CN1651579B - 一种基因芯片内参照、制备方法及其应用 - Google Patents
一种基因芯片内参照、制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1651579B CN1651579B CN 200410089082 CN200410089082A CN1651579B CN 1651579 B CN1651579 B CN 1651579B CN 200410089082 CN200410089082 CN 200410089082 CN 200410089082 A CN200410089082 A CN 200410089082A CN 1651579 B CN1651579 B CN 1651579B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- internal reference
- chip
- primer
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及丙肝病毒基因分型检测芯片的阳性内参照、制作方法及其应用,具体地说,是选取一段基因序列,该序列与HCV-DNA无任何同源性,设计一对引物,合成时在引物两端加上与外套引物和内套引物同样的序列。由于具有与扩增HCV样品有同样的引物序列,可以采用与HCV模板同样的PCR体系扩增;又由于该序列与HCV样品PCR产物的长度、Tm值和G+C含量相近,可尽量减弱二者之间的引物及模板竞争。我们将该序列作为HCV抽提、扩增、杂交中的内参照,不仅可用来检测整次芯片实验的过程的有效性,并可对目的基因进行定性和定量。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因芯片的内参照、制备方法及其应用,更确切地说涉及一种丙肝病毒基因分型检测芯片的阳性内参照、制备及其应用。属于基因芯片检测基因突变或基因型的技术领域。
背景技术
基因芯片技术是90年代兴起的一项前沿生物技术,其基本原理是指将大量寡核苷酸分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到生物芯(biochip)、微阵列(Microarray)、DNA芯片(DNA chip),甚至蛋白芯片。基因芯片集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术,使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测分析变得切实可行它可以将生物中许多不连续的分析过程,移植到固相的介质芯片,并使其连续化和微型化。这是对传统生物技术如检测、DNA杂交、分型和测序技术等的重大创新和飞跃。由于它横跨生命信息、生物物理等众多研究领域,涉及生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生物信息学等诸多自然学科,故已成为当今多学科交叉、综合的前沿研究热点。
基因芯片技术在分子生物学研究领域、医学临床检验领域、生物制药领域和环境医学领域显示出了强大的生命力。首先,它为临床检验工作提供了一种全新的技术,使一些临床检验工作中难解决的问题成为可能。例如实验室诊断在单一因素疾病诊断中具有决定性的意义,但由于人体和疾病的复杂性,单一指标在临床工作的作用是有限的,这是往往需要多指标组合,而芯片技术正好提供了解决的思路。另外,有的实验室难题在高通量的检测中可以得以解决,如呼吸道、消化道致病菌检测,结核的培养困难,耐药很难检测(可以测耐药基因)等等。已有不少在临床上使用,比如:在国内外已有白血病诊断用芯片、高血压诊断用芯片、急淋急非淋鉴别诊断芯片、地中贫血突变点筛查芯片等等。其次,基因芯片特别是1ab on chip的研究会导致微加工技术的突破性进展,会造成临床检验工作的高自动化,微量化,使床旁检验成为可能,并且完全能进入家庭,芯片可能会带来革命性进展。
另外,基因芯片是高通量的群体指标分析,而且从方法上灵敏度非常高,目前不仅用于定性而且用于定量的检测。所以内参标准的建立非常重要。内参照是决定分析系统是否可靠和稳定的关键因素,如何设计和制备内参照是最受研究人员关注的问题。制备基因芯片内参照模板有两点较为重要:□最大限度地保证在PCR过程中内参照模板与目的基因片段的等效扩增;□通过与芯片上内参照探针及需检测的寡核苷酸探针的杂交而能精确地对产物中的目的基因片段进行鉴定分析。目前内参模板制备最常用的方法有三种:即加长法、截短法和加酶切位点法。加长和截短法所制备的突变模板,虽然在PCR产物分析时具有直观、简便的优点,但由于突变模板是在野生模板序列的基础上加长或缩短,和野生模板在长度上的差异明显,无法保证两者扩增效率的一致,影响竞争PCR定量分析精确度;加酶切位点法所制备的内参照与目的片段等长,可以保证两者等效扩增,但该方法有两个缺陷:第一,选择或增加合适的酶切位点有较高的难度,实际应用时受到一定限制;第二,如不能保证对内参照扩增产物的完全酶切,则会降低产物分析的精确度。
目前在临床检测及诊断芯片的制作过程中还没有一个较为成熟的基因芯片内参照制备方法。例如丙型肝炎病毒的检测需要两次扩增,所以内参照的制备较为困难。
发明内容
综上所述,本发明的目的是提供一种基因检测芯片的内参照,它是一段基因片段。本发明的另一目的是提供一种基因检测芯片内参照的制备方法。本发明的又一个目的是提供该内参照的应用,主要应用于基因芯片检测病毒或细菌的突变、分型等。
具体地说,本发明所述的内参照是选取一段基因序列,该序列与目的基因序列(如HCV-DNA)无任何同源性,且与目的基因样品的PCR产物的长度、Tm值和G+C含量相近。设计一对引物,合成时在引物两端加上与目的基因扩增引物相同的序列。由于具有与扩增目的基因样品同样的引物序列,可以采用与目的基因模板同样的PCR体系扩增;又由于该序列与目的基因(本发明以HCV)样品PCR产物的长度、Tm值和G+C含量相近,可尽量减弱二者之间的引物及模板竞争。我们将该序列作为HCV抽提、扩增、杂交中的内参照,在病毒基因抽提、PCR扩增中内参照与目的基因片段等效扩增,芯片中的阳性探针和内参照的部分序列相同,最终通过内参照与芯片中的阳性参照探针进行杂交,以此来检测整个芯片实验的过程的有效性。
本发明提供一种在基因芯片检测丙型肝炎病毒基因型的内参照序列,它是一种与目的片段长度相等且A、C、T、G含量相当的基因序列。
本发明提供丙型肝炎基因检测芯片内参照的制备的整个方法,它包括下列步骤:
1.模板选择
选择拟检测的病原体的保守序列区域为目的基因,并根据目的基因的序列特点,利用DNASTAR进行比对,找到和目的基因序列长度相等,碱基组成相似(A、C、T、G含量相当)的基因序列作为候选模板。
2.引物的设计和内参照的制备
(1)在该候选序列的两端设计引物,并将该片段进行扩增,纯化产物。
(2)在上述序列的引物两侧直接连上HCV5’非编码区巢式PCR的内套引物序列,以上述(1)中的纯化产物为模板进行扩增,扩增产物再次纯化。
(3)将HCV5’非编码区巢式PCR的内套引物与外套引物的序列合在一起,用该复合引物去扩增(2)中的纯化产物,扩增成功并克隆于T载体中。
(4)以上述(3)中制备的克隆为模板,通过HCV5’非编码区巢式PCR的内外套引物扩增所得的产物进行测序,分析后保留正确的克隆序列,即作为内参照。该序列和目的基因序列长度相等,碱基组成相似,从而可以保证和目的基因的扩增效率基本一致。
3.内参质粒的制备及初步定量
将保种菌株解冻,摇菌,然后使用Qiagen的Hispeed Plasmid Midi kit进行质粒抽提,具体方法按Hispeed Plasmid Midi kit protocol操作。最终采用紫外分光光度仪测量质粒溶液的OD260/280值,此OD值等于1.83,此纯度已达到要求;测量其浓度,对质粒进行定量,稀释成106拷贝/ml溶液保存于-20℃备用。
4.芯片上阳性内参照I探针和阴性内参照I探针的设计
阳性内参照I探针选用的是内参中一段序列,在杂交中检测内参的抽提、扩增及杂交显色情况,借此评估整次芯片实验的过程的有效性。如果阳性参照I在试验结果中呈现杂交信号,说明此次试验有效;如果阳性参照I在试验结果中未呈现信号,说明此次试验无效。
阴性参照I的选用的序列与阳性参照I只差一个碱基,用于检测杂交条件是否严谨。如果阴性参照I在试验中未出现信号,说明此次试验有效;如果阴性参照I在试验结果中呈现信号,说明此次试验无效。
5.内参用量的确定
将定量的内参质粒按一定的梯度稀释到抽提试剂中,用于同一份血清的抽提与PCR扩增,扩增产物与芯片杂交,用于内参体系的稳定性研究。
综上所述,本发明提供的用于丙肝病毒基因分型检测芯片的制备方法,包括下列步骤:
(1)选择一段和目的基因无任何同源性,并且长度、Tm值以及G+C含量和目的基因相近的基因片段;
(2)将目的基因的引物合并内参照的一部分序列作为引物,这样通过二次PCR扩增可将目的基因的引物加到作为内参照序列的基因片段两端;
(3)选择内参照中的一段序列作为探针固定在芯片上,这个探针为芯片的阳性参照点;
(4)加入内参照入抽提液中,经过抽提后,用目的基因的引物,将内参照和目的基因同时扩增出来;
(5)内参照序列和芯片阳性探针的最终杂交,以便验证芯片制备的整个过程。
所述的引物是内参照序列的一段引物加上目的基因的引物,通过扩增将目的基因的引物加在内参照的序列上。
所述的第一次PCR扩增是内参照序列的一段引物加上目的基因的引物,通过扩增将目的基因的内套引物加在内参照的序列上。
所述的第二次PCR扩增是目的基因的外套引物加上目的基因的内套引物,将两套引物合并在一起,以上述基因扩增的PCR产物为模板进行扩增,以此将目的基因的外套引物加在内参照的序列上。
所述的内参照可用于等效扩增PCR及PCR产物和芯片杂交定性和定量检测病毒基因。
所述的内参照还可用于检测芯片制备的整个过程。
本发明基因检测芯片内参照应用于检测基因的突变或基因型
利用本发明所制备的内参照,建立基因芯片检测病原体的技术,以检测病毒或细菌的突变或基因型。检测包括以下几个部分:第一,竞争PCR,在同一反应管内含有待测目的基因和内参照,进行多聚酶链反应;第二,芯片杂交,用标记的PCR产物与芯片进行杂交。该检测可以达到三个目的:(1)可判断实验中PCR和杂交的情况(实验的有效性);(2)可对目的片段进行初步定量:(3)进一步提高基因检测的精确度和灵敏度。
本发明的优点:与常用的酶切方法等制备竞争PCR内参照技术相比,本发明有以下优点:第一,制备方法的优势:在目的片段上选择理想的扩增区域,并寻找合适的内参照序列(可以是植物基因、人类基因等基因片段),总之该序列和目的基因序列无任何同源性,并且和目的基因的序列具有相同的组成及GC含量。设计合适的引物(目的基因引物加上该序列引物),通过PCR扩增将目的基因的引物加在内参照序列的两端,这种方法简单、易行。第二,等效扩增:由于该序列与目的基因PCR产物的长度、Tm值和G+C含量相近,可尽量减弱二者之间的引物及模板竞争。有效保证两种模板在PCR过程中等效扩增。第三,有效检测芯片杂交过程:因为芯片上固定了一个阳性参照探针,是内参照序列中的一段,内参照的扩增产物最终和芯片杂交,就可验证芯片制备过程的有效性,该种方法经济,简便,易行,适合与各种基因诊断芯片的内参照的制作。
附图说明
图1PCR电泳结果鉴定
图2内参浓度倍比稀释和HCV血清混合后的杂交结果
具体实施方式
以下以HCV基因检测芯片的内参照为例结合实施例作进一步阐述,但并不限制本发明的范围。
实施例1.基因芯片的内参照模板的选择
来自E.coli chromosomal region from 89.2 to 92.8minutes,GeneBankaccession number:U00006。该基因序列的一部分由本实验室制作成克隆,全长约500bp,克隆于T载体中。序列分析显示,其中一段序列与HCV5’非编码区扩增片段碱基组成极为相近,并且无特殊二级结构,故根据此序列设计引物。
GCCAGACCGGCAGCGTATTACTCCAGGGCGTCGGCAAACTGACCTGCT
CTGTCCGGCTGTAGTGCGTTATCCAGCGCCTGCGCCGAGTTCCAGGTGGC
实施例2.引物的设计和内参照的制备
一、引物的合成
在上述序列两侧直接连上HCV5’非编码区巢式PCR的内套引物序列(阴影部分)引物合成委托博亚生物工程有限公司进行。
agggccgcgatcttcttcacg
用该引物去扩增上述基因质粒,扩增后的产物进行纯化。
然后合成第二对引物,由HCV巢式PCR的内外套引物组合而成,根据引物条件设计PCR程序,以上述的纯化的PCR产物做模板,再次进行PCR扩增,
这次扩增的产物再次进行纯化,并连接到T载体中作成克隆。
二.产物纯化及定量
1.采用Roche公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit进行纯化,严格按照说明书进行操作。
2.定量
采用紫外分光光度仪测量引物的OD260/280值,此OD值应该等于1.8,确定其纯度;测量引物OD260值,按照1OD相当于50μg/ml双链DNA,对其进行定量。
3.质粒的制作
采用Promega公司的pGEM-T Easy Vector System制作质粒。
4.克隆的保存:
将制作好的质粒转化于受体菌大肠杆菌JM109中,用液体LB培养基扩增,加入50%的无菌甘油,震荡混匀,保存于-70℃。
5.质粒的抽提:
将保存于-70℃的克隆复苏于LB平板,挑取单菌落,用液体LB培养基扩增,采用常规酚—氯仿法抽提质粒。
6.质粒的鉴定:
6.1PCR鉴定
取质粒作为模板,用相应的引物进行PCR扩增,电泳检测阳性,条带大小与预期相符。(图1)
6.2质粒测序及序列分析
序列测定委托博亚生物工程有限公司进行,采用DNASTAR软件对测序结果进行比对与预期结果完全一致,序列如下:
AGGCGGGTGTCTCTCAAGCGTTATTTGAGGAGAACGGCTGAGTGCGGTT
GCCAGACCGGCAGCGTATTACTCCAGGGCGTCGGCAAACTGACCTGCTCT
GTCCGGCTGTAGTGCGTTATCCAGCGCCTGCGCCGAGTTCCAGGTGGCAT
CCCAGGCGTGAAGAAGATCGCGGCCCT
7.克隆的保存:
将经鉴定的转化受体菌株大肠杆菌JM109,用液体LB培养基扩增,加入20%的无菌甘油,震荡混匀,保存于-70℃。
实施例3.内参质粒的制备及初步定量
将保种菌株解冻,摇菌,然后使用Qiagen的Hispeed Plasmid Midi kit进行质粒抽提,具体方法按Hispeed Plasmid Midi kit protocol操作。最终采用紫外分光光度仪测量质粒溶液的OD260/280值,此OD值等于1.83,此纯度已达到要求;测量其浓度,对质粒进行定量,稀释成106拷贝/ml溶液保存于-20℃备用。
实施例4.芯片上阳性内参照I探针和阴性内参照I探针的设计
阳性参照I的探针选用的是内参中一段序列,在杂交中检测内参的抽提、扩增及杂交显色情况,借此评估整次芯片实验的过程的有效性。如果阳性参照I在试验结果中呈现杂交信号,说明此次试验有效;如果阳性参照I在试验结果中未呈现信号,说明此次试验无效。
阳性探针序列如下:TACTCCAGGGCGTCGG
阴性参照I的选用的序列与阳性参照I只差一个碱基,用于检测杂交条件是否严谨。如果阴性参照I在试验中未出现信号,说明此次试验有效;如果阴性参照I在试验结果中呈现信号,说明此次试验无效。
实施例5.内参用量的确定
一、方案
将定量的内参质粒按一定的梯度稀释到抽提试剂中,用于同一份血清的的抽提与PCR扩增,扩增产物与芯片杂交,用于内参体系的稳定性研究。
二、方法
1.将定量的内参质粒按一定的比例稀释,使内参质粒的终浓度分别为102、103、104、105。将每份血清分为5份,每份50μl,其中一份不加质粒,另外4份分别与上述稀释度的质粒混匀,再分别与150μl TRIZOL旋涡混匀,加50ul氯仿,混匀。13000rpm离心10min,弃上清。加2ul Dextroo7500(10ug/ul),再加等量的异丙醇,混匀后室温下放10分钟。
离心13000rpm×15分,弃上清,加入300ul75%乙醇,颠倒混匀数次后,13000rpm×10分,吸干上清,沉淀待反转录。
2.取1.5μl模板与12.5μl PCR混合液(包括Buffer1.5μl,dNTP1.2μl,P1、P20.7μl,1U Taq酶)混合均匀,于200ul薄壁管进行扩增,扩增条件94℃4′;94℃30′,55℃30′,72℃30′(30cycle);72℃4′。
3.取0.5μl第一次PCR产物与12.5μl PCR混合液(包括Buffer1.5μl,dNTP1.2μl,P3、P40.7μl,1U Taq酶)混合均匀,于200ul薄壁管进行扩增,扩增条件94℃4′;94℃30′,55℃30′,72℃30′(30cycle);72℃4′。
4.分别取PCR产物1μl,与10μl EasyHyb杂交液混合,取10μl滴于芯片阵列表面,盖上盖玻片,在37℃杂交20min;取出芯片,去除盖玻片,迅速投入洗液I中摇床荡洗5mins。放入洗液II中平衡1min。
5.从洗液II中取出芯片,用吸水纸吸除多余液体,另取20μl抗体溶液滴于芯片表面,盖上盖玻片静置30mins,使抗体与地高辛充分结合。
6.去除盖玻片,吸除多余液体,然后置第3步洗液II中荡洗1min。取出芯片,用吸水纸吸除多余液体。
7.取50μl平衡液滴于芯片表面,静置1分钟,吸除多余液体,然后取一小块尼龙膜(6×6mm)浸透BCIP/NBT Solution,盖于芯片阵列表面,反过来压与光滑玻璃上(注意不能有气泡出现且尼龙膜不能移动),闭光静置。普通光学扫描仪(dpi1200)扫描记录结果
8.实验结果和分析
实施结果详见图2,由图可见质粒的浓度为103个/ml时的体系较为稳定,如果浓度过高,会抑制低浓度样品的检测;如果浓度过低,阳性内参I的信号稳定性较差。因此今后实验中血清抽提中内参质粒的浓度定为103个/ml。实施例6.基因检测芯片内参照应用于检测丙型肝炎病毒基因
1.主要材料
血清标本:共收集了100份丙型肝炎病毒(HCV)阳性的血清标本,均来自慢性丙型肝炎患者。上述所有标本均证实为丙型肝炎病毒基因阳性。
2.血清标本处理及巢式PCR反应
将每份血清为50μl,每份中加内参质粒(内参质粒的浓度定为103个/m),再分别与150μl TRIZOL旋涡混匀,加50ul氯仿,混匀。13000rpm离心10min,弃上清。加2ul Dextroo7500(10ug/ul),再加等量的异丙醇,混匀后室温下放10分钟。离心13000rpm×15分,弃上清,加入300ul75%乙醇,颠倒混匀数次后,13000rpm×10分,吸干上清,沉淀待反转录。
3.扩增条件
①第一次扩增:
取1.5μl模板与12.5μl PCR混合液(包括Buffer1.5μl,dNTP1.2μl,P1、P20.7μl,1U Taq酶)混合均匀,于200ul薄壁管进行扩增,扩增条件94℃4′;94℃30′,55℃30′,72℃30′(30cycle);72℃4′。
②第二次扩增
取0.5μl第一次PCR产物与12.5μl PCR混合液(包括Buffer1.5μl,dNTP1.2μl,P3、P40.7μl,1U Taq酶)混合均匀,于200ul薄壁管进行扩增,扩增条件94℃4′;94℃30′,55℃30′,72℃30′(30cycle);72℃4′。
4.芯片杂交
与实施例5中所述的杂交方法相同。
5.HCV基因分型及定量检测结果
100例标本经琼脂糖凝胶电泳分析均见分子量在240bp左右得阳性条带,经过杂交检测阳性参照I探针(内参照序列)全部为阳性斑点,说明整个实验有效;阴性参照I探针全部为空白,说明没有污染;阳性参照II探针(根据HCV保守序列设计)全部为阳性斑点,说明样品的HCV RNA都为阳性。用阳性参照I(内参序列)和阳性参照II的灰度比与标准曲线进行对照可初步确定100例丙型肝炎患者血清HCV RNA病毒的含量高低不等,在107拷贝/ml到103拷贝/ml之间。分型结果包括了1a,1b,2a,3a,3b,6a等6种基因亚型。上述结果表明,本发明所制备的基因芯片内参照可用于定性和定量检测丙型肝炎病毒,并可以对丙型肝炎病毒基因进行分型,具有临床应用价值。
Claims (2)
1.一种内参照基因片段在丙肝病毒基因芯片杂交过程中的应用,其特征在于,所述杂交过程包括下列步骤:
(1)选取一段与目的基因无任何同源性,并且长度、Tm值以及G+C含量和目的基因相近的基因片段;
(2)将目的基因的引物合并所述的基因片段的一部分序列作为引物,通过两次PCR扩增将目的基因的内套引物和外套引物加到作为内参照的基因片段两端;
(3)选取内参照中的一段序列作为探针固定在芯片上,这个探针为芯片的阳性参照点;
(4)加入内参照入抽提液中,经过抽提后,用目的基因的引物,将内参照和目的基因同时扩增;
(5)内参照和芯片阳性探针的最终杂交;
其中,①步骤(1)中所述的基因片段为
GCGTTATTTGAGGAGAACGGCTGAGTGCGGTTGCCAGACCGGCAGCGTATTACTCCAGGGCGTCGGCAAACTGACCTGCTCTGTCCGGCTGTAGTGCGTTATCCAGCGCCTGCGCCGAGTTCCAGGTGGCATCCCAGG
③步骤(3)中所述的一段序列为TACTCCAGGGCGTCGG。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的内参照序列来自植物基因或人类基因。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410089082 CN1651579B (zh) | 2004-12-03 | 2004-12-03 | 一种基因芯片内参照、制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410089082 CN1651579B (zh) | 2004-12-03 | 2004-12-03 | 一种基因芯片内参照、制备方法及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1651579A CN1651579A (zh) | 2005-08-10 |
CN1651579B true CN1651579B (zh) | 2010-09-29 |
Family
ID=34869286
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200410089082 Expired - Fee Related CN1651579B (zh) | 2004-12-03 | 2004-12-03 | 一种基因芯片内参照、制备方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1651579B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101921871B (zh) * | 2010-01-27 | 2012-04-11 | 南京迪安医学检测中心有限公司 | 丙肝测序分型试剂盒及其检测方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1281052A (zh) * | 2000-07-07 | 2001-01-24 | 上海长征医院 | 等效竞争多聚酶链反应内参照、制备方法及其应用 |
CN1366067A (zh) * | 2001-01-15 | 2002-08-28 | 上海博华基因芯片技术有限公司 | 一种乙型、丙型肝炎双检基因芯片试剂盒及其制备和使用方法 |
CN1405321A (zh) * | 2001-08-09 | 2003-03-26 | 上海博华基因芯片技术有限公司 | 一种定量分型基因芯片及其制备和使用方法 |
-
2004
- 2004-12-03 CN CN 200410089082 patent/CN1651579B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1281052A (zh) * | 2000-07-07 | 2001-01-24 | 上海长征医院 | 等效竞争多聚酶链反应内参照、制备方法及其应用 |
CN1366067A (zh) * | 2001-01-15 | 2002-08-28 | 上海博华基因芯片技术有限公司 | 一种乙型、丙型肝炎双检基因芯片试剂盒及其制备和使用方法 |
CN1405321A (zh) * | 2001-08-09 | 2003-03-26 | 上海博华基因芯片技术有限公司 | 一种定量分型基因芯片及其制备和使用方法 |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
Jalava T, et al..Quantification of hepatitis B virus DNA by competitiveamplification and hybridization on microplates.biotechniques15 1.1993,第134页至第139页. |
Jalava T, et al..Quantification of hepatitis B virus DNA by competitiveamplification and hybridization on microplates.biotechniques15 1.1993,第134页至第139页. * |
Liang TJ, et al..Rapid identification of low level hepatitis B-related viralgenome in serum.J. Clin. Invest.84.1989,第1367-1370页. * |
张翼冠,毛红菊等.基于膜显色结果判读的基因芯片快速检测丙型肝炎基因型方法的研究.中华肝脏病杂志12 5.2004,12(5),第301-303页. |
张翼冠,毛红菊等.基于膜显色结果判读的基因芯片快速检测丙型肝炎基因型方法的研究.中华肝脏病杂志12 5.2004,12(5),第301-303页. * |
毛红菊,顾士民等.建立DNA芯片技术检测丙型肝炎病毒基因型及其初步应用.中华实验和临床病毒学杂志17 4.2003,17(4),第375-377页. |
毛红菊,顾士民等.建立DNA芯片技术检测丙型肝炎病毒基因型及其初步应用.中华实验和临床病毒学杂志17 4.2003,17(4),第375-377页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1651579A (zh) | 2005-08-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hyypiä* et al. | Polymerase chain reaction for human picornaviruses | |
Lindström et al. | Pyrosequencing for detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus | |
US10526667B2 (en) | Hepatitis B virus typing and resistance assay | |
CN109777893A (zh) | 微滴式数字pcr隐匿性乙肝病毒检测试剂盒 | |
CN102146487B (zh) | 乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针 | |
CN102586473B (zh) | 一种乙型肝炎病毒基因分型pcr检测试剂盒 | |
Jais et al. | Reliable subtype classification of diffuse large B-cell lymphoma samples from GELA LNH2003 trials using the Lymph2Cx gene expression assay | |
WO2022068079A1 (zh) | 一种基于微滴式数字pcr技术的乙型肝炎病毒t216c突变检测方法 | |
Stelzl et al. | Evaluation of the new cobas® HCV genotyping test based on real-time PCRs of three different HCV genome regions | |
Gharizadeh et al. | Viral and microbial genotyping by a combination of multiplex competitive hybridization and specific extension followed by hybridization to generic tag arrays | |
CN106636454A (zh) | 一种同时检测人冠状病毒229e,oc43,nl63和hku1的实时荧光多重rt-pcr方法 | |
CN103509858A (zh) | 一种人细胞色素酶p450基因多态性检测试剂盒 | |
CN1651579B (zh) | 一种基因芯片内参照、制备方法及其应用 | |
Laperche et al. | Unique NS5b hepatitis C virus gene sequence consensus database is essential for standardization of genotype determinations in multicenter epidemiological studies | |
CN109457049B (zh) | 一种用于乙型肝炎病毒基因分型检测的组合物、试剂盒及其方法 | |
CN103320531B (zh) | 一种可同时检测多个hbv耐药突变位点的新方法 | |
CN110863054A (zh) | 用于基因突变高发区突变检测的数字pcr检测试剂盒及其方法 | |
CN112885407B (zh) | 一种基于二代测序的微单倍型检测分型系统和方法 | |
CN105274197A (zh) | 用于生物样本核酸检测的质控方法及试剂盒 | |
Kostrikis et al. | Genotyping HIV-1 and HCV strains by a combinatorial DNA melting assay (COMA) | |
CN113337593A (zh) | 一种SSRIs类及三环类抗抑郁精准用药的引物探针组合、试剂盒及基因检测方法 | |
CN1970791A (zh) | 一种检测线粒体糖尿病45个基因位点膜芯片 | |
CN112795696A (zh) | 乙型肝炎病毒pgRNA芯片数字PCR绝对定量检测试剂盒及方法 | |
CN108660252A (zh) | 一种基于焦磷酸测序的人类免疫缺陷病毒耐药性分析方法 | |
CN103710466B (zh) | 一种hbv的ymdd荧光pcr检测试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100929 Termination date: 20201203 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |