CN1711352A - 丙型肝炎病毒复制的高允许性细胞系 - Google Patents
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Abstract
本发明一般性地涉及对丙型肝炎病毒(HCV)复制允许性的细胞和细胞系,以及制备和使用它们的方法和材料。
Description
本发明受美国政府的资助金CA57973和AI40034的支持。美国政府享有本发明的某些权利。
背景
1.发明领域
本发明一般涉及丙型肝炎病毒(HCV)复制的允许细胞,以及制备和使用该细胞的方法和材料。
2.相关领域
以前已确定了HCV非结构蛋白质中的促进RNA复制的适应性突变,和Huh-7细胞支持可检测的复制水平的频率(Blight,K.J.等,科学,290:1972-1974,2000年;Guo,J.T.等,病毒学,75:8516-8523,2001年;Kreiger,N.等,病毒学,75:4614-4624,2001年;Lohmann,V.等,病毒学,75:1437-1449,2001年)。具体地,在NS5A中的第2204位以异亮氨酸取代丝氨酸残基,致使10%的受转染的Huh-7细胞允许HCV复制(相对非突变HCV提高20,000倍),并且将复制提高到在转染后早期足以检测HCV RNA的水平(Blight等,2000年)。支持HCV复制的Huh-7细胞的低频率提示细胞环境可能是HCV复制效率的主要决定因素
附图简述
图1显示多种HCV RNA的示意图。
图2显示HCV复制的高允许细胞系的选择。
图3显示检测HCV RNA短暂转染的Huh-7.5和Huh-7细胞中的HCV蛋白质和RNA。
图4显示以全长HCV RNA转染Huh-7.5细胞后的HCV RNA积累。
图5显示在HCV RNA复制中第2204位的另一种替换的效果。
图6显示在HCV RNA复制中结合了NS5A适应性突变的效果。
图7显示在HCV复制中结合了NS3和NS5A突变的效果。
图8显示在HCV RNA复制中S2194A和S2194D突变的效果。
发明叙述
此处用到的术语“允许”HCV复制,对于具体细胞或细胞系而言,意指特定细胞或细胞系,以比其来源细胞或细胞系更大的频率支持HCV复制。例如,在这里所述的某个实施方式中,Huh-7亚系比其所来源的Huh-7细胞系以更高的频率支持HCV复制。因此,该亚系对HCV复制是所述的允许。在一些实施方式中,细胞或细胞系支持HCV复制的频率介于约10%至约30%之间。在另一个实施方式中,细胞或细胞系支持HCV复制的频率介于约10%至约75%之间。
术语“治愈的”指细胞完全没有自主复制HCV RNA。实施例1给出了关于治愈细胞的一种方法的描述,在如此处所用的术语含义之内。
术语“转染”指用多核苷酸来侵染细胞。多核苷酸可以是DNA或RNA。转染细胞的方法可以是本领域公知的任意方法。
通过检测含有复制的HCV RNA的细胞百分率来确定频率。一种测量频率的简单方法是确定能表现由HCV RNA赋予的特征的细胞百分率,且本领域已知的能达到该目的的任意方法都是适宜的。文中的实施例描述了利用包含neo基因和G418选择物的HCV RNA的方法。
除非另外指出,可使用细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,其中的所有技术都在本领域技术和文献中公开的范围之内。
为获得HCV复制的允许细胞系,通过用干扰素(IFN)治愈支持适应性和非适应性亚基因组或全长RNA复制的Huh-7细胞的克隆系和群体中的HCV RNA。由于HCV复制容易受IFN的阻滞,故延长IFN处理治愈细胞的HCV RNA。高百分率的处理细胞能支持HCV复制,并能使亚基因组和全长复制的多种测定检测变得更为方便。因此,在此描述的一个实施方案包括HCV复制的允许细胞和细胞系的制备方法。所述的方法包括治愈HCV侵染的细胞。然后检测所治愈的细胞,来确定细胞支持HCV复制的频率。
细胞可以是任何能支持适应性或非适应性HCV RNA复制的脊椎动物细胞。据信,在此描述的用于制备细胞和细胞系的方法可适用于能支持适应性或非适应性HCV RNA复制的任意细胞类型。这样的细胞可包括,例如,肝细胞、T-细胞、B-细胞、或包皮成纤维细胞,并且可以是哺乳动物细胞,或更具体的人细胞。特别有用的细胞型是肝细胞。例如,表明Huh-7细胞可支持HCV RNA复制。
在此证实,经治愈的Huh-7亚系允许HCV RNA复制。对含有高适应性的NS5A S2204I突变的复制子,至少30%的Huh-7.5细胞被转导为G418抗性。通过FACS,类似的分数比例对NS3抗原为阳性。类似地,对于缺少neo的SG复制子(图1),初始效率可达到至少50%。来自更敏感的FACS分析的数据(数据未显示)表明:转染过程幸存细胞的>75%包容HCV RNA。通过以IFN治愈含有复制子的细胞克隆可获得这些允许细胞。
其他实施方式包括HCV复制的允许细胞和细胞系的制备方法。所述的方法包括治愈受感染的细胞,并随后分析亚系来确定特定亚系支持HCV复制的频率。然后鉴定特别允许性的亚系。可以任何方式治愈受感染的细胞。尽管任何可利用的有效的处理方式都落在本发明范围之内,然后例如借助α-干扰素的治愈是有效治愈HCV侵染细胞的方式,
从G418筛选的包容复制子的克隆中可获得最高的允许亚系(Huh-7.5和Huh-7.8),所述复制子在NS3-5B区域(群体序列水平)未发生适应性改变。这些细胞代表原始Huh-7亲本系的亚群体,其对未改变的复制子的复制是允许性,以及对具有适应性突变的复制子是更加允许性的。对含有复制子的其他细胞系进行治愈,不一定生成对所测试的复制子是更加允许性的细胞群体。例如,对含有SG-Neo(S2204I)复制子的Huh-7群体进行治愈,可生成SG-Neo(S2204I)支持能力未改变的细胞底物,但对SG-Neo(5AΔ47)(图2)的启动效率更低(23倍)。
不需G418筛选的转染后直接研究HCV复制的能力允许检测缺失neo的亚基因组复制子的复制以及全长HCV基因组RNA。通过在核心蛋白质前12位氨基酸和NS3{SG-5′Ub-NS3(S2204I);图2}之间融合符合读码框的细胞泛素,来构建单顺反子复制子的最初尝试是失败的。而以泛素融合到NS3-5B的双顺反子衍生物是可行的,表明SG-5′Ub-NS3(S2204I)复制失败不归因于泛素/NS3接点加工的缺陷(数据未显示)。而是因为,在HCV 5’NTR附近融合泛素编码序列可干涉翻译,因为通过破坏位于HCV5′NTR的RNA元件或其互补元件,而形成有害的RNA二级结构或RNA复制物。将HCV5′NTR融合到EMCVIRES,生成比SG-Neo(S2204I)复制更好的亚基因组复制子(图3)。还不知道为什么来自双顺反子SG-Neo(S2204I)的第一顺反子(编码C-Neo融合的序列)的缺失可促进复制,但可能是起因于:由于废除了40S核糖体亚基与通常的HCV翻译起始位点的结合而促进复制酶翻译,并减少了在EMCV和HCV IRES元件之间的竞争(J.Marcotrigiano和C.M.Rice,结果未公开)。
观察到含有NS5A S2204I适应性变化的全长构建体的复制的相似图(图4)。在Huh-7.5细胞中,含有C-Neo顺反子{FL-Neo(S2204I);图1}的双顺反子结构起始复制的效率低于HCV 5′NTR融合于EMCVIRES{FL-5′HE(S2204I);图1}的RNA的效率。具有未修饰的HCV基因组(除了在NS5A中的S2204I替换)的FL构建体,与通过EMCV IRES介导翻译的RNA比较,起始复制的情况更好(图4),这表明在Huh-7.5细胞中EMCV IRES驱使的翻译对HCV复制不必须,因此可用于非修饰HCV基因组RNA的研究。后一点确实影响到HCV RNA被包装入传染性颗粒中的能力。然而,在已有的(K.J.Blight和c.M.Rice,结果未公开)和近来的报道中(Pietschmann,T.等,J.Virol.76:4008-4021,2002年),未在Huh-7细胞中观察到这些未修饰的FL RNA的选择性包装。与相应的适应性亚基因组复制子比较,全长HCV RNA建立复制的效率较低,这表明添加了结构性NS2-编码区可抑制HCV复制引发。其归因于编码蛋白质或是位于该区域的RNA元件(或二者)(31),目前是不清楚的。我们观察到含有SS2204I的FL和FL-Neo RNA的HCV复制水平(根据HCV蛋白质和RNA水平来测量),而非亚基因组复制子,取决于可消弱全长RNA在非同步转染的细胞群体中进行复制的能力的细胞周期(Balfe等,已提交)。
在进一步促进细胞培养中HCV复制的尝试中,检验了NS5A第2204位的其他氨基酸替换的效果。已观察到Ile和Val替换的有效亚基因组RNA复制,及较小程度效率的Ala在2204位的替换(图5)。Val或Ile是小分子、β-支链、非极性残基,尽管Ala有类似性质却是非β-支链。与此相反,在第2204位的例如Tyr、Glu、Thr、Ser或Asp等极性残基,严重地消弱了HCV复制(图5),这提示在该位点复制偏好非极性残基。值得指出的是:对于基因型1b分离物,在第2204位天然为(Lohmann,V等,科学,285:110-113,1999年),而在其他HCV基因型中Ser是保守性的(Tanji,Y.等,J.Virol.69:3980-3986,1995年),表明该残基对于HCV复制和/或体内发病都很重要。
联合NS5A适应性突变而生成受损的(A2199T+S2204I)或在Huh-7.5细胞中不能复制的复制子(S2197P+A2199T+S2204I)(图6)。以前有人描述了在HCV NS编码区中的其他地方的适应性突变的非兼容性(Lohmann,V.等,J.Virol.75:1437-1449)。例如,将NS5B中的适应性突变(R2884G)与NS4B(P1936S)或NS5A(E2163G)进行复合,可大大降低G418-抗性克隆形成的效率。另一方面,将某些NS3和NS5A的适应性突变复合,能提高复制效率(Krieger,N.等,J.Virol.75:4614-4624,2001年)。然而,尽管观察到NS3中的突变E1202G和T1280I与NS5A中的S2197P以协同方式作用而提高复制效率(Krieger等,2001年,及K.J.Blight和C.M.Rice,结果未公开),但在我们的系统中将这些NS3改变构建进SG-5′HE(S2204I)并不能促进复制(图7)。这些结果再次强调用不同的Hhu-7细胞环境优化适应性突变的经验性本质。
磷酸化NS5A在分歧的HCV基因型中是保守的(Reed,K.E.等,病毒学,71:7187-7197,1997年),这提示其在病毒生活周期中发挥重要作用。我们曾经揭示NS5A高磷酸化对HCV复制并非必须(Blight,K.J.等,科学,290:1972-1974,2000年)。在近来鉴定S2194为亚型1b的主要磷酸受体部位之后(Katze,M.G.等,J.Virol.278:501-513),在此位点替换Ala或Asp,并在S2204I适应性突变的背景下检测HCV复制的效果。考虑到复合了NS5A突变而观察到的非兼容性,还是不能评估不同突变体的绝对复制效率,但是回收的复制RNA在2194位点包容这些替换。这些结果显示对于该亚型1b分离物的复制,在S2194的磷酸化作用不是绝对需要的。
在以下实施例中描述了本发明的多种实施方式。应当理解,这些实施例仅仅用来示例发明,而非限制其范围。
实施例
实施例1:细胞培养和干扰素处理
将单层Huh-7细胞在补充了10%热失活的胎牛血清(FBS)和0.1mM非必需氨基酸(DMEM-10%FBS)的Dulbecco’s改良最低必需培养基(DMEM)中进行增殖。对于支持亚基因组复制子的细胞,在培养基中添加750ug/ml的G418(遗传霉素;Gibco-BRL)。在G418不存在时,通过初始传代细胞二次将含有复制子的Huh-7细胞的HCV RNA治除。第三代细胞则用100IU/ml的人白细胞起源的IFN(Sigma-Aldrich)培养。3至4天后,将汇合的单层细胞用胰蛋白酶处理,并在铺平板和培养24小时后添加IFN。在IFN的存在下将细胞传代共四次,并在第四次传代前先让细胞在没有IFN的存在下生长3天。在早期传代水平扩增治愈的细胞系,并低温保存。使用从这批低温保存的种子部分至少已传代20-30次的细胞来实施进一步的实验。
实施例2:构建质粒
使用标准重组DNA技术来构建和纯化所有的质粒。通过用Klen TaqLA DNA聚合酶(由Wayne Barnes惠赠,华盛顿大学,圣路易斯)进行引发的DNA合成,通过自动核酸测序仪确定由PCR扩增的区域。体外转录的质粒DNA由大规模的细菌培养制备,并通过氯化铯梯度离心得到纯化。
所有核苷酸(nt)和氨基酸数涉及从核心编码区开始的、位于基因型lb Conl全长HCV基因组(Genbank登录号no.AJ238799)中的位置。如前所述(5),在步进式PCR试验中该序列由化学合成的DNA寡核苷酸装配而成。简要地说,将10-12凝胶纯化的寡核苷酸(长度60-80nt)和16nt的单一互补重叠区用于合成跨越600-750碱基的cDNA。纯化PCR终产物,并用适宜的限制性酶酶解,将其连接到相同酶切的pGEM3Zf(+)质粒载体(Promega)。对多个重组克隆进行测序,将鉴定正确的克隆和重叠cDNA片段组装入连续的基因组序列中:5′NTRC-E1-E2-p7-NS2-3-4A-4B-5A-5B-3′NTR(pHCVBMFL)。(5)分别描述了(图1)可选择的复制子、pHCVreplbBartMan/AvaII{SG-Neo(wt);图1}及其衍生物,pHCV rep Ib/BBVII{SG-Neo(S2204I)}和pHCVreplb{SG-Neo(5AΔ47)},含有NS5A适应性突变物、SS2204I和在nt6960至7102间的47个氨基酸(Δ47aa)符合读码框的缺失。质粒pHCVBMFL/S2204I{FL(S2204I)图1}含有全长基因组和NS5A的适应性改变S2204I。对于基因组和亚基因组构建物,将活性部位中的Gly-Asp-Asp(GDD)基元转换成Ala-Ala-Gly(AAG)(5),从而生成携带三联氨基酸替换的NS5B聚合酶缺陷的衍生物,其贯穿全文并称为pol-。
含有泛素而neo基因及EMCV IRES的质粒pC-Ubi-NS3/HCVrepBBVII{SG-5′Ub-NS3(S2204I);图1}按下列各项进行构建。通过引物1289和引物1290(表1)从pHCVrep12/Neo(Blight等,结果未公开)中扩增得到的AscI-SacI酶解的PCR片段,通过引物对1291/1292(表1)及pHCVreplb/BBVII扩增得到的第二条PCR片段的SacI-BsrGI部分的,与来自HCVreplb/BBVII的XhaI-AscI酶解片段连接到HCVreplb/BBVII的XbaI和BsrGI位点之间。为了切除pHCVreplb/BBVII上的neo基因,将所合成的重叠区寡核苷酸1287和1288(表1)杂交并延长直至构成在5′NTR和EMCV IRES之间的连接。用ApaLI和AclI酶切该产物,并连同与来自pHCVreplb/BBVII的XhaI-ApaLI和AclI-EcoRI片段一起插入XbaI-EcoRI酶切的pHCVreplb/BBVII中。将该构建体命名为p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII{SG-5′HE(S2204I);图1}。为了用NS5AΔ47置换S2204I,将来自pHCVreplb/BBI的EcoRI-XhoI片段连接到类似切割的p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII,并生成p5′NTR-EMCV/HCVrepBBI{SG-5′HE(5AΔ47);图1}。
将来自于p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII的XbaI-HindIII片段、和由引物1293及1294从p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII中扩增得到的PCR产物的HindIII-AatII片段、以及来自于pHCVBMFL/S2204I的AatII-NotI片段一起连入预先用Xbal和NotI酶切过的pHCVBMFL/S2204I中,即构建成质粒p5′NTR-EMCV/HCVFLBM(S2204I){FL-5′HE(S2204I);图1}。通过将来自于pHCVreplb/BBVII的XbaI-HindIII片段、和来自于p5′NTR-EMCV/HCVBMFL(S2204I)的HindIII-EcoRI的酶切片段,连入pHCVreplb/BBVII的XbaI和EcoRI位点之间,即构建成可选择的双顺反子全长HCV克隆pHCVBMFL(S2204I)/Neo{FL-Neo(S2204I);图1}。
为获得在2204位点有突变的质粒,以及将单A2199T或双S2197P/A2199T突变导入p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII,先以p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII作为模板,用反向引物1030和一条以下的突变的正向引物进行第一次PCR:1319(S2204V)、1320(S2204A)、1322(S2204Y)、1324(S2204E)、1325(S2204T)、1184(S2204D)、1326(A2199T+S2204I)和1327(S2197P+A2199T+S2204I)(表1)。BlpI和XhoI酶解PCR-扩增产物,并将其克隆入p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII中的这些位点。将来自pHCVreplbBartMan/AvaII的EcoRI-XhoI片段插入已相似切割的p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII中,即构建获得S2204。
为将突变Q1112R构建入p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII,以获得p5′NTR-EMCV/HCVrepCloneA(Q1112R+S2204I),使用突变引物1358和寡核苷酸885(表1)从p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII PCR扩增获得NS3的nt 3640-3991。用BsrGI和EagI酶切所得的产物,并将之与来自p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII的EagI-EcoRI和BsrGI-EcoRI片段在连接反应混合液中联队合。通过多步克隆步骤构建NS3中的双突变(E1202G+T1280I)。首先,用正向引物1359和反向引物1356(表1)从p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII扩增得到PCR片段,并用ApaLI和XbaI酶切该片段,然后与来自pGEM3Zf(+)/HCVlbnt1796-2524的EcoRI-ApaLI片段(其含有NS3中nt 3420-4124(K.J.Blight和C.M.Rice,结果未公开))一起克隆入EcoRI-XbaI酶切过的pGEM3Zf(+),生成中间质粒pGEM3Zf(+)/HCVlbnt1796-2524NS3*。其次,在四部分克隆策略中,从pGEM3Zf(+)/HCVlbnt1796-2524NS3*切出的BsrCI-BsaAI片段,与来自p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII的BsaAI-BssHII和BssHII-EcoRI片段一起,插入用BsrGI和EcoRI酶切过的p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII中。将所得的质粒命名为p5′NTR-EMCV/HCVrepBBVII+NS3*(E1202G+T1280I+S2204I)。
通过使用引物对5′Ala/1030和5′Asp/1030(表1),分别PCR扩增来自pHCVreplb/BBVII的NS5A中的nt 6897-7186而将突变S2194A和S2194D导入。通过用BlpI-Xhol酶切的PCR产物替换对应的BlpI-XhoI部分,将这些突变物联合插入pHCVreplb/BBVII中。
实施例3:RNA转录
用ScaI使含有全长和亚基因组HCV序列的质粒DNA线性化,并用BamHI酶切脊髓灰质炎病毒亚基因组复制子。苯酚∶氯仿(1∶1)抽提线性DNA,并用乙醇沉淀.用80%乙醇洗涤沉淀的DNA,并重悬于10mMTris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA(pH8.0)。在含有40mMTris-HCl(pH7.9)、10mMNaCl、12mM MgCl2、2mM亚精胺、10mM二硫苏糖醇(DTT)、3mM的各种三磷酸核苷、0.025U的无机焦磷酸酶(Roche AppliedScience)、100U的RNasin(Promega)、100U的T7 RNA聚合酶(Epicentre Technologies)、以及2ug的线性DNA的100ul反应混合物中,于37℃反应90分钟以合成RNA转录产物。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提RNA,乙醇沉淀,在重悬于双蒸水之前先用80%乙醇洗涤RNA。在含有10U的DNas I(Roche Applied Science)的33mM Tris-HCl(pH7.8)、66mM KCl、10mM MgCl2和5mM DTT的溶液中,37℃下、经过三次连续的20分钟DNase消化去除DNA模板。用苯酚-氯仿(1∶1)抽提DNase消化过的RNA,乙醇沉淀之,在重悬于双蒸水之前先用80%乙醇洗涤RNA。通过测量260nm的吸收度确定RNA浓度,以及通过1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来确定RNA的完整性和浓度。
实施例4:转染培养的细胞
通过电穿孔法将体外转录的RNA转入Huh-7细胞及IFN-治愈的细胞。简要地说,通过胰蛋白酶处理来分离未汇合的Huh-7细胞,离心收集(500×g,5分钟),在冰冷的无RNase磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤三次,以1.25×107细胞/ml重悬于PBS中。在2mm的缺口小杯(BTX)中,将RNA转录产物(1ug)与0.4ml洗涤过的Huh-7细胞混合,并立即使用BTX ElectroSquarePorator进行脉冲(0.92kV,脉冲长度99微秒,5脉冲)。将脉冲后的细胞置于室温(RT)恢复10分钟,然后稀释在10ml DMEM-10%PBS中。
将细胞铺平板于:(i)直径35mm孔中以计数HCV RNA和进行代谢标记实验;(ii)八孔腔玻片(Becton Dickinson)进行免疫荧光研究,或;(iii)直径100mm培养皿中进行荧光激活细胞分类术(FACS)分析和G418选择。为确定G418抗性克隆的形成效率,将转染的细胞以多重密度(在1×103和2×105细胞之间)和被pol-RNA转录物转染的细胞一起铺平板,使得细胞总数保持每个直径100mm的培养皿中有2×105细胞。铺平板后48小时,以补充了1mg/ml的G418D的DMEM-10%FBS替换培养基。三周后,用7%甲醛固定G418抗性区,并用在50%乙醇中的1%结晶紫溶液染色,以便计数克隆。基于G418选择的克隆数相对于电穿孔后铺平板的Huh-7细胞数来计算G418的转导效率。
通过将表达绿色荧光蛋白(GFP;A.A.Kolykhalov和C.M.Rice,结果未公开)的脊髓灰质炎病毒亚基因组复制子进行平行电穿孔,以监测各系列RNA的转染效率。在转染后的12-16小时,使用荧光倒置显微镜,观察转染细胞的脊髓灰质炎病毒复制子诱导的细胞病理效应和GFP的可视化表达。24小时后,将存活的贴壁细胞(大概是未受脊髓灰质炎病毒复制子转染)胰蛋白酶化,用锥虫蓝混合并计数活细胞,从而确定电穿孔的细胞百分率。
实施例5:病毒RNA分析
使用TRIzoL试剂(Gibco-BRL)根据产品说明分离细胞总RNA。使用ABI PRISM 7700 Sequence Detector(Applied Biosystems),将每个RNA样品的十分之一用于量化HCV特异的RNA水平。使用TaqManEZ RT-PCR核心试剂盒(Applied Biosystems)和对HCV 5′NTR特异的引物进行实时反向转录(RT)-PCR扩增,其中:5′-CCTCTAGAGCCATAGTGGTCT-3′(正义,50uM)、5′CCAAATCTCCAGGCATTGAGC-3′(反义,50uM)以及FAM-CACCGGAATTGCCAGGACGACCGG(探针,10uM;AppliedBiosystems)。60℃温育RT反应物30分钟,继之以95℃7分钟,使得逆转录酶失活而同时Taq聚合酶活化。PCR进行40循环,循环条件为95℃15秒及60℃1分钟。已知浓度的合成HCV RNA标准物包含于各组反应中,并用于计算标准曲线。使用SDSv1.6.3软件(AppliedBiosystems)分析实时PCR信号。
实施例6:FACS分析
通过凡尔生/EDTA处理从直径100mm培养皿中将转染的单层细胞取出,以及将细胞通过16号针和74um孔膜以制备单细胞悬浮液:重悬浮细胞为2×106细胞/毫升,并加入等体积的4%多聚甲醛,室温温育20分钟。用PBS两次洗涤固定的细胞,并用0.1%的皂角苷/PBS重悬所得细胞沉淀为2×106细胞/毫升。室温温育20分钟后,用HCV特异性单克隆抗体(mAbs;核心蛋白(C750)、NS3(1B6)和NS5B(12B7);所有均由Darius Moradpour惠赠,弗赖堡大学,弗赖堡,德国)染色细胞(室温1小时),所述抗体在3%FBS/0.1%皂角苷/PBS溶液中将其稀释至10ug/ml。用0.1%皂角苷/PBS溶液洗涤细胞三次,然后使其与偶联Alexa 488(分子探针)的抗-鼠IgG(在3%FBS/0.1%皂角苷/PBS溶液中1∶1000稀释的)共同温育1小时来检测结合mAb,用0.1%皂角苷/PBS溶液洗涤染色的细胞三次,并重悬于FACS流式缓冲液(BDBiosciences)中,并立即用FACS Calibur(BD Biosciences)进行分析。
实施例7:间接免疫荧光法
将电穿孔的Huh-7.5细胞接种于八孔腔玻片上,并用PBS洗涤,以及用4%多聚甲醛室温固定20分钟。PBS洗涤细胞两次,通过和0.1%皂角苷/PBS溶液室温温育20分钟来渗透细胞,以及用3%山羊血清室温封闭20分钟。将NS5B mAb(12B7)在0.1%皂角苷/3%山羊血清/PBS溶液中稀释至10ug/ml,并室温温育1小时,继之以用0.1%皂角苷/PBS溶液洗涤三次。通过与偶联Alexa 488的抗-鼠IgG在0.1%皂角苷/3%山羊血清/PBS溶液1∶1000的稀释物并共同温育1小时来检测结合的mAb。PBS中,将细胞核与10ug/ml的Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)室温染色20分钟。未结合的荧光物缀合物通过用0.1%皂角苷/PBS溶液洗涤三次而除去,细胞上至Vectashield(VectorLaboratories),并用荧光显微镜观察。
实施例8:蛋白质的代谢标记和免疫沉淀反应
将直径35mm孔中的单层细胞在蛋氨酸-半胱氨酸缺乏的MEM中温育0.5-10小时,其中MEM含有1/40th的标准浓度的蛋氨酸、5%的透析的FBS和表达35S-蛋白质标记混合物(140uCi/ml;NEN)。用冷PBS洗涤标记的细胞一次,并在200ul磷酸钠(SDS)裂解缓冲液(0.1M磷酸钠(pH7.0),1%SDS,1x完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche AppliedScience),80ug苯甲基磺酰氟(PMSF)/ml)中收集细胞,以及由重复通过27.5号针来剪切细胞DNA。75℃将等量的蛋白质溶解液(50ul)加热10分钟,然后先离心澄清溶液,再与200ul的TNA溶液(50mMTris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.67%牛血清白蛋白、1mM EDTA、0.33%Triton X-100、80ug的PMSF/ml)混合。加入1ul HCV阳性患者血清(JHF),通过4℃过夜振荡温育形成免疫复合物。加入50ul预洗涤过的Pansorbin cells(Calbiochem)来收集免疫复合物,并将其于4℃振荡温育1-2小时。离心收集免疫沉淀物,在TNAS(TNA含有0.125%SDS)中洗涤三次,以及用TNE(50mM Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl,1mM EDTA,80ug的PMSF/毫升)洗涤一次,在蛋白质样品缓冲液中80℃加热20分钟溶解,并通过SDS-10%聚丙烯酰胺凝胶分离。通过荧光摄相观察代谢标记的蛋白质。
实施例9:HCV复制的允许细胞系
将来自于22个G418抗性克隆(Blight,K.J.2000)的克隆Huh-7.5和Huh-7.8(其容纳有HCV NS区未有氨基酸变化的SG-Neo亚基因组复制子)以及含有在NS5A第2204位Ser突变为Ile的复制子的克隆Huh-7.4治愈。用含有NS5A中的S2204I{SG-Neo(S2204I);图1}或47个氨基酸的NS5A缺失{SG-Neo(5AΔ47);图1}的亚基因组复制子转染后,将通过G418筛选得到的非克隆群体系Huh-7/S2204I和Huh-7/5AΔ47(Blight,K.J.2000)用IFN治愈。为了排除单独的IFN处理改变Huh-7细胞支持HCV复制能力的可能性,平行地用IFN处理亲本Huh-7细胞。IFN处理之后由检测限是~10分子的HCV RNA(Kolykhalov,A.A.,J.Virol.,70:3363-3371)的嵌套式RT-PCR和对G418的敏感性来显示细胞无HCV RNA。
为检测IFN治愈的细胞系支持HCV复制的能力,分别使用三个G418-可筛选的复制子(Blight,K.J.2000年):SG-Neo(S2204I)、SG-Neo(5AΔ47)和SG-Neo(wt)(图1),所述复制子具有在亲本Huh-7细胞中10%、0.2%和0.0005%的G418-转导效率。将体外合成的RNA电穿孔进入IFN治愈的细胞,48小时后实施G418筛选,并在固定和染色后计数所得的克隆。基于G418选择的克隆数相对于电穿孔后铺平板的Huh-7细胞数,来计算转导效率。支持SG-Neo(S2204I)复制的Huh-7.5细胞频率比亲本Huh-7细胞高出3倍(图2)。对于细胞系Huh-7.5和Huh-7.8,SG-Neo(5AΔ47)转染后获得的G418-抗性克隆数显著地高于亲本Huh-7细胞(分别提高了33倍和9倍;图2)。Huh-7.4的结果也相同,尽管形成克隆的增加频率没有那么高(3倍,图2)。在Huh-7.5、Huh-7.8和Huh-7.4细胞中,SG-Neo(wt)复制子也表现了增强的复制能力(分别提高了10倍、2倍和2倍;图2)。
通过用最初存在于群体系中的适应的复制子RNA转染后,两个治愈的细胞群体,Huh-7/5AΔ47和Huh-7/S2204I,显示出类似的或适度的G418转导的增长效率(图2)。当Huh-7/5AΔ47细胞用SG-Neo(5AΔ47)电穿孔时,G418-抗性克隆率提高2.5倍,而用SG-Neo(S2204I)转染导致略微降低了G418转导效率。然而,用SG-Neo(5AΔ47)转染Huh-7/S2204I细胞后,观测到形成的克隆减少了23倍(图2)。已注意到在亲本Huh-7细胞和IFN-治愈的Huh-7细胞之间,G418-抗性克隆形成没有显著的差异(数据未显示),表明IFN-介导的治愈方法对这些细胞支持HCV复制能力的影响不稳定。当平行转染聚合酶缺陷型复制子RNA,pol-时,未观察到G418-抗性克隆(数据未显示)。因此,在治愈的克隆系中较高频率的细胞,特别是那些原来就支持无适应性突变的RNA复制的细胞(Huh-7.5和Huh-7.8),对HCV复制是允许性。实施例10:在非筛选的Huh-7.5和Huh-7细胞中的HCV复制。
由于在所检测的细胞系中治愈的Huh-7.5细胞系是最允许性的,与亲本Huh-7细胞相比,我们使用一些不同方法来检测该亚系中的HCV复制。我们集中于瞬时分析,其不需要G418筛选而允许评估转染后早期HCV复制。用SG-Neo(S2204I)和SG-Neo(5AΔ47)RNA(图1)转染后96小时,从Huh-7.5和受IFN治愈的Huh-7细胞中提取总RNA,并通过RT-PCR确定HCV RNA的水平。将复制缺陷型复制子,pol-,进行平行转染,以辨别输入RNA和生产性复制生成的RNA。如图3所示,在受转染的Huh-7.5细胞中,相对于pol-对照的HCV RNA水平一直都更高。与在Huh-7细胞中仅仅提高85倍和6倍相比(图3,第10至11行),用SG-Neo(S2204I)和SG-Neo(5AΔ47)RNA进行的转染,在Huh-7.5细胞中分别提高了410倍和28倍(图3,第4至5行)。由于这些提高是通过与复制缺陷型pol-对照比较而进行测定的,因此它们反映了新合成的RNA的累积和输入RNA的降解。在Huh-7.5和Huh-7细胞中,各个时间点pol-RNA的剩余水平下降了约10倍。在Huh-7.5细胞中,RNA具有良好复制能力{如SG-Neo(S2204I)},其趋向于随时间积累以致于96小时后观察到RNA积累提高了约10倍。具有较低复制能力的那些{如SG-Neo(5AΔ47)}保持不变或轻微下降,但从不达到pol-对照的水平。对于Huh-7细胞,情况稍稍不同。例如,SG-Neo(S2204I)RNA保持相对不变,然而SG-Neo(5AΔ47)RNA随时间而减少,但还是没有达到pol-对照的程度。
这种发现由通过FACS分析测定的NS3阳性细胞的频率而得到反映。相比于Huh-7细胞{SG-Neo(S2204I)为3%,SG-Neo(5AΔ47)和pol-RNAs无法检测;图3,第7、10和11泳道},在Huh-7.5细胞中NS3阳性细胞百分率一直更高{SG-Neo(S2204I)为21%,且SG-Neo(5AΔ47)为5%;图3,第4至5泳道}。这些结果证实了我们的早期结论:更大部分的Huh-7.5细胞支持可检测水平的HCV复制。相比于G418转导效率,由FACS定量的HCV抗原-阳性细胞的较低频率可归因于随不同HCV特异抗体而变化(观察结果未公开)FACS分析以灵敏性。
转染后96小时,通过代谢标记细胞检测HCV蛋白质的积累。用35S-甲硫氨酸和-半胱氨酸将单层细胞标记10小时,继之以进行SDS介导的裂解和使用可识别NS3、NS4B和NS5A的HCV阳性患者血清(JHF)进行HCV蛋白质的免疫沉淀(Grakoui,A.等,J.Virol.,67:1385-1395)。通过SDS-PAGE分离所标记的蛋白质后,仅仅在SG-Neo(S2204I)转染的Huh-7.5细胞中观察到NS3、NS4B和NS5A(图3,第4泳道)。在用SG-Neo(5AΔ47)、pol-转染的Huh-7.5和Huh-7细胞中,或SG-Neo(S2204I)RNA电穿孔的Huh-7细胞中,从未检测到HCV蛋白质(图3,第1、5、7、10和11泳道)。在放射菌素D的存在下HCV RNA代谢标记后也获得类似的结果(数据未显示)。这些分析表明:使用Huh-7.5细胞由RNA积累、FACS分析和病毒蛋白质的代谢标记快速分析HCV复制的优势。
实施例11:亚基因组和基因组HCV RNA的复制效率
无需筛选而的测控HCV复制的能力可排除双顺反子复制子的需要,以及允许具有最小异源元件的构建体得到检验。将亚基因组复制子构建成其中HCV 5’NTR及12个氨基酸的核心与泛素融合,随后是NS3-5B编码区(包括NS 5A中的S2204I适应性突变)和3′NTR{SG-5′Ub-NS3(S2204I);图1}。在这种聚合蛋白质中,细胞内的泛素羧基末端水解酶将酶切泛素/NS3连接点,生成有真实的N-末端Ala残基(2,21)的NS3。将体外合成的RNA电穿孔入Huh-7.5和Huh-7细胞,96小时后并通过RT-PCR量化HCV RNA的水平。令人惊讶地,HCVRNA水平与pol-对照没有区别(数据未显示),表明SG-5′Ub-NS3(S2204I)RNA不能复制。可能是泛素干扰了功能性NS3蛋白的生成。然而,双顺反子衍生物,其中泛素/NS3-5B的表达受EMCVIRES的控制,其复制效率与SG-Neo(S2204I)RNA的相同(数据未显示),这提示HCV IRES驱使的翻译对存在于核心蛋白-泛素编码序列的RNA元件敏感。
缺少neo但保留EMCV IRES(SG-5′HE衍生物;图1)的复制子也得到检测。转染后96小时参比pol-对照测量SG-5′HE(S2204I)和SG-5′HE(5AΔ47)RNA水平,发现其高于可选择版本在Huh-7.5和Huh-7细胞中的水平(图3)。而且,在Huh-7.5细胞中SG-5′HE(S2204I)和SG-5′HE(5AΔ47)RNA的水平显著高于Huh-7细胞的水平(图3,第2-3泳道,第8-9泳道)。在SG-5′HE(S2204I)RNA转染后,大约52%的Huh-7.5细胞对NS3抗原染色为阳性,相比于SG-Neo(S2204I)RNA转染的染色结果为21%(图3,第2泳道和第4泳道)。类似地,在用SG-5′HE(5AΔ47)电穿孔后高频率的Huh-7.5细胞表达了NS3,相比于用SG-Neo(5AΔ47)(11%相对5%;图3,第3泳道和第5泳道)。正如所料,对于受转染的Huh-7细胞,观察到低频率的NS3-阳性细胞。来自Huh-7.5细胞和Huh-7细胞的35S-标记的HCV蛋白质的免疫沉淀相对数量平行于NS3-阳性细胞频率和HCV RNA的相对水平。这些数据表明缺少neo基因的复制子开始RNA复制的效率更高。这些构建体,与高允许性Huh-7.5亚系一起,都是遗传研究HCV RNA复制有用的工具,其中一些在后文中得到叙述。
本发明也评价了支持含有NS5A中的S220 4I{FL(S2204I);图1}的全长HCV RNA复制的Huh-7.5细胞。在Huh-7.5和Huh-7细胞转染后的96小时,如上述测定HCV RNA和蛋白质的相对水平。在Huh-7.5细胞转染后,观察到HCV RNA复制相对于pol-提高了50倍,与之相比在Huh-7细胞中仅仅提高3倍(图3,第6和第12泳道)。类似地,在FL RNA转染的Huh-7细胞中,FACS分析和代谢标记蛋白的免疫沉淀无法检测出所表达的HCV抗原,然而可分别检测出14%和10%的Huh-7细胞表达的核心蛋白和NS3抗原,以及35S-标记的NS3(图3,第6泳道和第12泳道)。核心蛋白-抗原阳性细胞的频率始终高于NS3的结果,也许反映抗体亲合性的差异。全长HCV RNA在Huh-7.5细胞中建立复制的能力,表明复制不依赖于EMCV IRES-驱动的HCV编码的复制酶元件的翻译。事实上,HCV 5′NTR的下游包含EMCVIRES{FL-5′HE(S2204I);图1}或创建添加了neo基因的双顺反子构建体{FL-Neo(S2204I);图1},消弱了相对于FL(2204I)RNA(图4)的复制。值得指出的是:相对于缺少结构性NS 2编码区的亚基因组复制子{SG-5′HE(S2204I);图4},所有含有全部HCV编码序列的构建体(含S22041的FL,FL-5′HE和FL-Neo),建立复制的效率更低。这提示顺式RNA元件或在基因组该区域所编码的蛋白质可下调节系统中的HCV复制效率。但是,Huh-7.5细胞支持FL和FL-Neo RNA复制的能力提供了可用于颗粒组装步进研究和检查完整HCV蛋白质元件在宿主细胞生物学中的影响的系统。
实施例12:NS3和NS5A中的突变对HCV RNA复制的影响。
迄今为止,已鉴别出的最佳单突变是在NS5A的S2204I突变。为了检查在该位点Ile的重要性以及看看是否复制效率进一步提高,在该位点测试了许多其他氨基酸,并将这些复制子的复制效率与SG-5′HE(S2204I)或未修饰的亲本SG-5′HE(S2204)(图5)进行比较。通过将HCV RNA水平与SG-pol-对照相比,评价RNA转染的Huh-7.5细胞的复制能力。对于第2204位点含有Ile或Val的复制子,在第96小时观察到HCV RNA的相当水平,而与SG-5′HE(S2204I)相比,Ala替换导致HCV RNA下降3倍(图5)。与之相反,其余的氨基酸替换大大降低了HCV RNA的水平,至类似于未修饰的亲本复制子SG-5′HE(S2204)的水平(降低1400倍;图5)。正如所料,HCV RNA的相对水平在转染后24和48小时更低,然而在48小时该水平足以评价复制能力(图5)。尽管未发现此S2204I中观察到的更高促进亚基因组复制的替换,然而Val和Ala允许高效RNA复制。
我们研究了携带NS5A中的多个适应性突变的亚基因组复制子的复制效率。NS5A突变S2197P、A2199T和S2204I分别单独提高了G418抗性克隆形成约2,500倍、15,000倍和20,000倍(5)。构建携带S2204I与A2199T、或A2199T和S2197P一起的SG-5′HE复制子(图1),并通过RT-PCR测量Huh-7.5细胞中的HCV RNA水平。相比于SG-5′HE(S2204I),联合这些NS5A突变导致HCV RNA水平的降低,并且联合A2199T和S2204I时复制降低13倍和联合所有三种时复制可忽略(图6)。尽管观察到每个NS5A适应性突变都可单独促进复制,一旦联合时,便降低了亚基因组RNA的复制能力,提示这些联合是不相容的。
将在第1112位(Q至R)、第1202位(E至G)和第1280位(T至I)的NS3突变构建入SG-5′HE(S2204I)(图1),并通过测量HCV RNA水平、抗原阳性细胞频率以及通过在转染后笫96小时检测35S标记的蛋白质,来比较它们在Huh-7.5细胞中的复制。对于每个复制子,观察到相对于pol-RNA对照的等量水平的HCV RNA(图7A)。通过FACS(~30%;图7A)和免疫荧光(图7B)检测的NS5B阳性细胞的百分率也是相似的。然而,对于携带NS3突变(~73~87%;图7A)的复制子,NS3阳性细胞频率更高,这只不过反映NS3特异性抗体对这些NS3突变体的亲合力变化。最终,NS3、NS4B和NS5A的免疫沉淀水平是相当的(图7A)。经过还不能证实单独的Q1112R是适应性的,Krieger和合作者以前报道了E1202G和T1280I分别单独或一起提高复制效率~13倍、~6倍和~25倍(Krieger等,2001年)。当联合了NS5A中的S2204I时,这些NS3适应性突变不能进一步促进复制。
实施例13:S2194 NS5A磷酸化位点的突变形成
依然不清楚HCV复制中NS5A磷酸化的作用。以前,有人指出在具有NS5A中的不同适应性突变的复制子之间的NS5A磷酸化程度的差异(Blight等,2000年)。例如,具有S2197C、S2197P或S2204I的复制子,正如通过免疫沉淀的NS5A的一维SDS-JPAGE分离而评价的,其极少或不表达p58,提示NS5A超磷酸化不是HCV复制必需的。近来,亚型1b分离物的NS5A中的S2194被鉴定为p56磷酸化的最初位点(Katze等人,2000)。为评价需要NS5A S2194磷酸化的可能性,分别将SG-Neo(S2204I)(图1)中的该残基突变为Ala(S2194A+S2204I)或Asp(S2194D+S2204I),以分别消除或模拟磷酸化作用。Huh-7细胞中的这些复制子的G418转导效率显著地低于SG-Neo(S2204I)(低120倍和17倍;图8A)。为排除G418抗性位点是在该位点发生回复而生成的可能性,通过RT-PCR从细胞总RNA扩增NS 5A编码区并直接测序。在第2194位点,原始Ala和Asp替换得以确认(数据未显示)。为了使可能的第二位点补偿变化的影响最小化,在Huh-7.5细胞的RNA转染后的96小时,测量HCV RNA和蛋白质的表达。相对于pol-对照,S2194A+S2204I和S2194D+S2204I的HCV RNA水平比SG-Neo(S2204I)(图8B)低37倍和5倍,其与它们使Huh-7细胞获得G418抗性的能力降低一致。此外,在S2194A+S2204I中NS5B阳性细胞的频率明显低于在S2194D+S2204I中的(数据未显示),并且在用SG-Neo(S2204I)和S2194D+S2204I(图8B)转染过的Huh-7.5细胞中仅可检测到35S标记的NS3和NS4B。由于在瞬时转染的细胞中NS5A的表达水平低于检测极限(图8B,数据未显示),因此不可能直接研究从S2194A+S2204I和S2194D+S2204I表达的NS5A的磷酸化情况。尽管当S2194替换物与S2204I适应性突变的联合可能不相容时G418转导和复制效率的数量差异很难解释,这些数据仍显示S2194的磷酸化不是HCV复制绝对要求的。
附图标记
图1为本发明所用HCV RNA的示意图,显示了5’和3’NTR结构,以及具有所示的多聚蛋白质酶切产物的开放盒显示为ORF。图例显示核心蛋白编码区的前12位氨基酸(实框)、neo基因(Neo;阴影框)、EMCV IRES(EMCV;实线)和泛素(阴影线框)。图例显示NS5A适应性突变S2204I(*)和Δ47aa的位置;
图2表示对HCV复制高允许性的Huh-7细胞系的鉴定。将通过持续IFN处理而消除了自主复制的亚基因组RNA的Huh-7细胞用1ug亚基因组复制子、SG-Neo(S2204I)、SG-Neo(5AΔ47)和SG-Neo(wt)电穿孔。48小时后,将细胞进行G418筛选,固定所得的克隆并用结晶紫染色。左边所示的每个直径100mm培养皿所接种的转染细胞数说明代表性的平板。各个培养皿下的数值指该复制子的G418转导的计算效率。为确定G418转导效率,将连同用pol-复制子电穿孔的喂养细胞一起将转染细胞从5×105至103细胞/直径100mm培养皿进行连续滴定。在用初始铺平板的电穿孔细胞的数目除以克隆数之后,计数至少3种细胞密度所得的G418抗性位点,并以百分率的形式表示相关的G418转导效率。在两次独立的转染中得到类似的转导效率。将表达GFP(参见方法)的脊髓灰质炎病毒亚基因组复制子进行平行电穿孔。基于GFP阳性细胞片段和复制子诱导的致细胞病性,对~90%的细胞进行常规转染。NT=未测试。
图3表示在HCV RNA短暂转染的Huh-7.5和Huh-7细胞中,检测HCV蛋白质和RNA。顶部图,表示用亚基因组复制子、pol-(第1和7泳道),SG-5′HE(S2204I)(第2和8泳道)、SG-5′HE(5AΔ47)(第3和9泳道)、SG-Neo(S2204I)(第4和10泳道)、SG-Neo(5AΔ47)(第5和11泳道)和FL(S2204I)HCV RNA(第6和12泳道)转染的Huh-7.5和Huh-7细胞。转染后96小时,在35S-甲硫氨酸和-半胱氨酸的存在下将单层细胞温育10小时。裂解标记的细胞,并用HCV阳性人血清(JHF、抗-NS3、NS4B和NS5A)免疫沉淀,以及通过SDS-10%PAGE分离标记蛋白质。应该指出:在第6和12泳道装载两倍量的免疫沉淀样品(2×)。左边显示标准分子量(MW)的迁移率,右边显示NS3、NS4B、NS5A和5AΔ47的迁移。中间图表示:转染后96小时提取的细胞总RNA,以及按照材料和方法所述定量的HCV RNA水平。显示了相对于pol-缺陷复制子的HCV RNA的比例(HCV RNA/pol-)。在三个独立实验中比较HCV RNA相对pol-对照的水平。较低的两图表示:转染后96小时,用4%多聚甲醛固定细胞、0.1%皂角苷渗透,然后对HCV核心蛋白或NS3抗原染色,并通过FACS进行分析。相对于同型匹配的不相关的IgG,表达核心蛋白和NS3的细胞百分率,得到显示。值<1.5%被认为是阴性(-)。
图4表示在以全长HCV RNA转染Huh-7.5细胞后HCV RNA的积累。将1ug体外转录的RNA电穿孔入Huh-7.5细胞和在直径35mm孔中铺2×105细胞。在转染后24、48和96小时分离细胞总RNA,以及按照材料和方法所述定量HCV RNA水平。将HCV RNA与pol-缺陷型亚基因组RNA的比率(HCV RNA/pol)相对转染后的时间绘图,并且重复该实验时得到类似的结果。
图5表示HCV RNA复制中,在第2204位点的其他替换的效果。用1ug的携带所示氨基酸替换的SG-5′HE复制子转染Hun-7.5细胞并铺入直径35mm孔中2×105细胞。培养24、48和96小时后,提取细胞总RNA,并按照材料和方法所述定量HCV RNA水平。HCV RNA与pol-缺陷型亚基因组RNA比率(HCV RNA/pol-)相对转染后的时间绘图。在各条框上显示了HCV RNA较pol-的增长。该图中,HCV RNA相对pol-的水平是我们迄今为止所达到的最高水平。当这些RNA第二次转入Huh-7.5细胞时,可观察到HCV RNA积累的相同趋势。
图6表示在HCV RNA复制中联合NS5A适应性突变的效果。将亚基因组复制子转入Huh-7.5细胞,并如图5所述用定量HCV RNA水平。将HCV与pol-缺陷型亚基因组RNA的比率(HCV RNA/pol-)相对转染后的时间绘图且在各框上显示HCV RNA较pol-的增长。另外的转染实验获得与此处显示的相类似的HCVRNA/pol-比率。
图7表示在HCV RNA复制中联合NS3和NS5A突变的效果。通过在NS3中进一步突变,生成携带S2204I的、缺少neo的亚基因组复制子。(A)图片顶端,在RNA转染Huh-7.5细胞后96小时,用35S-蛋白标记混合物标记单层细胞,裂解细胞,并通过免疫沉淀法、SDS-10%PAGE和放射性自显影分析NS3、NS4A和NS5A。左边给出部分标准分子量,右边显示HCV特异性蛋白。图片中间,转染后96小时提取细胞总RNA,并按照材料和方法所述进行定量HCV RNA水平。HCV RNA与pol-阴性对照的比率得到显示(HCV RNA/pol-)。在两个独立实验中获得类似的比率。较低的两个图,转染后96小时,用4%多聚甲醛固定细胞,0.1%皂角苷渗透细胞,然后对HCV NS3或NS5B抗原染色,并通过FACS进行分析。相对于同型匹配的不相关的IgG,表达NS3和NS5B的细胞百分率得到显示。值<1.5%被认为是阴性(-)。(B)固定接种于八孔腔玻片的转染细胞,渗透细胞,并在培养96小时后通过免疫荧光法对NS5B染色。用Hoescht 33342对细胞核复染色,并通过荧光显微镜(×40放大率)观看染色细胞。
图8表示在HCV RNA复制中S2194A和S2194D突变的效果。在可选择的双顺反子复制子SG-Neo(S2204I)中用Ala或Asp取代S2194并体外转录RNA。(A)将RNA转录物转入Huh-7细胞并且将G418筛选的克隆固定并用结晶紫染色。各个培养皿下显示相对的G418转导效率。(B)转染后96小时,用35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸对Huh-7.5细胞标记10小时。裂解细胞,使用对NS3、NS4B和NS5A特异性的患者血清通过免疫沉淀法分离HCV蛋白质。HCV蛋白质和标准蛋白质分子量(千道尔顿)的位置得到显示。各道下面显示转染96小时后HCVRNA与pol-阴性对照的比率(HCVRNA/pol-)。表明的结果代表两个独立的转染。
由于可不背离本发明范围而对如此处所述的和图解说明的构建体和方法进行多种修饰,因此意味着含有以上说明书中记载的或在附图中显示的所有事物应该理解为用于说明而不是用于限制。因此,本发明的宽度和范围不应该限制于任一上述的示例性具体实施方式。
表1本研究所用的寡聚脱氧核苷酸
a在粗体处强调核苷酸改变,并且所得密码子有下划线b将用于cDNA克隆的限制性酶切位点进行下划线c寡核苷酸的极性表示为HCV基因组RNA正义(+)或其互补(-)
名称 | 序列 |
8851030118412871288 | (-)CCCTCTACAACCCCCCGAAACCTAGGGTGGCG(-)CCCTCTACA CTCCAGGGAATTTCCTCGAC(+)GACG GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGCATCTCCCCCCTCCTTGGCCAGCTCATCAGCT GACCAGCTGTCTGCGCCTTCC(+)AGACC GTGCACCAGACCACAACGGTTTCCCTCTACCGCCATCAATTCCG(-)CCAGT AACGTTAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGAATTGATCCCGCT |
12891290129112921293 | (+)CCAAAG GGCGCGCCATGCAGATCTTCGTGAAGACC 3’(-)AATAG GAGCTCCACCCCGGAGACGC(+)CCGTG GAGCTCCTATTACCGCCTACTCCCAAC(-)ATTGG TGTACATTTGGGTGATTGG(+)TCTGG AAGCTTCTTGAAGACA |
1294 | (-)GGCTT GACGTCCTGTGGGCGGCGGTTGGTGTTACGTTTGGTTTTTCTTTGAGGTPTAGGATTCGTGCfCATTATTATCGTGTTTTTCAAAGG |
1319 | (+)AGACG GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGGATCTCCCCCCTCCTTGGCCAGCTCATCAGCT GTACAGCTGTCTGCGCCTTCC |
1320 | (+)AGACG GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGGATCTCCCCCCTCCTTGGCCAGCTCATCAGCT GCCCAGCTGTCTGCGCCTTCC |
1322 | (+)AGACG GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGGATCTCCCCCCTCCTTGGCCAGCTCATCAGCT TACCAGCTGTCTGCGCCTTCC |
1324 | (+)AGACG GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGGATCTCCCCCCTCCTTGGCCAGCTCATCAGCT GAACAGCTGTCTGCGCCTTCC |
1325 | (+)AGACG GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGGATCTCCCCCCTCCTTGGCCAGCTCATCAGCT ACACAGCTGTCTGCGCCTTCC |
1326 | (+)AGACG GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGGATCTCCCCCCTCCTTG ACCAGCTCATCAGCT GAACAGCTGTCTGCGCCTTCC |
1327 | (+)AGACG GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGGATCTCCCCCC CCCTTG ACCAGCTCATCAGCT GAACAGCTGTCTGCGCCTTCC |
1356 | (-)CCGC TCTAGATACGTGATGGGGGCACCCGTGGTGATGGTCCTTACCCC GATTCTGATGTTAGGGTCGATAC |
1358 | (+)CCGA TGTACACCAATGTGGACCAGGACCTCGTCGGCTGG CGAGCGCCCCCCGGGGCGCGTTCC |
1359 | (+)CCGC GTGCACCCGAGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTCGAGTCTATG GGAACCACTATGCGGTCCCCGGTC |
5’Ala | (+)CACC GCTAAGCGTAGGCTGGCCAGGGGA GCACCCCCCTCCTTGGCCAGCTC |
5’Asp | (+)CACC GCTAAGCGTACGCTCCCCACCCGA GATCCCCCCTCCTTGCCCACCTC |
名称 | |
Claims (38)
1.丙型肝炎病毒(HCV)复制的允许性细胞系的生产方法,包括:
(a)培养用HCV感染的细胞;
(b)治愈(a)所述染感细胞的HCV;和
(c)鉴定(b)所述的治愈的细胞中的对HCV复制允许性的亚系。
2.权利要求1的方法,其中步骤(b)中所述的治愈包括用抗病毒剂处理(a)所述的感染的细胞。
3.权利要求2的方法,其中所述的抗病毒剂是抗病毒细胞因子。
4.权利要求3的方法,其中所述的抗病毒细胞因子是干扰素。
5.权利要求1的方法,其中(a)所述的细胞是脊椎动物细胞。
6.权利要求5的方法,其中所述的脊椎动物细胞是人细胞。
7.权利要求1的方法,其中(a)所述的细胞是肝细胞。
8.权利要求7的方法,其中所述的肝细胞是人肝细胞。
9.权利要求1的方法,其中(c)所述的亚系支持HCV复制的频率至少为30%。
10.HCV复制的允许性细胞系的生产方法,方法包括:
(a)提供包含复制性基因组或亚基因组HCV RNA的细胞系;
(b)治愈(a)所述细胞系的HCV RNA;和
(c)鉴定(b)所述的治愈的细胞系中对HCV复制允许性的亚系。
11.权利要求10的方法,其中步骤(b)所述的治愈包括用抗病毒剂处理。
12.权利要求11的方法,其中所述抗病毒剂是抗病毒细胞因子。
13.权利要求12的方法,其中所述的抗病毒细胞因子是干扰素。
14.权利要求10的方法,其中(a)所述的细胞系包含的复制性亚基因组HCV RNA不含适应性突变。
15.权利要求10的方法,其中(a)所述的细胞系包含的复制性亚基因组HCV RNA包含适应性突变。
16.对HCV复制允许性的细胞系,其中通过治愈受HCV感染的宿主细胞并且然后筛选对HCV复制允许性的治愈的亚系而生成所述的细胞系。
17.根据权利要求16的细胞系,其中所述的治愈包括用干扰素处理所述的宿主细胞系。
18.对HCV RNA复制允许性的细胞系,其中通过用干扰素治愈所述细胞系的HCV RNA。
19.HCV RNA复制的允许性细胞系的生产方法,该方法包括:
(a)用复制性HCV RNA转染宿主细胞;
(b)使所述的宿主细胞处于可治愈所述宿主细胞的HCV RNA的条件下;
(c)选择(b)中治愈的细胞群体;
(d)培育(c)中所选的治愈的细胞群体以生成对HCV RNA复制允许性的细胞系。
20.根据权利要求19的方法,其中步骤(a)所述的HCV RNA是亚基因组HCV RNA。
21.根据权利要求19的方法,其中步骤(b)包括用抗病毒剂处理所述的宿主细胞。
22.权利要求21的方法,其中所述的抗病毒剂是抗病毒细胞因子。
23.根据权利要求21的方法,其中所述的抗病毒细胞因子是干扰素。
24.权利要求21的方法,其中干扰素是干扰素-α。
25.根据权利要求19的方法,其中(d)所述的细胞系支持HCV RNA复制的频率在约10%和约75%之间。
26.根据权利要求25的方法,其中(d)所述的细胞系支持HCV RNA复制的频率在约10%和约30%之间。
27.根据权利要求25的方法,其中(d)所述的细胞系支持HCV RNA复制的频率至少为30%。
28.根据权利要求27的方法,其中(d)所述的细胞系支持HCV RNA复制的频率至少为50%。
29.根据权利要求19的方法,其中所述的宿主细胞是脊椎动物细胞。
30.根据权利要求29的方法,其中所述的宿主细胞是人细胞。
31.根据权利要求29的方法,其中所述的宿主细胞是肝细胞。
32.根据权利要求30的方法,其中所述的宿主细胞是人细胞。
33.通过权利要求19的方法生成的细胞系。
34.根据权利要求33的细胞系,其中所述的宿主细胞包含亚基因组HCV RNA。
35.根据权利要求34的细胞系,其中所述的亚基因组HCV RNA包含适应性突变。
36.权利要求35的细胞系,其中所述的适应性突变是S2204I,所述的位置通过与从核心蛋白编码区开始的基因型1b Con1全长序列HCV基因组(Genbank登录号:AJ238799)进行比对而得以确定。
37.通过权利要求1的方法生成的细胞系。
38.通过权利要求10的方法生成的细胞系。
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