ES2980651T3

ES2980651T3 - Método de detección de una secuencia de ácido nucleico

Info

Publication number: ES2980651T3
Application number: ES20700852T
Authority: ES
Inventors: John Holme; Nisha Jain; Steven Asquith
Original assignee: 3cr Bioscience Ltd
Current assignee: 3cr Bioscience Ltd
Priority date: 2019-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2024-10-02
Anticipated expiration: 2040-01-09
Also published as: EP3908677C0; US20220090194A1; EP3908677A1; WO2020144480A1; EP3908677B1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para detectar una o más secuencias diana en una muestra mediante amplificación. También se proporcionan kits y composiciones para su uso con el método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de detección de una secuencia de ácido nucleico

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a métodos y kits para la detección y/o amplificación de ácidos nucleicos, como en un sistema de ensayo.

FONDO DE LA INVENCIÓN

[0002] Los avances en las técnicas de biología molecular, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), han permitido el desarrollo de procesos que permiten una mayor comprensión de la composición genética de un individuo(es decir,su genotipo).

[0003] Genotipado es un término genérico dado a varias técnicas de análisis de ácidos nucleicos que identifican alteraciones o polimorfismos dentro de secuencias conocidas, y normalmente para un individuo dado. Estas técnicas son útiles en muchos aspectos de los campos científico, médico y forense. Por ejemplo, estas técnicas pueden utilizarse para examinar determinados loci genéticos en un individuo con el fin de diagnosticar enfermedades hereditarias o proporcionar un pronóstico basado en lesiones genéticas conocidas. Las modificaciones particulares de interés incluyen, por ejemplo, mutaciones puntuales, deleciones, inserciones e inversiones, así como polimorfismos dentro de las secuencias de ácidos nucleicos de interés. Estas técnicas también pueden utilizarse con fines clínicos, como la tipificación de tejidos para la histocompatibilidad, o con fines forenses, como la determinación de la identidad o la paternidad.

[0004] En muchas reacciones de genotipado basadas en PCR, se emplea un sistema productor de señales para detectar la producción de producto amplificado. Un tipo de sistema productor de señales que se utiliza habitualmente es el sistema de transferencia de energía de fluorescencia (FRET), en el que un detector de ácido nucleico incluye grupos donantes y aceptores de fluorescencia (véase, por ejemplo, la Patente Europea 1726664). Una consideración primordial con las técnicas basadas en PCR que emplean un sistema basado en FRET es que la señal generada debe ser altamente específica y sensible para garantizar resultados precisos. La amplificación de alta fidelidad también es fundamental.

[0005] El documento US2006/141518 describe un método que emplea una sonda que tiene una marcación de informador y una marcación de inhibidor y una secuencia que se une a una secuencia de marcación de detección presente en el iniciador o iniciadores directo y/o inverso. Un iniciador universal se une a una secuencia aguas arriba de la marcación e inicia una segunda ronda de amplificación, mientras que una ADN polimerasa con actividad exonucleasa 5'-3' hidroliza la sonda.

[0006] Por lo tanto, existe una necesidad continua de mejorar tanto la sensibilidad como la precisión de los sistemas de genotipado basados en PCR.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0007] En un aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar (y/o amplificar) una o más secuencias (diana) (por ejemplo, en una muestra), como por amplificación, comprendiendo el método:

a) proporcionar una composición acuosa que comprenda:

i) uno o más iniciadores oligonucleotídicos (hacia adelante) (cada uno) con una región 5' que es una secuencia de marcación y una región 3' específica para una secuencia diana;

ii) un iniciador oligonucleotídico (inverso), de manera que un iniciador directo y un iniciador inverso puedan formar operablemente un par de iniciadores;

iii) una o varias sondas (cada una de ellas) con un informador (marcación) y un inhibidor (marcación); cada sonda comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad, por ejemplo, con la secuencia de marcado de un iniciador oligonucleotídico (directo); y

iv) uno o más iniciadores oligonucleotídicos (potenciadores) que comprendan una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad, por ejemplo, con la secuencia de una sonda;

b) convenientemente, incubar los iniciadores y las sondas con la muestra y al menos una polimerasa; y

c) convenientemente, realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, en la muestra, para generar ácidos nucleicos marcados, opcionalmente mediante la cual la sonda o sondas puedan unirse a los ácidos nucleicos marcados.

[0008] En otro aspecto, la presente invención también proporciona un kit adecuado para su uso en un método o proceso (de amplificación de ácido nucleico), que comprende:

iii) una o varias sondas (cada una de ellas) con un informador (marcación) y un inhibidor (marcación); cada sonda comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad, por ejemplo, con la secuencia de marcado de un iniciador oligonucleotídico directo;

iv) uno o más iniciadores oligonucleótidos (potenciadores) que comprendan una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con la secuencia de una sonda; y

v) opcionalmente, una polimerasa.

[0009]En algunas realizaciones, el informador (marcación) puede estar situado en o en una porción diferente de la sonda en comparación con el inhibidor (marcación). La posición de las marcaciones puede ser tal que (por ejemplo, cuando están libres en la solución), el informador (marcación) y el inhibidor (marcación) pueden acercarse el uno al otro de tal manera que el informador se apaga (al menos parcialmente), o poca o ninguna emisión puede ser emitida y/o detectada desde el informador (marcación).

[0010]Preferiblemente, la polimerasa es una ADN polimerasa, por ejemplo, un fragmento o dominio o un derivado de la (Taq) polimerasa. En algunas realizaciones, la polimerasa es una polimerasa modificada. En algunas realizaciones, la polimerasa se modifica para reducir y/o eliminar la actividad exo-nucleasa y/o se modifica para ser una polimerasa de "arranque en caliente".

[0011]El (los) iniciador(es) oligonucleótido(s) (potenciador(es)) puede(n) comprender al menos dos regiones (distintas). Cada región puede comprender una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad, por ejemplo con una o más sondas. Las dos regiones distintas pueden estar separadas, por ejemplo, por una región enlazadora. La región enlazadora puede tener de 2 a 5 o 10 oligonucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, puede no haber región enlazadora.

[0012]De manera adecuada, la(s) sonda(s) puede(n) comprender una secuencia que tenga(n) una identidad de al menos el 90%, 95%, 98% o 99%, por ejemplo con la secuencia de marca de un iniciador oligonucleotídico (directo). En algunas realizaciones, la(s) sonda(s) comprende(n) una secuencia idéntica a la secuencia marcadora de un iniciador oligonucleotídico (forward).

[0013]El (los) iniciador(es) oligonucleótido(s) (potenciador(es)) puede(n) comprender una secuencia que tenga al menos 90%, 95%, 98% o 99% de identidad, por ejemplo, con la secuencia de una sonda. En algunas realizaciones, el o los iniciadores oligonucleotídicos potenciadores comprenden una secuencia idéntica a la secuencia de una sonda.

[0014]De manera adecuada, la una o más sondas pueden comprender una estructura de horquilla o bucle. De manera adecuada, la una o más sondas pueden comprender una porción en o adyacente a la terminación 3' que es complementaria a una porción en o adyacente a la terminación 5'. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y/o la porción terminal 5' tienen una longitud de al menos 4, al menos 5, al menos 6 o al menos 7 nucleótidos. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen al menos un 90% de complementariedad. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una complementariedad del 100%.

[0015]De manera adecuada, uno o más iniciadores oligonucleótidos potenciadores pueden comprender una estructura de horquilla o bucle. De manera adecuada, el uno o más iniciadores oligonucleótidos potenciadores pueden comprender una porción en o adyacente al extremo 3' que es complementaria a una porción en o adyacente al extremo 5'. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y/o la porción terminal 5' tienen una longitud de al menos 4, al menos 5, al menos 6 o al menos 7 nucleótidos. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen al menos un 90% de complementariedad. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una complementariedad del 100%. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' comprenden uno, dos o tres desajustes. En algunas realizaciones, la terminación 3' o la terminación 5' comprende además una porción saliente de uno, dos o tres nucleótidos que no hibrida con un nucleótido complementario en la porción terminal 5' o 3' respectivamente.

[0016]De manera adecuada, los uno o más iniciadores de oligonucleótidos potenciadores pueden configurarse de manera que la estructura de horquilla en los uno o más iniciadores de oligonucleótidos potenciadores sea menos estable que la estructura de horquilla en la una o más sondas.

[0017]En algunas realizaciones de los métodos, se llevan a cabo al menos 4, 10, 15, 20, 25 o 30 ciclos de PCR. En algunas realizaciones, se llevan a cabo hasta/no más de 35, 40, 45 o 50 ciclos de PCR.

[0018]En algunas realizaciones, el método puede comprender además: d) detectar o medir la señal generada por la unión de las sondas a los ácidos nucleicos (marcados). La medición puede realizarse en tiempo real y/o al final de la reacción.

[0019]En algunas realizaciones de los métodos y kits aquí proporcionados, la composición o kit comprende además una sal de amonio cuaternario.

[0020] Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de una sal de amonio cuaternario (o fuente de la misma) en un método como se proporciona en el presente documento. Puede tener la fórmula N(Alk)<x>H<y>Hal, N(Alk)<x>H<y>donde x y=4, Alk=C1-4 alquilo, y Hal=haluro.

[0021] La sal de amonio cuaternario (QAS) puede ser una sal de haluro (por ejemplo, cloruro). La sal de amonio cuaternario puede comprender de 1 a 4 grupos metilo. De manera adecuada, la sal de amonio cuaternario puede comprender una sal de tetrametilamonio; preferentemente, la sal de tetrametilamonio es cloruro de tetrametilamonio (TMAC). En algunas realizaciones, la presencia de TMAC puede aumentar la relación señal-ruido de la señal de la(s) sonda(s).

[0022] En otro aspecto que no forma parte de la invención, la presente especificación divulga una polimerasa modificada con función o actividad de exonucleasa reducida o nula (en lo sucesivo abreviada P-ENF) para su uso en un método o proceso de amplificación de ácidos nucleicos,por ejemplo,un método de amplificación de ADN.

[0023] La polimerasa puede ser un fragmento y/o dominio y/o un derivado de la Taq polimerasa. La polimerasa puede estar formada por un truncamiento o modificación N-terminal.

[0024] La polimerasa puede modificarse aún más para que sea una polimerasa de "arranque en caliente".

[0025] En otro aspecto que no forma parte de la invención, la presente especificación divulga un método para llevar a cabo la amplificación de ácidos nucleicos utilizando un P-ENF.

[0026] En otro aspecto que no forma parte de la invención, la presente especificación divulga una composición acuosa adecuada para la amplificación de ácidos nucleicos que comprende uno o más de:

a) un tampón;

b) dNTPs, que pueden comprender desoxirribonucleótidos trifosfatos (A, T, G y C);

c) una polimerasa, como una P-ENF tal como se define en el presente documento;

d) opcionalmente, un iniciador (directo) y un iniciador (inverso), preferiblemente en los que los iniciadores forman un par de iniciadores y/o son adecuados para amplificar un ácido nucleico diana;

e) preferentemente, una sal de amonio cuaternario (QAS, por ejemplo, como se ha definido anteriormente); y/o e) una fuente de cationes divalentes.

[0027] Tales composiciones pueden ser adecuadas para amplificar ADN, por ejemplo en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

[0028] El QAS y/o el P-ENF pueden utilizarse en un método o composición que comprenda una o más sondas con un informador y/o un inhibidor, o con al menos un 50% de identidad (con un iniciador), o uno o más iniciadores mejorados.

[0029] También se proporciona un kit adecuado para realizar la amplificación de ácidos nucleicos que comprende: a) un contenedor;

b) un P-ENF y/o una sal de amonio cuaternario (QAS), convenientemente en una composición acuosa tal como se define en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0030] Se proporcionan a título ilustrativo y no pretenden ser limitativas.

FIGURA 1 - Esquema de los métodos UPDS aquí empleados.

FIGURA 2 - Esquema del mecanismo del iniciador potenciador en UPDS.

FIGURA 3 - Datos que muestran la detección de fluorescencia en el punto final para un ensayo de polimorfismo de nucleótido único. El sistema de ensayo utiliza tres iniciadores de oligonucleótidos no marcados (dos iniciadores específicos de alelo y un iniciador inverso universal) y dos sondas de doble marcado. Las secuencias de los iniciadores y las sondas se encuentran en el Ejemplo 1. Los datos obtenidos se representaron como la señal FAM dividida por ROX en el eje X, y la señal HEX dividida por ROX en el eje Y (las señales están normalizadas por ROX). Se observaron tres grupos discernibles asociados a genotipos respectivos.

FIGURA 4 - Datos que muestran el efecto de un iniciador potenciador. El sistema de ensayo utiliza tres iniciadores oligonucleótidos no marcados y dos sondas de doble marcado. Las secuencias de los iniciadores y las sondas son las mismas que las del Ejemplo 1 y la Figura 2, pero con la adición de dos iniciadores potenciadores (uno para cada sonda/alelo), como se describe en el Ejemplo 2. Los datos obtenidos se representaron como la señal FAM dividida por ROX en el eje X, y la señal HEX dividida por ROX en el eje Y (las señales están normalizadas por ROX). Se observaron tres grupos discernibles asociados a genotipos respectivos.

FIGURA 5 - Datos que muestran el efecto de otro tipo de iniciador potenciador. El sistema de ensayo utiliza tres iniciadores oligonucleótidos no marcados y dos sondas de doble marcado. Las secuencias de los iniciadores y las sondas son las mismas que las del Ejemplo 1 y la Figura 2, pero con la adición de dos iniciadores potenciadores (uno para cada sonda/alelo), como se describe en el Ejemplo 3. Estos iniciadores potenciadores utilizan una secuencia duplicada en comparación con el Ejemplo 2. Los datos obtenidos se representaron como la señal FAM dividida por ROX en el eje X, y la señal HEX dividida por ROX en el eje Y (las señales están normalizadas por ROX). Se observaron tres grupos discernibles asociados a genotipos respectivos.

FIGURA 6 - Detección de señales UPDS en tiempo real.

FIGURA 7 - Datos que muestran el efecto de utilizar una Taq polimerasa truncada con actividad exonucleasa 5'-3' reducida en el protocolo UPDS. El sistema de ensayo utiliza tres iniciadores oligonucleótidos no marcados y dos sondas de doble marcado. Las secuencias de los iniciadores y las sondas se encuentran en el Ejemplo 5. Los datos obtenidos se representaron como la señal FAM dividida por ROX en el eje X, y la señal HEX dividida por ROX en el eje Y (las señales están normalizadas por ROX). Se observaron tres grupos discernibles asociados a genotipos respectivos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0031]Estos aspectos se refieren a un nuevo método de genotipado, divulgado en el presente documento como UPDS (Sistema universal de detección de polimorfismos). Este ensayo puede comprender el uso de dos (o más, por ejemplo, tres o cuatro o cinco o más) iniciadores oligonucleótidos alelo-específicos competidores. Cada uno puede incluir una porción de secuencia molde en el extremo 3' (que puede diferenciar entre los alelos) y diferentes colas de secuencia no molde, o marcaciones, en el extremo 5', y un iniciador inverso (común). Este sistema puede utilizar un sistema de notificación, como un sistema de notificación fluorescente. Este sistema puede utilizar una sonda, como una sonda de oligonucleótidos. Este sistema puede entonces unirse a la secuencia complementaria introducida por cada una de las colas de los iniciadores alelo-específicos, dando lugar a la generación de una señal detectable, como una señal luminosa.

[0032]En la Figura 1 se muestra un esquema de un proceso UPDS ejemplar. En el paso (A), el iniciador específico del alelo correcto 101 (sólo se muestra uno por simplicidad) con cola/marcación 101a y el iniciador inverso 102 se muestran junto al ADN molde 100, mostrando el polimorfismo de nucleótido único (SNP) que ejemplifica el alelo específico (aquí es un C-G). Tras la desnaturalización (en las plantillas monocatenario 100a y 100b), los iniciadores se recobran y extienden, y el paso (B) muestra la síntesis resultante de dos nuevas cadenas 103 y 104. Una de estas hebras 103 tiene cola/marcación como resultado del uso del iniciador alelo-específico, y los pasos de extensión subsiguientes - por ejemplo el paso (C) - causan la síntesis de una hebra que comprende el complemento de la cola/marcación 105 del iniciador aleloespecífico. En el paso (D), esto muestra que la generación del complemento de la cola/marcación específica del alelo permite que una sonda como la sonda 106 de doble marcado ejemplificada (con un fluoróforo FAM y un inhibidor) se una/pare en base a la porción de cola/marcación y genere una señal detectable.

[0033]La acción del iniciador potenciador en el proceso UPDS se muestra en la Figura 2. Aquí, siguiendo el paso (C) de la Figura 1, el iniciador potenciador 107 es capaz de competir con la sonda para unirse a la cola/marcación alelo-específica de la cadena sintetizada 105. Esto permite realizar más rondas de amplificación para generar más hebras 105, lo que resulta en un mayor número de sitios de unión de la sonda.

[0034]Así, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar una o más secuencias diana en una muestra mediante amplificación, comprendiendo el método:

a) proporcionar una composición acuosa que comprenda:

i) uno o más iniciadores oligonucleotídicos de avance que tengan una región 5' que sea una secuencia marcadora y una región 3' específica para una secuencia diana;

ii) un iniciador oligonucleotídico inverso, de forma que un iniciador directo y un iniciador inverso formen operablemente un par de iniciadores;

iii) una o más sondas con una marcación de informador y una marcación de inhibidor, cada sonda con una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con la secuencia marcadora de un iniciador oligonucleotídico directo; y

iv) uno o más iniciadores oligonucleotídicos potenciadores que comprendan una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con la secuencia de una sonda;

b) incubar los iniciadores y las sondas con la muestra y al menos una polimerasa; e

c) realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la muestra para generar ácidos nucleicos marcados, por lo que la sonda o sondas pueden unirse a los ácidos nucleicos marcados.

[0035]La presente invención también proporciona un kit para su uso en un proceso de amplificación de ácidos nucleicos, que comprende:

iii) una o más sondas con una marcación de informador y una marcación de inhibidor, cada sonda con una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con la secuencia marcadora de un iniciador oligonucleotídico directo; iv) uno o más iniciadores oligonucleótidos potenciadores que comprendan una secuencia que tenga al menos un 90% de identidad con la secuencia de una sonda; y

v) una polimerasa.

[0036] El término "muestra", tal como se utiliza en el presente documento, debe entenderse como una muestra que comprende o consiste en ADN. Generalmente, la muestra puede ser una muestra biológica, por ejemplo un fluido biológico seleccionado entre sangre o un producto derivado de la sangre como plasma o suero, saliva, orina, sudor, o líquido cefalorraquídeo. La muestra también puede ser una muestra de células o tejido, por ejemplo músculo, uña, pelo, hueso, médula, cerebro, tejido vascular, riñón, hígado, tejido nervioso periférico, piel y tejido epitelial. El tejido o las células pueden ser normales o patológicos. Generalmente, la muestra puede tratarse para eliminar todo el material excepto el ADN mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Los protocolos de preparación de muestras PCR también están bien descritos en la literatura y están disponibles en los sitios web de Agilent, Life Technologies, Qiagen e Illumina. En una realización, el método de la invención puede emplearse para determinar la presencia de un alelo particular de un locus de ADN, por ejemplo la presencia de un SNP en un gen u otro locus en el ADN. En algunas realizaciones, la muestra comprende ADN de origen desconocido y el método de la invención puede emplearse para detectar la presencia de un ADN diana en la muestra. El ADN presente en una muestra puede denominarse plantilla de ADN en el contexto de la presente divulgación.

[0037] El término "iniciador", tal como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido monocatenario producido sintética o biológicamente. En uso, los iniciadores pueden emparejarse/anularse típicamente a otra molécula de ácido nucleico monocatenario utilizando las reglas definidas por el emparejamiento de bases Watson-Crick para formar un dúplex de ácido nucleico bicatenario, por lo que la hebra del iniciador puede entonces extenderse/elongarse con una polimerasa apropiada en presencia de monómeros de nucleótidos. Es bien sabido que muchas de estas polimerasas de ácido nucleico o transcriptasas inversas requieren la presencia de un iniciador que puede extenderse para iniciar dicha síntesis de ácido nucleico. Por ejemplo, los oligonucleótidos aquí divulgados pueden utilizarse como uno o más iniciadores en diversas reacciones de extensión, síntesis, o amplificación. También es bien sabido que en los ensayos de PCR, los iniciadores suelen existir en pares de iniciadores, que comprenden un iniciador nominal "directo" y un iniciador nominal "inverso". Los iniciadores directo e inverso pueden diferenciarse por el hecho de que se unen a hebras diferentes de una plantilla dúplex dada, y forman operablemente un par de iniciadores de forma que el iniciador inverso se une corriente abajo al iniciador directo en el dúplex/plantilla de ADN(es decir,en la dirección 3' del iniciador directo).

[0038] El término "porción", tal como se utiliza en el presente documento con referencia a construcciones oligonucleotídicas (como iniciadores), debe entenderse como una parte contigua de dicha construcción oligonucleotídica que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis o más bases contiguas.

[0039] En algunas realizaciones, los iniciadores pueden tener al menos una porción que es específica para una secuencia diana(es decir,un iniciador específico de secuencia). En otras palabras, los iniciadores pueden diseñarse de tal manera que al menos una parte tenga una secuencia complementaria a una secuencia diana conocida que deba detectarse. Así, en una reacción de amplificación determinada, un iniciador específico de secuencia se emparejará/anulará preferentemente con su secuencia diana.

[0040] Los iniciadores específicos de secuencia también pueden ser iniciadores específicos de alelo en los que la secuencia diana es un alelo específico en un locus genético que puede utilizarse para alelos que comparten un polimorfismo común. El término "alelo", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una variación genética asociada a un gen o a un segmento de ADN, esdecir,una de las dos o más formas alternativas de una secuencia de ADN que ocupa el mismo locus genético. En otras palabras, los iniciadores alelo-específicos pueden utilizarse para amplificar un único alelo y pueden ser capaces de diferenciar entre dos secuencias que sólo difieren en una única base de cambio. La diferencia entre los dos alelos puede ser un SNP, una inserción, o una deleción.

[0041] Los iniciadores específicos de secuencia pueden ser universales para todos los alelos. En otras palabras, los iniciadores específicos de secuencia sólo pueden ser específicos para un locus que sea universal para todos los alelos y/o polimorfismos que se vayan a detectar. Por lo tanto, estos iniciadores pueden utilizarse como iniciadores universales. En otras palabras, se puede utilizar un iniciador universal específico de secuencia junto con dos o más iniciadores específicos de alelo en un método de la invención tal como se describe en el presente documento. Así, en una realización del método de la invención, el uno o más iniciadores oligonucleótidos de avance pueden ser iniciadores específicos de alelo que tienen una porción específica de secuencia que es específica para uno o más alelo(s) conocido(s). En tales realizaciones, los iniciadores de oligonucleótidos inversos pueden ser iniciadores de secuencia específica para una secuencia conocida cercana al alelo. En un ejemplo, se sabe que la secuencia unida por el iniciador inverso no es polimórfica y/o no depende del alelo.

[0042]Los iniciadores específicos de secuencia y/o específicos de alelo también pueden comprender una porción 5' que es una secuencia de marcación, en la que la secuencia de marcación no es complementaria a la secuencia o alelo diana. Esta organización permite incorporar una secuencia de marcación como parte del iniciador durante una reacción de polimerización específica. Los ciclos subsiguientes durante una reacción de PCR permitirán que la secuencia de la marcación se amplifique aún más y se incorpore como parte del dúplex amplificado. Las secuencias marcadoras pueden ser útiles ya que pueden diseñarse para ser específicas de secuencias de sonda complementarias, por lo que las sondas pueden marcarse utilizando una marcación indicadora para permitir la generación de una señal asociada en respuesta a la amplificación a partir de un iniciador específico de secuencia y/o específico de alelo.

[0043]En algunas realizaciones, la secuencia de la parte específica de secuencia de los iniciadores específicos de diana tal como se utilizan en el presente documento, como los iniciadores específicos de alelo, pueden diseñarse de tal manera que tengan al menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con sus secuencias diana (por ejemplo, una secuencia que comprende un SNP). En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser suficiente para que el iniciador específico de la diana sea capaz de unirse a la secuencia diana y permitir la extensión por la polimerasa, por ejemplo la ADN polimerasa, como parte de los métodos aquí previstos. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia es suficiente para que el iniciador específico de la diana sea capaz de unirse a la secuencia diana preferentemente a los demás iniciadores específicos de la diana presentes en la composición y/o el kit.

[0044]Los iniciadores potenciadores utilizados en el presente documento se refieren a iniciadores específicos de secuencia que son específicos para el mismo locus que una sonda utilizada en el presente documento. Por lo tanto, en uso, el iniciador potenciador puede ser capaz de competir con, por ejemplo, una sonda en la hibridación, bajo estrictas definidas, específicamente (es decir, preferentemente) a secuencias de ácido nucleico diana. La unión del iniciador potenciador puede facilitar la reacción de amplificación y generar así más cadenas marcadas/con cola para la unión de la sonda y la generación de la señal. Así, en algunas realizaciones, uno o más iniciadores oligonucleotídicos potenciadores comprenden una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de una sonda. En algunas realizaciones, la secuencia de los iniciadores potenciadores oligonucleotídicos tal como se utilizan en el presente documento puede diseñarse de forma que tengan al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con sus respectivas secuencias de sonda/marcación. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia entre el iniciador potenciador y la secuencia de sonda puede ser suficiente para que el iniciador potenciador sea capaz de unirse o hibridarse a la secuencia de marcación complementaria y permitir la extensión por la polimerasa, por ejemplo la ADN polimerasa, como parte de los métodos aquí previstos. En algunas realizaciones, la secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de una sonda puede tener una longitud de 10-30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de una sonda puede tener una longitud de 12-28, 15-27, 17-25, 19-23, 20-22 o 21 nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de una sonda puede tener 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, uno o más oligonucleótidos potenciadores pueden tener la misma longitud (en nucleótidos) que la sonda.

[0045]En algunas realizaciones, los uno o más iniciadores oligonucleotídicos potenciadores pueden comprender al menos dos regiones distintas, cada una de las cuales comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad (o al menos un 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad) con la de la una o más sondas. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia entre cada región distinta y la secuencia de la sonda puede ser suficiente para que el iniciador potenciador sea capaz de unirse o hibridarse con la secuencia marcada y permitir la extensión por la polimerasa, por ejemplo la ADN polimerasa, como parte de los métodos que se proporcionan en el presente documento. En tales realizaciones, las dos regiones distintas pueden estar separadas por una región enlazadora. La región enlazadora puede tener una longitud de 1 a 10 o de 2 a 5 oligonucleótidos. En algunas realizaciones, puede no haber región enlazadora. En algunas realizaciones, la secuencia de cada región distinta puede ser idéntica entre sí.

[0046]En algunas realizaciones, uno o más iniciadores oligonucleótidos potenciadores pueden comprender una estructura de bucle o de horquilla. En tales realizaciones, el uno o más iniciadores oligonucleotídicos potenciadores pueden comprender una porción en o adyacente al extremo 3' (la porción terminal 3') que es complementaria a una porción en o adyacente al extremo 5' (la porción terminal 5'). En solución libre, la porción terminal 3' puede hibridarse con la porción terminal 5' y formar así una estructura de horquilla o bucle. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una longitud de al menos 4, al menos 5, al menos 6 o al menos 7 nucleótidos. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una longitud de 4-8, 5-7 o 6 nucleótidos. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una longitud de 4, 5, 6, 7 u 8 nucleótidos. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen al menos un 90% de complementariedad. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una complementariedad del 100%. En otras realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen uno, dos o tres desajustes. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' flanquean la secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de una sonda. En algunas realizaciones en las que hay una porción terminal 3', la terminación 3' puede comprender además una porción "saliente" de uno, dos o tres nucleótidos que no hibrida con un nucleótido complementario en la porción terminal 5'. En algunas realizaciones en las que hay una porción terminal 5', la terminación 5' puede comprender además una porción "saliente" de uno, dos o tres nucleótidos que no hibrida con un nucleótido complementario en la porción terminal 3'. En algunas realizaciones, la porción saliente tiene un nucleótido de longitud.

[0047]A efectos de la presente invención, para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias (como dos secuencias polinucleotídicas o dos secuencias polipeptídicas), las secuencias pueden alinearse con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una primera secuencia para una alineación óptima con una segunda secuencia). A continuación, pueden compararse los residuos nucleotídicos en las posiciones nucleotídicas. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo nucleotídico que la posición correspondiente de la segunda secuencia, los nucleótidos son idénticos en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas / número total de posiciones en la secuencia de referencia * 100). ;;[0048]El experto conoce diferentes programas informáticos disponibles para determinar la homología o identidad entre dos secuencias. Por ejemplo, la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmo matemático. En una realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG de Accelrys (disponible en http://www.accelrys.com/products/gcg/), utilizando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de separación de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso de longitud de 1,2, 3, 4, 5, o 6. ;;[0049]Los términos "complementariedad" y "complementario" son intercambiables y se refieren a la capacidad de los polinucleótidos de formar pares de bases entre sí. Los pares de bases suelen formarse por enlaces de hidrógeno entre unidades nucleotídicas en cadenas o regiones polinucleotídicas antiparalelas. ;;[0050]Las cadenas o regiones polinucleotídicas complementarias pueden emparejarse en la forma Watson-Crick (por ejemplo, A a T, A a U, C a G). La complementariedad al 100% se refiere a la situación en la que cada unidad nucleotídica de una cadena o región polinucleotídica puede formar un enlace de hidrógeno con cada unidad nucleotídica de una segunda cadena o región polinucleotídica de igual longitud. ;;[0051]El término "sonda", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a ácidos nucleicos sintéticos o producidos biológicamente (ADN o ARN) que, por diseño o selección, contienen secuencias de nucleótidos específicas que les permiten hibridarse, bajo stringencias definidas, específicamente (es decir, preferentemente) con secuencias de ácido nucleico diana. Por lo tanto, las sondas también pueden utilizarse indistintamente con "sonda de oligonucleótidos". En las presentes enseñanzas, las sondas pueden estar marcadas, por ejemplo, con una marcación de informador como un fluoróforo o una marcación de inhibidor. En algunas realizaciones, las sondas también pueden comprender al menos un par de marcaciones, que comprenden una marcación de informador, como un fluoróforo, y una marcación de inhibidor, por lo que la marcación de inhibidor es capaz de atenuar la emisión de la marcación de informador. La marcación de informador puede estar situada en una porción diferente de la sonda en comparación con la marcación de inhibidor. En algunas realizaciones, la posición de las marcaciones es tal que, cuando están libres en la solución, la marcación de informador y la marcación de inhibidor están muy próximas entre sí, de modo que se puede detectar poca o ninguna emisión de la marcación de informador. ;;[0052]En algunas realizaciones, la(s) sonda(s) puede(n) comprender una secuencia que hibrida con el complemento de la secuencia marcadora de un iniciador oligonucleotídico. La secuencia que hibrida con el complemento de la secuencia marcadora de un iniciador oligonucleotídico puede tener al menos un 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia marcadora del iniciador oligonucleotídico. En algunas realizaciones, la(s) sonda(s) comprende(n) una secuencia idéntica a la secuencia marcadora del iniciador oligonucleotídico. En algunas realizaciones, la secuencia que hibrida con el complemento de la secuencia marcadora de un iniciador oligonucleotídico puede tener 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. ;;[0053]En algunas realizaciones, la sonda puede comprender una estructura de bucle u horquilla. El plegado de la sonda de este modo mejora la extinción de la fluorescencia en su forma nativa y conduce a una mejor generación de la señal cuando se une a la secuencia diana complementaria. De este modo, se mejora la relación señal-ruido del sistema de notificación. El mecanismo de acción sugerido es que la estructura en bucle mantiene el fluor y el inhibidor mucho más cerca, mejorando así la inhibición. Por el contrario, cuando la sonda está unida a su diana, el fluor y el inhibidor están más separados, la mayor distancia maximiza la fluorescencia y, por tanto, la liberación de la señal. En tales realizaciones, la sonda puede comprender una porción en o adyacente a la terminación 3' (la porción terminal 3') que es complementaria a una porción en o adyacente a la terminación 5' (la porción terminal 5'). En solución libre, la porción terminal 3' puede hibridarse con la porción terminal 5' y formar así una estructura de horquilla o bucle. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una longitud de al menos 4, al menos 5, al menos 6 o al menos 7 nucleótidos. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una longitud de 4-8, 5-7 o 6 nucleótidos. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una longitud de 4, 5, 6, 7 u 8 nucleótidos. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen al menos un 90% de complementariedad. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una complementariedad del 100%. En otras realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen uno, dos o tres desajustes en su región complementaria. En algunas realizaciones, la porción terminal 3' y la porción terminal 5' flanquean la secuencia que hibrida con el complemento de la secuencia marcadora. En algunas realizaciones en las que hay una porción terminal 3', la terminación 3' puede comprender además una porción "saliente" de uno, dos o tres nucleótidos que no hibrida con un nucleótido complementario en la porción terminal 5'. En algunas realizaciones en las que hay una porción terminal 5', la terminación 5' puede comprender además una porción "saliente" de uno, dos o tres nucleótidos que no híbrida con un nucleótido complementario en la porción terminal 3'. En algunas realizaciones, la porción saliente tiene un nucleótido de longitud. ;;[0054]En algunas realizaciones, cuando uno o más iniciadores de oligonucleótidos potenciadores y una o más sondas tienen estructuras de horquilla, uno o más iniciadores de oligonucleótidos potenciadores pueden configurarse de manera que la estructura de horquilla en uno o más iniciadores de oligonucleótidos potenciadores sea menos estable que la estructura de horquilla en una o más sondas. La disminución de la estabilidad de una estructura de horquilla puede lograrse mediante diferentes diseños, por ejemplo, reduciendo la región complementaria entre la porción terminal 3' y la porción terminal 5'; introduciendo desajustes en la región complementaria entre la porción terminal 3' y la porción terminal 5'; introduciendo un saliente en la terminación 3' o 5'. ;;[0055]El término "marcación de informador", tal como se utiliza en el presente documento, debe entenderse como una molécula capaz de emitir una señal detectable y capaz de ser apagada por la molécula de inhibidor. Ejemplos de moléculas informadoras son moléculas detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Ejemplos de etiquetas informadoras que pueden emplearse incluyen enzimas, sustratos enzimáticos, átomos radiactivos, tintes fluorescentes, cromóforos, etiquetas quimioluminiscentes, o ligandos con socios de unión específicos. ;;[0056]En una realización, la etiqueta informadora puede ser detectable por espectroscopia, y puede ser un colorante fluorescente. Los fluoróforos para los pares de oligonucleótidos marcados pueden seleccionarse de forma que pertenezcan a una familia química similar o a otra diferente, como colorantes de cianina, xantenos o similares. Los fluoróforos de interés incluyen, entre otros, los colorantes de fluoresceína (p. ej. 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',4',1,4,-tetraclorofluoresceína (TET), 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluoresceína (HEX) y 2'7"-dimetoxi-4',5'dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE)), colorantes de cianina como Cy5, derivados de dansilo, colorantes de rodamina (p. ej., tetrametilo-6-carboxifluoresceína), colorantes de cianina como Cy5, derivados de dansilo, colorantes de rodamina (p. ej., tetrametilo-6-carboxifluoresceína), colorantes dep. ej., tetrametilo-6-carboxirodamina (TAMRA) y tetrapropano-6-carboxirodamina (ROX)), DABSYL, DABCYL, cianina, como Cy3, antraquinona, compuestos de nitrotiazol y nitroimidazol, u otros colorantes no intercalantes. El término "marcación de inhibidor" debe entenderse como un "grupo inhibidor",es decir,cualquier grupo químico modificador de la fluorescencia que pueda atenuar, al menos en parte, la luz emitida por un grupo fluorescente. En lo sucesivo, denominaremos a esta atenuación "inhibición". Por lo tanto, la iluminación del grupo fluorescente en la proximidad de un grupo de atenuación puede dar lugar a una señal de emisión que es menos intensa de lo esperado, o incluso completamente ausente. La atenuación se produce por transferencia de energía entre el grupo fluorescente y el grupo de atenuación. ;;[0057]En las realizaciones de la presente invención en las que la sonda comprende tanto una marcación de informador como un fluoróforo y una marcación de inhibidor las marcaciones se colocan generalmente de tal manera que cuando están libres en solución, la marcación de informador y la marcación de inhibidor se acercan entre sí de tal manera que se puede detectar poca o ninguna emisión de la marcación de informador. Esto puede deberse, por ejemplo, a la formación de una estructura secundaria debida a la secuencia de la sonda oligonucleotídica. En tales realizaciones, la unión de las sondas a sus respectivas secuencias de marcacióndo puede separar la marcación de informador y la marcación de inhibidor de tal manera que el nivel de atenuación de la marcación de inhibidor disminuye en comparación con la sonda libre en solución. En otras palabras, la unión de la sonda a la secuencia marcadora debería aumentar la emisión de la marcación informadora de la sonda. En un ejemplo, esto puede hacerse colocando la marcación de informador y la marcación de inhibidor en extremos opuestos o porciones finales de una sonda. ;;[0058]Los términos "polimerasa", "polimerasa de ácido nucleico" y se utilizan aquí en un sentido amplio y se refieren a cualquier polipéptido que pueda catalizar la extensión 5'-a-3' de un iniciador hibridado mediante la adición de nucleótidos y/o ciertos análogos de nucleótidos de una manera dependiente de la plantilla. En una realización, la polimerasa es una ADN polimerasa. Ejemplos no limitantes de ADN polimerasas incluyen ADN polimerasas dependientes de ARN, incluyendo sin limitación, transcriptasas inversas, y ADN polimerasas dependientes de ADN. Se apreciará que ciertas ADN polimerasas (por ejemplo, pero sin limitarse a ciertas ADN polimerasas de tipo A eubacterianas y ADN polimerasa Taq) pueden comprender además una actividad nucleasa específica de estructura y que cuando una reacción de amplificación comprende una reacción de escisión invasiva. ;;[0059]En algunas realizaciones, la polimerasa puede ser una polimerasa modificada. Las polimerasas pueden modificarse en su estructura mediante ingeniería genética(es decir, mediante técnicas de biología molecular conocidas) o mediante modificación química para conferirles determinadas propiedades. En otras palabras, una polimerasa modificada, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una polimerasa, por ejemplo una ADN polimerasa, que tiene una o más de las siguientes características: una estructura primaria diferente(es decir,una secuencia de aminoácidos), una estructura secundaria diferente, una estructura terciaria diferente o una estructura cuaternaria diferente a la de una o más polimerasas o fragmentos de las mismas de los que se deriva. Tal como se ha mencionado anteriormente, el término polimerasa modificada también incluye en su ámbito de aplicación fragmentos, derivados y homólogos de una polimerasa modificada tal como se define en el presente documento, siempre que conserven su función de polimerasa y sus propiedades modificadas tal como se definen en el presente documento. ;;[0060]En algunas realizaciones, la polimerasa utilizada puede ser una polimerasa modificada para atenuar o eliminar completamente su actividad exonucleasa 5'-3' en las condiciones utilizadas para la reacción de polimerización. ;[0061] En algunas realizaciones, la polimerasa utilizada puede ser una polimerasa modificada para ser una polimerasa de "arranque en caliente". Las polimerasas de arranque en caliente son bien conocidas en la técnica como polimerasas que han sido modificadas de tal manera que se inactivan completamente a temperaturas más bajas. Durante una reacción PCR, cuando la temperatura aumenta generalmente a > 90°C, la modificación se invierte y la polimerasa vuelve a ser activa. Esta técnica permite reducir la amplificación inespecífica, en particular antes del inicio de una reacción PCR. ;[0062] En el contexto de la presente especificación, se entiende que incluye. ;[0063] Cuando sea técnicamente apropiado, las formas de realización de la invención pueden combinarse. En el presente documento se describen realizaciones que comprenden determinadas características/elementos. La divulgación también se extiende a realizaciones separadas que consisten o consisten esencialmente en dichas características/elementos. ;[0064] La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son meramente ilustrativos y no deben interpretarse en modo alguno como limitativos del alcance de la presente invención. ;EJEMPLOS ;Ejemplo 1: Detección final por fluorescencia de un ensayo de polimorfism o de un solo nucleótido Abreviaturas: ;[0065] ;FAM: Fluoresceína 6-carboxi ;HEX: 2',4', 5',7', 1,4- Hexaclorofluoresceína ;IABkFQ: Iowa Black® FQ ;ROX: 5,6-carboxi-X-rodamina, SE ;[0066] El sistema utiliza tres iniciadores oligonucleótidos no marcados y dos sondas marcadas doblemente. A continuación se indican las secuencias de los iniciadores y las sondas: ;Iniciador alelo-específico 1: ;;5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAT- ;3’ (SEQ ID NO: 1) ;;Iniciador alelo-específico 2: ;;5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGCTCCACAATTTGGTGAATTATCAAA- ;3’ (SEQ ID NO: 2) ;Iniciador Inverso: ;5'-CACTCTAGTACTATATCTGTCACATGGTA-3' (SEQ ID N.°: 3) ;Sonda FAM: ;5'-/6-FAM/GAAGGTGACCAAGTTCATGCT/IABkFQ/-3' (SEQ ID N.°: 4) ;Sonda HEX: ;5'-/HEX/GAAGGTCGGAGTCAACGGATT/IABkFQ/-3' (SEQ ID N.°: 5) ;[0067] La secuencia de la sonda marcada con FAM es idéntica a la parte de la marcación universal del iniciador específico del alelo 1 y la secuencia de la sonda marcada con HEX es idéntica a la parte de la marcación del iniciador específico del alelo 2. ;[0068] Todos los oligonucleótidos se diluyeron a una concentración inicial de 100|jM utilizando tampón Te (10mM TRIS pH8,3 con 0,1mM EDTA). ;[0069] Se creó una mezcla maestra de genotipado 2X incluyendo iniciadores de ensayo que incluían los siguientes componentes: ;1. 0,33 |<j>M iniciador alelo-específico 1 ;2. 0,33 j M iniciador específico del alelo 2 ;3. 0,83 j M iniciador inverso ;4. 400nM Sonda FAM ;5. 400nM HEX Probe ;6. 10mM TRIS pH 8,3 ;7. 100mM KCl ;8. 4,4mM Cloruro de magnesio ;9. 300<j>M dNTPs ;10. 300nM 5,6-carboxi-X-rodamina, SE (5,6-ROX, SE, isómero mixto) ;11. 0,05% Igepal ;12. 10% Glicerol ;13. 50-100 Unidades/mL Taq Polimerasa truncada N-terminalmente ;;[0070]El ensayo de genotipado se realizó en una placa PCR transparente de 384 pocillos utilizando un volumen final de reacción de 4 jl. A los pocillos de la placa PCR se añadieron 2 jl de ADN genómico de varios individuos caucásicos a una concentración final de 2ng/jl. A la adición de ADN le siguió la adición de la mezcla maestra de genotipado 2* (descrita anteriormente). La placa PCR se selló con una película de poliolefina StarSeal Advanced. A continuación, la placa se sometió a ciclos térmicos en el termociclador Peltier MJ PTC-200 utilizando las siguientes condiciones de termociclado:

[0071]Después del termociclado, se registró la fluorescencia del punto final utilizando el lector de placas fluorescentes Tecan Infinite F200, utilizando las siguientes longitudes de onda:

Excitación FAM: 485nm, Emisión FAM: 520nm

Excitación HEX: 535nm, Emisión HEX: 556 nm

Excitación ROX: 575nm, Emisión ROX: 610nm

[0072]Los datos obtenidos se graficaron entonces como señal FAM dividida por ROX en el eje X, y señal HEX dividida por ROX en el eje Y. Se observaron tres grupos claramente discernibles asociados a los respectivos genotipos (Figura 3).

Ejemplo 2: Efecto del iniciador potenciador Tipo 1 (marcación universal de longitud única)

[0073]Este ejemplo demuestra el aumento de la generación de señales y la agrupación de genotipos en presencia del iniciador potenciador tipo 1.

[0074]En cuanto al Ejemplo 1, se utilizó un protocolo para demostrar la importancia de la adición del iniciador potenciador en el sistema de detección de genotipado SNP fluorescente de punto final basado en PCR. El genotipado SNP se realizó en presencia del iniciador potenciador tipo 1. Se añadió un par de iniciadores potenciadores, uno para cada alelo, a la mezcla maestra de genotipado concentrado 2X a una concentración final de 80nM.

Iniciador Potenciador 1:

5-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3' (SEQ ID N.°: 6)

Iniciador Potenciador 2:

5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3' (SEQ ID N.°: 7)

[0075]El gráfico de clústeres de genotipado de punto final demostró claramente una mayor relación señal-ruido, clústeres más apretados y una mayor amplificación en presencia del iniciador potenciador. (Figura 4)

Ejemplo 3: Efecto del iniciador potenciador de tipo 2 (marcación universal duplicada)

[0076]En cuanto al Ejemplo 2, se utilizó un protocolo para demostrar la importancia de la adición del iniciador potenciador de tipo 2 en el sistema de detección de genotipado SNP fluorescente de punto final basado en PCR. El genotipado SNP se realizó en presencia del iniciador potenciador tipo 2. Se añadió un par de iniciadores potenciadores, uno para cada alelo, a la mezcla maestra de genotipado 2X a una concentración final de 80nM.

Iniciador Potenciador 3:

5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3' (SEQ ID N.°: 8)

Iniciador Potenciador 4:

5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3' (SEQ ID N.°: 9)

[0077]Se observaron tres grupos claramente discernibles asociados a los respectivos genotipos (Figura 5).

Ejemplo 4: Detección en tiempo real del producto de la PCR

[0078]La PCR en tiempo real se realizó utilizando el protocolo descrito anteriormente (Ejemplo 1-3) para demostrar la capacidad del sistema para detectar fluorescencia en tiempo real en cada ciclo de PCR.

[0079]Las muestras de ADN humano se analizaron en una dilución en serie de 1:10 con una concentración inicial de 20ng/|jl. La detección se realizó únicamente en el canal FAM utilizando los siguientes iniciadores y sondas.

Alelo-específico Iniciador Directo:

5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGTGCAGGTTCAGACGTCC-3' (SEQ ID N.°: 10)

Iniciador Inverso:

5'-CTCCCTTCCACCTCCGTACCAT-3' (SEQ ID N.°: 11)

Sonda FAM:

5'-/6-FAM/GAAGGTGACCAAGTTCATGCT/IABkFQ/-3' (SEQ ID N.°: 4)

Iniciador Potenciador 1:

5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3' (SEQ ID N.°: 6)

[0080]Todos los oligonucleótidos se diluyeron a una concentración inicial de 100jM utilizando tampón Te (10mM TRIS pH8,3 con 0,1mM EDTA).

[0081]Se creó una mezcla maestra de genotipado 2X incluyendo iniciadores de ensayo que incluían los siguientes componentes:

1. 0,33 jM iniciador directo específico del alelo

2. 0,83 jM iniciador inverso

3. 400nM Sonda FAM

4. 80nM Iniciador potenciador tipo 1

5. 10mM TRIS pH 8,3

6. 100mM KCl

7. 4,4mM Cloruro de magnesio

8. 300 jM dNTPs

9. 1000nM 5,6-carboxi-X-rodamina, SE (5,6-ROX, SE, isómero mixto)

10. 0,05% Igepal

11. 10% Glicerol

12. 20mM TMAC

13. 50-100 Unidades/mL Taq Polimerasa truncada N-terminal

[0082]La PCR se realizó en una placa PCR transparente de 384 pocillos utilizando un volumen de reacción final de 10 jl. A los pocillos de la placa PCR se añadieron 5 jl de ADN genómico con una concentración inicial de 20ng/ul a 0,02ng/ul. A la adición de ADN le siguió la adición de la mezcla maestra de genotipado 2x (descrita anteriormente). La placa PCR se selló con una película de poliolefina StarSeal Advanced.

[0083]A continuación, la placa se sometió a termociclado en el Applied Biosystem 7900 utilizando las siguientes condiciones de termociclado:

[0084]La fluorescencia se registró en tiempo real en cada ciclo de PCR durante la etapa de recocido y extensión. Los datos resultantes se graficaron como deltaRn vs ciclo y los valores Cq se calcularon automáticamente usando el software ABI 7900, como se muestra a continuación y en la Figura 6.

[0085]Esto demuestra la capacidad del sistema para detectar fluorescencia en tiempo real.

Ejemplo 5: Utilización de Taq polimerasa con truncamiento terminal con sondas de doble mareaje.

[0086]Este ejemplo demuestra la capacidad de la Taq Polimerasa N-terminalmente suprimida para liberar fluorescencia de una sonda doblemente marcada apagada sin el uso de la actividad nucleasa 5' de la Taq Polimerasa de longitud completa.

[0087]El ensayo de genotipado SNP se realizó utilizando ADN genómico humano.

Iniciador alelo-específico 1:

5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGTGCAGGTTCAGACGTCC-3' (SEQ ID N.°: 10)

Iniciador alelo-específico 2:

5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGTGCAGGTTCAGACGTCT-3' (SEQ ID N.°: 12)

Iniciador Inverso:

5'-CTCCCTTCCACCTCCGTACCAT-3' (SEQ ID N.°: 11)

Sonda FAM:

5'-/6-FAM/GAAGGTGACCAAGTTCATGCT/IABkFQ/-3' (SEQ ID N.°: 4)

Sonda HEX:

5'-/HEX/GAAGGTCGGAGTCAACGGATT/IABkFQ/-3' (SEQ ID N.°: 5)

[0088]Todos los oligonucleótidos se diluyeron a una concentración inicial de 100|jM utilizando tampón Te (10mM TRIS pH8,3 con 0,1mM EDTA).

[0089]Se creó una mezcla maestra de genotipado 2X incluyendo iniciadores de ensayo que incluían los siguientes componentes:

1. 0,33<j>M iniciador alelo-específico 1

2. 0,33<j>M iniciador específico del alelo 2

3. 0,83<j>M iniciador inverso

4. 400nM Sonda FAM

5. 400nM HEX Probe

6. 10mM TRIS pH 8,3

7. 100mM KCl

8. 4,4mM Cloruro de magnesio

9. 300 j M dNTPs

10. 300nM 5,6-carboxi-X-rodamina, SE (5,6-ROX, SE, isómero mixto)

11. 0,05% Igepal

12. 10% Glicerol

13. 20mM TMAC

14. 50-100 Unidades/mL Taq Polimerasa truncada N-terminalmente

[0090] El ensayo de genotipado se realizó en una placa PCR transparente de 384 pocillos utilizando un volumen de reacción final de 4 jl. A los pocillos de la placa PCR se añadieron 2 jl de ADN genómico de varios individuos caucásicos a una concentración final de 2ng/jl. A la adición de ADN le siguió la adición de la mezcla maestra de genotipado 2x (descrita anteriormente). La placa PCR se selló con una película de poliolefina StarSeal Advanced. A continuación, la placa se sometió a un termociclado en el termociclador Peltier MJ PTC-200 utilizando las siguientes condiciones de termociclado:

[0091] Después del termociclado, se registró la fluorescencia del punto final utilizando el lector de placas fluorescentes Tecan Infinite F200, utilizando las siguientes longitudes de onda:

Excitación FAM: 485nm, Emisión FAM: 520nm

Excitación HEX: 535nm, Emisión HEX: 556 nm

Excitación ROX: 575nm, Emisión ROX: 610nm

[0092] Los datos obtenidos se graficaron entonces como señal FAM dividida por ROX en el eje X, y señal HEX dividida por ROX en el eje Y. Se observaron tres grupos claramente discernibles asociados a genotipos respectivos (Figura 7). Ejemplo 6: Utilización de sondas y iniciadores potenciadores con extremos autocomplementarios.

[0093] Se realizó un ensayo de genotipado según la presente invención utilizando ADN genómico humano, con el uso de sondas y iniciadores potenciadores con extremos autocomplimentarios que forman estructuras internas de horquilla/bucle. Secuencia del ensayo

TGTCTAGCTAGCTAGCCTTCCATCAGCCATCTTCTTTTTTCATTGTCAGTGCCT

CTTTATGAAGGTAAAATTGACATACCAGAACATATCCTCATTTTAGGCACACA

TTTCATGATTTAAGTAAATTTATACAGTTGTGCAACCATCAGCATAATCTAGT

TTTAGAACACTTCTGTTACCCTAAGCACGTTCTCCTCATA[C/T]CGTTTGTCGTC

AATCCCTACCACGGCTACCAGTCTCAGGCAGCTACTAATCTATCTGCTTTTTTT

CTGTGTAATTTTGCCTTTTCCAGAAAGTCTTTATAGATAGAAGTATACAATGT

ATAGTCTCTTCTGTTTGGCTTCTTTCATTAGAATGGTGCTTTTGAGATTCATCT

ATGTTGTGGCATGTATCAGTAGGTTGTT (SEQ ID NO: 13)

Iniciador alelo-específico 1:

5’-AGCTGCTATTGTTACCAGTGACGCAGCTCCCTAAGCACGTTCTCCTCATAC-

3’ (SEQ ID NO: 14)

Iniciador alelo-específico 2:

5’-

TGGCCAGTGTATTCTGCACAGGTGGCCAACCCTAAGCACGTTCTCCTCATAT-

3’ (SEQ ID NO: 15)

Iniciador Inverso:

5'-GACTGGTAGCCGTGGTAGGGAT-3'(SEQ ID N.°: 16)

Sonda FAM:

5'-/6-FAM/AGCTGCTATTGTTACCAGTGACGCAGCT/IABkFQ/-3' (SEQ ID N.°: 17)

Sonda HEX:

5'-/HEX/TGGCCAGTGTATTCTGCACAGGTGGCCA/IABkFQ/-3' (SEQ ID N.°: 18)

Iniciador Potenciador A1:

5'-GCTGCTATTGTTACCAGTGACGCAGCT-3' (SEQ ID N.°: 19)

Iniciador Potenciador A2:

5'-GGCCAGTGTATTCTGCACAGGTGGCCA-3' (SEQ ID N.°: 20)

[0094]La estructura de horquilla predicha para las sondas y potenciadores se muestra en la Figura 8.

[0095]Todos los oligonucleótidos se diluyeron a una concentración inicial de 100|jM utilizando TE (10mM TRIS pH8,3 con 0,1mM EDTA).

[0096]Se creó una mezcla maestra de genotipado 2X incluyendo iniciadores de ensayo que incluían los siguientes componentes:

1. 0,33 j M iniciador alelo específico 1

2. 0,33 j M iniciador alelo específico 2

3. 0,83 j M iniciador inverso

4. 600nM Sonda FAM

5. Sonda HEX 600nM

6. 10mM TRIS pH 8,3

7. 100mM KCl

8. 4,4mM Cloruro de magnesio

9. 300 j M dNTPs

10. 300nM 5,6-carboxi-X-rodamina, SE (5,6-ROX, SE, isómero mixto)

11. 0,05% Igepal

12. 10% Glicerol

13. 20mM TMAC

14. 50-100 Unidades/mL Taq Polimerasa truncada N-terminal

[0097]Se añadió un par de iniciadores potenciadores, uno para cada alelo, a la mezcla maestra de genotipado 2X a una concentración final de 80nM.

[0098]El ensayo de genotipado se realizó en una placa PCR transparente de 384 pocillos utilizando un volumen final de reacción de 4 jl. A los pocillos de la placa PCR se añadieron 2 jl de ADN genómico de varios individuos caucásicos a una concentración final de 2ng/jl. A la adición de ADN le siguió la adición de la mezcla maestra de genotipado 2x (descrita anteriormente). La placa PCR se selló con una película de poliolefina Star Seal Advanced. A continuación, la placa se sometió a termociclado en el termociclador Peltier MJ PTC-200 utilizando las siguientes condiciones de termociclado:

[0099]La fluorescencia del punto final posterior al ciclo térmico se registró utilizando el lector de placas fluorescentes Tecan Infinite F200.

Excitación FAM: 485nm, Emisión FAM: 520nm

Excitación HEX: 535nm, Emisión HEX: 556 nm

Excitación ROX: 575nm, Emisión ROX: 610nm

[0100]Los datos obtenidos se graficaron como señal FAM dividida por ROX en el eje X, y señal HEX dividida por ROX en el eje Y, y se muestran en la Figura 9B. Los datos generados con sondas estándar y iniciadores potenciadores (sin extremos autocomplementarios) dirigidos al mismo SNP se muestran en 9A. Con el uso de sondas y iniciadores potenciadores con extremos autocomplementarios puede observarse una mejora de la relación señal/ruido y de la divergencia de grupos. Por supuesto, se entenderá que, aunque la presente invención se ha descrito a modo de ejemplo, los ejemplos no pretenden en modo alguno ser limitativos, y pueden realizarse modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones que figuran a continuación. Las características preferidas de cada forma de realización de la invención son las mismas que para cada una de las otras formas de realizaciónmutatis mutandis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar una o más secuencias diana en una muestra mediante amplificación, el método comprende: a) proporcionar una composición acuosa que comprenda:

2. Un kit para su uso en un proceso de amplificación de ácidos nucleicos, que comprende:

v) una polimerasa.

3. El método o kit según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:

(a) la polimerasa es una ADN polimerasa; y/o

(b) la polimerasa es un fragmento o dominio o un derivado de la Taq polimerasa; y/o

(c) la polimerasa es una polimerasa modificada; opcionalmente, la polimerasa se modifica para: (i) eliminar la actividad exo-nucleasa y/o (ii) ser una polimerasa de "arranque en caliente".

4. El método o kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que uno o más iniciadores oligonucleotídicos potenciadores comprenden al menos dos regiones distintas, cada región comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con la de una o más sondas.

5. El método o kit según la reivindicación 8, en el que las dos regiones distintas están separadas por una región enlazadora, opcionalmente en el que la región enlazadora tiene de 1 a 10 oligonucleótidos de longitud, más opcionalmente en el que la región enlazadora tiene de 2 a 5 oligonucleótidos de longitud.

6. El método o kit según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:

(a) la una o más sondas comprenden una secuencia que tiene al menos 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia marcadora de un iniciador oligonucleotídico directo o una secuencia idéntica a la secuencia marcadora de un iniciador oligonucleotídico directo; y/o

(b) los uno o más iniciadores oligonucleotídicos potenciadores comprenden una secuencia que tiene al menos 95%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de una sonda o una secuencia idéntica a la secuencia de una sonda.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se realizan al menos 4 ciclos de PCR, opcionalmente en el que se realizan al menos 20 ciclos de PCR, más opcionalmente en el que se realizan al menos 30 ciclos de PCR.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes comprende además: d) medir la señal generada por la unión de las sondas a los ácidos nucleicos marcados, opcionalmente en el que la medición se realiza en tiempo real o al final de la reacción.

9. El método o kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición o kit comprende además una sal de amonio cuaternario, opcionalmente en el que la sal de amonio cuaternario es una sal de tetrametilamonio, más opcionalmente en el que la sal de tetrametilamonio es cloruro de tetrametilamonio (TMAC).

10. El método o kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la una o más sondas comprenden una porción en o adyacente al extremo 3' que es complementaria a una porción en o adyacente al extremo 5', opcionalmente en el que:

(a) la porción terminal 3' y/o la porción terminal 5' tienen una longitud de al menos 4, al menos 5, al menos 6 o al menos 7 nucleótidos y/o

(b) en la que la porción terminal 3' y la porción terminal 5' tienen una complementariedad de al menos el 90% o el 100%.

11. El método o kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el uno o más iniciadores oligonucleótidos potenciadores comprenden una porción en o adyacente al extremo 3' que es complementaria a una porción en o adyacente al extremo 5', opcionalmente en el que:

(a) la porción terminal 3' y/o la porción terminal 5' tienen una longitud de al menos 4, al menos 5, al menos 6 o al menos 7 nucleótidos; y/o

(b) donde la porción terminal 3' y la porción terminal 5': (i) tienen al menos un 90% o 100% de complementariedad, o (ii) comprenden una, dos o tres discordancias.

12. El método o kit según la reivindicación 11, donde: (a) la porción terminal 3' o la porción terminal 5' comprende además una porción saliente de uno, dos o tres nucleótidos que no hibrida con un nucleótido complementario en la porción terminal 5'o 3' respectivamente; o (b) el uno o más iniciadores de oligonucleótidos potenciadores están configurados de tal manera que la estructura de horquilla en el uno o más iniciadores de oligonucleótidos potenciadores es menos estable que la estructura de horquilla en la una o más sondas.

13. Uso de una sal de amonio cuaternario en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. El uso según la reivindicación 13, en el que:

(a) la sal de amonio cuaternario es una sal de tetrametilamonio en la que, opcionalmente, la sal de tetrametilamonio es cloruro de tetrametilamonio (TMAC); y/o

(b) la presencia de TMAC aumenta la relación señal-ruido de la señal procedente de la sonda o sondas.