MXPA05005092A - Lineas celulares altamente tolerantes para la replicacion del virus de hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere generalmente a celulas y lineas celulares que son tolerantes para la replicacion del virus de la hepatitis C (HCV), y metodos y materiales para elaborarlos y usarlos.

Description

LINEAS CELULARES ALTAMENTE TOLERANTES PARA LA REPLICACION DEL VIRUS DE HEPATITIS C DECLARACION RESPECTO A INVESTIGACION O DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE Esta invención se llevó a cabo con el apoyo del gobierno de los Estados unidos bajo los números de concesión CA57973 y AI40034. El Gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona en general con células que permiten la replicación del virus de la hepatitis C (HCV), y métodos y materiales para realizarlos y utilizarlos.

TECNICA ANTECEDENTE Se han identificado previamente mutaciones adaptivas en las proteínas no estructurales de HCV que incrementan la replicación de ARN así como la frecuencia de células Huh-7 que sustentan niveles detectables de replicación (Blight, K.J. et al. Science 290:1972-1974, 2000; Guo, J. T. Et al., Virol. 75:8516-8523, 2001 ; Kreiger, N. Et al., J. Virol. 75: 4614-4624, 2001; Lohmann, V. et al., J. Virol. 75:1437-1449, 2001). En particular, el reemplazo de residuo de Serina con isoleucina en la posición 2204 en NS5A permite una replicación HCV en ~10% de células Huh-7 transfectadas (una mejora de 20,000 veces sobre HCV no mutado) e incrementa la replicación a un nivel suficiente para la detección de ARN del HCV un poco después de la transfección. (Blight et al., 2000). La baja frecuencia de células Huh-7 que sustenta la replicación HCV sugiete que el entorno celular ser determinante principal de la eficiencia en la replicación de HCV.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra representaciones esquemáticas de diversos ARN del HCV. La figura 2 muestra la selección de línea celulares altamente tolerantes de la replicación HCV. La figura 3 muestra la detección de proteínas HCV y ARN en células HuH-7.5 y Huh-7 transfectadas transitoriamente con ARN del HCV. La figura 4 muestra la acumulación de ARN del HCV después de la transfección de células Huh-7.5 con ARN del HCV de longitud completa.

La figura 5 muestra efectos de sustituciones alternativas en la posición 2204 en la replicación de ARN del HCV. La figura 6 muestra efectos de combinar las mutaciones adaptivas de NS5A en la replicación de ARN del HCV. La figura 7A-7B muestra los efectos de combinar mutaciones NS3 y NS5A en la replicación de HCV. La figura 8A-8B muestra el efecto de mutaciones S2194A y S2194D en la replicación de ARN del HCV.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Como se describe en la presente el término "tolerante" de la replicación dé HCV, en referencia a una célula o línea celular en particular, quiere decir que la célula o línea celular en particular sustenta la replicación de HCV en una frecuencia que es mayor la de la célula o línea celular a partir de la cual se derivó. Por ejemplo, en ciertas modalidades descritas en la presente, las sublíneas de Huh-7 sustentan una mayor frecuencia de replicación de HCV que la línea celular de Huh-7 a partir de la cual se derivaron. Así, se dice que las sublíneas son tolerantes de la replicación de HCV. En algunas modalidades, la célula o línea celular sustenta la replicación de HCV a una frecuencia de entre alrededor de 10% a alrededor de 30%. En otras modalidades, la célula o línea celular sustenta la replicación de HCV en una frecuencia de entre alrededor de 10% y alrededor de 75%.

El término "curado" se refiere a células substancialmente libres de ARN del HCV de autorreplicación. El ejemplo 1 proporciona una descripción de un medio para curar células dentro del significado de ese término como se utiliza en la presente. El término "transfección" se refiere a la infección de una célula con un polinucléotido. El polinucleótido puede ser ADN o ARN. Se conocen en la técnica métodos para transfectar una célula, cualquiera de los cuales puede ser utilizado. Se indaga sobre la frecuencia al determinar el porcentaje de células que tienen ARN del HCV de replicación. Una manera fácil de medir la frecuencia es determinar el porcentaje de células que exhiben una característica conferida por el ARN del HCV, y cualquier método conocido en la técnica para lograr esto es adecuado. Los métodos en la presente describen un método utilizando un ARN del HCV que comprende un neo gen y la selección G418. A menos que se indique lo contrario, se emplean técnicas convencionales para cultivos celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e immunología, todas las cuales están dentro del condencimiento de la técnica y se describen en la literatura. Para obtener líneas celulares tolerantes de la replicación de HCV, se curaron líneas celulares clónales y de población Huh-7 que sustentaban la replicación de ARN subgenomica o de longitud completa adaptiva y no adaptiva, de ARN del HCV mediante tratamiento con ¡nterferón (IFN). Ya que se puede bloquear fácilmente la replicación de HCV mediante IFN, el tratamiento prolongado con IFN cura las células de ARN del HCV. Un porcentaje más elevado de células curadas fue capaz de sustentar la replicación de HCV y facilitó la detección de tanto la replicación subgenómica como de longitud completa mediante ensayos múltiples. Así, una modalidad descrita en la presente comprende un método para conformar células y líneas celulares que sean tolerantes de la replicación de HCV. Dicho método comprende curar células infectadas con HCV. Posteriormente se ensayan las células curadas para determinar la frecuencia en la cual la célula sustenta la replicación de HCV. Las células pueden ser células de cualquier vertebrado que sean capaces de sustentar la replicación adaptiva o no adaptiva de ARN del HCV. Los métodos descritos en la presente para conformar células y líneas celulares se consideran aplicables a cualquier tipo de célula que sea capaz de sustentar la replicación adaptiva o no adaptiva de ARN del HCV. Dichas células pueden incluir, por ejemplo hepatocitos, linfocitos T, linfocitos B o fibroblastos del prepucio, y pueden ser células de mamíferos o más específicamente de humano. Un tipo de célula particularmente útil es la célula de hepatocitos. Por ejemplo, se ha mostrado que las células Huh-7 sustentan la replicación de ARN del HCV. En la presente se demuestra que la sublíneas de Huh-7 que han sido curadas son tolerantes de la replicación de ARN del HCV. Para el replicón que contiene la mutación altamente adaptiva de NS5A S2204I se pueden transducir por lo menos 30% de las células Huh-7.5 a resistencia contra G418. Una fracción comparable fue positiva para el antígeno NS3 mediante FACS. De manera similar, para los replicones SG que no contaban con neo (fig. 1), se logró una deficiencia de iniciación de por lo menos 50%. Datos de análisis más sensibles de FACS (datos que no se muestran) indican que >75% de las células que sobreviven al procedimiento de transfección alojan ARN del HCV de replicación. Se obtuvieron estas células tolerantes al curar clones de célula con contenido de replicón con IFN. Otras modalidades comprenden métodos para conformar células y líneas celulares que sean permisibles de la replicación de HCV. Dichos métodos comprenden curar células infectadas, y posteriormente ensayar sublíneas para determinar la frecuencia en la cual una sublínea particular sustenta la replicación de HCV. Las sublíneas que son particularmente tolerantes pueden identificarse posteriormente. Se pueden curar las células infectadas por cualquier medio. Por ejemplo, el tratamiento con lnterferón-ot es un medio efectivo para curar células de la invención con HCV, aunque se pueden utilizar cualesquiera métodos efectivos de curación dentro del alcance de esta invención. Se obtuvieron las sublíneas con mayor tolerancia (Huh-7.5 y Huh-7.8) de clones seleccionados de G418 que albergaban replicones sin cambios de adaptación en la región NS3-5B (en el nivel de secuencias de población). Estas células pueden representar una subpoblación de la línea parental original de Huh-7 que son tolerantes a la replicación de replicones no modificados, así como más tolerantes a replicones con mutaciones adaptivas. La curación de otras líneas celulares con contenidos de replicón no siempre generó una población celular que fuera más tolerante de los replicones probados. Por ejemplo, curar la población Huh-7 que contenía el replicón SG-Neo (S22041) generó un substrato celular que no cambió en su capacidad de sustentar SG-Neo (S2204I), pero que fue menos eficiente (en 23 veces) para la iniciación inicio de SG-Neo (5?? 47) (Fig. 2). La habilidad de estudiar la replicacion de HCV directamente después de la transfección, sin necesidad de la selección de G418, permitió el análisis de la replicacion de replicones subgenómicos que no contaban con neo así como con ARN del genoma de HCV de cadena completa. Los intentos iniciales para crear un replicón monocistrónico al fusionar ubiquitina celular dentro del marco entre los primeros 12 aminoácidos del núcleo y NS3 {SG-5'Ub-NS3 (S22041 ); Fig. 1} fueron infructuosos. Estuvo disponible un derivado bicistrónico con ubiquitina fusionada a NS3-5B, lo que sugiere que la falla de SG-5'Ub-NS3 (S2204I) para replicar no se debió a un defecto de procesamiento en la unión de ubiquitina/NS3 (datos que no se muestran). Por el contrario, la fusión de la secuencia de codificación de ubiquitina cerca de HCV 5' NTR pudo haber interferido con la traducción debido a la formación de estructuras secundarias de ARN nocivas o replicacion de ARN al interrumpir los elementos de ARN que reposan en HCV 5' NTR o en su complemento. La fusión de HCV 5' NTR al EMCV IRES generó un replicón subgenómico que replicó mejor que SG-Neo (S22041 ); Fig. 3}. Por qué la deleción del primer cistrón (secuencias que codifican la fusión C-Neo) estimuló la replicación por SG-Neo (S2204I) bicistrónico se desconoce, pero puede resultar de una traducción mejorada de la replicasa debido a la unión abrogada de la subunidad ribosómica 40S al sitio usual de inicio de traducción de HCV y disminuyó la competencia entre los elementos EMCV y HCV IRES (J. Marcotrigiano y C. M. Rice, resultados no publicados). Se observó un cuadro similar para la replicación de las construcciones de longitud completa que contenían el cambio adaptivo a NSSA S22041 (figura 4). En células Huh-7.5, la construcción bicistrónica que contenía el cistrón C-Neo {FL-Neo (S22041); Fig. 1} inició la replicación de manera menos efectiva que ARN con el HCV 5' NTR fusionado a EMCV IRES {FL-5'?? (S2204I); Fig. 1}. La construcción FL con el genoma HCV no modificado (excepto para la sustitución de S22041 en NS5A) fue mejor al iniciar la replicación que el ARN en donde se medió la traducción mediante el EMCV IRES (Fig. 4), lo que demuestra que no se requiere la traducción impulsada por EMCV IRES para la replicación HCV en las células Huh-7.5 permitiendo así del estudio de ARN del HCV genómico no modificado. Este último punto podría tener impacto ciertamente en la capacidad de ARN del HCV para hacer compactado en partículas infecciosas. Sin embargo, en nuestras manos (K. J. Blight y C.M. Rice, resultados no publicados) y en un informe reciente (Pietschmann, T. Et al., J. Viral. 76:4008-4021 , 2002) no se observó la compactación selectiva de estos ARN del FL no modificado en células Huh-7. Los ARN del HCV de longitud completa fueron menos eficientes en establecer la replicación que los replicones subgenómicos adaptivos correspondientes, lo que sugiere que la adición de la región de codificación estructural de -NS2 inhibe el inicio de la replicación de HCV. Ya sea que esto se deba a las proteínas codificadas o elementos ARN que reposan en esta región (o en ambos) (31 ) aún no está claro. Hemos observado que los niveles de replicación de HCV (según se mide por lo niveles de proteína de HCV y ARN) de los ARN de FL y FL-Neo con contenido de S2204I pero no replicones subgenómicos, depende del ciclo celular que podría comprometer la capacidad de los ARN de longitud completa a iniciar la replicación en una población celular transfectada y sincronizada (Balfe et al. remitido). En un intento para mejorar aún más replicación de HCV de cultivo celular, se examinó el efecto de otras substituciones de aminoácidos en la posición 2204 en NS5A. Se observó una replicación eficiente subgenómica de ARN para lie y Val y en mucho menor grado Ala en la posición 2204 (figura 5). Val o lie son residuos pequeños, ß-ramificados no polares, mientras que Ala tiene propiedades similares pero no está ß-ramificado. En contraste, los residuos polares como Tyr, Glu, Thr, Ser o Asp en la posición 2204 afectaron de forma severa la replicación de HCV (figura 5) lo que sugiere que la replicación favorece residuos no polares en este lugar. Es interesante observar que Ser se encontra naturalmente en la posición 2204 para este aislado de genotipo 1B (Lohmann, V. Et al., Science 285:110-1 3, 199) y se conserva entre otros genotipos de HCV (Tanji, Y. et al., Virol. 69:3980-3986, 1995), lo que sugiere que este residuo puede ser importante para la replicación y/o patogénesis de HCV ¡n vivo. Combinar mutaciones adaptivas de NS5A resultaron en replicones que estaban deshabilitados (A2199T+S2204I) o incapaces de replicación (S2197P+A2199T+S2204I) en células Huh-7.5 (figura 6). La incompatibilidad de mutaciones adaptivas en otras partes en la región de codificación de NS del HCV ya se había descrito previamente (Lohmann, V. et ai., J. Viral. 75:1437-1449). Por ejemplo, combinar una mutación adaptiva en NS5B (R2884G) ya sea con NS4B (P1936S) o (NSA (E2163G) redujo drásticamente la eficiencia de la formación de colonias resistentes a G418. Por otra parte, combinar ciertas mutaciones adaptivas a NS3 y NS5A puede incrementar la eficiencia de replicación (Krieger, N. et al., J. Viral. 75:4614-4624,2001). Sin embargo, a pesar de la observación de que las mutaciones E1202G y ??2801 en NS3 actúan sinérgicamente con S2197 en NS5A para incrementar la eficiencia de replicación (Krieger et al., 2001 y K.J. Blight y C.M. Rice, resultados no publicados), el diseño de estos cambios de NS3 en SG-5JHE (S2204I) no mejoró la replicación a nuestro sistema (figuras 7A-7B). Estos resultados nuevamente subrayan la naturaleza empírica de optimizar mutaciones adaptivasbles con diferentes entornos celulares de Huh-7. Se conserva la fosforilación de NS5A entre genotipos de HCV divergentes (Reed, K.E. et al, J. Viral. 71 :7187-7197, 1997), lo que sugiere que juega un papel importante en el ciclo de vida del virus. Previamente mostramos que la hiperfosforilación de NS5A no es esencial para la replicación de HCV (Blight, K.J. et al., Science 290:1972-1974, 2000). Posterior a la resiente identificación de S2194 como un sitio principal aceptor de fosfato para el subtipo 1 b (Katze, M.G. et al, Virology 278:501-513), se sustituyó Ala o Asp en esta posición y se analizó el efecto sobre la replicación de HCV dentro del contexto de la mutación adaptiva de S2204I. Dadas las incompatibilidades observadas al combinar mutaciones NS5A, no se pudieron evaluar las eficiencias de replicación absolutas de los diferentes mutantes, sin embargo se recuperaron ARN de replicación que albergaban estas sustituciones en el lugar 2194. Estos resultados muestran que la fosforilación en S2194 no es un requisito absoluto para la replicación de este aislado de subtipo 1b. Se describe en los siguientes ejemplos varias modalidades de la invención. Estos ejemplos deben considerarse como tales y no pretenden ser restrictivos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Cultivo celular y tratamiento de interferón Se propagaron monocapas celulares Huh-7 en medio esencial mínimo modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% y 0.1 mM de aminoácidos no esenciales (DMEM- 10% FBS). Para células que sustentaban replicones subgenómicos, se añadieron 75Q^g/ml de G4 8 (Geneticin; Gíbco-BRL) al medio de cultivo. Se curaron células Huh-7 con contenido de replicón de ARN del HCV al pasar inicialmente las células dos veces en ausencia de G418. En el tercer paso se cultivaron las células con 100 lU/ml de IFN derivado de leucocitos humanos (Sigma-Aldrich). Después de 3-4 días, las monocapas confluentes se les aplicó tripsina, se les colocó en placas y se cultivaron durante 24 horas antes de la adición de IFN. Las células se pasaron un total de 4 veces en presencia de IFN y previo al cuarto paso se cultivaron las células durante 3 días sin IFN. Se expandieron las líneas celulares curadas y se criopreservaron en niveles de paso tempranos. Se realizaron experimentos adicionales utilizando células que fueron pasadas menos de 20-30 veces a partir de estos lotes de semilla criopreservadas.

EJEMPLO 2 Construcción de plásmido Se utilizó la tecnología estándar de ADN recombinante para construir y purificar todos los plásmidos. Se realizó la síntesis de ADN iniciado con KlenTaqLA ADN polimerasa (proporcionado amablemente por Wayne Barnes, Washington University, St, Louis), y se confirmaron las regiones amplificadas mediante PCR mediante una realización de secuencias automatizada de nucleótidos. Se prepararon ADN de plásmido para una trascripción in vitro a partir de cultivos bacteriales a gran escala y se purificaron mediante centrifugazo en gradientes CsCI. Todos los nucleótidos (nt) y números de aminoácidos se refieren a la ubicación dentro del genoma HCV de longitud completa Con1 de genotipo 1b (número de acceso Genbank AJ238799) que comienza con la región codificadora de núcleo. Se ensambló esta secuencia a partir de oligonucleótidos de ADN químicamente sintetizados en un ensayo PCR escalonado esencialmente como se describió con anterioridad (5). En resumen, se utilizaron 10-12 oligonucleótidos purificados con gel (60-80 nt de longitud) con superposiciones complementarias únicas de 16 nt utilizadas para sintetizar ADNc que abarcaba 600-750 bases. Los productos finales de PCR se purificaron, se digirieron con enzimas de restricción apropiadas y se ligaron en el vector de plásmido cortado de manera similar pGEM3Zf(+) (Promega). Se realizaron secuencias de clones recombinantes múltiples, se identificaron los clones correctos y los fragmentos de ADNc superpuestos se ensamblaron en la secuencia genómica contigua: 5'NTR-C-E1~E2-p7-NS2-3-4A-4B-5A-5B-3!NTR (pHCVBMFL). El replicón seleccionare, pHCVrep1 bBartMan/Avall{SG-Neo (wt); Fig. 1} y las derivadas, pHCVrep1 b/BBVII {SG-Neo (S22041)} y pHCVrep1b/BBI{SG-Neo (5??47)}, que contenían las mutaciones adaptivas de NS5A, S2204I y una deleción dentro de marco de 47 aminoácidos (A47aa) entre 6960 y 7102, respectivamente, ya han sido descritos (5) (figura 1 ). El plásmido pHCVBMFL/S2204l {FL (S22041 ); Figura 1} contiene el genoma de longitud completa con el cambio adoptivo a NS5A S22041. Para las construcciones genómicas y subgenómicas, se generaron derivadas defectuosas de NS5B polimerasa que portaban una triple sustitución de aminoácido, cambiando el motivo Gly-Asp-Asp (GDD) en el sitio activo a Ala-Ala-Gly (AAG) (5), y a través de este reporte se hace referencia a ellos como pol". El plásmido pC-Ubi-NS3/HCVrepBBVII {SG-5'-Ub-NS3 (S2204I); Figura 1} que contenía ubiquitina en vez del neo gen y EMCV IRES fue construido como sigue. Se ligaron un fragmento PCR por Ascl-Sacl digerido amplificado de PHCVrep12/Neo (Blinght et al., resultados no publicados) con iniciadores 1289 y 1290 (cuadro 1) y la porción Sacl-BsrGI de un segundo producto PCR general utilizando el par iniciador 1291-1292 (cuadro 1 ) con pHCVrep11b/BBVII entre los situados Xbal y BsrGI de HCVrep1 b/BBVII junto con el fragmento Xbal-Ascl de HCVrep1 b/BBVII. Para borrar el neo gen de PHCVrep1b/BBVII, se hibridaron los oligonucléotidos de superposición sintética 1287 y 1288 (cuadro 1 ) y se extendieron para crear la unión entre el 5'NTR y el EMCV IRES. Este producto se digirió con ApaLI yAcll, y se insertó, junto con fragmentos Xbal-ApaLI y Ac/l-EcoRI de PHCVrep1 b/BBVll, en PHCVrep1b/BBVII digerido con Xbal-EcoRI. A esta construcción se le llamó P5'NTR-EMCV/HCVrepBBVII {SG-5'?? (S2204I); figura 1}. Para reemplazar S2204I con NS5AA47, se ligó el fragmento EcoR\-Xhol de PHCVrep1b/BBl al P5'NTR-EMCV/HCVrepBBVII de corte similar, generando P5WR-EMCV/HCVrepBBI{SG-5'HE(5AA47); Figura 1}.

Se creó el plásmido p5'NTR-EMCV/HCVFLBM(S2204I) {FL-5'?? (S2204I); Figura 1} a ligar el fragmento Xbai-Hindlll de P5'NTR-EMCV/HCVrepBBVIl, el fragmento Hindlll-Aatll de un producto PCR amplificado a partir de P5'NTR-E CV/HCVrepBBVll utilizando los iniciadores 1293 y 1294 y el fragmento Aatll-Nortl de pHCVBMFL/S2204l en pHCVBMFL/S2204l previamente digerido con Xbal y Nortl. El clon HCV de longitud completa bicistrónico seleccionable pHCVBMFL(S2204l)/Neo {FL-Neo(S2204i); Figura 1} se ensambló al ligar el fragmento Xbai-Hindlll de pHCVrep1 b/BBVII y el fragmento HindIII-EcoRI de p5'NTR-EMCV/HCVBMFL(S2204I) entre los sitios Xbal y EcoRI de pHCVrep1b/BBVII. Para obtener plásmidos con mutaciones en la posición 2204, y para introducir mutaciones de A2199T individual o S2197P/A2199T doble en p5'NTR-E CV/HCVrepBBVII, primero se realizaron PCR utilizando p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVIl como una plantilla con el iniciador inverso 1030 y uno de los siguientes iniciadores directos mutantes: 1319 (S2204V), 1320 (S2204A), 1322 (S2204Y), 1324 (S2204E), 1325 (S2204T), 184 (S2204D), 1326 (A2100T+S2204I) y 1327 (S2 97P+A2199T+S22041) (cuadro 1 ). Se digirieron los productos amplificados con PCR con BIpl y Xhol y se clonaron en estos sitios en p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVII. Se diseñó S2204 mediante la inserción del fragmento EcoRI-Xhol de pHCVrepI bBartMan/Avall en el p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVIl de corte similar. Para diseñar la mutación, Q1112R, en el p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVIl para crear p5'NTR-EMCV/HCVrepCloneA (Q11 12R+S2204I), nt 3640-3991 de NS3 se amplificaron con PCR a partir de p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVII utilizando el iniciador muíante 1358 y el oligonucleótido 885 (cuadro 1 ). El producto resultante se digirió con BsrGI y Eagl y se combinó en una mezcla de reacción de ligación con los fragmentos Eagl-EcoRI y BsrGI-EcoRI a partir de p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVII. Se creó la doble mutación (E1202G+T1280I) en NS3 mediante un procedimiento de clonación de múltiples pasos. Primero, se digirió un fragmento PCR amplificado a partir de p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVII con un iniciador directo 1359 y un iniciador inverso 1356 (cuadro 1) con ApaLI y Xbal y se clonó en pGEM3Zf(+) digerido con EcoRI-Xbal junto con el fragmento de EcoRI-ApaLI de Pgem2Zf(+)/HCV1 nt 796-2524, que contenía nt 3420-4124 en NS3 (K. J. Blight and C. M. Rice, resultados no publicados) generando el plásmido intermediario pGEM3Zf(+)/HCV1 bnt1796-2524NS*. En segundo lugar, en una estrategia de clonación de cuatro partes, el fragmento BsrG\-BsaA\, suprimido de pGEM3Zf(+)/HCV1bnt1796-2524NS*. se insertó, junto con los fragmentos BsrAI-BssHIl y BssHIl-EcoRI de p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVII, en p5'NTR-EMCV/HCV repBBVIl, cortado de BsrGI y EcoRI. El plásmido resultante se nombró p5'NTR-EMCV/HCVrepBBVII+NS3* (E1202G+T12801 +S22041 ). Se introdujeron las mutaciones S2194A y S2194D al utilizar pares iniciadores 5'Ala/1030 y 5'ASp/ 030 (cuadro 1), respectivamente para amplificar mediante PCR nt 6897-7186 en NS5A de pHCVrep1 b/BBVII. Estas mutaciones se incorporaron en PHCVrep b/BBVII al reemplazar la porción Blp\-Xho\ con el producto PCR digerido con Blp\-Xho\ correspondiente.

EJEMPLO 3 Transcripción de ARN Los ADN de plásmido que contenían secuencias de longitud completa y subgenómica de HCV se alinearon con Seal y un replicón subgenómico de poliovirus digerido con Bam \. Los ADN linearizados fueron extraídos con fenol :cloroformo (1 :1 ) y precipitados con etanol. Los ADN en pellas se lavaron en etanol al 80% y se resuspendieron en 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)/1 mM EDTA (pH 8.0). Se sintetizaron transcripciones de ARN a 37°C durante 90 minutos en una mezcla de reacción de 100 µ? que contenía 40 mM Tris-HCl (pH 7.9), 10 mM NaCI, 12 mM MgCI2 2 mM de espermidina, 10 mM ditiotreitol (DTT), 3 mM de cada trifosfato nucleósido, 0.025 U de pirofosfatasa inorgánica (Roche Applied Science), 100 U de RNasin (Promega), 100 U de T7 ARN polimerasa (Epicentre Technologies), y 2 µg de ADN linearizada. Se extrajo ARN con fenol-cloroformo (1 :1 ), se precipitó con etanol y la pella se lavó en etanol al 80% antes de su resuspensión en ddH20. Se removió la plantilla de ADN mediante tres digestiones de DNasa en serie durante 20 minutos a 37°C en 33 mM Tris-HCl (pH 7.8), 66 mM KCI, 10 mM MgCI2 y 5 mM DTT que contenía 10 U de DNasa I (Roche Applied Science). Los ARN digeridos con DNasa se extrajeron con fenol:cloroformo (1 :1 ), se precipitaron con etanol y la pella de ARN se resuspendió en ddH20 después de lavar en etanol al 80%. Se determinó la concentración de ARN mediante la medición de la densidad óptica a 260 nm y se confirmó la integridad y concentración mediante una electroforesis con gel de agarosa al 1 % y tinción con bromuro de etidio.

EJEMPLO 4 Transfección de células cultivadas Se transfeccionó ARN trascrito in vitro en células Huh-7 y curadas con IFN mediante electroporación. En resumen, se desprendieron las células subconfluentes de Huh-7 mediante tratamiento con tripsina, se recolectaron mediante centrifugado (500 x g, 5 min), se lavaron tres veces en una solución salina regulada de fosfato libre de RNasa enfriada por hielo (PBS) y se resuspendió en 1.25 x 107 células/ml en PBS. Se mezclaron las transcripciones de ARN (1 µg) con 0.4 mi de células Huh-7 lavadas en una cubeta con brecha de 2 mm (BTX) e inmediatamente se le aplicaron impulsos (0.92 kV, 99 µseg pulso-longitud, 5 pulsos) utilizando un BTX ElectroSquare Porator. Las células con impulsos se dejaron recuperar durante 10 minutos a temperatura ambiente (ta) y posteriormente se diluyeron en 10 mi DMEM-10% FBS. Las células se colocaron en placas en: (i) pozos con diámetro de 35 mm para cuantificar ARN del HCV y para experimentos de marcado metabólico; (¡i) portaobjetos con cámara de 8 pozos (Becton Dickinson) para estudios de inmunofluorescencia o; (iii) disco con un diámetro de 100 mm para análisis de citómetro de flujo activado por fluorescencia (FACS) y selección G418. Para determinar la eficiencia de la formación de colonias resistentes a G418, se colocaron en placas las células transfectadas en densidades múltiples (entre 1 x 103 y 2 x 105 células), junto con células transfectadas con transcripciones de ARN po1" para que el número total de células se mantuviera en 2 x 105 células por plato de 100 mm. Cuarenta ocho horas después de la colocación en placas, se reemplazó el medio con DMEM- 0% FBS suplementado con 1 mg/ml G418. Tres semanas después, se fijaron los focos resistentes a G418 con formaldehído al 7% y se tiñeron con violeta de cristal al 1 % en etanol al 50% para facilitar el conteo de colonia. Se calculó la eficiencia de transducción de G4 8 con base en el número de colonias seleccionadas de G4 8 relacionadas con el número de células Huh-7 colocadas en placas después de la electroporación. Se monitoreó la eficiencia de transfección para cada serie de ARN al electroporar en paralelo una proteína fluorescente verde con expresión de replicón subgenómica de poliovirus (GFP; A. A. Kolykhalov y C. . Rice, resultados no publicados). Se observaron las células transfectadas para encontrar el efecto citopático inducido por replicón de poliovirus y la expresión de GFP visualizada utilizando un microscopio fluorescente invertido en una postransfección a las 12-16 h. Después de 24 horas, las células adjuntas supervivientes (presumiblemente no transfectadas con el replicón de poliovirus) se les trató con tripsina, se mezclaron con azul tripano y se contaron las células viables para determinar el porcentaje de células electroporadas.

EJEMPLO 5 Análisis de ARN viral Se aisló ARN celular total utilizando agente reactivo TRIzol (Gibco-BRL) de conformidad con el protocolo del fabricante. Se utilizó un décimo de cada muestra de ARN para cuantificar niveles de HCV específicos a ARN utilizando un detector de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems). Se realizaron amplificaciones en tiempo real de transcripción inversa (RT)-PCR utilizando los agentes reactivos de núcleo TaqMan EZ RT-PCR (Applied Biosystems) y los iniciadores específicos para HCV 5' NTR: 5'-CCTCTAGAGCCATAGTGGTCT-3' (sentido, 50 µ?), 5' CCAAATCTCCAGGCATTGAGC-3' (antisentido, 50 µ?) FAM-CACCGGAATTGCCAGGACGACCGG (sonda, 10 µ?; Applied Biosystems). Las reacciones RT se incubaron durante 30 minutos a 60°C, seguido por la inactivación de la transcriptasa inversa acoplada con activación de Taq polimerasa durante 7 minutos a 95°C. Se realizaron 40 ciclos de PCR con condiciones de ciclo de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C. Se incluyeron estándares sintéticos de ARN del HCV de concentración conocida con cada conjunto de reacciones y se utilizaron para calcular una curva estándar. Se analizaron las señales de PCR en tiempo real utilizando software SDS v .6.3 (Applied Biosystems).

EJEMPLO 6 Análisis FACS Se removieron las monocapas de células transfectadas de discos de cultivo con un diámetro de 100-mm mediante tratamiento con verneso/EDTA y una suspensión celular individual preparada al pasar células a través de una aguja calibre 16 y una membrana con poro de 74 µ?t?. Se resuspendieron las células a 2 x 106 por mi, un volumen igual para formaldehído al 4% añadido a las suspensiones celulares se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron dos veces con PBS y la pella celular resultante se resuspendió a 2 x 106 células por mi en 0.1% saponina/PBS. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente, se tiñeron las células (una hora a temperatura ambiente) con anticuerpos monoclonales específicos a HCV (mABS; núcleo (C750), NS3 (1B6) y NS5B (12B7); todos proporcionados generosamente por Darius Moradpour, Universidad de Freiburg, Freiburg, Alemania) diluido a 10 µg/ml en 3% FBS/01% saponina/PBS. Se lavaron las células tres veces con 0.1% saponina/PBS y se detectó el mAb ligado mediante la incubación durante una hora a temperatura ambiente con IgG antiratón conjugado a Alexa 488 (Molecular Probes) diluido 1:1000 en 3% FBS/0.1 % saponina/PBS. Las células teñidas se lavaron tres veces con 0.1 % saponina/PBS, se resuspendieron en una solución reguladora FACSflow (BD Biosciences) y se analizaron inmediatamente utilizando un FACS Calibur (BD Biosciences).

EJEMPLO 7 Inmunofluorescencia indirecta Se lavaron células Huh-7.5 electroporadas sembradas en portaobjetos de cámara de ocho pozos con PBS y se lavaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron la células dos veces con PBS, se permeabilizaron mediante incubación con 0.1% saponina/PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente y se bloquearon con suero de cabra al 3% durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se diluyó NS5B mAb (12B7) a 10 µg ml en 0.1% saponina/3% suero cabra/PBS y se incubó durante una hora a temperatura ambiente, seguido por tres lavadas con 0.1 % saponina/PBS. Se detectaron los mAb ligados al incubar durante una hora a temperatura ambiente con IgG antiratón conjugado con Alexa 488 diluido 1 :1000 en 0.1 % saponina/3% suero cabra/PBS. Se tiñeron los núcleos durante 20 minutos a temperatura ambiente con 10 µg/ml Hoechst 33342 (sigma-Aldrich) en PBS. El conjugado fluorescente sin ligar se removió con tres lavadas con 0.1 % saponina/PBS, células montadas en Vectashield (Vectror Laboratories) y se vieron con un microscopio fluorescente (Nikon, Eclipse TE300).

EJEMPLO 8 Marcado metabólico de proteína e inmuno-precipitación Se incubaron monocapas celulares en pozos con un diámetro de 35 mm durante 0.5-10 h en ME sin metionina y cisteina que contenía 1/40 de la concentración normal de metionina, FBS dializado al 5% y mezcla de marcado Express 35S-protein (140 µ??'/???; NEN). Las células marcadas se lavaron una vez con PBS frío y se cosecharon en 200 µ? de una solución reguladora para lisis de dodecilsulfato de sodio (SDS) (solución reguladora de fosfato de sodio 0.1 M (pH 7.0), 1 % SDS, un coctel inhibidor de proteasa completo 1x (Roche Applied Science), 80 µ de fenilmetilsulfonilsulfuro (PMSF) por mi) y AND celular cortado mediante paso continuo a través de una aguja con calibre 27.5. Se calentaron cantidades iguales de lisado de proteínas (50 µ?) a 75°C durante 10 minutos y se aclararon mediante centrifugado previo al mezclado con 200 µ? de TNA (50 mm Tris-HCI (pH 7.5), 150 mM NaCL, 0.67% albúmina de suero bovino, 1 mM EDTA, 0.33% Tritón X-100, 80 µ9 de PMSF por mi). Se añadió un µ? de suero de paciente positivo de HCV (JHF) y se permitió la formación de complejos inmunes al incubar de la noche a la mañana a 4°C con oscilación. Se recolectaron los complejos inmunes al añadir 50 µ? de células de Pansorbin prelavadas (Calbiochem) e incubación durante 1-2 horas a 4°C con oscilación. Se recolectaron los inmunoprecipitados mediante centrifugado y se lavaron tres veces en TNAS (TNA que contenía 0.125% SDS) y una vez con TNE (50 mM Tis-HCI (pH 7.5), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 80 µg de PMSF por ml), solubilizado al calentar a 80°C durante 20 minutos en una solución reguladora de muestra de proteína y se separó en un gel de poliacrilamida SDS- al 10%. Se visualizaron las proteínas marcadas metabólicamente mediante fluoroagrafía.

EJEMPLO 9 Líneas celulares permisibles de la replicación de HCV A partir de clones resistentes a G418 (Blight, K.J. 2000), se curaron los clones Huh-7.5 y Huh-7.8 que albergaban replicones subgenómicos SG-Neo sin cambios en aminoácidos dentro de la región NS del HCV, así como el clon Huh-7.4, que contenía un replicón con el cambio Ser a lie en la posición 2204 en NS5A. También se trataron líneas de población no clonadas Huh-7/S2204l y Huh-7/5A 47 (Blight, K.J. 2000), seleccionadas con G418 después de la transfección de replicones subgenómicos que contenían ya fuera S2204I en NS5A {SG-Neo (S2204I); Fig. 1} o la deleción de NS5A del aminoácido 47 {SG-Neo(5A 47); Fig. 1}, con IFN. Para excluir la posibilidad de que el tratamiento con IFN únicamente pudiera alterar la capacidad de la célula Huh-7 para sustentar la replicación de HCV, se trataron las células Huh-7 parentales con IFN en paralelo. Posterior al tratamiento con IFN, se mostró que a las células les faltaba ARN del HCV mediante un RT-PCR anidado específico a 3'NTR, en donde el límite de detección fue -10 moléculas de ARN del HCV (Kolykhalov, A.A., J. Viral 70:3363-3371 y mediante sensibilidad de G418. Para examinar la capacidad de líneas celulares curadas con IFN para sustentar la replicación del HCV, se utilizaron tres replicones seleccionabas de G418, SG-Neo(S2204l), SG-Neo(5A 47) y SG-Neo (wt) (fig. 1), con eficiencia de transducción de G418 en células Huh-7 parentales de 10%, 0.2% y 0.0005%, respectivamente (Blight, K.J. 2000). Se electroporó ARN sintetizado in vitro en células curadas con IFN y después de 48 horas se impuso la selección de G418 y las colonias resultantes se contaron después del fijado y tinción. Se calcularon las eficiencias de transducción con base en el número de colonias seleccionadas de G418 en relación con un número de célula Huh-7 colocadas en placas después de la electroporaclón. La frecuencia de células Huh-7.5 capaces de sustentar la replicación SG-Neo (S2204I) fue ~3 veces mayor que la de las células parentales Huh-7 (figura 2). Para líneas celulares Huh-7.5 y Huh-7.8, el número de colonias resistentes a G4 8 obtenidas después de la transfección de SG-Neo (5A 47) fue significativamente mayor que para las células Huh-7 parentales (incrementos de ~33 y 9 veces, respectivamente; figura 2). Lo mismo fue verdad para Huh-7.4 aunque la mayor frecuencia de formación de colonias no fue tan grande (~3 veces; figura 2). El replicón SG-Neo (wt) también muestra una capacidad replicativa incrementada en las células Huh-7.5, Huh-7.8 y Huh-7.4 (con incrementos de 10, 2 y 2 veces, respectivamente; véase la figura 2).

Las dos poblaciones celulares curadas, Huh-7/5Ap47 y Huh-7/S2204I, muestran ya sea incrementos comparables o modestos en las eficiencias de transducción de G418 después de la transfección del ARN replicón adaptado originalmente presente dentro de la línea de población (figura 2). La frecuencia de colonias resistentes a G418 se incrementa -2.5 veces cuando la células Hu -7/5Ap47 son electroporadas con SG-Neo(5Ap47), mientras la transfección con SG-Neo (S22041) resulta en una disminución ligera en la eficiencia de transducción de G418 (figura 2). No obstante, una reducción de 23 veces en la formación de la colonia se observa después de la transfección de células Huh-7/S2204l con SG-Neo (5Ap47) (figura 2). No se observan diferencias significativas en la formación de la colonia resistente a G418 entre las células Huh-7 parentales y las células Huh-7 tratadas con IFN (datos no mostrados), que indican que el protocolo de curado mediado con IFN no tiene influencia establemente en la capacidad de estas células para soportar la replicacion de HCV. Las colonias resistentes a G418 no se observan cuando el ARN replicón defectivo de polimerasa, pol" es transfectado en paralelo (datos no mostrados). Por tanto, una frecuencia más alta de células en las líneas clónales curadas, en particular aquellas originalmente capaces para soportar la replicacion de ARNs sin mutaciones adaptivas (Huh-7.5 y Huh-7.8), son tolerantes para la replicacion de HCV.

EJEMPLO 10 Replicación de HCV en células Huh-7.5 y Huh-7 no seleccionadas Debido que la línea Huh-7.5 curada es la más tolerante de aquellas analizadas, se ha examinado la replicación de HCV en esta sublínea en comparación con las células Huh-7 parentales usando un número de métodos diferentes. Se ha enfocado en ensayos transitorios que puedan permitir una valoración de la replicación de HCV justo después de la transfección sin la necesidad de la selección de G418. Noventa y seis horas después de la transfección con ARN SG-Neo (S22041 ) y SG-Neo (5Ap47) (figura 1 ), el ARN total es extraído de células Huh-7 tratadas con Huh-7.5 e IFN y los niveles de ARN de HCV son cuantificados por PT-PCR. El replicón defectuoso de replicación pol", es transfectado en paralelo para permitir la discriminación entre ARN de entrada y ARN generado por la replicación productiva. Como se muestra en la figura 3, los niveles de ARN HCV con relación al control pol" son consistentemente más altos en las células Huh-7 transfectadas. La transfección con ARNs SG-Neo (S2204I) y SG-Neo (5Ap47) resulta en incrementos de 410 y 28 veces, respectivamente, en células Huh-7.5 (figuras 3, senderos 4 y 5) en comparación a solo 85 y 6 veces en células Huh-7 (figuras 3, senderos 10 y 11). Debido a que estos incrementos se miden en relación al control pol" defectuoso de replicación, estos reflejan la acumulación de ARN sintetizado nuevo versus la degradación de ARN de entrada. En la células Huh-7.5 y Huh-7, el nivel de ARN pol" residual declinado por cerca de 10 veces en cada punto de tiempo. En las células Huh-7.5, el ARNs tienen capacidades replicativas buenas {similar a SG-Neo (S2204I)} que tienden a acumularse con el tiempo de tal manera que cerca de un incremento de 10 veces se observa durante 96 horas. Aquellas con capacidad replicativa inferior {similar a SG Neo (5Ap47)} permanecen constantes o declinan ligeramente, pero nunca al nivel del control pol". Para las células Huh-7, la ilustración es de alguna forma diferente. Por ejemplo, ARN SG Neo (S2204I) permanece relativamente constante mientras que ARN SG-Neo (5Ap47) disminuye con el tiempo, pero nuevamente, no al grado del control pol". Este hallazgo es reflejado por la frecuencia de células NS3-positivas según se mide por el análisis FACS. El porcentaje de células NS3-positiva es consistentemente más alto en las células Huh-7.5 {21 % para SG-Neo (S2204I) y 5% para SG-Neo (5Ap47); figura 3, senderos 4 y 5} en comparación a las células Huh-7 {3% para SG-Neo (S2204I) y no detectabie para SG-Neo (5Ap47) y ARNs pol"; figura 3, senderos 7, 10 y 11}. Estos resultados confirman la conclusión inicial de que una fracción más grande de células Huh-7.5 soportan niveles detectables de replicación de HCV. La frecuencia más baja de células antígeno-positivo HCV cuantificada por FACS en comparación a la eficiencia de transducción G418 se puede atribuir a la sensibilidad del análisis FACS, que varia con diferentes anticuerpos HCV-específico (observaciones no publicadas).

La acumulación de proteína de HCV es examinada por células marcadas metabólicamente 96 horas después de la transfección. Las monocapas celulares son marcadas con 35S-metionina y cisteina durante 10 horas, seguido por lisis mediada con SDS e inmunoprecipitación de proteínas de HCV con un suero de paciente HCV-positivo (JHF) que reconoce NS3, NS4B y NS5A (Grakoui, A. et al., J. Viral. 67:1385-1395). Después de la separación de proteínas marcadas por SDS-PAGE, NS3, NS4B y NS5A solamente son visibles en células Huh-7.5 transfectadas con SG-Neo (S2204I) (figuras 3, sendero 4). Las proteínas de HCV nunca fueron detectadas en las células Huh-7.5 y Huh-7 transfectadas con células Huh-7 electroporadas con ARN SG-Neo(5Ap47), pol' o SG-Neo (S22041) (figura 3, senderos 1 , 5, 7 y 11 ). Resultados similares se obtienen después del marcado metabólico de ARN de HCV en presencia de actinomicina D (datos no mostrados). Estos análisis demuestran las ventajas de usar células Huh-7.5 para un análisis rápido de replicación de HCV a través de acumulación de ARN, análisis FACS y marcado metabólico de proteínas víricas.

EJEMPLO 11 Eficiencias replicativas de ARNs de HCV subgenómico y qenómico La capacidad de supervisar la replicación de HCV sin la selección elimina la necesidad de replicones bicistronic y permite construcciones con elementos heterólogos mínimos para ser analizados. Un replicón subgenómico es diseñado en donde HCV 5' NTR y los 12 aminoácidos de núcleo son fusionados a ubiquitina seguido por la región de codificación NS3-5B (que incluye la mutación adaptiva S2204I en NS5A) y el 3'NTR {SG-5'Ub-NS3 (S2204I); figura 1}. En esta poliproteína, la hidrolasa con terminal carboxilo de ubiquitina celular es dividida en la unión ubiquitina/NS3 para producir NS3 con un residuo Ala terminal-N auténtico (2, 21). El ARN sintetizado in vitro es electroporado en células Huh-7.5 y Huh-7 y en nivel de ARN HCV cuantificado 96 horas después por RT-PCR. Sorprendentemente, los niveles de ARN de HCV no difieren del control pol" (datos no mostrados), que indican que ARN SG-5'Ub-NS3 (S2204I) presenta fallas para replicar. Es posible que ubiquitina pueda interferir con la producción de una proteína NS3 funcional. Sin embargo, un derivado de bicistronic, donde la expresión de ubiquitina/NS3-5B se encuentra bajo el control de EMCV IRES, es replicado tan eficiente como ARN SG-Neo (S2204I) (datos no mostrados), lo que sugiere que la traducción accionada por HCV IRES puede ser sensible a elementos de ARN presentes dentro de la secuencia de codificación de ubiquitina-núcleo. Un replicón que carece de neo pero que retiene IRES EMCV (derivados de SG-5'??; figura 1 ) también es analizado. Los niveles de ARN SG-5'?? (S2204I) y SG-5' HE (5Ap47) en relación al control pol' se miden 96 horas después de la transfección y se encuentra que son más altos que las versiones seleccionares en ambas células Huh-7.5 y Huh-7 (figura 3). Además, los niveles de ARN SG-5'?? (S2204I) y SG-5'?? (5Ap47) son significativamente más altos en las células Huh-7.5 en comparación a las células Huh-7 (figura 3, senderos 2, 3, 8 y 9). Aproximadamente 52% de las células Huh-7.5 con tinción positiva para el antigeno NS3 después de la transfección de ARN SG-5'?? (S2204I), en comparación al_ 21 % de ARN SG-Neo (S22041) (figura 3, senderos 2 y 4). Similarmente, una frecuencia más alta de NS3 que expresan células Huh-7.5 después de electroporación con SG-5?? (5Ap47) en comparación a SG-Neo (5Ap47) (11% contra 5%; figura 3 senderos 3 y 5). Como se esperaba, las frecuencias más bajas de células NS3-positivo se observan para las células Huh-7 transfectadas (figura 3). Las cantidades relativas de proteínas del HCV marcadas con 35S de células Huh-7.5 y Huh-7 paralelas a la frecuencia de células NS3-positivo y a los niveles de ARN del HCV relativos (figura 3). Estos datos demuestran que los replicones que carecen del gen neo inician la replicación de ARN más eficientemente. Estas construcciones, junto con la sublínea de Huh-7.5 altamente tolerante, son herramientas valiosas para los estudios genéticos en la replicación de ARN del HCV, algunos de los cuales se describen posteriormente en este reporte. La capacidad de las células Huh-7.5 para soportar la replicación de ARN del HCV de longitud completa que contiene S22041 en NS5A {FL (S2204I); figura 1} también se valora. Noventa y seis horas después de la transfección de células Huh-7.5 y Huh-7, los niveles relativos de ARN del HCV y la proteína se miden como se describió anteriormente. Un incremento de 50 veces en el ARN del HCV en relación a pol", se observa después de la transfección de células Huh-7.5, en comparación a sólo un incremento de 3 veces en las células Huh-7 (figura 3, senderos 6 y 12). Similarmente, el análisis FACS y la inmunoprecipitación de proteínas marcadas metabólicamente tiene errores para detectar la expresión de antígeno de HCV en células Huh-7 transfectadas con ARN FL, mientras que el 14% y 10% de células Huh-7.5 que expresan núcleo y antígenos de NS3, respectivamente, y NS3 marcado con 35S, se pueden detectar (figura 3, senderos 6 y 12). La frecuencia de células núcleo-antígeno positivas es consistentemente más alta que lo que se observa para NS3, posiblemente reflejando diferencias en la afinidad de anticuerpo. La capacidad de ARN del HCV de longitud completa para establecer la replicación en células Huh-7.5 demuestra que la replicación no es dependiente de la traducción accionada con EMCV IRES de componentes replicasa codificados con HCV. De hecho, la inclusión de EMCV IRES corrientes abajo del HCV 5' NTR {FL-5'?? (S2204I); figura 1} o la creación de una construcción biscistrónica con el gen neo agrega replicación dañada {FL-Neo (S2204I); figura 1} en relación a ARN FL (2204I) (figura 4). Es interesante observar que todas las construcciones que contienen la secuencia de codificación HCV completa (FL, FL-5'?? y FL-Neo que contienen S2204I) es menos eficiente para establecer la replicación en comparación a los replicones subgenómicos que carecen de la región de codificación NS2-estructural {por ejemplo, SG-5'?? (S2204I); figura 4}. Esto sugiere que los elementos o proteínas de ARN cis codificadas en esta región del genoma puedan sub-regular la eficiencia de replicación del HCV en este sistema. Sin embargo, la capacidad de las células Huh-7.5 para soportar la replicación de ARNs FL y FL-Neo provee sistemas que pueden ser útiles para el estudio de etapas en montaje de partículas y examinar el impacto en el complemento de proteína del HCV completo en la biología de las células huésped.

EJEMPLO 12 Efecto(s) de mutaciones en NS3 y NS5A en la replicación del ARN del HCV De esta forma, la mejor mutación individual que ha sido identificada es la substitución S2204I en NS5A. Para examinar la importancia de lie en esta posición y para observar si la eficiencia de replicación se puede incrementar también, un número de otros aminoácidos se analiza en esta posición y se compara con la eficiencia de replicación de estos replicones para SG-5'?? (S2204I) o el progenitor no modificado, SG-5'?? (S2204) (figura 5). La capacidad replicativa es valorada en células Huh-7.5 transfectadas con ARN al comparar los niveles de ARN del HCV a un control SG-??G. Los niveles comparables de ARN del HCV se observan a 96 horas para replicones que contienen lie o Val en la posición 2204, mientras que una substitución Ala resulta en una reducción de 3 veces en ARN del HCV en comparación a SG-5'?? (S2204I) (figura 5). En contraste, la substituciones de aminoácido restantes reducen dramáticamente el ARN del HCV a niveles similares al replicón parental no modificado, SG-5'?? (S2204) (disminución de aproximadamente 1400 veces; figura 5). Como se esperaba, los niveles de ARN del HCV relativos son inferiores a 24 y 48 horas después de la transfección, sin embargo los niveles son suficientes para valorar la capacidad repllcativa a 48 horas (figura 5). Aunque las substituciones que incrementan la replicacion subgenómica arriba de lo observado con S2204I no se han encontrado, Val y Ala permiten una replicacion de ARN eficiente. La eficiencia de replicacion de replicones subgenómicos que tienen mutaciones adaptivas múltiples en NS5A se investiga. Las mutaciones de NS5A de S2197P, A2199T y S2204I incrementan independientemente la formación de la colonia resistente a G418 aproximadamente 2,500, 15,000 y 20,000 veces, respectivamente (5). Los replicones SG-5'?? (figura 1) que tienen S2204I junto con cualquiera de A2199T, o A2199T y S2197P se construyen y los niveles de ARN del HCV en células Huh-7.5 se miden por RT-PCR. La combinación de estas mutaciones NS5A llevan a una reducción en los niveles de ARN del HCV en comparación a SG-d?? (S2204I), con una disminución de 13 veces para la combinación de A2199T y S2204I y a replicacion despreciable cuando todas las tres se combinan (figura 6). A pesar de la observación de que cada una de estas mutaciones adaptivas NS5A en forma individual incrementan la replicacion, cuando se combinan, la capacidad replicativa de ARNs subgenómico disminuye, lo que sugiere que estas combinaciones son incompatibles. NS3 cambia en las posiciones 112 (Q a R), 202 (E a G) y 1280 (T a I) se diseñan en SG-5'?? (S2204I) (figura 1 ) y su replicacion se compara en células Huh-7.5 al medir los niveles de ARN del HCV, la frecuencia de células antígeno-positivo y a través de la detección de proteínas marcadas con 35S a 96 horas después de la transfección. Los niveles equivalentes de ARN del HCV en relación al control de ARN pol" se observan en cada replicón (figura 7A). El porcentaje de células NS5B-positivo detectado por FACS (~30%; figura 7A) e inmunofluorescencia (figura 7B) también es similar. Sin embargo, la frecuencia de células NS3-positivo es mayor para los replicones que tienen las mutaciones NS3 (~ 73-87%; figura 7A), lo cual simplemente puede reflejar afinidad alterada del anticuerpo NS3-especifico para estos mutantes NS3. Finalmente, los niveles de NS3, NS4B y NS5A inmunoprecipitados son comparables (figura 7A). Aunque no se ha verificado que Q1 112R solamente es adaptivo, Krieger y co-trabajadores previamente refieren que E1202G y T1280I solos o en conjunto incrementan la eficiencia de replicación por ~ 13, 6 y 25 veces, respectivamente (Krieger et al. 2001 ). Estas mutaciones adaptivas NS3 no incrementa adicionalmente la replicación cuando se combinan con S2204I en NS5A.

EJEMPLO 13 Mutagénesis del sitio de fosforilación S2194 NS5A La función de la fosforilación de NS5A en la replicación HCV permanece siendo un misterio. Previamente, las diferencias se observaron en el grado de fosforilación NS5A entre replicones con mutaciones adaptivas diferentes en NS5A (Blight et al. 2000). Por ejemplo, los replicones con S2197P, S2197P o S2204I expresan un mínimo o no p58 según se valora por una separación SDS-PAGE de una dimensiones de NS5A inmunoprecipitado, los que sugiere que la hiperfosforilación de NS5A no es esencial para la replicación del HCV. Recientemente, S2194 en NS5A de un aislado subtipo 1b se identifica como el sitio primario de la fosforilación de p56 (Katze et al.2000). Para valorar el requerimiento posible para la fosforilación de S2194 NS5A, este residuo es mutado en SG-Neo (S2204I) (figura 1) a cualquiera Ala (S2194A+S2204I) o Asp (S2194A+S2204I), para extirpar o imitar la fosforilación, respectivamente. Las eficiencias de transducción G418 de estos replicones en las células Huh-7 es significativamente inferior que SG-Neo (S2204I) (unas 120 y 17 veces menor; figura 8A). Para excluir la posibilidad de que focos resistentes a G418 se generen por la inversión de este sitio, la región de codificación de NS5A es amplificada del ARN celular total mediante RT-PCR y directamente secuenciada. Las substituciones Ala y Asp originales en la posición 2194 se confirman (datos nos mostrados). Para minimizar el impacto de cambios de compensación del segundo sitio, el ARN del HCV y expresión de proteína se miden 96 horas después de la transfección del ARN de células Huh-7.5. Los niveles de ARN del HCV de S2 94A+S2204I y S2194D+S2204I en relación al control pol" fueron ~37 y 5 veces inferior a SG-Neo (S2204I) (figura 8b), consistente con su capacidad reducida para producir células Huh-7 G418 resistentes. Además, una frecuencia más baja de células NS5B-positivo es evidente en S2194A+S2204I a diferencia de S2194D+S2204I (datos no mostrados), y NS3 y NS4B marcados con Sd5 solamente son detectables en células Huh-7.5 transfectadas con SG-Neo (S2204I) y S2194D+S2204I (Fig. 8B). No es posible estudiar directamente el estado de fosforilación de NS5A expresado de S2194+S2204I y S2194+S2204I debido a que los niveles de NS5A expresados en células transfectadas transitoriamente son inferiores al limite de detección (figura 8B y datos no mostrados). Aunque las diferencias cuantitativas en la transducción de G418 y eficiencias de replicación son difíciles de interpretar dada la posibilidad de incompatibilidad de combinar las substituciones de S2194 con el cambio adaptivo de S2204I, estos datos muestran que la fosforilación de S2194 no es un requerimiento absoluto para la replicación de HCV.

Leyendas de la figura La figura 1 es una representación esquemática de ARNs del HCV usado en este estudio. Las estructuras 5' y 3'NTR son mostradas y ORFs se representa como cajas abiertas con ios productos de división de poliproteínas indicados. Los primeros 12 aminoácidos de la región de codificación del núcleo (caja llena), el gen neo (Neo; caja obscura), el E CV IRES (EMCV; líneas llenas) y ubiquitina (cajas sombreadas) se ilustran. Se indican los sitios de las mutaciones adaptivas NS5A S2204I (*) y A47aa. La figura 2 muestra la identificación de líneas Huh-7 altamente tolerantes para la replicación del HCV. Las células Huh-7 que han sido curadas del ARNs subgenómico de autoreplicación a través del tratamiento de IFN extendido, son electroporadas con 1 µ9 de las replicones subgenómicos, SG-Neo (S2204I), SG-Neo (5??47) y SG-Neo (wt). Cuarenta y ocho horas después, las células son sometidas a la selección de G418 y las colonias resultantes son fijadas y teñidas con violeta cristal. Las placas representativas se ilustran con el número de células transfectadas sembradas por discos de diámetro de 100-mm mostradas en la izquierda. Los números posteriores de cada disco se refieren a la eficiencia de transducción de G418 calculada del replicón. Para determinar la eficiencia de transducción de G418, las células transfectadas son valoradas en forma serial de células 5x 105 a 103 por cada disco de diámetro de 100-mm, junto con células alimentadoras electroporadas con el replicón pol". Los focos resistentes a G418 resultantes son contabilizados por al menos de 3 densidades celulares y la eficiencia de transducción de G418 relativa expresada como un porcentaje, después de dividir el número de colonias por el número de células electroporadas inicialmente fijadas en placas. Las eficiencias de transducción similares se obtienen en dos transfecciones independientes. Un replicón subgenómico de polivirus que expresa GFP (véase métodos) es electroporado en paralelo. Basándose en la fracción de células GFP-positivo y citopatognicidad inducida por replicón, -90% de células son transfectadas de manera rutinaria. NT = no analizado. La figura 3 muestra la detección de proteínas del HCV y ARN en células Huh-7.5 y Huh-7 transfectadas de manera transitoria con ARN del HCV. En el panel superior, las células Huh-7.5 y Huh-7 son transfectadas con los replicones subgenómicos, pol" (senderos 1 y 7), SG-5'?? (S2204I) (senderos 2 y 8), SG-5'?? (5??47) (senderos 3 y 9), SG-Neo (S2204I) (senderos 4 y 10), SG-Neo (5??47) (senderos 5 y 11) y FL (S22004I) ARN del HCV (senderos 6 y 12). A 96 horas después de la transfeccion, las monocapas son incubadas durante 10 horas en presencia de metionina y cisteína-35S. Las células marcadas son lisadas, inmunoprecipitadas con suero humano HCV-positivo (JHF, anti-NS3, NS4B y NS5A) y proteínas marcadas separadas por PAGE SDS-10%. Observar que el doble de la cantidad de muestra inmunoprecipitada es cargada en senderos 6 y 12 (2x). Las movilidades de los estándares de las masas moleculares (MW) se indican a la izquierda y la migración de NS3, NS4B, NS5A y 5??47 se muestra a la derecha. En el panel intermedio, el RNA celular total es extraído a 96 horas después de la transfeccion y cuantificado para los niveles de ARN del HCV según se describe en los materiales y métodos. La proporción de ARN del HCV en relación al replicón defectuoso pol" se muestra en (ARN del HCV/pol"). Los niveles del ARN del HCVrelativos al control pol" son comparables en tres experimentos independientes. En los dos paneles inferiores, 96 h después de la transfeccion las células se fijan con paraformaldehído al 4%, se permeabilizan con saponina al 0.1 %, se tiñen en el núcleo del HCV o antígenos de NS3 y se analizan mediante FACS. El porcentaje de células que expresan núcleo y NS3 en relación a un IgG irrelevante con isótopo coincidente se despliega. Los valores <1.5% son considerados negativos (-).

Figura 4. Muestra la acumulación de ARN del HCV después de la transfección de células Huh-7.5 con ARN de HCV de longitud completa. 1-µg de ARN transcrito ¡n vitrio es electroporado en células Huh-7.5 y 2x 105 fijadas en placas en pozos de diámetro de 35-mm. El ARN celular total es aislado a 24, 48 y 96 horas después de la transfección y los niveles de ARN del HCV se cuantifican como se describe en los materiales y métodos. La proporción de ARN del HCV en relación al ARN subgenómico defectuoso pol" (ARN del HCV/??G) es graficada contra el tiempo de la transfección posterior y resultados similares se obtienen cuando este experimento se repite. Figura 5. Muestra los efectos de substituciones alternas en la exposición 2204 en las replicación de ARN del HCV. Las células Huh-7.5 son transfectadas con 1 µg de los replicones SG-5'?? que tienen las substituciones de aminoácido indicadas y 2 x 105 células fijadas en placas en pozos de diámetro de 35-mm. Después de 24, 48 y 96 horas en cultivo, el ARN total celular es extraído y los niveles de ARN del HCV son medidos como se describe en los materiales y métodos. La proporción de ARN del HCV en relación al ARN subgenómico defectuoso pol" (ARN del HCV/pol") es graficada contra el tiempo de post-transfección. El incremento en el ARN del HCV arriba de pol" se indica en cada barra arriba. En esta figura los niveles de ARN del HCV en relación a pol" son los más altos que se han logrado. Cuando estos ARNs son transfectados en células Huh-7.5 una segunda vez se observa un curso similar en la acumulación de ARN del HCV.

Figura 6. Muestra el o los efectos de combinar mutaciones adaptivas NS5A en replicación de ARN del HCV. Los replicones subgenómicos se transfectan en células Huh-7.5 y los niveles de ARN del HCV se cuantifican como se describe en la figura 5. La proporción de ARN del HCV en relación al ARN subgenómico defectuoso pol" (ARN del HCV/??G) se gráfica contra el tiempo de transfección posterior y el incremento en pol" arriba de ARN del HCV se indica en cada barra arriba. Un experimento de transfección adicional produce proporciones a ARN del HCV/pol" similares a las ilustradas en la presente. Figuras 7A-7B. Muestran el o los efectos de combinar mutaciones NS3 y NS5A en la replicación de ARN del HCV. Los replicones subgenómicos que carecen de neo se generan llevando S22004I con mutaciones adicionales en NS3. (A) La parte superior, 96 horas después de la transfección de ARN de células Huh-7.5, las monocapas son marcadas con una mezcla de marcado de proteína-S35, lisadas y NS3, NS4A y NS5A se analizan por inmunoprecipitación, PAGE SDS-10% y auto-radiografía. Las posiciones de los estándares de peso molecular se proporcionan en la izquierda y las proteínas HCV-específicas se indican en la derecha. Parte intermedio, el ARN celular total es extraído a 96 h después de la transfección y los niveles de ARN del HCV se cuantifican según se describe en los materiales y métodos. La proporción de ARN del HCV en relación al control negativo pol" se muestra (ARN del HCV/??G). Las proporciones comparables se obtienen en dos experimentos independientes. Dos paneles inferiores, 96 h después de la transfección, las células se fijan con paraformaldehído al 4%, se permeabilizan con saponina al 0.1%, se tiñen para NS3 HCV y antígenos NS5B y se analizan mediante FACS. El porcentaje de células que expresan NS3 y NS5B en relación a un IgG irrelevante de isótopo coincidente se despliega. Los valores <1.5% se consideran negativos (-). (B) Las células transfectadas sembradas en correderas de cámaras de ochos pozos se fijan, se permeabilizan y tiñen para NS5B mediante inmunofluorescencia después de 96 horas en cultivo. Los núcleos son contrateñidos con Hoescht 33342 y las células teñidas son visualizadas por microscopía fluorescente (amplificación x40). Las figuras 8A-8B. Muestran el efecto de las mutaciones de S2194A y S2194D en la replicación de ARN del HCV. S2194 se reemplaza con Ala o Asp en el replicón bicistrónico seleccionable SG-Neo (S22041 ) y ARN transcrito ¡n vitro. (A) transcritos de ARN son transfectados en células Huh-7 y colonias G418-seleccionadas son fijadas y teñidas con violeta cristal. Las eficiencias de transducción G418 relativas se indican posteriormente en cada disco. (B) Noventa y seis horas después de la transfección las células Huh-7.5 se marcan con metionina y sisteína-S35 durante 10 horas. Las células son Usadas, y las proteínas del HCV aisladas por inmunoprecipitación usando un suero de paciente específico para NS3, NS4B y NS5A. Las proteínas del HCV y las posiciones de los estándares de peso molecular de la proteína (en kilodaltons) se muestran. La proporción de ARN del HCV en relación al control negativo pol" 96 horas después de la transfección se muestra posteriormente en cada línea (ARN del HCV/?? ). Los resultados ¡lustrados son representativos de dos transfecciones independientes. Se pueden realizar diversas modificaciones en las construcciones y métodos descritos e ¡lustrados en la presente sin desviarse del alcance de la invención, se pretende que toda la materia contenida en la descripción anterior o mostrada en los dibujos anexos se deba interpretar como ilustrativa y no como limitativa. De esta forma, la amplitud y alcance de la presente invención no se deben limitar por ninguna de las modalidades ejemplares descritas anteriormente.

CUADRO 1 Oligonucleótidos usados en este estudio Nombre Secuencia (- CCCICrAGAAa3CCCCGAAACCTAGGOTG0CO 1030 (- 0:crCTAGAa_a£a^AATITCCI 3GAC 1184 (+OGACGGia_i¿_£GTAGGCTGGCCACGGGATCTCCOT AATTGA CCCGCT ( ATTGGIQIACA rrGGGIGATrGG (+)TCTGG4ílQ£n:CrraAAGACA (i £_-&A¿_£GTA (X^ (+)AGACGS2_I-ii---^AGGCTGGCCAGGGGAra 1322 (+)AGACGGCIAA^GTAGGCrGGCCAGGGGATCTCCrCCC^^ (+)AGACGQ02 -rcAGaGaAOTCCCCCCTCCTra ÍHOAGACQGia^GJIGTACHK GGCCAGaGaAICTCCCrc^ . C+)AGACC£lCIAAGCGrAGGC GGCCAGGGGATtnra:rc^ (-)CCGQCCI-iGATACCiTGAT(K3CGG (+)CCGA_CGjaCACCAATCIGGACXM X3AOT :Gq3IS^CCGAGGGGTTGCGMGCCGGTG0ACTITC^ (+XX¾CGi:i_^A5£GTAGGCTGGCCAGGGGAíH^CCCCCCTCCTTGGCCAGCrC (+)CCACSiCIA¿G£GTAGGCTGGCCAGGGGAG^ICCCCCCrCCrrGGCCAGCTC aLos cambios de nucleótido son resaltados en la sangre y el codón resultante es subrayado. bLos sitios de restricción usados para la clonación del ADNc son subrayados. cLas polaridades de los oligonucleótidos se indican en el sentido (+) del ARN de genoma del HCV o en su complemento (-).

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1. - Un método para producir una línea celular tolerante para la replicacion del virus de hepatitis C (HCV), que comprende (a) el cultivo de células infectadas con el HCV; (b) el curado de células de (a) del HCV; y (c) identificar una sublínea de células curadas de (b) que son tolerantes para la replicacion del HCV. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la etapa de curado de (b) comprende someter las células infectadas de (a) al tratamiento con un agente antiviral. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el agente antiviral es una citocina antiviral. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la citocina antiviral es ¡nterferón. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células de (a) son células de vertebrado. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque las células de vertebrado son células de humano. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células de (a) son células de hepatocito. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque las células hepatocito son células de hepatocito de humano. 9 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la sublínea de (c) soporta la replicación del HCV a una frecuencia de por lo menos 30%. 10. - Un método para producir una línea celular tolerante para la replicación del HCV, el método comprendiendo: (a) proveer una línea celular que comprende un ARN del HCV genómico o subgenómico de replicación; (b) curar la línea celular de (a) del ARN del HCV; (c) Identificar la sublínea de la línea celular curada de (b) que son tolerantes para la replicación del HCV. 1 1. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el curado de la etapa (b) comprende el tratamiento con un agente antiviral. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el agente es una citocina antiviral. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la citocina antiviral es interferón. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la línea celular de (a) comprende un ARN del HCV subgenómico de replicación que no contiene mutaciones adaptivas. 15. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la línea celular de (a) comprende un ARN del HCV subgenómico de replicación que comprende una mutación adaptiva. 16. - Una línea celular que es tolerante para la replicación del HCV, en donde la línea celular es producida mediante el curado de una línea celular huésped infectada con el HCV y la selección después de sublíneas curadas que son tolerantes para la replicación del HCV. 17. - La línea celular de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el curado comprende el tratamiento de la línea celular huésped con ¡nterferón. 18. - Una línea celular que es tolerante para la replicación de ARN del HCV, en donde la línea celular ha sido curada del ARN del HCV mediante tratamiento con interferón. 19. - Un método para producir una línea celular que es tolerante para la replicación de ARN del HCV, el método comprendiendo: (a) transfectar células huésped con ARN del HCV de replicación, (b) someter las células huésped a condiciones que curan las células huésped de ARN del HCV; (c) seleccionar las poblaciones celulares curadas de (b), (d) dejar crecer las poblaciones celulares curadas seleccionadas de (c) para generar una línea celular que es tolerante para la replicación de ARN del HCV. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el ARN del HCV de la etapa (a) es ARN del HCV subgenómico. 21- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la etapa (b) comprende el tratamiento de las células huésped con una gente antiviral. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque el agente antiviral es una citocina antiviral. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la citocina antiviral es interferón. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la interferón es interferón-a. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la línea celular de (d) soporta replicación de ARN del HCV a una frecuencia de entre cerca de 10% y cerca de 75%. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la línea celular de (d) soporta replicación de ARN del HCV a una frecuencia de entre cerca de 10% y cerca de 30%. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la línea celular de (d) soporta replicación de ARN del HCV a una frecuencia de por lo menos el 30%. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la línea celular de (d) soporta replicación de ARN del HCV a una frecuencia de por lo menos el 50%. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la célula huésped es una célula de vertebrado. 30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la célula huésped es una célula de humano. 31. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque la célula huésped es una célula de hepatocito. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la célula huésped es una célula de humano. 33. - Una línea celular producida por el método de conformidad con la reivindicación 19. 34. - La línea celular de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque la célula huésped contiene ARN del HCV subgenómico. 35. - La línea celular de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque el ARN del HCV subgenómico comprende una mutación adaptiva. 36.- La línea celular de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque la mutación adaptiva es S22041 , dicha posición estando identificada por el alineamiento con el genoma de HCV de longitud completa de genotipo 1b Con1 (acceso a genbank no. AJ238799) que inicia con la región de codificación del núcleo. 37.- Una línea celular producida por el método de conformidad con la reivindicación 1. 38.- Una línea celular producida por el método de conformidad con la reivindicación 10.