现，因此不适于早期诊断，并且常常出现假阳性。第二代重组基因多肽检测抗-HCV的ELISA技术，是在原包被抗原中加入了核心抗原C_22-3、C₁₂₀、C₁₁。与第一代相比，检出率有所提高，抗体出现时间也提早到16～60天。但由于重组基因多肽抗原仍有SOD多肽，所以仍存在抗-SOD造成的假阳性。

PCR方法可检出HCV-RNA，但有一定的漏检率。由于HCV在被感染者体内浓度很低，目前只能用逆转录PCR(RT-PCR)才能检测到血清中的HCV-RNA。PCR技术的优点：1、特异性强，抗-HCV阳性不能直接说明受检者体内当时HCV是否存在，而HCV-RNA可作为有无传染性的直接指标；2、敏感性高，可发现抗-HCV阴性者HCV感染；3、阳性出现早，可在ALT增高的同时检出。黑猩猩感染HCV后第三天即可在血清中检出HCV-RNA。但PCR的技术要求严格，试验成本高和因环境污染而造成的假阳性等原因，限制了它的使用范围。

基因芯片技术是诊断学发展的必然趋势

在面积不大的基质表面上有序地点阵排列了大量固定于一定位置的可寻址的识别分子。具体地说，就是在玻璃、硅等载体上有序地、高密度地排列、固定了大量的靶基因片段或寡核苷酸片段(也叫分子探针)，这些被固定的分子探针在基质上就形成了高密度DNA微阵列。借用了计算机芯片的概念称为基因芯片(Gene Chip)，也叫基因微矩阵(DNA microarray)。

到目前为止，生物芯片在技术上已趋成熟，尤其是DNA微矩阵系统在轻巧性、速度和功能性方面的完整统一，使之在疾病诊断领域具备了强大的应用潜能。微矩阵将在未来一段时间里成为生物芯片的主流，应用微矩阵技术生产的基因芯片也将成为主导产品。从基本技术来说，微矩阵的技术包括三方面内容：一是制备与靶基因互补的DNA，并将它以微粒子数量级(microscopicquantities)点滴到固体表面的既定位置上；二是从表面洗脱样品DNA与互补DNA结合；三是在激光激活下，运用荧光测定法检测结合的DNA。

基因芯片的概念可追溯到Southern blot杂交技术，即DNA-DNA之间通过碱基配对机制形成互补链。随后又发展出Northern blot杂交和点杂交技术。这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上，样品容易扩散，因此在单位面积上点样的密度受到限制，无法进行大规模、高通量的DNA杂交。同时，由于滤膜面积较大而需较多探针量，检测灵敏度较低。为了提高点样密度和检测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅等材料为载体的基因芯片技术逐步得到了发展。

从制作上可将基因芯片分为两大类：原位合成法(DNA chip)和微矩阵法(DNA mircoarray)。原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等发明，他们将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，用单核苷酸或其它生物大分子为底物，在玻片上原位合成寡核苷酸，每次循环都有特定的核苷酸结合上去，直到设定的寡核苷酸长度，每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因，存在于DNA芯片的特定位置上[1]。微矩阵法最早由Stanford大学的P.Brown等发明[2，3，4]，将PCR等方法得到的cDNA用针点或喷点的方法直接排列到玻片等介质上，从而制备成芯片。

美国Affymetrix公司80年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究[5-7]。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片[8]。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描和计算机分析等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生[14]。标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。

原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定，SNP分析等。但其缺点是合成寡聚合苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，它的最大优点是靶基因特异性非常好，用作检测诊断的结果非常可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片[10]。

世界上许多国家和地区已相继开展基因芯片的研制和开发工作。美国政府非常重视该领域的发展，于1998年6月29日宣布正式启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入了20亿美元以上的研究经费。许多政府机构如NIH(美国国立卫生院)、DOE(美国能源部)、商业部、司法部、国防部和中央情报局等参与了此项目，同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分实验室如Argonne、Oakridge也参与了该项目的开发和研究；英国剑桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究。此外，国外大型的制药公司都希望能推进基因芯片技术的实际应用，尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，相继投入巨资开发基因芯片技术和相应的设备。

参考资料1.Watson，J.D.(1993)Gene 135，309-315.2.Collins，F.S.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，10821-10823.3.Pease，A.C.et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5022-5026.4.Shal on，D.，Smith，S.J.& Brown，P.O.(1996)Genome Res.6，639-645.5.Fodor，S.P.A.et al.(1991)Science 251，767-773.6.Fodor，S.P.A.et al(1993)Nature 364，555-556.7.Lipshutz，R.J.et al(1999)Nature genetics supplement 21，20-24.8.Southern，E.，Maskos，U.& Elder，R.(1992)Genomics 13，1008-1017.9.DeRisi，J.L.，Lyer，V.& Brown，P.O.(1997)Science 278，680-686.10.Baldwin，D.，Crane，V.，Rice，D.(1999)Curr Opin Plant Biol 2(2)：96-103.11.Brown，P.O.，Botstein，D.(1999)Nature genetics supplement 21，33-37.12.姜军平等，《实用PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司，1998。13.Schena，M.，Shalon，D.，Heller，R.(1996)Proc.Natl.Acad. Sci. USA.Vol.93：10614-10619.14.Schena，M.，Shalon，Dari.，Davis，R.W.(1995)Science.270.(20)：467-480.15.Zhu Z，Chao J，Yu H，Waggoner AS.(1994)Nucleic Acids Res 25：22(16)：3418-22.16.Zhu Z，Waggoner AS.(1997)Cytometry 1；28(3)：206-11.17.Yu H，Chao J，Patek D，Mujumdar R，Mujumdar S，Waggoner AS.(1994)Nucleic Acids Res 11；22(15)：3226-32.18.候云德，《分子病毒学》，学苑出版社，1990年.19.叶维法、钟振义，《肝病免疫学》，天津科学技术出版社，1997。20.王吉耀，《现代肝病治疗——理论与进展》，上海医科大学出版社，1999。21.姚桢，《分子乙型肝炎病毒相关病学》，中国医药科技出版社，1998。22.郝飞、余宙耀，《丙型肝炎基础与临床》，人民卫生出版社1998。23.丁振若、苏明权，《临床PCR基因诊断技术》，世界图书出版公司，1998。

本发明的一个目的在于应用国内外生物医药领域的基因芯片技术，设计出一种能同时检测乙型、丙型肝炎病毒的双检试剂盒。它具有特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠及适于批量样本检测的特点，适用于乙、丙型病毒肝炎的血源检测及临床诊断。

本发明的另一个目的是设计一种可以同时检测乙型、丙型肝炎病毒的检测芯片。

本发明的另一个目的在于提出一种生产这种检测芯片的方法。

本发明的另一个目的在于提出一种生产检测用试剂盒的方法。

本发明的另一个目的在于提供了一种利用所述的试剂盒进行HBV和HCV同时检测的方法。

本发明的另一个目的在于提供了一种可利用于乙肝检测的HBV病毒的特征基因片断。

本发明的另一个目的在于提供了一种可利用于丙肝检测的HCV病毒的特征基因片断。

本发明的另一个目的在于提供了一种可以用作监控HBV检测的阳性参照基因片断。

本发明的另一个目的在于提供了一种可以用作监控HCV检测的阳性参照基因片断。

本发明的另一个目的在于提供了一种在检测中用作阴性参照的基因片断。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

乙型、丙型肝炎双检基因芯片是将HBV、HCV高度保守的特征性基因片段(靶基因)固定于玻片上，并在同一块检测芯片上固定有各种系统监控的内参照基因。将从血清样本中抽提出的DNA或RNA经PCR(或RT-PCR)扩增，再经萤光标记后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描，最后经计算机的专用软件进行分析确诊。

具体地说通过分子克隆操作，分别将HBV、HCV一段约200bp的高度保守的特征性基因片段(靶基因)用专用的芯片点样仪点到特制的玻片上。同时为防止芯片制备及检测过程中的污染，在同一块检测芯片上设置了多个监控系统：

1)空白点作为芯片制备过程中的污染监控；

2)阴性内参照是一段与HBV、HCV靶基因序列没有同源

性的特异的植物基因片段，作为芯片杂交过程中的特异

性杂交监控；

3)阳性内参照1 是一段与HBV、HCV靶基因序列没有同

源性的特异的植物基因片段，但该参照的两头接上HCV

的引物序列。阳参1在血清抽提过程中加入，作为抽提、

扩增及HCV标记、杂交过程的监控；

4)阳性内参照2 是一段与HBV、HCV靶基因序列没有同

源性的特异的植物基因片段，但该参照的两头接上HBV

的引物序列。阳参2在标记过程中加入，作为HBV标记、

杂交过程的监控；

下述的技术方案不用于限定由权利要求书所界定的本发明的范围：一检测芯片的生产含有HBV、HCV特征基因片段载体的制备、转化和测序验证：

1)按所需要克隆的HBV特征基因(Genbank号及描述：NC-001707(3215bp)DNA circular，Hepatitis B virus)和HCV特征基因(Genbank号及描述：NC_001433(9413bp)，ss-RNAVRL，Hepatitis C virus)片段分别设计出特异性引物(如SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示)，HBV、HCV特征基因的模板直接取自携带有HBV病人及携带有HCV病人的血清抽提物，采用PCR方法扩增出目标基因片段。HCV的cDNA用RT和nest-PCR方法获得。

所获得的乙肝病毒特征基因片断如SEQ ID NO：1所示，丙肝病毒特征基因片断如SEQ ID NO：2所示。

用作乙肝检测阳性参照的植物基因如SEQ ID NO：7所示，用作丙肝检测阳性参照的植物基因如SEQ ID NO：8所示，用作阴性参照的植物基因如SEQ ID NO：9所示，这些模板均取自复旦大学遗传学研究所。

2)将PCR产物跑分离电泳，检测专一的扩增片段，条带大小正确的割胶回收，割胶产物用割胶纯化试剂盒纯化。

3)纯化的DNA片段用pGEM^-T Vector System做连接，连接液转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，蓝白斑筛选重组克隆。

4)挑白斑，用QIAprep^Spin Miniprep Kit试剂盒(QIAGENE公司)抽质粒，用通用引物M13+和M13-测序(M13+ 5’cag gaaaca gct atg acc 3’；M13-5’tgt aaa acg acg gcc agt 3’)在3700测序仪(PE公司)上测序。

5)测序结果经过比对和确认。靶基因DNA的制备、纯化

将上述经过测序验证的HBV、HCV及3个植物基因片段的质粒分别用去离子水稀释至浓度1ng/μl，作为PCR扩增的模板。在50μl PCR扩增体系中掺入上述模板1μl，每种模板需做10份。

50μl PCR扩增体系的组成：

去离子水 41μl

10×buffer 5μl

10mmol/L dNTP 1μl

10mmol/L primer(HBV、HCV或植物基因) 1μl

template(HBV、HCV或植物基因) 1μl

Taq酶 0.3μl

试剂按10×的量配制，所有操作在冰浴条件下进行，Taq酶最后加入，充分混合后稍稍离心。将配好的反应试剂分装到10个200μl的薄壁管中，置于PCR仪中按下列程序进行PCR扩增：

①94℃ 180sec

②94℃ 30sec

③60℃ 30sec

④72℃ 30sec

⑤goto② for 35 cycles

⑥72℃ 300sec

⑦4℃ forever(待机)

⑧END

将第一次PCR产物(10管)合并，浓缩后跑分离电泳，割胶分离目的片段。以割胶回收的DNA为模板再进行一轮PCR扩增，第二轮PCR的产物直接用于点芯片，因此需大量制备，可上96孔板操作。第二次PCR产物经电泳检测，只有条带专一的方可用于点芯片。纯化PCR产物，加入1/10体积的醋酸钠溶液(浓度为3mol/L，pH5.2)及等体积的异丙醇，混匀，于-20℃沉淀2hr。13,000rpm离心15min。弃异丙醇，用75％乙醇500μl洗涤沉淀2次，室温干燥后备用。点样

1)用去离子水将Micro Spotting Solution原液(2X)稀释成1×溶液。将HBV、HCV和阴性参照的靶基因终浓度配制至500ng/μl；而将HBV、HCV阳性参照的植物基因终浓度配制至5个浓度梯度，作为定量的监控依据。5个梯度分别是1000ng/μl，500ng/μl，250ng/μl，125ng/μl及62.5ng/μl。

2)将14个样品(HBV阳性参照5份，HCV阳性参照5份，HBV基因片段1份，HCV基因片段1份，阴性参照1份，空白参照1×Spotting Solution溶液1份)每种8.0μl加在384孔板的A1-A14。其中A1-A5为HCV阳性参照的5个梯度，A6为HCV，A7为阴性参照，A8为1×spot solution，A9为HBV，A10-A14为HBV阳性参照的5个梯度。点样时按照低浓度向高浓度的顺序加样。

3)将384孔板放入Cartesian点样仪内，打开按设计要求编写点样程序(如图1)，将靶基因片段点于玻片上。点完样后将芯片直接置于点样仪内经过0.5hr水合，水合完毕后取出芯片置于玻片盒中。室温放置1小时进行自然干燥。

4)取0.2％的SDS 50ml放入染色缸内，将干燥的点样玻片浸入染色缸中，洗去一些未共价结合上的cDNA。浸洗2min后用双蒸水冲掉残余的SDS，自然晾燥。

5)待玻片干燥后，在定位区上加上琥珀酸酐溶液400μl-500μl左右，将点样区完全覆盖，封闭点样区15min，去除靶基因周围的背景干扰。经双蒸水冲掉残余琥珀酸酐。自然干燥后置于玻片盒中，4℃保存。二本发明的双检基因芯片试剂盒的生产

在检测芯片制备完成后，生产出试剂盒的其余组成成分：核酸抽提液，反转录试剂，PCR混合物，标记混合物，荧光标记试剂，杂交试剂I，杂交试剂II，洗涤浓缩液，反转录酶，Taq酶，阳性对照和说明书。具体的讲：

诊断芯片核酸抽提液配方

异硫氰酸胍 92.6g

柠檬酸钠(B₄₆) 13ml

超纯水 26ml

十二烷基肌氨酸钠(B₁₇) 13ml

β-巯基乙醇(B₁₀) 1.3ml

tRNA(库存半成品) 8.5ml

注：4℃保存；1000μl单管分装；

1)tRNA配制：tRNA 1mg+超纯水2ml

2)饱和酚的制备：重蒸酚用68℃水浴融化，称取0.1g——羟基喹啉，加入100ml重蒸酚，50ml超纯水，溶解混匀，4℃静置过夜。第二天用滴管把水分吸出

3)B₁₇配制：称取十二烷酰肌氨酸钠25g，加入超纯水定容至体积为500ml，

B₄₆配制：称取柠檬酸钠36.75g，加入超纯水定容至体积为500ml

注：先测pH至7.0，后定容；高压灭菌；室温贮存，首次开启使用后4℃贮存；用HCl溶液(HCl∶水＝1∶11)调pH

TE缓冲液：在800ml蒸馏水中加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml 0.5mol/L的EDTA(pH8.0)，加蒸馏水定容至1000ml。

75％乙醇：量取95％乙醇37.5ml，加入10ml蒸馏水，充分混匀，4℃保存。

20×SSC溶液：称取NaCl 175.3g，柠檬酸三钠88.2g，加入800ml蒸馏水，用10mol/L的NaOH调pH至7.0，加蒸馏水定容1000ml。

PBS溶液：800ml蒸馏水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加蒸馏水定容1000ml。在1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20分钟，保存于室温。

10％十二烷基磺酸钠溶液(SDS)：在800ml蒸馏水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃，用浓盐酸调节pH值至7.2，加水定容至1000ml。

琥珀酸酐溶液：称取1g琥珀酸酐溶解于100ml/L的硼酸溶液和100ml 1-甲基-2-吡咯烷酮中。

25∶24∶1饱和酚∶氯仿∶异戊醇(V/V/V)：

酸性酚∶氯仿∶异戊醇∶将重蒸酚于50℃水浴锅中融化，加入等体积的蒸馏水充分混匀，再加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，此时pH值约为4.5。

点样液(spot solution)：Sigma公司购得。

杂交液I：6×SSPE+3×SSC+10×Dehart，各100μl

杂交液III：Frmamide 20×SSC+5％SDS溶液 100μl

反转录试剂：

HCV反转录引物(10mmol/L) 0.5μl

植物基因反转录引物 0.5μl

超纯水 6μl

0.1mmol/L DTT 1μl

5×first stand buffer 2μl

10mmol/LdATP-dGTP-dCTP-dTTP Mixture 0.25μl

反转录酶：SuperScriptII反转录酶(5U/μl) 0.5μl

PCR-mixture I：

ddH₂O 31.5μl

10×Buffer 5ul

10mmol/L dNTP 1ul

10mmol/L HCV primer 1ul

10mmol/L阳参1引物 1ul

Taq酶 0.5ul

标记mixture

10×buffer(含25mmol/L MgCl₂) 5μl

10mmol/LdATP-dGTP-dCTP Mixture 1μl

1mmol/L dUTP 1μl

15mmol/L HBV primer Mixture 2μl

15mmol/L HCV primer Mixture 3μl

植物基因primer mixture 1μl

尿嘧啶糖基化酶 0.5U

标记试剂：0.1mmol/LCy5-dU 1μl

标记酶：Taq酶(5 0.5μl

10×洗涤浓缩液：10×SSC+2％SDS，10×SSC+2％Tween-20，10×SSC各5ml

阴性对照血清：

将正常人血清(40份)混和均匀，加入终浓度为0.02％的硫柳汞钠盐，分装后贴标签，注明名称、批号、数量和生产人员，-20℃保存。以100μl/瓶分装，封盖，贴标签，注明名称，2ˉ8℃保存。

阳性对照血清：

将HBV和HCV阳性血清分别加入终浓度为0.02％的硫柳汞钠盐，分装后贴标签，注明名称、批号、数量和生产人员，-20℃保存。以100μl/瓶分装，封盖，贴标签，注明名称，2ˉ8℃保存。

将以上物品按要求装入包装盒内，经复核后密封，打印组装批号(合格号)，质控合格后入库。4℃保存。三利用本发明双检基因芯片试剂盒进行检测的方法

核酸抽提

1)将待检测样品的血清取50μl进行抽提。抽提液各150μl，振荡混匀后加200μl的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)溶液，混匀。

2)14,000rpm离心10分钟。吸取上清，对于抽双份的样品需合并上清。

3)加入等体积的异丙醇(-20℃预冷)及1μl的10μg/μltRNA(助沉)，混匀。13,000rpm 4℃离心15分钟。弃上清，用500μl预冷的75％乙醇洗涤沉淀，13,000rpm离心5分钟。重复洗涤一次。

4)倒去乙醇后室温干燥或65℃快速抽干。注意不能太干。RT-PCR扩增

1)向含核酸沉淀的上述eppendorf管内，加入反转录试剂，成分如下：

去离子水 6μl

10μmol/L HCV反转录引物 0.5μl

0.1mol/L DTT 1μl

5×first strand buffer 2μl

10mmol/L Dntp 0.5μl

混匀样品，5000rpm离心数秒后置于65℃水浴锅变性5min。注意：整个反转录操作应当避免RNA酶的污染，所有操作应当在冰上完成。

2)取出eppendorf管，冰浴1min，5,000rpm离心数秒。加入0.2μl Super Script II逆转录酶，混匀，5,000rpm离心数秒，置于42℃水浴锅内保温30min。75℃灭活15min。

3)吸取RT产物5μl PCR-mixture I，成分如下：

去离子水 31.6μl

10×Buffer 5μl

10mmol/L dNTP 1μl

10μmol/L HCV引物 1μl

10mmol/LHB引物 1μl

Taq酶 0.4μl

将薄壁管置于MJ Research PTC-225 PCR仪中按下列程序进行PCR反应：

①95℃ 1.5min

②95℃ 30sec

③60℃ 30sec

④72℃ 30sec

⑤Goto② for 35 cycles

⑥72℃ 5min标记

1)吸取2μl上述PCR产物，并加入标记mixture试剂：

去离子水 35.5μl

10×Buffer 5μl

10mmol /L dATP-dGTP-dTTP mixture 1μl

1mmol/L dCTP 1μl

10μmol/L HCV primer mixture 1μl

10μmol/L HBV primer mixture 1μl

HBV阳参标记模板(lng/μl) 1μl

0.1mmol/L Cy5-dCTP 1μl

Taq酶 0.5μl

将薄壁管置于PCR仪中按下列程序进行PCR反应：

①95℃ 90sec

②95℃ 30sec

③58℃ 30sec

④72℃ 30sec

⑤Goto② for 35 cycles

⑥72℃ 5min

⑦4℃ forever(待机)

⑧END

取出薄壁管，-20℃蔽光保存。杂交

1)(暗室中操作)在1.5ml的离心管中加入鱼精DNA和tRNA各2μl，将上述制备的标记产物加入到离心管中混匀，加2倍体积的无水乙醇及十分之一体积的3N的醋酸钠(PH5.2)，混匀，4℃ 13,000rpm离心15min，弃去上清，再加500μl的75％的乙醇，13000rpm离心5分钟，重复洗一次，室温晾干。

2)加入5μl预热的杂交试剂I溶液和5μl杂交试剂II，混匀后于5000rpm离心10sec。

3)将溶解好的探针和待杂交的玻片置于95℃的水浴锅内变性5min，立即放在冰上冰浴。将变性好的玻片插入到盛有无水乙醇的染色缸内室温放置30sec，取出于室温晾干。

4)取10μl的上述探针，滴于玻片的点样区上，用镊子将盖玻片慢慢盖上，赶出气泡。水平放置于专用杂交仓中(加入少许双蒸水，以免玻片干燥)，盖上杂交仓，封上parafilm，仓置于有湿润纱布的饭盒内，42℃杂交，1.5-2hr。

5)取出玻片先用0.1×SSC轻轻地冲去盖玻片，再放入装有0.1×SSC及玻片架的烧杯中，洗涤10min，再用0.1×SSC轻轻冲洗。避光晾干后待扫描。检测

将诊断芯片插入ScanArray 3000扫描仪中根据点样位置进行扫描，并使用Imagene软件分析杂交结果。扫描结果显示检测监控系统中阳性对照有荧光信号；阴性对照没有荧光信号，再在疾病诊断系统中根据信号的有无来判断待测样品是阴性还是阳性。疾病诊断结果以诊断报告的形式表示。待检测的血清在此便知道检测的结果。四检测结果的监控系统和信息分析系统

监控系统

为了保证检测结果可靠，设置的监控指标如下：

1)阳性植物内参照基因1(以下简称阳参1)，该植物基因DNA片段(如SEQ ID NO：18所示)在PCR扩增标记时按一定的量加入，用于检测HCV的扩增及荧光底物的掺入效率。杂交后该样品应该有明显的梯度信号，表明HCV扩增体系正常。阳参1标准点的荧光值应大于3倍阴性内参照的平均信号值。

2)阳性植物内参照基因2(以下简称阳参2)，该植物基因DNA片段(如SEQ ID NO：15所示)在PCR扩增标记时按一定的量加入，用于检测HBV的扩增及荧光底物的掺入效率。杂交后该样品应该有明显的梯度信号，表明HBV扩增体系正常。阳参2标准点的荧光值应大于3倍阴性内参照的平均信号值。

3)阴性植物内参照基因(如SEQ ID NO：21)(以下简称阴参)，杂交后应该无信号检出，表明杂交过程并没产生干扰。阴参点的荧光值应低于1/3倍阳性内参照的平均信号值。

4)空白对照(1×spot solution)，杂交后应该无信号检出，表明点样液及点样过程无污染。空白点的荧光值应低于1/4倍阳性内参照的平均信号值。检测结果判断分析系统

1)空白对照点的荧光值作为玻片背景处理，以所有空白点的平均数取值。空白点的荧光值应低于1/4阳参的平均信号值。根据经验，我们认为大于800以上的背景值是干扰造成，需重新做实验。

2)阴参点的荧光值作为非特异杂交信号处理，以所有阴参点的平均数取值。规定≥0(如果低于0仍视为0)，其值如果大于1/3倍阳参平均信号值则视为无效，说明杂交失败。根据经验，我们认为低于200的荧光值不可靠，因此阴参荧光值的最低值为200。

3)阳参在标准浓度点的荧光值应大于3倍阴参平均信号值，否则视为无效，说明标记扩增失败。

4)芯片的诊断以3个ratio值来判断：

阴参的ratio值＝阴参的荧光值×2/(阳参1标准点的荧光值+阳参2标准点的荧光值)

HBV的ratio值＝HBV荧光值/阳参2标准点的荧光值

HCV的ratio值＝HCV荧光值/阳参1标准点的荧光值

定性的诊断标准：HBV/HCV的ratio值∶阴参的ratio值

根据500例正常人和300例(200例HBV，100例HCV)阳性病例的血清实验，我们确定上述的比值为3时可以作为定性的标准，考虑±10％灰度范围，即2.7ˉ3.3，因此我们判断小于2.7的为阴性，大于等于2.7和小于等于3.3的为可疑样本，大于3.3的为阳性。

五本发明中涉及的主要原材料和设备、试剂：

原材料：

染色架，染色缸，国产。

Silanized Slides玻片(Telechem公司)，

probe-clip杂交舱(Sigma公司)

MicroSpin S-200 Colume(Amersham Pharmacia Biotech公司)

RNase-free 1.5ml eppendorf管，Tip头(Fisher公司)

96孔板，(Fisher公司)

384孔板，(Fisher公司)

设备：

MJ RESEARCH PR PTC-225 PCR仪

Cartisian 7500点样仪

Robbins Scientific Model 1000杂交箱

水浴锅

ScanArray 3000扫描仪

Biofuge fresco冷冻离心机

FR-280电泳仪

旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)

紫外分光光度计：

超纯水器：美国Millipore公司

pH计

试剂

Taq酶由上海生工公司提供。

dNTP由Promega公司和Takara公司提供。

DNA Marker由Takara公司提供。

尿嘧啶糖基化酶系MBI公司产品。

agarose(琼脂糖)由上海东海制药厂生产。

苯酚由中国医药(集团)上海化学试剂公司生产。

氯仿由中国医药(集团)上海化学试剂公司生产。

冰乙酸由中国医药(集团)上海化学试剂公司生产。

异丙醇由中国医药(集团)上海化学试剂公司生产。

异戊醇由上海试剂一厂生产。

乙醇由上海振兴化工一厂生产。

Tris由生工公司分装进口试剂。

溴乙锭由生工公司分装进口试剂。

溴酚蓝由生工公司分装进口试剂。

醋酸钠由生工公司提供。

十二烷基磺酸钠(SDS)由生工公司分装进口试剂。

琥珀酸酐，1-甲基2-吡咯烷酮和硼氢化钠由Sigma公司提供。

柠檬酸三钠由中国医药(集团)上海化学试剂公司生产。

Micro-Spotting solution由Telechem公司提供

DEPC由生工公司提供。

SuperScript II反转录酶，DTT，5xfirststrand buffer由GIBCO公司提供。

Cy3-dUTP，Cy5-dUTP由Amersham Phamacia Biotech公司提供。

QIAprep^Gel Extraction Kit(Gene公司代理)

pGEM^-T Vector System(Promega公司)

抽提液的配方如下：

250g异硫氰酸胍+17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠(pH＝7.0)+293ml Milli-Q水65度溶解之后+26.4ml 10％的十二烷基肌氨酸钠(一定要在后加)，终体积为529ml混匀备用，此液在室温下可保存4个月，用前每100ml溶液必须加0.24ml的β-巯基乙醇。此液可在室温下保存一个月附录：抽提液I和II的配方如下：

抽提液I：溶液D+平衡酚(3∶2的体积比)

抽提液II：溶液D+饱和酚(3∶2的体积比)

本发明旨在利用基因芯片技术建立和发展一种直接检测病人血清中是否存在HBV和HCV的核酸，特异性强、灵敏度高、安全可靠、价格低廉并适合于批量样本筛查的乙型、丙型肝炎的检测方法。HBV和HCV的生活史复杂，人们对其致病机理尚不清楚，目前用于临床检测的ELISA结果，只能说明病人是否曾经受到过病毒的感染，虽然能间接地反映一些病毒的活动状况，但对逃避免疫机制的病毒突变株、病毒在肝细胞中的复制情况、病人传染性的大小不能真实反映。而单纯的PCR检测，由于易被污染、可靠性差等缺点，经过几年的探索而最终放弃。尤其对一些混合感染的病例目前的检测手段都不能同时进行检测。

本发明的乙型、丙型肝炎双检试剂盒采用基因芯片技术，根据碱基互补的原理，用HBV、HCV病毒高度保守的特异性片断作为探针，一次试验就可以同时检测出待测样品中的HBV、HCV病毒。初步的临床结果表明，该双检基因芯片在乙型、丙型肝炎检测中显现出极好的特异性和灵敏度，对乙型、丙型肝炎病毒感染的确诊，对减少血源感染的发生具有重要的意义；同时，它自动化程度高，操作简便规范、价格适宜，适合批量样本的筛查。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明的范围。

图1为点样矩阵图，◎ 标准浓度点；※ 梯度浓度点；¤ 空白点。

图2为点于芯片上的靶基因的PCR产物电泳图。

图3：三批产品(99001，99002，99003)置2-8℃保存，在0ˉ8个月的保存期内分别测定三批产品的稳定性，采用工作标准阴性和阳性血清作为质控标准。图中数值为阴性及阳性血清用三批产品测定的平均值。

图4：三批产品(99011，99012，99013)置37℃保存，在0-13天的保存期内分别测定三批产品的稳定性，采用工作标准阴性和阳性血清作为质控标准。图中数值为阴性及阳性血清用三批产品测定的平均值。

实施例实施例1：仪器的选择和误差试验

1)点样仪的选择

比较了两家公司的点样仪，A公司点样仪点样矩阵整齐，点与点之间的CV值在10％以内(表1)，符合点样要求。所以选择了该公司的点样仪。

点样误差：

A 公司点样仪，用8根点样针对适当稀释过的荧光染料进行点样，然后统计单针及针与针之间点样量的CV值，结果如表1。

表1 点样针之间点样量的误差统计(CV)

单针针与针之间

平均CV 最大CV 平均CV 最大CV

无DNA 4.3％ 7.2％ 6.5％ 9.6％

有DNA 4.6％ 7.9％ 7.0％ 10.4％

结论：

1)样误差可以控制在10％以内。

2)单针的点样误差比针与针之间的点样误差小。

3)单针的点样误差在有无DNA样品时最大差异为7.9％，

针与针之间的点样误差在有无DNA样品时最大差异为

10.4％。

4)点的直径范围为180μmˉ200μm；点DNA时，由于

DNA长度及浓度不一样，导致直径范围可能会增加到210

μm。

2)扫描仪的选择

用1根点样针对不同稀释度的荧光染料进行点样，然后分别用两家公司的扫描仪进行扫描，计算两种扫描仪检测灵敏度(如表2)

表2 两种扫描仪检测灵敏度的比较

扫描仪种类我们测定的灵敏度厂家介绍的灵敏度

(个荧光分子/μm²) (个荧光分子/μm²)

扫描仪1 1.0 0.45

扫描仪2 0.8 0.8

从表可知，两种扫描仪的灵敏度接近，无显著差异，它们的灵敏度都符合诊断芯片的要求。因此我们任选一种扫描仪(扫描仪1)进行以下的试验。

扫描仪的误差：

用1根点样针对不同稀释度的荧光染料进行点样，然后进行扫描，并用软件进行结果分析，结果如下：

1)同一芯片两次扫描结果，平均CV值为0.033％，误差极小。

2)同一芯片一次扫描，两次处理，平均CV值为1.65

(Cy3)，1.84(Cy5)，两次处理无显著差异。实施例2：靶基因的PCR及纯化

以下所有实验的靶基因都是通过PCR法制备。为了保证芯片质量，需要PCR产物有较高的特异性，无杂带(图2)，因此用HPLC纯化PCR产物。

实施例3：探针标记

探针标记是指通过PCR或逆转录等方法，掺入经过荧光染料修饰的碱基(如dCTP、dUTP)，形成带有荧光标记的DNA探针。这是基因芯片检测系统的重要步骤。所以荧光标记的效率直接影响杂交信号检测的灵敏度。

在感染性疾病的诊断中，由于病毒的滴度很低，因此PCR标记方法是最合适的标记方法。

在标记过程中，一般要加入一定量的dNTP和Cy3或Cy5-dUTP(或Cy3或Cy5-dCTP)。其中，dNTP的作用是保证DNA链的延伸，以形成更多量的探针。Cy3或Cy5-dUTP(或Cy3或Cy5-dCTP)的作用是保证荧光染料修饰碱基的掺入，以形成荧光标记探针。由于dTTP和Cy3或Cy5-dUTP(或dCTP和Cy3或Cy5-dCTP的浓度和比例)在PCR反应中是竞争性掺入的，所以两者之比直接影响荧光标记效率。因此，要设计出高荧光掺入率低成本的探针标记法，就必须解决两个矛盾：第一，dNTP终浓度和成本间的矛盾，dNTP终浓度达到饱和时，标记效率不再增加，若再增加dNTP终浓度，标记效率无显著提高，只会导致浪费。第二，标记效率和dTTP∶Cy3或Cy5-dUTP(或dCTP∶Cy3或Cy5-dCTP)用量之间的矛盾。由于在反应体系中保持dTTP和Cy3或Cy5-dUTP(或dCTP∶Cy3或Cy5-dCTP)的总量恒定，因此两者在反应体系中存在竞争关系。dTTP用量越高，虽能得到更多的探针，但抑制了荧光染料的掺入，使标记效率降低；若Cy3或Cy5-dUTP(或Cy3或Cy5-dCTP)用量增加，能形成更多荧光标记探针，但荧光染料的掺入也增大了反应分子间的空间位阻，进而抑制了DNA链的延伸和酶的作用，降低了标记效率。所以，在反应体系中维持适当的dTTP∶Cy3或Cy5-dUTP(或dCTP∶Cy3或Cy5-dCTP)用量比，对提高标记效率尤为重要。

PCR反应体系中，通常单核苷酸的终浓度为500uM，实验表明，由于荧光染料标记的单核苷酸对反应体系的抑制，在有荧光染料标记的单核苷酸存在时，单核苷酸的终浓度达到40uM时即饱和，因此在PCR标记系统中，dATP、dCTP、dGTP的终浓度为500uM，dTTP的终浓度为40uM。

为了找出dTTP∶Cy3或Cy5-dUTP的最佳比例，分别在反应体系中加入dTTP浓度1/5、1/10、1/15、1/20的Cy5-dUTP进行PCR标记，然后分别与芯片进行杂交，通过杂交的信噪比来判断最好的标记条件，结果显示dTTP∶Cy3或Cy5-dUTP的最佳比例为10/1，即荧光染料标记的单核苷酸终浓度为4uM时，标记效果最好。Zhu等(1-3)报道，Cy3-dUTP(或Cy5-dUTP)也降低PCR及Nick translation反应产物的得率，这与我们的报导一致。实施例4：杂交信号检测

杂交系统的建立

为了提高杂交的信噪比，对下列参数进行了系列研究：

1)同的玻片

2)杂交液的种类

3)是否预杂交及预杂交液的种类

4)封闭剂的选择

5)杂交条件

6)洗脱条件部分结果如表3所示。

表3 不同玻片的杂交结果比较杂交液 5xSSC+0.2％SDS Arrayit UniHyb预杂交否是否

Cy3 Cy5 Cy3 Cy5 Cy3 Cy5

信背信背信背信背信背信背

号景号景号景号景号景号景玻片1 ++ + +++ - +++ ++ +++ - +++ + +++ +++

+玻片2 ++ +++ ++ - ++ + ++ + +++ ++ ++ +玻片3 + +++ + - +++ +++ ++ + +++ ++ ++ ++玻片4 + + + - + ++ + - - ++ + -玻片5 - +++ - - +++ +++ ++ - + +++ ++ ++注：+++——最强 ++ ——较强 + ——较弱 - ——无

基于玻片1杂交的信噪比最高，背景最低，同时固定率能满足实验的要求，因此选择了1号玻片制备基因芯片。

另外，发现检测Cy3时背景很高，为了克服这个难点，经过反复实验，研制出独特的杂交液和洗涤液配方，并确定了最适的杂交条件和洗涤条件，解决了Cy3的背景问题。

综合上述实验结果，确定了基因芯片技术的最佳条件：将5′端氨基修饰的PCR产物点于玻片1上，按固定方法1固定DNA样品制成基因芯片，按BioDoor反转录标记方法标记探针，用BioDoor杂交液进行基因芯片杂交；用Biodoor洗涤液进行杂交后芯片的洗涤。从而确立了基因芯片技术的完整方案。

实施例5：杂交动力学

1)杂交动力学芯片设计：

点样顺序(每个样品重复5次)：

空白点样液

靶DNA∶HCV基因，点样液原液浓度：500ng/uL，从500ng/uL开始，作两倍等比稀释，共8个稀释度，每个稀释度点5个点

阴参：点样液浓度500ng/uL

阳参1/2：点样液浓度500ng/uL

2)标记探针的制备

HCV基因和植物基因用PCR的方法分别进行荧光标记，标记物纯化后测定其浓度。

3)杂交

将标记的HCV探针作三倍等比稀释，共8个稀释度，分成8组，每组加入相同体积的阳性对照探针，真空干燥后用杂交液溶解，分别对8片芯片进行杂交。每个点的结果是重复5个点杂交信号的平均值，用阳性对照的扫描信号值加以normalize(均衡)。

此实验重复4次。其中一次结果如表4所示。

表4 靶DNA和探针对杂交信号的影响

探针用量靶基因浓度 0.25ng 0.75ng 2.25ng 6.75ng 20.25ng 60.75ng 182.3ng 546.8ng4ng/ul 275.109 464.407 661.25 1041.01 2322.91 2952.73 2482.96 2752.948ng/ul 372.142 600.214 1038.22 2040.9 4756.86 5877.65 4947.56 5155.7916ng/ul 509.27 706.44 2033.07 3892.95 9098.5 12166 9378.31 1007431ng/ul 604.01 1057.17 3873.07 7575.52 19940 22793.5 20226.2 19329.163ng/ul 1267.81 1880.4 7886.65 13587.7 33918.6 56369 40245.1 39966125ng/ul 2003 3745.81 14993.4 24191.4 80969.9 127590 100164 89302.1250ng/ul 2822.67 6074.7 22689.8 37790.2 133440 221999 173079 160602500ng/ul 4232.1 8290.46 24989 51060.2 161878 270719 197066 220300

4)结果

从以上表格可得如下结论：

A)在同一探针浓度下，杂交的信号强度随着靶DNA的浓度升高而增加，在一定范围内基本成线性关系，当靶DNA的点样浓度提高到250ng/ul，杂交信号基本饱和。

B)在同一靶DNA浓度下，杂交的信号强度随着探针的用量升高而增加，在一定范围内基本成线性关系，当探针的用量提高到60.75ng时，杂交信号达到饱和。

C)通常情况下，靶DNA的点样浓度范围在250ng-500ng/uL，此时，杂交信号的强度与标记探针量成正比，即可以做到定量检测血清样品。参考文献：1.Zhu Z，Chao J，Yu H，Waggoner AS.(1994)Nucleic AcidsRes 25：22(16)：3418-22.2.Zhu Z，Waggoner AS.(1997)Cytometry 1；28(3)：206-11.Yu H，Chao J，Patek D，Mujumdar R，MujumdarS，Waggoner AS.(1994)Nucleic Acids Res 11；22(15)：3226-32.实施例6：核酸抽提液的确定

对于血清样品的处理，由于样本体积小，且病毒滴度低，不可能用以上常规指标判定，故抽提血清样品时，将同一患者HCV阳性血清(各50μl)分别用本试剂盒的核酸抽提液与QIAGEN公司的RNA抽提试剂盒进行RNA抽提，用不含荧光标记的dNTP进行RT-PCR。两者的比较检测标准如下：

本试剂盒的RNA抽提 QIAGEN公司RNA抽提试剂

液盒RT-PCR后条带浓 5ng/μl左右 5ng/μl左右度RT-PCR条带特异条带专一条带专一性杂交信号 2000-3000 2000-3000

由于荧光标记的核苷酸底物对Taq酶和合成效率有很大影响，所以得率比较低。不能通过电泳方法进行判断，因此我们采用联合基因科技有限公司正在申请专利的方法进行标记效率的检测，结果发现这两种方法得到的RNA经标记和标记后探针纯化检测发现两者的标记效率一致。进一步用杂交信号的强弱观察，发现两者的杂交信号强弱和背景情况相同。杂交结果见上表。由以上两组数据说明，用这两种抽提方法以同一份阳性血清为对照标本同时抽提RNA，溶解于相同体积溶液中，结果经多步检测，表明本发明的RNA抽提液得到的RNA样品质量等同于进口试剂盒。故选择本发明的RNA抽提液。实施例7：试剂盒质量考核系统：

重复性测定：

将工作标准阳性和阴性血清进行10块芯片复测，计算出均值及标准差，以及变异系数作为批内差。结果表明试剂盒的批内变异系数均小于15％。用3个不同批号试剂盒进行同样测定，计算变异系数作为批间差，结果表明批间变异系数均小于15％。

特异性检测：在上海博华生物芯片有限公司的实验室用本发明的试剂盒检测HBV、HCV标准血清样本，结果表明，本试剂盒对HBV、HCV标准血清的诊断符合率为100％，拟进行临床试验。实施例9：稳定性测定结果：

试剂盒需要能在4℃存放6个月以上，37℃存放4天以上保持其稳定的质量标准，而且要能经得起长途运输的考验。

置2～8℃稳定性实验：

本发明的试剂盒为HBV、HCV定性检测试剂，产品质量及其稳定性检测的最重要指标是能否检测出不同强度的阳性标本，同时保持正常血清标本的低背景值。对产品的稳定性进行了广泛的考核。将批号99011、99012、99013的三批试剂盒置于2～8℃，每月抽检一次，连续观察8个月。

从99年12月份开始，用HBV、HCV标准阴性及阳性血清连续检测8个月。结果表明在至今为止的6个月的储存期内，试剂盒的稳定性良好，与0月相比，6个月2-8℃储存后，其荧光读数绝对值变异小于15％。(图3)

置37℃稳定性实验：

将批号99011，99012，99013试剂盒(除酶试剂外)置于37℃，每天抽检一次，连续观察13天。连续13天检测标准HBV、HCV阴性及阳性血清，结果表明四天内试剂盒稳定性良好，四天后阳性值开始下降(图4)。实施例10：乙型、丙型肝炎双检试剂盒使用说明书

本双检基因芯片采用控制PCR和基因杂交相结合的技术，用于体外检测人血清中的HBV、HCV核酸，从而达到诊断疾病的目的。一次试验可同时诊断HBV、HCV两种病原体。具有操作标准化、特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠等特点。

1.双检基因芯片包装组成：

组份提供量

诊断芯片 10片

HBV核酸抽提液 1.5ml

HCV核酸抽提液 1.5ml

反转录试剂 225μl

PCR-mixture 400ul

标记mixture 200ul

标记试剂 10μl

杂交试剂I 66μl

杂交试剂II 66μl

洗涤浓缩液100× 2ml

SuperScriptII 5μl

Taq酶 15μl

阳性对 50μl

说明书 1份2.操作规程：

1)常规静脉采血，分离血清(检测需要约100μl的血清)。

2)核酸抽提：在1.5ml离心管内加入150μl抽提液，加入50μl血清，震荡混匀(对未知病原体的血清需取50μl各2份，按DNA和RNA的抽提要求平行进行，最后合并上清)。再加入100μl氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，冰浴5分钟。13,000rpm离心15分钟，取上清液约100μl。加入等体积的异丙醇(-20℃预冷)和1μl tRNA，4℃ 13,000rpm离心15分钟。用500μl 75％的乙醇(-20℃预冷)洗涤沉淀2次，室温干燥或快速抽干(注意不能太干)。

3)RT-PCR：在含沉淀物的离心管中加入7μl反转录试剂I，溶解沉淀，混匀，5,000rpm离心5秒钟，65℃水浴5分钟后置于冰上，加入0.2μl SuperScript II反转录酶，混匀，5,000rpm离心5秒钟，42℃水浴30分钟。加入PCR-mixture 40μl及0.3μl的Taq酶进行反应(94℃ 1.5min；94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃30sec 35cycles；72℃ 5min；4℃待机)。

4)PCR标记：取2μl步骤3中转录产物于0.2ml薄壁管中，加入13.5μl标记Mixture、1μl标记试剂、0.3μl Taq酶，混匀；离心后进行PCR反应(94℃ 1.5min；94℃ 30sec，58℃30sec，72℃ 30sec，35cycles；72℃ 5min；4℃待机)。-20℃避光保存。

5)杂交：纯化产物抽干后加入5.5μl杂交试剂I，避光充分振荡以溶解探针；加入5.5μl杂交试剂II，混匀，离心10秒钟；探针和待杂交玻片分别置于95℃水浴变性2分钟；探针避光冰浴，玻片在无水乙醇中室温放置30秒钟，取出95℃烤干；取12μl上述探针滴于玻片上，用镊子上端将盖玻片盖上，放入杂交仓中，封上PARAFILM；杂交仓置于湿盒内，42℃杂交2小时。

6)将杂交好的芯片放入盛有55℃预热的0.1×SSC+0.2％SDS溶液的烧杯中，让盖玻片自然脱落，准备两个染色缸和一个500ml烧杯(内置玻片架)，分别装有1×SSC+0.2％SDS，1×SSC+0.2％Tween-20，0.1×SSC，两个染色缸放入60℃水浴锅中。烧杯置于磁力搅拌器上。将玻片依次浸入以上三个染色缸中洗涤10min，在烧杯中搅拌洗涤10分钟.，避光晾干后扫描。结果判断：

用诊断芯片分析软件进行诊断。

注意事项：

A.试剂盒应按有感染性材料进行操作和处理。

B.在效期内使用。

C.试剂有混浊、异物等，不得使用。

D.从第四步骤开始，应避光操作。

E.核酸抽提和PCR在不同房间操作。

F.核酸抽提要在Rnase-free条件下操作。

保存：

RT和PCR系统-20℃保存，基因芯片和抽提试剂4℃保存，保存期为六个月。

序列表

(1)一般信息：

(ii)发明名称：一种乙型、丙型肝炎双检基因芯片试剂盒及其制备和使用方法

(iii)序列数目：24

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：304bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：序列所在基因组中的(193bp-498bp)，编码部分表面抗原，序列为单拷贝数。编码的表面抗原部分在HBV各亚型中非常保守，而且在其它基因组中不存在。CCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGG

(3)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：301bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：该序列在HCV亚型AJ000009基因组中的位置301bp(150bp-450bp)，位于基因的5’非翻译区。在不同的HCV毒株之间的保守性很高，接近100％，PCR的检出率也比较高，靶核酸序列的特异性很好，与其他物种的核酸序列没有同源性。AGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCATCATGAGCACAAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTTAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCAGGG

(4)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’CCCAACCTCCAATCACTCACC 3’

(5)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’GCCCAGGATGATGGGATGGGA 3’

(6)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’CCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTG 3’

(7)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’GGAATACAGGTGCAATTTCCGTCC 3’

(8)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：46bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’CCCAACCTCCAATCACTCACCAACAATCTCAAGCTCCAAGCTGATG 3’

(9)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：47bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’CCAGGATGATGGGATGGGAATACACCTCCTCATCATTCTCCTCTAAC 3’

(10)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’AGTACACCGGAATTGCCAGGACGACC 3’

(11)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’CCCTGCGCGGCAACAAGTAAACTCC 3’

(12)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’AACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGG 3’

(13)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’GTCCTGTGGGCGACGGTTGGTGTTAC 3’

(14)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：48bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。5’TTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGAGGAAGATGTGAACTCTGCC 3’

(15)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：49bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。5’TGCGCGGCAACAAGTAAACTCCACCAACGAGCAAGCAAGGAATTGTCCG 3’

(16)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：195bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：该植物基因片段的序列特异性好，与HBV、HCV及其他物种的核酸序列没有同源性。

AGCAAGCAAGGAATTGTCCGAAAAGGTAAAACGCATTTAAACAGACTTGCATGCTCAGTCATCAGTCTAATTCATGATTCATCACCAAAACTTCTCCATGGCCCATACACTTTTAGGTACAAAACAAATGTGTCCAAAAGGATAAGCCGGCACGCCTTGTTTCAGCAACAGCAGTGGCAGAGTTCACATCTTCCT

(17)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’GCAAGCAAGGAATTGTCCGA 3’

(18)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’GGAAGATGTGAACTCTGCCA 3’

(19)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：238bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：该植物基因片段的序列特异性好，与HBV、HCV及其他物种的核酸序列没有同源性。

CAATCTCAAGCTCCAAGCTGATGATTTCATCATTCCTCAGGATCTTGCAAGCATCTTTACTGGTGAACCTTGTAGCCTCTCCAGCCTCCATTAAAAGAGATGATTTCTTAGTCTTACAAGCGTTTTCTGGTGTATGTTTTGACTTGGGGCTCAAGGAACGGATCAAACCTGCCCTATATCTTGGTGAGGATGGAGGAGAAAGGGTTGGAAATAGGGTTAGAGGAGAATGATGAGGAGG

(20)SEQ ID NO：19的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’CAATCTCAAGCTCCAAGCTG 3′

(21)SEQ ID NO：20的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’CCTCCTCATCATTCTCCTCT 3’

(22)SEQ ID NO：21的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：2887bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：该植物基因片段的序列特异性好，与HBV、HCV及其他物种的核酸序列没有同源性。

AGGAAGATGTGAACTCTGCCACTGCTGTTGCTGAAACAAGGCGTGCCGGCTTATCCTTTTGGACACATTTGTTTTGTACCTAAAAGTGTATGGGCCATGGAGAAGTTTTGGTGATGAATCATGAATTAGACTGATGACTGAGCATGCAAGTCTGTTTAAATGCGTTTTACCTTTTCGGACAATTCCTTGCTTGCTGTGGTTTTAAATATGATGCTGTGTAAACAGCTCTGGATATTTAAGCATCTAGAGACTTGACAGAACGATCTGTCACATTTGAGGCCAAGCTATTTTTTAAAATATAAATGCTTAGAGCTGGTACTGTGATGCATA

(23)SEQ ID NO：22的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’GGAAGATGTGAACTCTGCCA 3’

(24)SEQ ID NO：23的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：引物内部无发夹结构，引物对的3’端没有大于或等于3个碱基的互补配对。

5’TATGCATCACAGTACCAGCT 3’

Claims

1、一种乙型、丙型肝炎双检基因芯片诊断试剂盒，其特征在于所述的乙型、丙型肝炎双检基因芯片诊断试剂盒由检测芯片，核酸抽提液，反转录试剂，PCR混合物，标记混合物，荧光标记试剂，杂交试剂I，杂交试剂II，洗涤浓缩液，反转录酶，Taq酶，阳性对照和说明书组成。

2、如权利要求1所述的乙型、丙型肝炎双检基因芯片诊断试剂盒，其特征在于可在体外同时检测人血清中乙型和丙型两种肝炎病毒的DNA或RNA，从而可以在诊断乙型和丙型肝炎中应用。

3、如权利要求1或2所述的乙型、丙型肝炎双检基因芯片诊断试剂盒，其特征在于：

(1)所述的检测芯片是载有HBV特征基因片断、HCV特征基

因片断、乙肝阳性植物内参照基因、丙肝阳性植物内参

照基因、阴性植物内参照基因、空白参照样品的玻片；

(2)所述的标记试剂包含：dNTP，Cy3-dNTP/Cy5-dNTP，

试剂中，dTTP：Cy3-dUTP为1/5——1/20，最优选的

比例是1/10。

4、一种权利要求1中提到的检测芯片，其特征在于：

(1)所述的作为检测芯片载体的是玻片；

(2)玻片上点有HBV特征基因片断、HCV特征基因片断、乙

肝阳性植物内参照基因、丙肝阳性植物内参照基因、阴

性植物内参照基因、空白参照样品。

5、如权利要求3或4中所述的HBV特征基因片断，其特征在于它包含有选自以下组的一种：

(a)SEQ ID NO：1所示的多核苷酸；

(b)与(a)互补的多核苷酸；

(c)严谨条件下，与(a)或(b)可杂交的多核苷酸；

(d)与(a)或(b)或(c)有至少70％相同性的多核

苷酸。

6、如权利要求3或4中所述的HCV特征基因片断，其特征在于它包含有选自以下组的一种：

(a)SEQ ID NO：2所示的多核苷酸；

(b)与(a)互补的多核苷酸；

(c)严谨条件下，与(a)或(b)可杂交的多核苷酸；

(d)与(a)或(b)或(c)有至少70％相同性的多核苷

酸。

7、如权利要求3或4中所述的乙肝阳性植物参照基因，其特征在于它包含有选自以下组的一种：

(a)如SEQ ID NO：15所示的阳性植物基因序列；

(b)SEQ ID NO：所示的多核苷酸；

(c)与(a)互补的多核苷酸；

(d)严谨条件下，与(a)或(b)可杂交的多核苷酸；

(e)与(a)或(b)或(c)有至少85％相同性的多核苷

酸。

8、如权利要求3或4中所述的丙肝阳性植物参照基因，其特征在于它包含有选自以下组的一种：

(a)如SEQ ID NO：18所示的阳性植物基因序列；

(b)SEQ ID NO：所示的多核苷酸；

(c)与(a)互补的多核苷酸；

(d)严谨条件下，与(a)或(b)可杂交的多核苷酸；

(e)与(a)或(b)或(c)有至少85％相同性的多核苷

酸。

9、如权利要求3或4中所述的阴性植物参照基因，其特征在于它包含有选自以下组的一种：

(a)SEQ ID NO：21所示的多核苷酸；

(b)与(a)互补的多核苷酸；

(c)严谨条件下，与(a)或(b)可杂交的多核苷酸；

(d)与(a)或(b)或(c)有至少85％相同性的多核苷

酸。

10、一种制备权利要求4所述的检测芯片的方法，包括HBV、HCV特征基因的制备、转化、测序验证，靶基因的制备纯化、步骤，点样，其特征在于：

(2)HBV特征基因、HCV特征基因是直接取自病人的血清抽

提物，cDNA是通过RT-PCR和nest-PCR方法获得的；

(3)含有经过测序验证的HBV特征基因、HCV特征基因和3

个植物基因片断的质粒作为PCR扩增的模板，经过两次

扩增后，纯化PCR产物，得到样品；

(4)调节样品的终浓度，HBV特征基因、HCV特征基因和阴

性植物内参照基因的终浓度为500ng/μl，乙肝阳性植

物内参照基因、丙肝阳性植物内参照基因的终浓度则配

制为5个浓度梯度，分别是：1000ng/μl，500ng/μ

l，250ng/μl，125ng/μl和62.5ng/μl；

(5)将样品按照点样矩阵的要求点于玻片上，干燥后，去除

背景干扰。

11、一种利用如权力要求1或2所述的乙型、丙型肝炎双检试剂盒检测待检测样本中乙肝、丙肝病毒的方法，包括：从待检测样本中抽提核酸，反转录扩增，标记荧光，杂交，检测，分析，其特征在于：(1)利用HBV核酸抽提液和HCV核酸抽提液从待测样本中分别抽提乙肝和丙肝病毒核酸；(2)利用反转录试剂进行RT-PCR；(3)利用标记试剂和荧光标记混合物对PCR产物进行标记；(4)利用杂交试剂I和杂交试剂II将探针和检测芯片进行杂交；(5)将杂交后的检测芯片进行扫描；(6)利用软件分析杂交结果，得出诊断结果。