JP6427100B2 - 初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞を産生する方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年８月３１日出願の米国特許仮出願第６１／６９６，０５９号および２０１３年２月６日出願の米国特許仮出願第６１／７６１，５８８号の優先権の利益を主張し、それぞれの出願は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

序文
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、急性および慢性肝炎を引き起こす、フラビウイルス科の小型でエンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。罹患した個体に硬変症、肝細胞癌および脂肪症を引き起こし得る。９．６ｋｂゲノムのＨＣＶは、同時翻訳で、および翻訳後に切断される約３，０００アミノ酸ポリタンパク質をコードする、単一のオープンリーディングフレームから構成される。幾つかの研究は、ＨＣＶ感染を支持するヒト因子を報告している（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６：１６４１０−１６４１５；Ｒｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ９：３２−４５）。これらの因子の相当数が、小胞組織化、または膜および脂質関連遺伝子において役割を果たす。一方、ＨＣＶタンパク質も、例えば、膜状網の形成、先天性免疫経路の調節、および脂質合成経路の誘発により、感染した細胞において転写変化を誘発することが知られている（Ｂｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ９：９１２−９２３；Ｂｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８５：２５６０２−２５６１２；Ｊｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ５：ｅ１０００２９１；Ｓｉｎｇａｒａｖｅｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｃｉ ８：５；Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ３：３７；Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ２：ｅ５９）。

サブゲノム完全長レプリコン系およびＪＦＨ−１感染モデルは、ＨＣＶ翻訳、ならびにＲＮＡ複製、侵入、および放出についての洞察を与えている。これらのモデルの大部分は、ＨｕＨ−７またはＨｕＨ−７誘導細胞に基づいている。ＨｕＨ−７（または誘導）細胞の使用は、ＨＣＶのインビトロ研究にとって多くの利点を有する。これらは容易に利用可能であり、急速に分裂し、したがって大規模実験を可能にする。しかし、これらの系は、肝細胞が通常は非分裂性であり、完全に分化しているので、インビボにおける天然のＨＣＶ感染の際に生じる事象を正確に表すとは限らない。このことを克服するために努力がなされており、１〜２％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、極性の非プロトン性溶媒）を細胞培養培地に添加して細胞の増殖を停止すること（Ｓａｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０：１０２５３−１０２５７）により、肝細胞特異的遺伝子の発現の誘導をもたらしている。

新たに単離された初代ヒト肝細胞は、論理的には、ＨＣＶ感染性を研究するより代表的なインビトロモデルである。しかし、これらの細胞により産生されるウイルスの量は低く（典型的には、１０^３ＲＮＡコピー／ｍｌ未満）、長期間の実験（数日を超える）では、これらの細胞を他の細胞型と同時培養しなければならない（Ｂａｎａｕｄｈａ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，５１：１９２２−１９３２；Ｐｌｏｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１０ ｖｏｌ．１０７ ｎｏ．７ ３１４１−３１４５）。したがって初代肝細胞は、大規模ウイルス産生には適していない。

ＨＣＶウイルス力価は、１ｍｌあたり約１０^６〜１０^７ＲＮＡコピー（細胞１個あたり１個のウイルス）のＨｕＨ−７またはＨｕＨ−７誘導細胞によって達成されている。しかし、これらのウイルス力価は、一般に、商業的な規模のウイルス粒子産生をもたらすには低すぎる。加えて、ＨｕＨ７．５細胞の感染は、異型ＨＣＶ変種のＪＦＨ−１によってのみ可能である。

初代ヒト肝細胞のインビトロモデルとして機能し得る培養系の分野において、必要性が存在する。

本開示は、初代ヒト肝細胞表現型を示すヒト肝細胞の細胞系のインビトロ培養物に関する方法および組成物を提供する。そのような細胞系は、ＨＣＶまたはＨＢＶのような向肝性ウイルスによる感染に感受性があり、ウイルス複製および高レベルのウイルス粒子産生の両方を支持する。そのようなインビトロ培養物は、向肝性ウイルスの産生および研究、同じくスクリーニングの方法（例えば、抗ウイルス薬のため、薬剤代謝を評価するため）、ならびに初代ヒト肝細胞の研究における使用が見出される。

本開示は、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞を含む細胞培養物を産生する方法を提供し、その方法は、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えて培養することを含み、前記培養することは、ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発する。幾つかの実施形態において、培養培地は、約１％〜２０％のヒト血清、任意には約２％〜１０％のヒト血清を含む。幾つかの実施形態において、ｈＨＣＣ細胞系は、ＨｕＨ−７またはＨｕＨ−７誘導細胞系である。幾つかの実施形態において、培養することは、ヒト血清を含む培養培地における１０日間の培養の後の継代培養を伴わないで実施することである。本開示は、そのような培養方法により産生される細胞を含む細胞培養物を更に提供する。

本開示は、ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞を含む細胞培養物を提供し、細胞は、ｈＨＣＣ細胞系の分化後代であり、培養培地はヒト血清を含んでいる。幾つかの実施形態において、細胞培養物は、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、もしくは少なくとも２１日間、またはそれ以上にわたって連続的に維持される。幾つかの実施形態において、培養培地は、約１％〜２０％のヒト血清、任意には約２％〜１０％のヒト血清を含む。幾つかの実施形態において、ｈＨＣＣ細胞系は、ＨｕＨ−７またはＨｕＨ−７誘導細胞系である。

本開示は、ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞に対する候補作用物質の効果を評価する方法であって、本開示の分化細胞培養物を候補作用物質と接触させることと、ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞の表現型に対する候補作用物質の効果の不在の存在をアッセイすることと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、アッセイすることは、初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞による脂質代謝に対する候補作用物質の効果についてである。他の実施形態において、アッセイすることは、初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞による超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および／または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の分泌に対する候補作用物質の効果についてである。

本開示は、ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞による作用物質の代謝を評価する方法であって、本開示の分化細胞培養物を作用物質と接触させることと、作用物質の代謝産物および／または作用物質の不在の存在をアッセイすることと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、作用物質は薬剤である。

本開示は、ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞に対する作用物質の毒性を評価する方法であって、本開示の分化細胞培養物を作用物質と接触させることと、細胞に対する作用物質の毒性を示す、細胞の表現型における変化の不在の存在をアッセイすることと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、アッセイされる表現型は、培養培地におけるトランスアミナーゼの増加、および／または細胞死のマーカーついてのアッセイである。

本開示は、ウイルス粒子を産生する方法であって、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、前記インキュベートすることが、ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、向肝性ウイルスのゲノムを、ｈＨＣＣ細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞の少なくとも１つに導入することと、細胞培養物を、ウイルス粒子の産生に適した条件下で維持することと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、ウイルスゲノムは、感染性ウイルス粒子を培養培地に添加することにより導入される。幾つかの実施形態において、感染性ウイルス粒子は、前記培養の１日目に添加される。幾つかの実施形態において、ウイルスゲノムは、前記インキュベートする前にｈＨＣＣ細胞系に導入される。これらの方法の幾つかの実施形態において、方法は、ウイルス粒子を培養培地から単離することを含む。

本開示は、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、前記培養することが、ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、向肝性ウイルスのゲノムを、ｈＨＣＣ細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞の少なくとも１つに導入することと、を含む方法により産生される細胞を含む、ウイルス感染細胞培養物を提供する。

本開示は、候補作用物質を抗ウイルス活性についてスクリーンする方法であって、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、前記インキュベートすることが、ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、向肝性ウイルスのゲノムを、ｈＨＣＣ細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞の少なくとも１つに導入することと、細胞培養物を候補抗ウイルス剤と接触させることと、細胞培養物を、ウイルス複製に適した条件下で維持することと、ウイルス複製に対する候補作用物質の効果の存在または不在を検出することと、を含み、候補作用物質の不在下と比較した、候補作用物質の存在下でのウイルス粒子産生の減少が、候補作用物質が抗ウイルス活性を有することを示す方法を提供する。幾つかの実施形態において、ウイルスゲノムは、感染性ウイルス粒子を培養培地に添加することにより導入される。幾つかの実施形態において、感染性ウイルス粒子は、前記培養の１日目に添加される。幾つかの実施形態において、ウイルスゲノムは、前記インキュベートする前にｈＨＣＣ細胞系に導入される。

本開示は、抗体を含有することが疑われる試料を抗ウイルス活性についてスクリーンする方法であって、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、前記インキュベートすることが、ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化の誘発することと、向肝性ウイルスのゲノムを、ｈＨＣＣ細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞の少なくとも１つに導入することと、細胞培養物を、抗体を含有することが疑われる試料と接触させることと、細胞培養物を、ウイルス複製に適した条件下で維持することと、ウイルス複製に対する試料の効果の存在または不在を検出することと、を含み、試料の不在下と比較した、試料の存在下でのウイルス粒子産生の減少が、試料が、抗ウイルス活性を有する抗体を含有することを示す方法を提供する。幾つかの実施形態において、ウイルスゲノムは、感染性ウイルス粒子を培養培地に添加することにより導入される。幾つかの実施形態において、感染性ウイルス粒子は、前記培養の１日目に添加される。幾つかの実施形態において、ウイルスゲノムは、前記インキュベートする前にｈＨＣＣ細胞系に導入される。

本開示は、リポタンパク質仲介疾患の治療のために候補作用物質をスクリーンする方法であって、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において少なくとも３日間、少なくとも５日間、幾つかの実施形態では、少なくとも１４日間インキュベートすることであって、前記インキュベートすることが、ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、細胞培養物を、候補作用物質と接触させることと、対照試料と比較した、分化ｈＨＣＣ細胞系により分泌されたリポタンパク質のレベルに対する候補作用物質の効果の存在または不在について細胞培養物をアッセイすることと、を含み、分化ｈＨＣＣ細胞系により分泌されたリポタンパク質のレベルに対する候補作用物質の効果が、候補作用物質がリポタンパク質仲介疾患の治療に使用され得ることを示す方法を提供する。ある特定の実施形態において、細胞培養物は、対照試料と比較した、培養培地における超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および／または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のレベルに対する候補作用物質の効果の存在または不在についてアッセイされる。特定の実施形態において、方法は、アテローム動脈硬化症の治療のために候補作用物質をスクリーンするためであり、ＶＬＤＬもしくはＬＤＬの減少、またはＨＤＬの増加は、候補作用物質がアテローム動脈硬化症の治療に使用され得ることを示す。

本開示は、向肝性微生物（例えば、ウイルス）が感染した培養肝細胞を産生する方法であって、培養肝細胞を、ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清を含む培養培地において感染性向肝性微生物と接触させることを含み、接触させることが、培養肝細胞に向肝性微生物による感染をもたらすのに十分な時間にわたるものである方法を提供する。幾つかの実施形態において、培養細胞は、初代肝細胞または不死化肝細胞の細胞系である。幾つかの実施形態において、培養細胞は分化ｈＨＣＣ細胞である。幾つかの実施形態において、ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清は、ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇しているヒト血清、またはＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇しているウシ胎児血清である。幾つかの実施形態において、感染性の向肝性微生物は向肝性ウイルスである。幾つかの実施形態において、向肝性ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスである。幾つかの実施形態において、向肝性ウイルスは臨床分離株である。

これらおよび他の特徴は、本明細書を検討することによって当業者には明らかになる。

培養条件の時系列の例を示す流れ図である。 ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とヒト血清（ＨＳ）を含有する培養培地における細胞の外観および増殖の差を例示する。図２Ａは、培養物にヒト初代肝細胞（右側パネル）を補充した培地と比較した、ＦＢＳ（左側パネル）およびＨＳ（中央パネル）を補充した培地で増殖させた細胞を示す一連の写真である ウシ胎児血清（ＦＢＳ）とヒト血清（ＨＳ）を含有する培養培地における細胞の外観および増殖の差を例示する。図２Ｂは、ＦＢＳ含有培地（中実円）とＨＳ含有培地（中空円）において維持された細胞培養物における細胞数を示すグラフである。 ＦＢＳまたはＨＳに７または２１日間維持された細胞、ならびに初代肝細胞培地（ＰＨＭ）に維持されたＨｕＨ７．５細胞、および培養物におけるヒト初代肝細胞（初代肝細胞）における、肝細胞分化マーカーのＬＤＬ受容体、アルブミン、およびアルファ１抗トリプシンの発現を示す一連のグラフである。また、肝臓において高度に発現している２つの密着結合タンパク質である、クローディン−１およびオクルーディンの発現が含まれる。 主要な脂質代謝調節因子（肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲα）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファおよびガンマ（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ）が、ＨＳで培養された細胞において全て高度に発現していることを示す一連のグラフである。細胞骨格タンパク質のビメンチンおよびＥ−カドヘリンも、ヒト血清において増殖された細胞において増加している。 ＦＢＳおよび培養初代肝細胞（初代肝細胞）と比較した、２％のＤＭＳＯまたは２％の成体ウシ血清（ＡＢＳ）の存在下で増殖させた細胞への上記記述の分化マーカーの効果を示すグラフである。ＡＢＳおよびＤＭＳＯは、両方とも接触阻害／増殖停止を誘発するが、分化マーカーの発現の増加を誘発しない。 細胞脂肪滴が、ＦＢＳと比較して、ＨＳ（右側パネル）で培養された細胞において増加することを例示する一連の写真である。 ＦＢＳまたはＨＳに維持された細胞のＢｏｄｉｐｙ蛍光の定量化を示すグラフである（ｎ＞４）。 ＨＣＶ株ＪＨＦ−１（「ＪＦＨ」）による細胞の感染の結果を示す一連のグラフであり、細胞はＦＢＳまたはＨＳに培養されている。図６Ａ：ヒト血清または胎児ウシ血清において培養された細胞から産生されたＪＦＨウイルス（ＪＦＨ−ＨＳ 円、ＪＦＨ−ＦＢＳ 四角）による感染後に、ＦＢＳにおいて培養された細胞のウイルス力価。 ＨＣＶ株ＪＨＦ−１（「ＪＦＨ」）による細胞の感染の結果を示す一連のグラフであり、細胞はＦＢＳまたはＨＳに培養されている。図６Ｂ：異なる条件下（ＦＢＳ 中空円、ＨＳ 中実円）で増殖させた細胞のウイルス力価を、同じウイルス（ＪＦＨ−ＨＳ）で感染させた。 ＨＣＶ株ＪＨＦ−１（「ＪＦＨ」）による細胞の感染の結果を示す一連のグラフであり、細胞はＦＢＳまたはＨＳに培養されている。図６Ｃは、ＨＳ培養細胞におけるＪＦＨ−ＨＳと比較した、ＦＢＳ培養細胞におけるＪＦＨ−ＦＢＳの産生のウイルス力価に１０００倍の差を示す。 ＨＣＶ株ＪＨＦ−１（「ＪＦＨ」）による細胞の感染の結果を示す一連のグラフであり、細胞はＦＢＳまたはＨＳに培養されている。図６Ｄ：ＦＢＳ含有培地からＨＳ含有培地への細胞の移動時に（中空円）、またはＦＢＳ含有培地からＨＳ含有培地に移動した１４日後に（中実円）感染させたヒト血清で増殖させた細胞における、高いウイルス力価の長期産生。 ＨＣＶ株ＪＨＦ−１（「ＪＦＨ」）による細胞の感染の結果を示す一連のグラフであり、細胞はＦＢＳまたはＨＳに培養されている。図６Ｅ：２％のＨＳを有する初代肝細胞培地（ＰＨＭ、２％ＨＳ）または２％のＨＳを有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ、２％ＨＳ）において増殖させた細胞のウイルス力価を例示する。 ＨＣＶ感染患者血清（円）、ＨＳ含有培地における培養後にＨｕＨ７．５細胞の電気穿孔により産生されたＪＦＨウイルス（ＪＦＨ−ＨＳ、四角）、または組織培養ウイルスＨＣＶｃｃ（三角）を用いた、キメラＳＣＩＤ／Ａｌｂ−ｕＰＡマウスモデルの感染の結果を示すグラフである。 ＨＣＶに対するヒト血清含有培養物の効果を示す一連のグラフである。パネルＡ：スクロース勾配遠心分離により決定された、ＦＢＳ（円）またはヒト血清（四角）において培養された細胞から産生されたウイルスのウイルス密度；パネルＢ：ＦＢＳまたはヒト血清（ＨＳ）において培養された細胞から産生されたウイルスのウイルス密度分布の定量化；パネルＣ：異なるウイルス変種とのアポリポタンパク質Ｂの会合。ＪＦＨ ＦＢＳ：ＦＢＳで培養された細胞から産生されたＪＦＨ−１；ＪＦＨ ＨＳ：ＨＳで培養された細胞から産生されたＪＦＨ−１；患者の血清。 分化細胞へのアポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質の添加の効果を示す一連のグラフである。左側パネル：ウイルス産生における分化細胞へのヒトＶＬＤＬの添加の効果；右側パネル：ウイルス産生における分化細胞へのヒトＬＤＬの添加の効果。 ２人の異なる患者（患者１：円、患者２：四角、両方とも遺伝子型１Ａ）からのＨＣＶ陽性血清による、ヒト血清に維持された細胞の感染を示すグラフである。 パネルＡおよびＢは、ヒト血液（Ａ）の、およびヒト血清（ＨＳ）において様々な時間の長さで培養されたＨｕｈ７．５細胞の培地（Ｂ）の、トリアシルグリセリドに基づいたリポタンパク質プロファイルを示すグラフである。リポタンパク質の分離は、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を使用して実施した。 ヒト血清（ＨＳ）において様々な時間の長さで培養されたＨｕｈ７．５細胞から取られた培地の、コレステロールに基づいたリポタンパク質プロファイルを示すグラフである。リポタンパク質の分離は、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を使用して実施した。 ヒト血清（ＨＳ）において培養されたＨｕｈ７．５細胞の感染後のＨＢＶ産生を示すグラフである。 ＦＢＳおいて、または異なる時間にわたってヒト血清において培養されたＨｕｈ７．５細胞のＮＴＣＰ発現を示すグラフである。 異なる培養培地（ＦＢＳ、ＨＳ、ならびにヘパリン処理ＦＢＳおよびＨＳ（ＨｅｐＨＳおよびＨｅｐＦＢＳ）におけるＨＣＶウイルス産生の比較を示す一連のグラフである。パネルＡ：ＨＳ（四角）またはＦＢＳ（円）において培養された細胞のウイルス力価。パネルＢ：ＨｅｐＦＢＳまたはＨｅｐＨＳにおいて培養された細胞のウイルス力価。パネルＣ：パネルＢの最初の８日間の拡大図。 ヘパリンカラムを使用したＨＣＶの精製を示すグラフである。ＨＣＶは、それぞれの画分におけるＨＣＶコアタンパク質の定量化によって検出された。 ヘパリンカラムを使用して精製されたウイルスによる、ＦＢＳまたはＨｅｐＨＳにおいて２日間培養された細胞の感染を示す画像である。 マウス継代ＨＣＶ遺伝子型１ａによる（パネルＡ）、またはパネルＡの星印（^＊）により示された時点の細胞の上澄みによる（パネルＢ）ＨＳ培養Ｈｕｈ７．５細胞の感染を示すグラフを提供する。パネルＢの細胞を、ＨＳで分化させ、ＨｅｐＨＳに２日間配置し、次に感染させた。 ＨＳ培養Ｈｕｈ７．５細胞における第Ｉ相代謝遺伝子の遺伝子発現分析を示す。 ＨＳ培養Ｈｕｈ７．５細胞における第Ｉ相代謝遺伝子の遺伝子発現分析を示す。 ＨＳ培養Ｈｕｈ７．５細胞における第ＩＩ相代謝遺伝子の遺伝子発現分析を示す。 ＨＳ培養Ｈｕｈ７．５細胞における第ＩＩ相代謝遺伝子の遺伝子発現分析を示す。

本発明が更に記載される前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、当然のことながら変わり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみであり、本発明の範囲が添付の請求項によってのみ限定されるので、限定的であることを意図しないことが理解されるべきである。

値の範囲が提供される場合、その範囲の上および下限の間の、特に文脈から明白に示されない限り、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在値、ならびにその記述された範囲における他の任意の記述または介在値が、本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上および下限は、独立して、より小さい範囲内に含まれ得、本発明の範囲内にも包含されるが、記述された範囲におけるあらゆる明確な排除限界を条件とする。記述された範囲が一方または両方の限界を含む場合、これらの包含限界のいずれかまたは両方を排除する範囲も、本発明に含まれる。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものに類似または同等のあらゆる方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することもできるが、ここでは、好ましい方法および材料が記載されている。本明細書に記載されている全ての出版物は、出版物が引用される関連する方法および／または材料を開示および記載するため、参照として本明細書に組み込まれる。

本明細書および添付の請求項で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈から明白に示されない限り、複数の参照を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「細胞」への参照は、複数のそのような細胞を含み、「ウイルス」への参照は、１個以上のウイルスおよび当業者に知られているその同等物などへの参照を含む。

本明細書において考察されている出版物は、単に、本出願の優先日の前に開示されたものとして提供されている。本明細書において、先願発明によるそのような公開に先行して本発明には権利がないことを容認していると考慮されるものは何もない。更に、提供される出版物の日付は、実際の出版日と異なることがあり、これは個別に確認する必要があり得る。

例は、本発明をどのように作製し使用するかについて完全な開示および記載を当業者に提供するために提起されており、発明者たちが何を発明として考慮しているかの範囲を制限することを意図せず、下記の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことも意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にする努力がなされてきたが、幾らかの実験誤差および偏差が釈明されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

明確さのため、別々の実施形態の文脈で記載されている本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態に組み合わせとしても提供され得ることが理解される。したがって、簡潔さのため、単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は、別々に、または適切な副組み合わせによっても提供され得る。本発明に関する実施形態の全ての組み合わせは、本発明に明確に包含され、そのような組み合わせが、例えば安定した化合物（すなわち、生物学的活性のために作製、単離、特徴決定、および試験され得る化合物）である化合物である主題を包含する程度に、ありとあらゆる組み合わせが個別に明確に開示されているかのように、本明細書において開示されている。加えて、様々な実施形態およびその要素（すなわち、そのような変数を記載する実施形態に列記されている化学基の要素）の全ての副組み合わせも、本発明に明確に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個別に明確に本明細書に開示されているかのように、本明細書において開示されている。
定義

細胞または細胞培養物は、細胞が、または細胞個体群における細胞およびこれらの後代の相当な割合が、未分化親細胞と異なる望ましい表現型、例えば本明細書に記載されている初代肝細胞の表現型を有する分化細胞と区別される未分化親細胞の形態的特徴を示すとき、「未分化」と記載される。個体群内の未分化細胞のコロニーは、多くの場合、分化している隣接細胞で囲まれていることが理解される。

「増殖環境」は、目的の細胞がインビトロにおいて繁殖、分化、および／または成熟する環境である。環境の特徴には、細胞が培養される培地、存在し得る任意の増殖因子または分化誘発因子、および存在する場合は支持構造（例えば、固体表面上の基質）が含まれる。

「表現型マーカー」は、細胞型の指標である細胞の観察可能な特徴を意味する。表現型マーカーには、細胞のバイオマーカー、形態的特徴、および生理学的機能が含まれる。

「バイオマーカー」は、本明細書で使用されるとき、異なる表現型状態の細胞（例えば、初代肝細胞と比較した未分化ｈＨＣＣ細胞）に異なって存在する、または既知の表現型状態を有する第１の細胞と第２の細胞（例えば、初代肝細胞と比較した分化ｈＨＣＣ細胞）において類似している、有機生体分子（例えば、ポリペプチド）を一般に意味する。バイオマーカーは、第２の表現型状態と比べた第１の表現型状態のバイオマーカーの平均または中央値レベルが統計的に有意な差を表すと計算される場合、異なる表現型状態の間で異なって存在する。統計的有意性のついての一般的な試験には、とりわけ、ｔ−検定、ＡＮＯＶＡ、クラスカル−ワリス、ウィルコクソン、マン−ホイットニー、およびオッズ比が含まれる。バイオマーカーは、単独または組み合わせで、細胞が目的の表現型状態に属する相対的確率の測度を提供する。

個別の細胞または細胞個体群における表現型バイオマーカーの評価において、特に記述のない限り、細胞がバックグラウンドまたは陰性対照レベルを有意に上回るバイオマーカーの検出可能なレベルを示す場合、細胞はバイオマーカーにとって「陽性」であると言われる。特に記述のない限り、バイオマーカーの発現がバックグラウンドまたは対照レベルを有意に上回らない場合、細胞は、バイオマーカーにとって「陰性」であると言われる。

ポリヌクレオチドが任意の適切な人為的操作手段により細胞の中へ移動される場合、または細胞が、ポリヌクレオチドを遺伝した最初に遺伝子改変された細胞の後代である場合、細胞は、「遺伝子改変」または「遺伝子修飾」されたと呼ばれる。遺伝子改変は、改変細胞の後代が同じ改変を有する場合、「遺伝性」であると言われる。

「組織培養適応ウイルス」とは、培養する前に、親ウイルスと比べて、改善された、インビトロ細胞系における複製、インビトロ細胞系における感染性、またはこれら両方のために選択されるように、インビトロ細胞培養物において予め培養されたウイルスを意味する。

本明細書で使用されるとき、適応ウイルスの文脈における「適応突然変異」は、ウイルスが、適応突然変異を有さない複製可能ウイルスと比較して、標的細胞を複製、感染、または複製および感染の両方を行う能力を増加する遺伝子変化を意味する。

「遺伝子修飾ウイルス」とは、天然に生じるウイルスと比べて、遺伝子修飾されたウイルスゲノムから産生されたウイルスを意味する。

「偽型ウイルス」とは、ウイルスに含有されているウイルスゲノムと異なる起源（例えば、異なるウイルス）からの少なくとも１個のウイルスタンパク質（例えば、コートタンパク質）を有するウイルスを意味する。

「初代細胞培養物」は、組織（例えば、肝臓）から直接得た細胞のインビトロ培養物を意味し、不死化していない（例えば、癌性組織からのものではない、または不死化になる培養物を介して形質転換されていない）。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を意味し、これには生化学的に修飾された、または誘導体化されたアミノ酸が含まれ得る。用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および相同性リーダー配列を有し、Ｎ−末端メチオニン残基を有するまたは有さない融合体、免疫学的に標識されたタンパク質などが含まれるが、これらに限定されない融合タンパク質を含む。「ＮＨ_２」は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味し、「ＣＯＯＨ」は、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシル基を意味する。

「保存的アミノ酸置換」は、１個のアミノ酸残基を、アミノ酸側鎖の化学および物理特性（例えば、電荷、サイズ、疎水性／親水性）を共有する別のものと置換することを意味する。「保存的置換」は、以下の群のアミノ酸残基：ｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒの範囲内の置換を含むことが意図される。そのような置換の指針は、ポリペプチドのアミノ酸配列の整列によって導かれ得る。

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用されるとき、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。この用語には、二本および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。既知の種類の修飾、例えば、メチル化のような天然に生じる修飾も含まれる。ポリヌクレオチドが非天然に生じる場合、ポリヌクレオチドは、類縁体による１個以上の天然に生じるヌクレオチドの置換、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、および荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、例えばタンパク質のようなペンダント部分を含むもの（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、介入物を有するもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を含有するもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸など）、のようなヌクレオチド内修飾、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態を含み得る。

単細胞実体として培養される微生物または高級真核細胞系を示す、「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および他のそのような用語は、組み換えベクターまたは他の転移ＤＮＡの受容体として使用され得る、または使用されている細胞を意味し、形質移入された元の細胞の後代を含む。単一親細胞の後代は、天然、偶発的、または意図的な突然変異に起因して、元の親と形態、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体が完全に同一であるとは限らない場合があることが理解される。

「レプリコン」は、任意の遺伝要素、例えば、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律単位として挙動する、すなわち自己制御下で複製が可能なプラスミド、染色体、ウイルス、コスミドなどを意味する。

「ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの複製および／または発現をもたらすように、選択されたポリヌクレオチドを挿入することができるレプリコンを意味する。

「機能的に結合している」は、記載される構成成分が、意図される方法で機能することを許容する関係性にある、近位を意味する。コード配列に「機能的に結合している」、プロモーターのような制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法で結合している。

「形質転換」は、本明細書で使用されるとき、外来性ポリヌクレオチドを、挿入に使用される方法、例えば形質導入、形質移入、または電気穿孔に関わりなく、宿主に導入することを意味する。外来性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えばプラスミドとして維持され得る、または代替的に宿主ゲノムに組み込まれ得る。

「単離されている」は、化合物が天然に生じ得るものと異なる環境にある目的の実体を意味する。「単離されている」は、目的の化合物が実質的に濃縮されている、および／または目的の化合物が部分的もしくは実質的に精製されている試料内にある化合物を含むことが意図される。

「精製されている」とは、本質的に随伴する構成成分から分離された目的の化合物（例えば、ポリペプチド）を意味する。「精製されている」は、製造（例えば、化学合成）の際に随伴し得る構成成分から分離された目的の化合物を意味するために使用することもできる。幾つかの実施形態において、化合物は、天然に付随する、または製造の際に付随する有機分子の少なくとも５０重量％〜６０重量％を含有しないとき、実質的に純粋である。幾つかの実施形態において、調製物は、少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、または少なくとも９９重量％の目的の化合物である。実質的に純粋な化合物は、例えば、天然の供給源（例えば、細菌）からの抽出により、化合物の化学合成により、または精製と化学修飾の組み合わせにより得ることができる。実質的に純粋な化合物は、例えば、化合物を含有する試料を濃縮することによっても得ることができる。実質的に純粋な化合物は、組み換え的または化学合成的産生によっても得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えば、クロマトグラフィー、質量分析法、高速液体クロマトグラフィー分析などにより測定することができる。

本明細書で使用されるとき、用語「決定する」、「評価する」、「アッセイする」、「測定する」、および「検出する」は、定量的、半定量的、および定常的な決定を意味し、このように、用語「決定する」は、「アッセイする」、「測定する」などと本明細書において交換可能に使用される。定量的決定が意図される場合、分析物などの「量を決定する」という語句が使用される。定量的決定または半定量的決定が意図される場合、分析物の「レベルを決定する」、または分析物を「検出する」という語句が使用される。
インビトロ肝細胞の培養の方法および組成物

本開示は、ｈＨＣＣ細胞系を、初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞に分化するのに十分な条件下で、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を培養する方法を提供する。細胞、培養培地、および培養方法の例が、下記により詳細に記載される。

培養方法に使用される細胞
初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞を産生する本開示の方法による使用に適した細胞には、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系が含まれる。「ｈＨＣＣ細胞系」（ヒト肝細胞腫細胞系とも呼ばれる）は、不死化細胞系およびその後代を意味し、不死化細胞系は、ヒト肝細胞起源のもの（例えば、天然に生じる癌性ヒト肝臓細胞、例えば肝細胞癌または肝芽腫を培養して得られる細胞系）である。ｈＨＣＣ細胞系には、ＨｕＨ−７細胞（ＪＣＲＢ０４０３）、ＨｕＨ−７から誘導された細胞系（「ＨｕＨ−７誘導細胞」、例えばＨｕｈ７．５、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８５６１、米国特許第７，４５５，９６９号）、ＨｕＨ−６（ＪＣＲＢ０４０１）ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）、ＨｅｐＧ２誘導細胞（例えば、Ｃ３Ａ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１０７４１）、およびＨｅｐａＲＧ（商標）細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡから入手可能）が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。「誘導細胞」とは、所望の表現型（例えば、親細胞と比べて、ウイルス（例えば、組織培養適応ウイルス（例えばＨＣＶ））のウイルス複製の改善された支持）の選択により単離された参照親細胞の下位個体群（または「亜系」）である細胞を意味する。一例において、ｈＨＣＣ細胞は、ＨｕＨ−７細胞またはＨｕＨ−７誘導細胞（例えば、Ｈｕｈ７．５）である。

本開示の方法による使用に適した細胞を、組み換え遺伝子修飾、例えば構築物による形質移入をする必要なく使用して、例えばウイルス力価産生の増加を促進する、または初代ヒト肝細胞の表現型への分化を促進することができる。

培養培地
ウイルス感染ｈＨＣＣ細胞を含むｈＨＣＣ細胞の維持および繁殖のための培養培地は、非ヒト血清、例えば、子ウシ血清（ＦＣＳ）とも呼ばれる胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、または合成血清（例えばＮｕ−Ｓｅｒｕｍ（登録商標））を含有する任意の適切な培養培地である。一般に、ｈＨＣＣ細胞系の維持および繁殖のための培養培地は、細胞系に適合するように選択され得る。

初代ヒト肝細胞の表現型を有するようにｈＨＣＣ細胞の分化を誘発する本開示の方法において使用される培養培地は、使用される出発細胞系と最も適合するように選択され得るが、ヒト血清（ＨＳ）が非ヒト血清を置換する（例えば、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）の代わりになる）。

一般に、培養培地は、炭素供給源、窒素供給源、無機塩、微量栄養素、緩衝液、および任意に抗生物質を含む。炭素供給源は、アラビノース、セロビオース、フルクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、ラムノース、ラフィノース、ソルビトール、ソルボース、スクロース、トレハロース、ピルベート、スクシネート、もしくはメチルアルニン、または当業者によって決定され得る他の物質が含まれるが、これらに限定されない様々な糖アルコール、ポリオール、アルドール糖、またはケト糖であり得る。

培地は、ポリオールまたはアルドール糖を含有することができる。より特定の実施形態において、培地は、炭素供給源としてマンニトール、イノシトール、ソルボース、グリセロール、ソルビトール、ラクトース、およびアラビノースを約０．１ｈＨＣＣ〜約２０．０重量％の濃度で含む。全ての炭素供給源を、培養の開始前に添加することができる、または培養の際に段階的に、もしくは連続的に添加することができる。培養培地は、窒素供給源、適切な無機塩、適切であれば様々な微量栄養素、増殖因子なども含むことができる。

適切な補充炭素供給源の例には、グルコース、フルクトース、マンニトール、デンプンまたはデンプン加水分解物、セルロース加水分解物、および糖蜜のような他の炭水化物、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、およびフマル酸のような有機酸、ならびにグリセロール、イノシトール、マンニトール、およびソルビトールのようなアルコールが含まれるが、これらに限定されない。

適切な窒素供給源の例には、アンモニアガスおよびアンモニア水を含むアンモニア、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、および酢酸アンモニウムのような無機または有機酸のアンモニウム塩、尿素、硝酸塩および亜硝酸塩、ならびに純粋または粗調製物としてのアミノ酸、肉抽出物、ペプトン、魚粉、魚加水分解物、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ダイズかす加水分解物、酵母抽出物、乾燥酵母、エタノール酵母留出物、ダイズ粉、綿実かすを含む他の窒素含有材料などが含まれるが、これらに限定されない。

適切な無機塩の例には、カリウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、コバルト、亜鉛、銅、モリブデン、タングステン、および他の微量元素、ならびにリン酸の塩が含まれるが、これらに限定されない。

適切な微量栄養素、増殖因子などの例には、純粋もしくは部分的に精製された化合物として、または天然の材料に存在するものとして、補酵素Ａ、パントテン酸、ピリドキシン−ＨＣｌ、ビオチン、チアミン、リボフラビン、フラビンモノヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチド、ＤＬ−６，８−チオクト酸、葉酸、ビタミンＢｉ２、他のビタミン、システインおよびヒドロキシプロリンのようなアミノ酸、アデニン、ウラシル、ウリジン、グアニン、チアミン、およびシトシンのような塩基、チオ硫酸ナトリウム、ｐ−またはｒ−アミノ安息香酸、ナイアシンアミド、ニトロアセテートなどが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、培養培地は、ウリジンおよび／またはシチジンを、それぞれ５０μＭ〜２００μＭを下回る濃度で含有する。

細胞培養物に使用される抗生物質の例には、ペニシリン、ネオマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。

適切な培養培地の例には、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５培地、ＲＰＭＩ １６４０、および初代肝細胞培地（本明細書においてＰＨＭと呼ばれる）が含まれるが、これらに限定されない。追加の培養培地の適合性は、容易に評価することができ、本発明の方法は、培養に使用される細胞培養培地の特定の種類に限定されないが、培地が、ｈＨＣＣ細胞系の増殖を支持することに適していること、およびヒト血清の添加に適していることが条件である。培養培地は、添加された非ヒト血清（例えば、添加されたウシ胎児血清）を含有しないように提供され得る。

一般に、本開示の方法および組成物に使用されるヒト血清は、従来の方法によりヒト対象から得られる。「ヒト血清」は、個人からの血清、ならびに複数の個人から集めた血清の使用が考慮される。「ヒト血清」は、完全なヒト血清、ならびにその細画分を包含する。分化ｈＨＣＣが高レベルのウイルス粒子の産生に使用される場合、ヒト血清細画分は、ヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を含有する、またはヒトＬＤＬが補充される。ヒト血清は、新鮮なものが、または保存（例えば、摂氏−２０度）した後で、使用され得る。ヒト血清は、使用前に熱不活性化され得る。

ヒト血清は、健康なヒト対象、例えば、病原体（例えば、細胞に培養される病原体）による検出可能な感染を有さない、および／または病原体に関して無傷である（例えば、ヒト血清に抗病原体抗体が存在しない）ヒト対象から得ることができる。健康な対象から得たヒト血清の使用は、初代ヒト肝細胞の表現型を有する分化ｈＨＣＣ細胞の培養物が、（例えば、ＨＣＶを用いる）病原体による細胞の感染、および／または細胞における病原体の繁殖を伴う方法に使用されることである。

ヒト血清は、ｈＨＣＣ細胞系の培養および初代ヒト肝細胞の表現型を有するためのその分化に適した任意の濃度で培養培地に存在し得る。例えば、ヒト血清は、少なくとも１％（ｖ／ｖ）、少なくとも２％（ｖ／ｖ）、少なくとも５％（ｖ／ｖ）、少なくとも８％（ｖ／ｖ）、少なくとも１０％（ｖ／ｖ）、またはそれ以上の濃度で存在することができ、約１％（ｖ／ｖ）〜２０％（ｖ／ｖ）、または約２％（ｖ／ｖ）〜１０％（ｖ／ｖ）を有することができる。

ｈＨＣＣ細胞分化を促進する培養方法
一般に、本開示の培養方法は、ｈＨＣＣ細胞系を、初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞へのｈＨＣＣの分化の誘発をもたらすのに十分な条件下で、ヒト血清を含む培養培地に培養することを伴う。図１は、本開示の培養方法の例を提供する。

上記に示されたように、ＨＳにおいて培養する前、ｈＨＣＣ細胞を、通常は非ヒト血清または非ヒト血清代用物（例えば、ＮｕＳｅｒｕｍ（登録商標））を含有する任意の適切な培養培地において培養することができる。ＦＢＳ含有培地中のｈＨＣＣ細胞培養物を、必要であれば、例えば３〜４日毎に継代培養（例えば、トリプシン処理）することができる。ＦＢＳ含有培地において維持する、またはＨＳ含有培地において培養する、のいずれにしても、細胞は、一般にｈＨＣＣ細胞系に適したインキュベーション条件下、例えば３７℃、５％ＣＯ_２で培養される。

ＦＢＳ培養ｈＨＣＣ細胞の、ＨＳ含有培地への移動は、ＦＢＳ培養ｈＨＣＣ単層の解離、ならびにｈＨＣＣ細胞の、ＨＳ含有培地における再懸濁および平板培養によって達成され得る。ＦＢＳ培養ｈＨＣＣ細胞単層の培養物は、任意の適切な方法を使用して、例えばトリプシンを用いる処理によって）解離され得る。トリプシンのような酵素が単層解離の促進ために使用される場合、酵素は、（例えば、血清、例えばＦＢＳまたはＨＳを含有する培養培地により）不活性化され得る。次に、解離された細胞は、遠心分離され、細胞ペレットは、ＨＳ含有培養培地に再懸濁される。次に細胞は、組織培養プレートにおいて適切な密度、例えば約３０％〜５０％で平板培養される。これは、例えば、１０^６細胞／ｍｌの懸濁液の３〜５ｍｌを７５ｃｍ^２のプレートで平板培養することによって達成され得る。

ＨＳ含有培地における培養を開始した後、細胞は、細胞培養物の残りの寿命にわたって継代する必要がない。細胞培養培地は、一般に、３〜４日毎または２〜４日毎に交換される。

任意には、ＨＳ含有培地で平板培養した後、約２〜７日間、約２〜６日間、約２〜５日間、約２〜４日間、または約２〜３日間以内に（例えば、ＨＳ含有培地で培養した細胞が、培養密度またはほぼ培養密度になるとき）、細胞培養物を、例えば単層解離の標準的な技術を使用して（例えば、トリプシンによる処理、続くトリプシンの不活性化により）継代培養し（「分割させ」）、遠心分離し、ＨＧ含有培養培地に再懸濁し、組織培養皿において平板培養することができる。一般に、この段階において、この任意の継代培養の最良の結果は、再平板培養する前に、細胞が約１：２以下に希釈される（すなわち、約５０％以下の希釈）場合に達成される。本開示の方法は、ＨＳ培養細胞がこの方法においてＨＳ含有培養培地への移動のおよそ１週間後までに分裂し得ることをもたらすが（ここでも、最良の結果は、細胞が１：２を越えて分裂しない場合に達成される）、ヒト血清おける約１０日間の培養後のトリプシン処理、および平板培養は、最良の結果をもたらさず、細胞培養物の死と関連した。約１０日後のトリプシン処理の悪影響は、コラーゲン被覆プレートによる細胞の平板培養によって低減され得る。

理論に束縛されることなく、ＨＳ含有培地における約７日間の培養では、細胞は増殖停止になると思われ、この時点で、ＦＢＳ含有培地における増殖と比較して、細胞の分裂は遅くなり、一般に止まる。（図１）したがって、培養方法は、この観察を考慮し、ＨＳ含有培地における培養の際の増殖停止の開始後に細胞の継代培養を回避することができ、例えば、ＨＳ含有培地における約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間の培養の後に継代培養をしない。

図１の本開示の方法の例に記載されているように、理論に束縛されることなく、ＨＳ含有培地における約７日間の培養での細胞の見掛け増殖停止の後、ｈＨＣＣ細胞は、初代ヒト肝細胞の表現型への分化の証拠を見せ始める。ＨＳ含有培地における約１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、もしくは１８日間の範囲内、またはそれ以上の培養では、培養物は、初代ヒト肝細胞の表現型に完全に分化した細胞を含有する。一般に、そのような分化細胞培養物は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、またはそれ以上の分化細胞を含有する。

ｈＨＣＣにおける初代ヒト肝細胞の表現型の誘発に適した培養条件は、一般に、ｈＨＣＣを、ヒト血清（ＨＳ）（例えば、少なくとも２％容量／容量のＨＳ）を含有する適切な培養培地において、少なくとも７日間、通常は１１日間を越えて、通常は少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、もしくは少なくとも２１日間、またはそれ以上の期間にわたって培養することを伴う。

一般に、ＨＳ含有培養培地におけるｈＨＣＣ細胞の培養は、細胞を、１回を越えて継代培養することなく、またはＨＳ含有培地における培養の最初の７日間以内もしくは最初の１０日間以内に継代培養することなく、実施することができる。「継代培養すること」は、培養物において細胞密度が低減するように、培養細胞個体群を分裂（「分割」）させることを意味する。

初代ヒト肝細胞の表現型に分化したｈＨＣＣ細胞は、少なくとも１か月間もしくは少なくとも２か月間、またはそれ以上にわたって培養物に維持され得る。そのような長期間の培養は、継代培養することなく維持され得る。

本開示の方法の例は、図１に概略的に記載されている。例えば、ｈＨＣＣ細胞は、３〜４日毎に継代培養（例えば、トリプシン処理）しながら、ＦＢＳ含有培養培地に維持され得る。ｈＨＣＣ細胞は、継代培養され、ＨＳを含有する培養培地に移動される。ＨＳ含有培地への移動後の２〜４日目に、細胞は、１：２以下に希釈され、任意に継代培養される。ＨＳ含有培地への移動後の７日目に、ｈＨＣＣ細胞は、成長停止の兆候、例えば細胞分化の停止を示し始め（すなわち、個体群における細胞数が有意に増加しない）、細胞は凝集せず（例えば、細胞は、互いに重層せず）、継代培養する必要なく長期にわたって維持され得る）。この時点の後、細胞は継代培養されず、培地は新たなＨＳ含有培地に３〜４日毎に交換される。ＨＳ含有培地への移動後の約１４〜１８日目に、ｈＨＣＣ細胞は、初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞に完全に分化したと思われる。これらの細胞は、培地を新たなＨＳ含有培地交換しながら、少なくとも１か月、２か月、またはそれ以上にわたって培養物に維持される。

分化ｈＨＣＣ細胞を含む組成物
本開示は、初代ヒト肝細胞の表現型を有する分化ｈＨＣＣ細胞を含む細胞個体群を提供する。簡潔さのため、ｈＨＣＣ細胞から分化した、およびヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞は、また、本明細書において「分化ｈＨＣＣ細胞」と呼ばれ得る。「初代ヒト肝細胞の表現型」とは、初代ヒト肝細胞に特徴的な表現型マーカー（例えば、バイオマーカー、細胞の生理学的特徴、および形態的特徴）を発現するか、に従って特徴決定される細胞を意味する。表現型マーカーの外観および数（例えば、下記に記載されるようなバイオマーカー、および／または形態的特徴、および／または生理学的特徴の２つ以上、または３つ以上、または４つ以上、または全て）は、初代ヒト肝細胞の表現型を有する完全分化ｈＨＣＣへのｈＨＣＣ細胞の分化の段階によって決まる。

下記に提供される初代ヒト肝細胞の表現型の表現型マーカーは、一般に、ＨＳ含有培地に少なくとも７日間培養した後にｈＨＣＣにおいて現れ始める。追加の表現型マーカー、ならびに表現型バイオマーカーの発現レベルの増加は、ｈＨＣＣが完全分化ｈＨＣＣになるよう進行しながら、ＨＳ含有培地におけるｈＨＣＣの（例えば、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、もしくは少なくとも１４日間、またはそれ以上にわたる）連続培養によって表れる。

初代ヒト肝細胞の表現型バイオマーカーの特徴には、バイオマーカーのアルブミン、アルファ１−抗トリプシン、およびＬｘＲα／ＮＲ１Ｈ３、ならびに密着結合の形成に関連するクローディン−１およびオクルーディンの発現の２、３、４つ、または全ての発現が含まれる。初代ヒト肝細胞の表現型は、少なくともアルブミンおよびアルファ１−抗トリプシンの発現に対して陽性であると定義され得、これらのバイオマーカーそれぞれの、陰性対照レベルを上回る発現は、初代ヒト肝細胞の表現型を示す（例えば、下記に考察される、ｈＨＣＣがヒト血清の不在下で、ＤＭＳＯを伴う、または伴わないで培養されたときのアルブミンおよびアルファ１−抗トリプシンの発現レベルを上回る）。初代ヒト肝細胞に特徴的な追加の表現型バイオマーカーには、ＬｘＲα／ＮＲ１Ｈ３、クローディン−１およびオクルーディンが含まれる。分化ｈＨＣＣは、陰性対照レベルを上回る（例えば、下記に考察される、ヒト血清の不在下でＤＭＳＯを伴い、または伴わないで培養されたｈＨＣＣの発現レベルを上回る）ＬｘＲα／ＮＲ１Ｈ３、クローディン−１、およびオクルーディンの少なくとも１、２、または３つ全ての発現に対して陽性であると記載され得る。

初代ヒト肝細胞の特徴を有する分化ｈＨＣＣは、陰性対照、例えばトヒ血清の不在下で培養される（例えば、ＦＢＳまたは成体ウシ血清（ＡＢＳ）のような非ヒト血清の存在下で、ＤＭＳＯを伴い、または伴わないで培養され得る）ｈＨＣＣにより発現されたものと比べた、１つ以上の表現型バイオマーカーの異なる発現に関して記載され得る。したがって、例えば、非ヒト血清（例えば、ＤＭＳＯを伴い、または伴わないＦＢＳまたはＡＢＳ）において培養されるｈＨＣＣ細胞の表現型バイオマーカーの発現レベルは、初代ヒト肝細胞の表現型マーカーのアルブミン、アルファ１−抗トリプシン、ＬｘＲα／ＮＲ１Ｈ３、オクルーディン、およびクローディン−１の、初代ヒト肝細胞に特徴的なレベルでの発現に対して陰性であると考慮される。

初代ヒト肝細胞に特徴的な表現型を有する分化ｈＨＣＣ細胞は、アルブミン、アルファ１−抗トリプシン、ＬｘＲα／ＮＲ１Ｈ３、クローディン−１、およびオクルーディンの１、２、３、４つ、またはそれ以上の異なる発現を示すと記載され得、分化ｈＨＣＣにおけるバイオマーカーの発現レベルは、ヒト血清の不在下で培養されるｈＨＣＣのバイオマーカーの発現レベルより有意に大きく、ヒト血清の不在下で培養されるｈＨＣＣと比較して、分化ｈＨＣＣでは少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、またはそれ以上であり得る。

初代ヒト肝細胞の表現型の表現型マーカーには、形態的特徴が含まれる。初代ヒト肝細胞の形態的特徴には、顆粒状の外観、細胞の多角形（例えば、立方体）形状、密着結合の形成、および細胞個体群の敷石様組織が含まれ、多核形成も、多くの場合に初代ヒト肝細胞の典型的な特徴である。

初代ヒト肝細胞の表現型の表現型マーカーには、細胞の正義学的特徴、例えば、初代ヒト肝細胞に関連する細胞活性が含まれる。初代ヒト肝細胞の表現型の生理学的特徴には、アルブミンの分泌、ならびに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込みおよび利用が含まれる。

初代ヒト肝細胞の表現型を有する完全分化ｈＨＣＣは、本明細書に記載されている表現型マーカーの任意の適切な組み合わせにより記載され得、組み合わせは、初代ヒト肝細胞を、初代ヒト肝細胞ではない細胞と区別するのに十分なものである。一般に、初代ヒト肝細胞の表現型を有する完全分化ｈＨＣＣは、アルファ１−抗トリプシンおよびアルブミンの発現に対して陽性であること、ならびに多角形（例えば、立方体）の細胞形状によって識別され得る。完全分化ｈＨＣＣにおいて、アルブミンおよびアルファ１−抗トリプシンは、同じ条件下で培養された初代ヒト肝細胞におけるアルブミンおよびアルファ１−抗トリプシン発現のレベルより有意に低くなく、同じであり得るか、または越え得るレベルでそれぞれ発現され得る。

初代ヒト肝細胞の表現型を有する完全分化ｈＨＣＣは、また、密着結合タンパク質のクローディン−１およびオクルーディンの一方または両方の発現により任意に特徴決定され得る。例えば、初代ヒト肝細胞の表現型を有する完全分化ｈＨＣＣは、クローディン−１およびオクルーディンを、同じ条件下で培養された初代ヒト肝細胞よりも有意に低くなく、同じであり得るか、または越え得るレベルでそれぞれ発現し得る。初代ヒト肝細胞の表現型を有する完全分化ｈＨＣＣは、また、密着結合の存在の形態的特徴により、および／またはＬＤＬ脂質を取り込む、および利用する能力の生理学的特徴によって、特徴決定され得る。

初代ヒト肝細胞表現型のマーカーは、任意の適切な方法により検出され得る。例えば、マーカーは、細胞表面マーカーでは流動免疫細胞化学、または細胞内もしくは細胞表面マーカーでは免疫組織化学（例えば、固定細胞もしくは組切片）のような、任意の適切な免疫学的技術を使用して検出され得る。例えば、細胞表面抗原の発現は、任意には細胞を固定した後、および任意には標識二次抗体もしくは標識化を増幅する他の抱合体を使用して、標準的な免疫細胞化学またはフローサイトメトリーアッセイにより、抗原への特定の抗体の結合によって検出され得る。

遺伝子産物マーカーの発現は、また、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリッド形成分析、または標準的な増幅方法により配列特異的プライマーを使用する逆転写酵素開始ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ｍＲＮＡレベルで検出され得る。特定のマーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベースから得ることができる。

本開示は、個体群における細胞のある割合が初代ヒト肝細胞の特徴を有するように、未分化および分化ｈＨＣＣ細胞の両方を含む培養細胞個体群を提供することができる。例えば、そのような細胞培養物は、個体群における少なくとも約２０％、少なくとも３０、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９８％、またはそれ以上の細胞が、分化ｈＨＣＣ細胞であるもの、例えば、上記に記載された初代ヒト肝細胞に特徴的な表現型マーカーおよび／または形態的マーカーの１、２、３つ、またはそれ以上に対して陽性であるものを含み得る。細胞個体群における未分化ｈＨＣＣ細胞の割合を最小限にすることも、望ましいことがある。ある特定の実施形態において、分化ｈＨＣＣ細胞個体群は、１５％未満、１０％未満、または５％未満の未分化ｈＨＣＣ細胞を有する。

本出願の方法は、初代ヒト肝細胞の表現型を有するｈＨＣＣ分化細胞の大個体群のために提供され得る。初代ヒト肝細胞の表現型を有する少なくとも１０^８、１０^１０、または１０^１２細胞の個体群を、産生することができる。

本開示の組成物は、ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞を含む培養細胞個体群を提供し、細胞は、ｈＨＣＣ細胞系の分化後代であり、培養培地はヒト血清を含んでいる。幾つかの実施形態において、細胞培養物は、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、もしくは少なくとも２１日間、またはそれ以上にわたって連続的に維持される。幾つかの実施形態において、培養培地は、約１％〜２０％のヒト血清、任意には約２％〜１０％のヒト血清を含む。幾つかの実施形態において、ｈＨＣＣ細胞系は、ＨｕＨ−７またはＨｕＨ−７誘導細胞系である。幾つかの実施形態において、培養細胞は、固体支持体（例えば、培養プレートのウエル、ビーズなど）に付着し、固体支持体は、１つ以上の細胞外マトリックス構成成分、例えばコラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン）を含んで、培養細胞の、固体支持体への付着を促進する。

本開示の組成物は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、もしくは８週間、またはそれ以上にわたって培養物に維持されている分化ｈＨＣＣ細胞を含む培養細胞個体群を含む。

ｈＨＣＣ細胞系から分化した細胞は、初代ヒト肝細胞の表現型を示すが、これらはｈＨＣＣ細胞系から誘導されるので、細胞または細胞系由来の分化後代としても特徴決定され得る。したがって、分化ｈＨＣＣは、それらが誘導される細胞と同じゲノムを有する。このことは、任意の核型に加えて、染色体ＤＮＡが、元の親ｈＨＣＣ細胞系と、それらから産生され、かつ初代ヒト肝細胞の表現型を有する分化ｈＨＣＣ細胞との間に９０％を越える同一性あることを意味する。従来の培養方法による親ｈＨＣＣ細胞系の培養に通常関連する遺伝子変化を受けた、または導入遺伝子を導入する、もしくは内在性遺伝子をノックアウトする組み換え法により処理された、分化ｈＨＣＣ細胞は、依然として、それらが誘導された系と同じゲノムを有すると考慮され、それは、全ての非組み換え操作遺伝要素が保存されているからである。分化ｈＨＣＣ細胞およびこれらの親ｈＨＣＣ細胞は、標準的な遺伝子指紋技術により、同じゲノムを有すると識別され得る。

この特徴は、本開示の分化ｈＨＣＣ細胞の貴重な特徴であり得る。例えば、分化ｈＨＣＣ細胞を生成するために同じｈＨＣＣ細胞系を使用することは、異なる時点で生成された分化ｈＨＣＣ細胞の個体群間の変動を低減し得る。

開示の組成物のある特定の実施形態は、初代ヒト肝細胞の特徴を有する分化細胞と組み合わせた起源細胞（例えば、未分化ｈＨＣＣ細胞系または中間体個体群）を含む。２つの個体群は、同じ容器（例えば、同時培養物）の中、同じ施設内の別々の容器の中、または２つの異なる場所のいずれかであり得る。未分化および分化細胞は、同時に、または未分化細胞の培養がその全体を分化ｈＨＣＣに分化させるときのように、異なる時点で存在し得る。

ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清を含有する培養培地を使用する方法および組成物
本開示は、向肝性微生物（例えば、向肝性ウイルス、向肝性寄生虫（例えば、マラリア）など）による培養細胞の感染に使用される方法および組成物も提供する。一般に、方法は、培養細胞を、ＬＤＬおよびＶＬＤＬを含むＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清を含有する培養培地の存在下で、向肝性微生物に曝露して、向肝性ウイルス、例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ）など、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のような向肝性微生物による、培養細胞の感染を促進することを伴う。向肝性微生物が肝炎ウイルスである場合、ウイルスは、任意の遺伝子型（例えば、ＨＣＶ遺伝子型１（例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ）、２、３、４、５、６、および７）であり得、天然に生じるウイルス（例えば、感染した霊長類から得たウイルス、例えば、感染したヒトから得た臨床分離株）、組織培養適応ウイルス、遺伝子修飾ウイルス、キメラウイルス、または偽型ウイルスであり得る。

ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清を使用する方法に使用される細胞は、霊長類の肝細胞、不死化肝細胞の細胞系（例えば、ｈＨＣＣ細胞）、および本明細書に開示されている方法に従って分化されて初代ヒト肝細胞の表現型を示すｈＨＣＣ細胞）のような任意の適切な肝細胞である。本発明は、肝炎ウイルスの臨床分離株、例えばＨＣＶの臨床分離株による、培養肝細胞（例えば、分化されて初代ヒト肝細胞の表現型を示すｈＨＣＣ細胞を含む、初代肝細胞または不死化肝細胞の細胞系）の感染の提供において特定の使用が見出される。

本開示のこれらの方法における培養培地に使用されるＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清は、当該技術において利用可能な任意の適切な方法により調製され得る。方法に使用される血清は、ヒト、ウシ（例えば、胎児ウシ）、または任意の他の適切な供給源であり得る。一例において、ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清は、血清を、結合剤への結合をもたらすのに十分な時間にわたって、ＬＤＬ受容体、例えばヒトＬＤＬ受容体に結合するリポタンパク質の結合剤（例えば、抗ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質抗体（例えば、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、抗ＶＬＤＬ抗体、抗ＬＤＬ抗体、抗アポリポタンパク質Ｂ抗体）、またはヘパリン）と接触させ、続いて結合剤に結合していない血清構成成分を、培養培地に使用するために回収することによって、調製される。「ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清」とは、処理の前の血清（「未処理血清」）と比べて、ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清を意味し、枯渇する前の血清と比べて、ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上枯渇している血清を包含する。１つの実施形態において、ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清は処理前の血清と比べて、ＨＤＬ（ＬＤＬ受容体に有意に結合しない）を実質的枯渇していない。

１つの実施形態において、ＬＤＬ受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清は、血清を、結合剤としてのヘパリンと接触させることであって、接触させることが、血清中のヘパリン結合構成成分（例えば、ＬＤＬ、ＶＤＬ）の、ヘパリンへの結合をもたらすのに十分な時間にわたるものであり、続いてヘパリンに結合しない血清構成成分を、培養培地における使用のために回収することによって、調製される。

本方法に使用される血清には、枯渇する前の血清と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のリポタンパク質を枯渇している血清、枯渇する前の血清と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のヘパリン結合リポタンパク質を枯渇している血清、および／または枯渇する前の血清と比較して、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のアポリボタンパク質Ｂを枯渇している血清が含まれる。

リポタンパク質枯渇血清（例えば、ヘパリン処理血清）を使用する本開示の方法は、細胞（例えば、ｈＨＣＣ細胞、初代ヒト肝細胞、または向肝性微生物による感染に感受性のある他の細胞）に、向肝性微生物を感染させることを伴い、細胞は、リポタンパク質枯渇血清を含有する培地において培養される。感染した後、細胞を任意の適切な培養培地（例えば、分化が望ましいｈＨＣＣ細胞または分化したｈＨＣＣ細胞の維持では、ＨＳ含有培地）に移行され得る。

使用
本開示の方法および組成物を、ウイルス粒子の産生（例えば、ウイルスワクチン生産）、肝細胞機能の研究、およびスクリーニング方法のなどであるが、これらに限定されない様々な方法に使用することができる。使用の例は、下記により詳細に記載される。

ウイルス粒子の産生
本開示の方法および組成物を、ウイルス粒子、とくに肝炎ウイルス、例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ，ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ）など、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のような向肝性ウイルスのウイルス粒子の産生に使用することができる。ウイルスは、任意の遺伝子型（例えば、ＨＣＶ遺伝子型１（例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ）、２、３、４、５、６、および７）であり得、天然に生じるウイルス（例えば、感染した霊長類から得たウイルス、例えば、感染したヒトから得た臨床分離株）、組織培養適応ウイルス、遺伝子修飾ウイルス、または偽型ウイルスであり得る。

本開示のウイルス粒子産生分化ｈＨＣＣ細胞は、任意の適切な方法を使用して達成され得る。例えば、ウイルスゲノムを感染、電気穿孔、形質移入などにより細胞に導入することができる。幾つかの実施形態において、ｈＨＣＣ細胞および／または分化ｈＨＣＣ細胞は、ゲノム組み込みウイルスゲノムをもたらすように、組み換え技術により修飾されない。幾つかの実施形態において、ｈＨＣＣ細胞および／または分化ｈＨＣＣ細胞は、ウイルスゲノムに対して在来的ではないプロモーターに機能的に結合するゲノム組み込みウイルスゲノムを含むため、遺伝子修飾されない。

ウイルスゲノムは、ＨＳ含有培地における分化の前、ＦＢＳ含有培地からＨＳ含有培地への移行時、ＨＳ含有培地における培養による分化の際に（例えば、ＨＳ含有培地への移行の１、２、３、４、５、もしくは６日後）、または増殖停止、および／もしくは初代ヒト肝細胞の表現型への分化後（例えば、ＨＳ含有培地への移転の７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、もしくはそれ以上後）に、ｈＨＣＣ細胞に導入され得る。

ウイルスゲノムが感染により導入される場合、感染は、上記に記載されたリポタンパク質枯渇（例えば、ヘパリン処理）血清（例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清）を含有する培養培地において実施され得る。任意には、感染の後、細胞をＨＳ含有培地に移行して、例えば、ｈＨＣＣ細胞の分化を提供すること、および／または細胞生存力を促進する。１つの実施形態において、未分化または分化ｈＨＣＣ細胞は、リポタンパク質枯渇血清を含有する培養培地において、細胞に添加されたウイルス粒子の感染を可能にする時間にわたって培養される。感染期間の後、培養培地は、ＨＳ含有培地に交換され、ｈＨＣＣ細胞の分化をもたらす時間にわたって培養された細胞は、ｈＨＣＣ細胞の分化を続ける、および／または分化ｈＨＣＣ細胞の維持をもたらし、ウイルス粒子の産生をもたらす。

本開示は、培養培地１ミリリットルあたり、少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、もしくは少なくとも１０^９、またはそれ以上のウイルス粒子を含む、分化ｈＨＣＣ細胞の培養物を提供する。本開示の組成物は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、もしくは８週間、またはそれ以上にわたって維持されている、そのようなウイルス粒子産生培養物を更に提供する。

ＨＳにおいて培養されたｈＨＣＣ細胞から産生されたウイルス粒子は、それらを、非ヒト血清（例えば、ＦＢＳ）において培養されたｈＨＣＣ細胞において産生されたウイルス粒子から区別する構造的特徴を示す。例えば、ＨＳにおいて培養された分化ｈＨＣＣ細胞により産生される場合、ウイルス粒子は、ＦＢＳにおいて培養されたｈＨＣＣ細胞から産生された場合よりも低い平均密度を有する。例えば、ＨＣＶ粒子がＦＢＳ培養ｈＨＣＣ細胞から産生される場合、約７５％のウイルス粒子が約１．１６ｇ／ｍｌを越える密度を有する。対照的に、ＨＣＶ粒子がＨＳ培養ｈＨＣＣ細胞から産生される場合、ＨＣＶ粒子は、平均密度の低いものであり、個体群の僅か約２５％のＨＣＶ粒子が、１．１６ｇ／ｍｌを越える密度を有する。加えて、ＨＳ培養ｈＨＣＣ細胞から産生されるＨＣＶ粒子は、アポリポタンパク質Ｂと会合し、産生されたウイルス粒子個体群の通常少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、またはそれ以上のＨＣＶ粒子がアポリポタンパク質Ｂと会合する。

分化ｈＨＣＣ細胞から産生されたウイルス粒子を様々な方法に使用することができる。例えば、分化ｈＨＣＣ細胞から産生されたウイルス粒子を、細胞培養培地から単離し、ワクチンとしての投与に適するように処方することができる。ウイルス粒子を、研究設定において、例えばヒトキメラマウスモデルのような動物モデルの感染のために使用することができる。分化ｈＨＣＣ細胞個体群は、ウイルス、とりわけ向肝性ウイルスの研究に使用される研究ツールも提供する。

アッセイ
本開示の分化ｈＨＣＣは、様々なアッセイにおける使用が見出される。例えば、分化ｈＨＣＣは、ヒト肝細胞のモデルとして、したがって肝臓機能および疾患（例えば、発癌、脂肪症（脂肪肝疾患））のモデルとして役立ち得る。他の使用には、リポタンパク質代謝および分泌、ならびに生物学的中間体と生体異物化合物（例えば、チトクロームＰ４５０による酸化）の両方についての代謝研究が含まれる。

本開示の分化ｈＨＣＣを使用するアッセイは、例えば、初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞に対する作用物質の効果を評価すること、例えば、ヒト肝細胞機能に対する作用物質の効果を評価すること（例えば、作用物質の肝臓毒性を評価すること）、ヒト肝細胞による作用物質の代謝を評価すること、肝細胞機能に関与するメカニズムを研究すること、などを伴い得る。分化ｈＨＣＣ細胞を使用して、ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞の特徴に影響を与える作用物質（例えば、溶媒、小分子薬剤、ペプチド、ポリヌクレオチド）、および／または環境条件（例えば、培養条件もしくは操作）をスクリーンすることができる。

作用物質（例えば、候補作用物質）の活性の評価は、一般に、分化ｈＨＣＣ細胞を、単独の、または他の作用物質（例えば、既知の活性を有する薬剤）と組み合わせた作用物質と接触させることを伴う。十分な時間にわたるインキュベーションの後、適切なアッセイを実施して、あるとしたら、分化ｈＨＣＣ細胞に対する候補作用物質の効果を（例えば、細胞形態の変化、細胞機能、ヒト初代肝細胞の表現型のマーカーの変化を評価することにより）検出する。表現型に対する作用物質の効果の存在または不在は、例えば、対照と比較することにより（例えば、作用物質の不在下での表現型との比較により、および／または肝臓細胞に対する既知の効果を有する作用物質の存在下での表現型との比較により）、検出および分析される。

例えば、アッセイがリポタンパク質代謝に対する候補作用物質の効果を評価するためである場合、アッセイは、候補作用物質の不在下と比較した、候補作用物質の存在下での表現型マーカーの変化、例えば形態的変化（例えば、分化ｈＨＣＣ細胞の脂質構成の変化の存在もしくは不在（例えば、脂肪滴の存在もしくは不在、および／またはそのような脂肪滴のパターンの変化に示されるような））、あるいはリポタンパク質または脂質のようなバイオマーカーの変化（例えば、リポタンパク質または脂質のレベルの変化）を検出することを伴い得る。候補作用物質の不在下と比較した、候補作用物質の存在下での表現型マーカーの変化は、候補作用物質がリポタンパク質代謝に対して効果を有することを示す。

１つの態様において、本明細書に提供されている分化ｈＨＣＣ細胞のいずれかのリポタンパク質分泌に対する候補作用物質の効果を評価する方法が、本明細書に提供されている。下記の実施例において考察されるように、ヒト血清を含有する培養培地において少なくとも３〜５日間またはそれ以上にわたって培養されるヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系は、リポタンパク質（例えば、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）を分泌する。ヒト血清を含む培養培地における１４日間以上の培養によって、ｈＨＣＣ細胞は、培養物における初代ヒト肝細胞により分泌されたレベルに酷似する、またヒト血清において見出されるリポタンパク質レベルに酷似するレベルでリポタンパク質を分泌する。したがって、ヒト血清において培養されたｈＨＣＣ細胞の分泌されたリポタンパク質のプロファイルは、初代ヒト肝細胞により分泌されたリポタンパク質のプロファイル、およびヒト血清において見出されるリポタンパク質のプロファイルに類似している。このように、候補作用物質の不在下と比較した、候補作用物質の存在下でのリポタンパク質分泌のレベルの変化は、候補作用物質がリポタンパク質分泌に対して効果を有することを示す。

ある特定の実施形態において、方法は、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ＨＳ含有培地において１４日間を越えてインキュベートするステップを含む。ｈＨＣＣ細胞系を、本明細書に記載される任意のＨＳ含有培地において３日間以上にわたって培養することができる。ある特定の実施形態において、ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系は、候補作用物質との接触の前に、ＨＳ含有培地において３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０、またはそれ以上の日数にわたって、培養される。

ｈＨＣＣ細胞系を選択された期間にわたって培養した後（例えば、所望の分泌リポタンパク質プロファイルを提供するため）、次に細胞系を候補作用物質と接触させる。候補作用物質には、合成、天然に生じる、または組み換え的に産生された分子（例えば、小分子、薬剤、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、真核または原核細胞に存在する内在性因子（例えば、ポリペプチド、植物抽出物など））など）が含まれるが、これらに限定されない。候補作用物質には、多数の化学部類の作用物質が含まれるが、典型的には、これらは有機分子、好ましくは、５０超から約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小型有機分子である。候補作用物質には、抗体、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類縁体、核酸阻害剤、またはこれらの組み合わせであるが、これらに限定されないような生体分子が含まれる。

方法は、様々な量の候補作用物質（作用物質なし、から培養細胞の毒性限度内で送達され得る量の上限に近づく量の作用物質）の投与を伴い得、異なる製剤による作用物質の送達を含み得る。作用物質は、単独で投与され得る、または２つ以上の組み合わせに組み合わせることができ、例えば候補薬剤併用療法の効果が評価される。

候補作用物質と共に十分な時間インキュベートした後、適切なアッセイを実施して、あるとすれば、分化ｈＨＣＣ細胞がリポタンパク質を分泌することに対する候補作用物質の効果を、検出する。ある特定の実施形態において、方法は、ＨＳ含有培地においけるリポタンパク質（例えば、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、および／またはＨＤＬ）のレベルを評価するステップを含む。ｈＨＣＣ細胞により分泌されるリポタンパク質のレベルは、任意の適切な方法により評価され得る。例えば、分泌されるリポタンパク質のレベルは、リポタンパク質プロファイルを得るために培養ｈＨＣＣ細胞から収集された培地をアッセイすること（ＨＤＬ、ＬＤＬ、および／またはＶＬＤＬ、コレステロール、ならびにトリグリセリドのレベルの測定）によって評価され得る。リポタンパク質プロファイルは、例えば、超遠心分離を使用して、または液体クロマトグラフィー技術により、得ることができる。例えば、Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（６）：９６０−９６４を参照すること。ある特定の実施形態において、リポタンパク質プロファイルは、ｈＨＣＣ細胞の培養に使用された培地を単離すること、およびリポタンパク質を、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィーの使用により培地から分離することによって得られる。続いて脂質含有物（例えば、コレステロールまたはトリアシルグリセロール）を、蛍光に基づいた液体検出方法を含む任意の適切な液体検出方法によって測定することができる。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ １６５（２）：１３３−４１を参照すること。

リポタンパク質分泌に対する候補作用物質の効果の存在または不在は、対照試料（例えば、作用物質と接触していないｈＨＣＣ細胞の培地から得た対照リポタンパク質プロファイル）と比較することによって決定される。そのような実施形態において、対照試料と比較した、候補作用物質の存在下でのリポタンパク質レベルの差は、候補作用物質がリポタンパク質分泌に対して効果を有することを示す。任意の適切な試料が、候補作用物質と接触したｈＨＣＣ細胞系から得たリポタンパク質のレベルと比較するための対照試料として役立ち得る。特定の実施形態において、対照試料は、試験し、かつ候補作用物質の不在下の試料と同じ条件下で、ＨＳ含有培地において培養されたヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系から得たリポタンパク質プロファイルである。他の実施形態において、比較は、肝細胞リポタンパク質分泌に対する既知の効果を有する作用物質と接触した試料からのリポタンパク質プロファイルによって行われる。

そのような方法は、例えば、異脂肪血症、低脂血症、高脂血症、低リポタンパク血症、高リポタンパク血症、タンジール病、高リポアルファタンパク質血症、低リポアルファタンパク質血症、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）、脳血管性疾患（ＣＶＤ）、アテローム動脈硬化症、血栓症、および卒中が含まれるが、これらに限定されない、リポタンパク質仲介疾患および状態の治療に使用される治療剤をスクリーンすることに有用であり得る。特定の実施形態において、方法は、アテローム動脈硬化症の治療または予防のためである。そのような実施形態では、対照試料と比較した、培養培地におけるＶＬＤＬもしくはＬＤＬの減少、またはＨＤＬの増加は、候補作用物質がアテローム動脈硬化症の予防または治療に使用され得ることを示す。

アッセイが薬剤の代謝を評価するためである場合、方法は、一般に、ヒト初代肝細胞の表現型を有する分化ｈＨＣＣ細胞の培地を、（あるとすれば）薬剤の代謝産物の産生のために十分な時間にわたって薬剤と接触させること、および薬剤の代謝産物について（例えば、培養物上澄みを）アッセイすることを伴う。薬剤代謝産物は、当該技術に利用可能な方法を使用して検出され得る。代謝産物は、例えば代謝産物の構造を識別するため、更なる分析に付され得る。

アッセイが、ヒト肝細胞に対する作用物質の毒性をアッセイするためである場合、方法は、一般に、ヒト初代肝細胞の表現型を有する分化ｈＨＣＣ細胞の培養物を、作用物質と接触させること、ならびに表現型マーカーにおける変化（例えば、毒性を示す形態的変化および／またはバイオマーカーの変化、例えばトランスアミナーゼのレベルの変化）を検出することを伴う。作用物質の不在下と比較した作用物質の存在下での変化の検出（例えば、作用物質の存在下での細胞培地におけるトランスアミナーゼの増加、および／または細胞死の表現型マーカーの増加（例えば、アポトーシス性細胞死、壊死性細胞死の表現型マーカー（例えば、ＴＵＮＥＬ、カスパーゼ）の増加）は、分化ｈＨＣＣ細胞への作用物質の毒性を示す）。

分化ｈＨＣＣが向肝性微生物（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶのような向肝性ウイルス）と共に培養される場合、アッセイは、ウイルスの侵入、複製、および文脈、ウイルス粒子産生の研究を伴い得る。アッセイは、抗向肝性病原体作用物質、例えば抗ウイルス剤をスクリーンするためにも提供され得る。

例えば、アッセイが抗ウイルス剤をスクリーンするためである場合、アッセイは、一般に、分化ｈＨＣＣ細胞をウイルスゲノムの存在下で少なくとも１つの試験候補作用物質と共にインキュベートすること、およびウイルスに対する効果の存在または不在を検出することと伴い得る。そのようなものは、例えばウイルス複製をアッセイすることによって達成され得る。ウイルス複製をアッセイすることは、例えば、ウイルス粒子のレベル（例えば、ウイルス力価）をアッセイすること、ウイルス核酸を検出することなどによって達成され得る。例えば、分化ｈＨＣＣ細胞にＨＣＶを感染させる場合、ＨＣＶのレベルは、ウイルス力価を測定すること、ＨＣＶ ＲＮＡを定量的に測定すること、ＨＣＶウイルス粒子を測定すること（例えばコアタンパク質の検出により、例えばイムノアッセイにより）、顕微鏡などにより評価され得る。ウイルス産生ウイルス複製の阻害は、例えば、核酸レベルでのウイルス複製の阻害、ウイルス粒子産生の阻害、および／または阻害あるいは細胞へのウイルス侵入に起因し得る。候補作用物質の不在下と比較した、候補作用物質の存在下でのウイルス複製の減少は、補作用物質が抗ウイルス活性を有することを示す。

抗ウイルス剤のためにスクリーンする方法は、例えば、分化ｈＨＣＣのウイルス感染性の阻害によりウイルスを中和する抗体を、例えばアッセイするため、抗体の抗ウイルス活性についてスクリーンするように適合され得る。そのような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。１つの実施形態において、スクリーンされる抗体は、ウイルス（例えば、ＨＣＶ）に曝露された対照、またはワクチン（例えば、候補ワクチン）が投与された対象から得られる生物学的試料に存在する。生物学的試料は、例えば、抗ウイルス抗体を含有すると疑われる、例えば血液またはその画分であり得る。１つの実施形態では、分化ｈＨＣＣ細胞に臨床ウイルス分離株を感染させる。アッセイは、抗体の存在下または抗体を含有すると疑われる試料において、ウイルス複製を比較することを伴い得、抗体の存在下または試料におけるウイルス複製の減少は、抗ウイルス活性を示す。生物学的試料が免疫処置後の対象からのものである場合、免疫処置後試料の抗ウイルス活性を、免疫処置前の生物学的試料（例えば、同じ対象からのもの）の抗ウイルス活性と比較することができる。

多様な候補作用物質のいずれかをスクリーンすることができる。「候補作用物質」は、合成、天然に生じる、または組み換え的に産生された分子（例えば、小分子、薬剤、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、真核または原核細胞に存在する内在性因子（例えば、ポリペプチド、植物抽出物など））など）を含むことが意図される。候補作用物質は、多数の化学部類の作用物質を包含するが、典型的には、これらは有機分子、好ましくは、５０超から約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小型有機分子である。候補作用物質には、抗体、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類縁体、またはこれらの組み合わせであるが、これらに限定されないような生体分子も含まれ得る。

候補作用物質は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得ることができる。例えば、多数の方法が、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子の無作為および直接的な合成のために利用可能である。細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、容易に産生される。抗体のライブラリーは、当該技術に利用可能な方法を使用して産生され得る。加えて、天然の、または合成的に産生されたライブラーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、およびお生化学的な方法を介して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを産生するために使用され得る。既知の薬理学的作用物質を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化のような、直接的なまたは無作為の化学修飾に付して、構造類縁体を産生することができる。

アッセイは、様々な量の候補作用物質（作用物質なし、から培養細胞の毒性限度内で送達され得る量の上限に近づく量の作用物質）の投与を伴い得、異なる製剤による作用物質の送達を含み得る。作用物質は、単独で投与され得る、または２つ以上の組み合わせに組み合わせることができ、例えば候補薬剤併用療法の効果が評価される。

アッセイを様々なフォーマットにより実施できること、および分化ｈＨＣＣ細胞をウイルスおよび候補作用物質と接触させる順番は変動し得ることが、理解される。例えば、分化ｈＨＣＣ細胞に、候補作用物質を接触させる前に、ウイルスを感染させることができる、あるいは分化ｈＨＣＣ細胞を、感染性ウイルス粒子への曝露の前に、候補作用物質と接触させることができる。

作用物質（例えば、候補作用物質、薬剤、および／または微生物（例えばウイルス））を、ｈＨＣＣ細胞をＨＳ含有培地に移行する時点で、ｈＨＣＣ細胞の分化の際に、またはｈＨＣＣ細胞の、ヒト初代肝細胞の表現型への分化後に、培養培地に添加することができる。

キット
本開示のキットは、ｈＨＣＣ細胞、ヒト初代肝細胞の表現型を有する分化ｈＨＣＣ細胞、またはその両方を含むことができる。キットは、任意に、培養培地構成成分、例えば培養培地（例えば、血清を有さない、またはヒト血清を含有する）、培養に使用されるヒト血清など）を含む。例えば、キットは、ヒト血清を有する、または有さない初代肝細胞培地（例えば、下記に実施例に詳細が記載されている）を含むことができる。キットの様々な構成成分は、別々の容器に存在し得る、またはある特定の適合性構成成分を、望ましい場合、単一の容器内で予め組み合わせることができる。

キットは、本開示の方法を実施するキットの構成成分を使用するための、使用説明書を含むことができる。使用説明書は、一般に、紙、プラスチック、電子記憶装置、媒体などのような適切な記録媒体に記録されている。例えば、使用説明書は、包装挿入物としてキットの中に、キットの容器またはその構成要素（例えば、包装と関連する）のラベルなどに存在し得る。他の実施形態において、使用説明書は、適切なコンピューター読み取り可能記憶媒体、例えば、コンパクトディスク読み取り専用メモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。他の例において、提供される使用説明書は、アッセイの多くまたは全ての詳細を含有せず、むしろ、例えばインターネットを介して詳細な使用説明書を得る遠隔供給源として指示を提供する。
実施例

以下の実施例は、本発明をどのように作製し使用するかについて完全な開示および記載を当業者に提供するために提起されており、発明者たちが何を発明として考慮しているかの範囲を制限することを意図せず、下記の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことも意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にする努力がなされてきたが、幾らかの実験誤差および偏差が釈明されるべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。

材料および方法
以下の方法および材料が下記の実施例に使用される。

標準的培養条件（ヒト血清における培養の前の細胞繁殖のため）。ＨｕＨ−７（ＪＣＲＢ４０３）細胞は、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ−細胞バンク（ＪＣＲＢ細胞バンク）から入手可能である。Ｈｕｈ７．５細胞は、Ｄｒ．Ｃ．Ｒｉｃｅからの寄贈品である。両方の細胞系は、記載されたプロトコールに従って（ヒト血清において培養する前に）維持された。簡潔にはＨｕｈ７．５またはＨｕＨ−７細胞は、ＤＭＥＭ／１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）／ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培養培地に維持し、トリプシン処理し、３〜４日毎に分割した。２０〜３０継代後に、細胞を廃棄し、新たなバイアルを解凍した。

ヒト血清の使用が細胞の増殖停止をもたらすので、細胞培養物は、通常、ＦＢＳ含有培地（上記に記載されたＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ペニシリン／ストレプトマイシン）に維持された。

ＪＦＨ−１ウイルスによる細胞の感染 ＪＦＨ−１ウイルス（ＪＦＨ）は、Ｄｒ．Ｔ．Ｗａｋｉｔａから得た。感染の２日前、細胞を密度３０％で再平板培養した。４時間感染させた後、細胞を洗浄し、適切であればＦＢＳまたはＨＳ含有のいずれかにおいて培養した。

キメラマウスの感染 ヒト肝細胞を移植したキメラＳＣＩＤ／ｕＰＡマウス（例えば、国際公開公報第０１／６７８５４号を参照すること）を、以前に記載されたように感染させた（Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９９：Ｇ８４４−８５４；Ｍｅｒｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｕｇ ２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７（８）：９２７−３３）。感染は、ＪＦＨ感染細胞の組織培養物の上澄み、またはＨＣＶ感染患者の血清の、１００μｌを使用して達成した。マウスモデルキメラマウスの血清におけるＨＣＶ力価およびヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）は、それぞれ、定量的ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡにより決定した。

免疫蛍光による脂肪滴の可視化および定量化 細胞を、カバーガラスにおいて増殖させ、ＦＢＳまたはＨＳのいずれかにおいて培養した。脂肪滴を可視化するため、細胞を供給会社の使用説明書に従ってＢｏｄｉｐｙ４９３／５０３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色した。中性脂質染色の量を、蛍光顕微鏡の使用により可視化した。異なる細胞培養条件下でのＢｏｄｉｐｙ４９３／５０３染色の画像を、同一の顕微鏡の使用および曝露設定の使用により取得した。蛍光の量は、ＩｍａｇｅＪソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の使用により定量化した。データを、条件１つあたり４〜８つの顕微鏡視野で測定した、３つの独立した実験から収集した。バックグラウンドおよび自己蛍光は、無視できるほどであった。

脂肪滴の分布および形状を同一の顕微鏡設定下であるが、それぞれ個別の条件では露出を最適化した、別々に染色された試料において検査した。

スクロース勾配／密度遠心分離 スクロース密度勾配超遠心分離分析は、以前に記載されたとおりに実施した（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０２：９２９４−９２９９）。ＨＣＶ感染細胞の上澄みを３００ｇにより５分間遠心分離して、プロテアーゼ阻害剤（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を含有するＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）の中に細胞片を取り出し、２０〜６０％のスクロース勾配に装填し（総容量１２．５ｍｌ）、ＳＷ４１Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）において１２０，０００ｇにより４℃で１６時間遠心分離した。それぞれの画分の０．５ｍｌを勾配の最上部から回収し、それぞれの画分の力価を、下記に記載される定量的ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。それぞれの画分の密度は、既知容量の重量を決定することによって、決定した。

アポリポタンパク質Ｂ粒子の免疫沈降 免疫沈降実験は、本質的に以前に記載されたとおりに実施した（Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９９：Ｇ８４４−８５４）。少なくとも１０^５ＲＮＡコピー／ｍｌの力価を有する血清または細胞培養物の上澄み試料（５０μｌ）を、７．５μｌの抗アポリポタンパク質Ｂ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ＡＢ７４２、ヤギ抗ヒトアポリポタンパク質Ｂ、ヒト、マウス、およびウシアポリポタンパク質Ｂと交差反応する）と共に、回転さながら、４℃で一晩インキュベートした。Ｇタンパク質スラリー（２０μｌ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４高速流）をそれぞれの試料に加え、回転子により最低１時間インキュベートした。Ｇタンパク質複合体を、１４０００ｇにより微量遠心管に沈殿させた。ペレットをＰＢＳにより１回洗浄し、ウイルスＲＮＡをペレットから直接単離し（ＱｉａＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡキット，Ｑｉａｇｅｎ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。高量の免疫グロブリンを含有する試料（例えば、患者の血清）を、免疫沈降の前にＧタンパク質ビーズにより前清浄して、アポリポタンパク質Ｂ複合体の定量的免疫沈降を確実にした。Ｇタンパク質ビーズがＨＣＶまたはＨＣＶ複合体に直接結合しないことを確実にするため、ＨＣＶ含有マウス血清を、抗アポリポタンパク質Ｂ抗体の不在下でＧタンパク質Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズと共にインキュベートした。これらの試料の沈殿物のＨＣＶ力価は、無視できるほどであった。

肝細胞マーカーの定量的ＲＴ−ＰＣＲ ＲＮＡを、製造会社の使用説明書に従ってＴｒｉｚｏｌを使用して細胞から単離した。ｃＤＮＡを、Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）の使用によりＲＮＡから産生した。遺伝子特異的プライマープローブセットを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより設計した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ系を、遺伝子産生の定量化に使用した。遺伝子発現を、Ｐｆａｆｆｌ（Ｐｆａｆｆｌ ＭＷ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：ｅ４５， ００１）に従って、ＨＰＲＴに対して計算した。

初代肝細胞培養物 凍結ヒト初代肝細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した、または所内において、以前に記載されたとおりに単離した（Ｍｅｒｃｅｒ ｅｔ ａｌ，２００１ Ｎａｔ Ｍｅｄ．７ ９２７−９３３）。単離細胞を、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ ＨＴＳ−Ｐｕｒｇｅ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）により前処理し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に再懸濁し、速度制御冷凍庫により１分あたり１℃の速度で−４０℃まで冷却した。次に細胞を液体窒素の中に保存した。細胞を解凍し、予熱初代肝細胞培地（ＤＭＥＭ、１．２μｇ／ｍｌインスリン、１１μＭの半コハク酸ヒドロコルチゾン、１５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ペニシリン／ストレプトマイシン、２００ｍｍｏｌのグルコース、２％のヒト血清）に再懸濁し、Ｉ型コラーゲン被覆プレート（Ｍｉｌｉｃｏａｔ ６ウエルプレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ウエル１つあたり１百万個の細胞の密度に平板培養した。１２〜１８時間後、組織培養培地を新しくして、非付着細胞を除去した。平板培養後の３日以内に細胞を使用した。

分泌リポタンパク質のＦＰＬＣ分析：サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を使用して、培養Ｈｕｈ７．５細胞により分泌されたリポタンパク質粒子を分離し、培地の中へ入れた。系において、最大粒子がカラムから最初に溶出し（ＶＬＤＬ）、ＬＤＬおよびＨＤＬのサイズの粒子が続いた。分離の後、トリアシルグリセロール（ＴＧ、トリグリセリドとも呼ばれる）またはコレステロールの含有量をインラインで決定した。

試料を調製するため、細胞を、無血清ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により十分に洗浄して、血清含有培地に存在するリポタンパク質を除去した。最後の洗浄液が収集され、ベースライン測定として機能した。次に細胞を無血清ＯｐｔｉＭＥＭに一晩配置した。翌日、培地を収集し、細胞片を遠心分離（３００ｇ、１０分間）により除去した。次に培地を、遠心分離フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。濃縮した培地（６５μｌ）を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＦＰＬＣカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣ機器に注入した。総コレステロールおよびＴＧ（Ｉｎｆｉｎｉｔｙコレステロールおよびトリグリセリド試薬、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のインラインアッセイを、カラム後反応を使用して３７℃で実施した。反応生成物を、リアルタイムにより５００ｎｍでモニターし、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウエアの使用により分析した。全てのリポタンパク質は、ＴＧとコレステロールの両方を含有する。しかし、ＶＬＤＬは、ＴＧが豊富であり、コレステロールをほとんど有さず、一方、ＨＤＬは、コレステロールが豊富であり、ＴＧをほとんど有さない。したがって、コレステロールプロファイルは、分泌ＨＤＬレベルにおける差を検出するのにより適しており、一方、ＴＧプロファイルは、ＶＬＤＬレベルを分析するのにより適している。

実施例１：ヒト血清に培養されたＨＵＨ７．５細胞の増殖および外観
図１は、分化細胞をもたらすためにヒト血清（ＨＳ）における細胞の培養に使用されるステップの例を示す流れ図を提供する。ＦＢＳ含有培養培地に予め維持されているＨｕｈ７．５細胞を、トリプシン処理して、単層の解離を促進した。トリプシンを、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳにより不活性化した。次に細胞を３００ｇにより遠心分離し、細胞ペレットをＤＭＥＭ／２％ＨＳ／ペニシリン／ストレプトマイシンに再懸濁し、３０〜５０％の密度で平板培養した。培養密度で（典型的には、接種の２日後に）、細胞を再度トリプシン処理し、次に５０％の密度で平板培養した。この時点から、細胞を、更に分割させることなく培養して、未分裂細胞の培養密度層の形成を可能にした。任意には、ヒト血清において培養された細胞をおよそ１週間まで分裂させることができるが、これらが１：２を越えて分裂しないことが条件である。しかし、ヒト血清における１０日間の培養後の反復トリプシン処理は、８０〜９０％あるいはそれ以上の細胞死を伴う、細胞培養物の生存力の損失をもたらした。

胎児ウシ血清（ＦＢＳ）の代わりにヒト血清（ＨＳ）を補充した培地におけるＨｕｈ７．５細胞の増殖は、一連の形態的変化を受け、更に分割させることなく、培養密度層として２か月を越えて維持された。ＨＳ培養細胞は、組織培養基質に非常に強力に付着した緊密に充填された単層を形成する、敷石様構造に組織化された。およそ１週間後、細胞分裂は、ＨＳ含有培地で培養された細胞において遅くなり、最終的に接触阻害を受けて、増殖停止になった。培養物における初代肝細胞（右側パネル）と同様に、ＨＳ培養細胞は、単または二核性であり、ＦＢＳ培養細胞（図２Ａ、左側パネル）と比較して、顆粒状の外観（図２Ａ、中央パネル）を有した。ＨＳにおけるおよそ１４〜１８日後、細胞のサイズは有意に増加した。

ＨＳにおける培養の見掛け増殖停止効果を検査するため、細胞数を、ＨＳ培養細胞およびＦＢＳ培養細胞による初期平板培養後に３週間間隔で数えた。図２Ｂに示されているように、ＨＳ含有培地において培養された細胞の増殖は、ＦＢＳ含有培地における増殖と比較して、有意に遅くなった。

定期的な培地交換によって、ＨＳ含有培地において培養された細胞を、分割および再平板培養することなく、少なくとも２か月間にわたって維持することができた。

実施例２：ＨＳにおけるＨＵＨ７．５細胞の培養が初代肝細胞様表現型への分化を促進する
ＨＳ含有培地における細胞の培養の効果を更に評価するため、およびこれらの細胞が分化を受けて初代肝細胞様細胞になるかを評価するため、肝細胞分化マーカーの発現レベルを、Ｈｕｈ７．５細胞の、ＨＳ補充培地への移行後の７日および２１日目にアッセイした。７日後では、肝細胞マーカーにおいて僅かな変化しか観察されなかった。（図３Ａ）しかし、２１日後では、肝臓分化マーカーのアルブミンおよびアルファ１−抗トリプシンの発現は、ＦＢＳと比較して、ヒト血清において増殖した細胞においておよそ４倍に増加した。これらのタンパク質の発現レベルは、培養物中のヒト初代肝細胞の発現レベルと類似している。初代肝細胞培地（ＰＨＭ）におけるＨｕｈ７．５細胞の培養は、アルブミンおよびアルファ１−抗トリプシンの発現に対して、有意な追加的な効果を有さなかった。ＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）の変化は、ＨＳにおいて増殖された細胞では有意ではなかったが、Ｈｕｈ７．５細胞が初代肝細胞培地（ＰＨＭ）において増殖されたとき、ＬＤＬ−Ｒ発現は、増加した。

密着結合構成成分であるクローディン−１およびオクルーディンの発現も、ヒト血清において増殖された細胞において、２１日後に増殖し、培養物におけるヒト初代肝細胞の発現に匹敵した（図３Ａ）。高レベル密着結合が、肝臓組織に存在する。加えて、細胞の不動化を介して、これらのタンパク質は強力な腫瘍抑制因子としても知られており、細胞の腫瘍形成状態からより分化した状態への移行を示している。クローディン−１およびオクルーディンは、ＨＣＶにとっての侵入受容体としても機能する。

主要な脂質代謝調節因子の発現は、ＦＢＳにおいて増殖された細胞と比較して、ＨＳにおいて増殖された細胞において増加した（図３Ｂ）。ＬＸＲアルファ（肝臓Ｘ受容体アルファ）は、肝臓に高度に発現し、脂質ホメオスタシスおよび炎症に関与する転写プログラムを制御する。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、分化および代謝の主要な調節因子である。ＰＰＡＲαは、肝臓における脂質代謝の主な調節因子である。ＰＰＡＲαの活性化は、脂肪酸の輸送および脂肪酸の酸化に関与する遺伝子の上方制御により、脂肪酸の取り込みおよび利用を促進する。ＰＰＡＲγは、脂肪酸の取り込みおよび貯蔵、ならびグルコース代謝を調節する。細胞骨格タンパク質のビメンチンおよびｅ−カドヘリンも、ヒト血清において培養された細胞において増加している。ビメンチンは、形状を維持し、細胞小器官を所定の位置に保持するために必須であり、また、細胞内の低密度リポタンパク質の輸送を制御する。Ｅ−カドヘリンは、細胞接着について細胞内で重要な役割を果たし、したがって、密着結合タンパク質と同様に、細胞の非繁殖／非腫瘍形成状態を示す。

実施例３：他の培養条件の検査
ヒト血清におけるＨｕＨ−７またはＨｕＨ−７誘導細胞の培養の効果を比較するため、他の培養条件を検査した。

ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）は、ＨｕＨ−７または誘導細胞および他の肝細胞腫細胞において、増殖停止を誘発することが報告されている。（Ｓａｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０：１０２５３−１０２５７）。ＤＭＳＯの効果を評価するため、ＤＭＥＭにおいて１％または２％のＤＭＳＯの存在下で（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％または２％ＤＭＳＯ、ペニシリン／ストレプトマイシン）３週間増殖させたＨｕｈ７．５細胞における肝細胞特異的遺伝子の発現レベルを検査した。加えて、Ｈｕｈ７．５細胞を、胎児ウシ血清の代わりに、ＤＭＥＭ中の２〜１０％の成体ウシ血清（ＡＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＤＭＥＭ、２％ＡＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンにおいて培養した。

両方の培養条件は、およそ７日以内に増殖停止をもたらした。ＤＭＳＯまたはＡＢＳを含有する培地において培養された細胞は、いくらかの形態的変化を受けたが、ヒト血清に培養された細胞の程度までにはならなかった。いずれの培養物においても、初代ヒト肝細胞表現型を示す細胞質の点状パターンは、典型的には観察されなかった（データ示されず）。

ＡＢＳまたはＤＭＳＯにおいて培養された細胞の分化状態は、上記に記載されたものと同じ肝細胞分化マーカーの発現レベルを評価することによって検査した（図４）。２％ＤＭＳＯにおける培養がアルブミン発現に僅かな増加をもたらし、ＡＢＳは密着結合タンパク質のクローディン−１およびオクルーディンの発現に僅かな増加をもたらしたが、いずれのタンパク質も、培養物中の初代ヒト肝細胞に匹敵するレベル、またはヒト血清に培養されたＨｕｈ７．５細胞の発現に匹敵するレベルで発現しなかった。試験した他のバイオマーカーの発現は、ＦＢＳを含有する培地における培養と比べて有意に増加しなかった。

実施例４：細胞脂肪滴の外観に対する培養培地の効果
ＨＳと比べた、ＦＢＳにおけるＨｕｈ７．５細胞の培養後の細胞脂肪滴の外観を検査した。図５Ａおよび５Ｂに示されているように、脂質を示すＢｏｄｉｐｙ蛍光は、ＦＢＳと比較して、ＨＳに培養された細胞においてはるかに強力であった。ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して定量化したとき、Ｂｏｄｉｐｙ蛍光強度は、ＦＢＳに培養した細胞より、ＨＳ中の細胞培養物においておよそ４倍高かった（図５Ｂ）。

加えて、脂肪滴の分布は、異なる培養条件によって影響を受ける。ＦＢＳ培地において、細胞における脂肪滴のサイズは不均質である。ＨＳ培地において、細胞における脂肪滴のサイズは、ＦＢＳ培養細胞よりも一般に小さく、サイズははるかに均一である。

実施例５：ＪＦＨ−１のウイルス力価の産生
ＪＦＨ−１をＦＢＳ培養細胞の中に電気穿孔した。次に、電気穿孔された細胞をＦＢＳに維持した、または実施例１に従って、電気穿孔の直後にＨＧ含有培地に移動した。電気穿孔後の４〜６日目に、ウイルスを、培養上澄みの回収により採取した。

ＦＢＳ培地に維持された細胞の電気穿孔により産生されたウイルスを「ＪＦＨ−ＦＢＳ」と呼び、電気穿孔の直後にＨＧ含有培地に移動され、維持された細胞の電気穿孔により産生されたウイルスは、「ＪＦＨ−ＨＳ」と呼ばれる。

図６Ａは、２つの異なるウイルスによる、ＦＢＳに培養された細胞の感染を示す。ＦＢＳ維持細胞に、（ＪＨＦ−ＨＳと同様に）電気穿孔の４日後に単離されたＪＦＨ−ＦＢＳを感染させたとき、感染はこれらの細胞において検出されず、それは、これらのウイルス株のＲＮＡ力価が低すぎたからである。対照的に、ＪＨＦ−ＨＳは、高いウイル力価をＦＢＳ増殖細胞において直ぐにもたらした。ウイルス力価は、急速に平坦に到達した。比較のため、電気穿孔の１５日後に単離されたＪＨＦ−ＦＢＳを使用した（ＪＦＨ−ＦＢＳ（１５）と呼ばれる）。ＪＦＨ−ＦＢＳ（１５）のウイルス力価は、ＪＦＨ−ＨＳと比較して、感染経過の全体にわたって低いままであった。

図６Ｂは、異なる条件下（ＦＢＳおよびＨＳ）において増殖させた、同じウイルス（ＪＦＨ−ＨＳ）を感染させた細胞のウイルス力価を示す。注目すべきは、ＨＳにおける最初の１０〜１１日間の培養の間は、ウイルス産生にＨＳを使用する利点は明らかではなかった。しかし、約１１日後、ウイルス力価は増加し始め、このようにして、ＨＳ培地の細胞の移動の約１４日後に、ウイルス産生はＨＳ維持細胞において急速に増加した。ウイルス産生のこの増加は、ＦＢＳ培養細胞において観察されなかった。この時間は、ＨＳ培養細胞が、初代ヒト肝細胞に類似した表現型への表現型分化を示した近似した時間に相当する。同様の感染をＨｕＨ−７細胞に実施した。ＨｕＨ−７細胞において観察された傾向は、Ｈｕｈ７．５細胞において観察されたものと類似していた（倍増が類似していた）。

図６Ｃは、ＨＳにおいて増殖された細胞にＪＦＨ−ＨＳを感染させたとき、ウイルス産生（１ｍｌあたりのＨＣＶ ＲＮＡコピー）は、ＦＢＳ培養細胞においてＪＦＨ−ＦＢＳを使用する標準的な組織培養条件と比較して、約１，０００倍増加する。ＨＳ含有培地における細胞の培養は、新たなＨＳ含有培地に３〜４日毎に交換しながら、１０^８ＲＮＡコピー／ｍｌ以上に近づく少なくとも４５日間にわたる連続ウイルス力価の産生を可能にする（図６Ｄ）。細胞を（ＨＳ含有培地に約１４日間培養することにより）初代肝細胞様表現型に最初に分化させ、次にＪＦＨ−ＨＳを感染させたとき、類似したウイルス力価が達成された（図６Ｃ）。

図６Ｅは、ウイルス力価に対する、初代肝細胞培地を使用する効果を示す。感染させ、ＨＳの使用により最初に分化された細胞を、初代肝細胞培地（ＤＭＥＭ、１．２μｇ／ｍｌのインスリン、１１μＭの半コハク酸ヒドロコルチゾン、１５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ペニシリン／ストレプトマイシン、２００ｍｍｏｌのグルコース、２％のヒト血清））に移動し、ウイルス産生に対する効果を評価した。移動後の３日以内に、ＨＳにおける培養の結果として見られる形態的変化が、より明確になった（示されず）。加えて、ウイルス力価は、ＤＭＥＭ／２％ＨＳ／ペニシリン／ストレプトマイシンに維持された同じ細胞と比較して、およそ５倍増加した。

実施例６：ＪＦＨ−ＨＳおよびＪＦＨ−ＦＢＳによるマウスの感染
ＪＦＨ−ＨＳおよびＪＦＨ−ＦＢＳの両方によるインビボ感染性を、キメラＳＣＩＤ／Ａｌｂ−ｕＰＡマウスモデルにおいて試験した。電気穿孔後に収集したＪＦＨ−ＨＳ株を使用して、新たな細胞を感染させ、これらの感染細胞の上澄みを使用して、マウスを感染させた。ＦＢＳにおいて産生された同じウイルスとの直接的な比較は、ウイルス力価が検出可能な感染を予想するには低すぎたので、可能ではなかった。したがって、組織培養適応ＪＦＨ変種（ＨＣＶｃｃ）を、比較の目的のためだけに同じ力価で使用した。

ＪＦＨウイルス株であるＨＣＶｃｃは、ＦＢＳに培養された細胞の電気穿孔により産生した。集めたウイルスを、感染後の１５日目から３０日目まで、５日毎に単離した。この集めたウイルスを使用して、ＦＢＳにおいて増殖させた細胞を感染させた。続いて、感染細胞の上澄みを使用して、新たな細胞に感染させた。この手順を数回の感染において繰り返した。したがって、得られたウイルスは組織培養適応性である。ＨＣＶ感染患者からの血清は、陽性対照として機能した。

図７は、感染後の２５日までのマウス血清におけるウイルス力価を示す。ＪＦＨＨＳは、キメラマウスに急速な感染を引き起こした。ＪＦＨＨＳ力価は、感染後の４日目に高い力価で検出可能であり、次の３週間にわたってほんの僅か更に増加した。対照的に、組織培養適応ＪＦＨＦＢＳのウイルス力価は、最初の２週間にゆっくりと増加し、次に同じ平坦に到達したと思われる。ＪＦＨＨＳと同様に、高感染性患者血清ＨＣＶのウイルス力価も、４日以内に検出可能である。

実施例７：ＨＣＶ粒子に対するＨＳ培養細胞の効果：ウイルス密度、リポタンパク質会合
ウイルスの生物物理学的特徴が、ＦＢＳと比べて、ＨＳにおける培養により影響をうけたかを評価するため、ウイルス密度およびウイルスのアポリポタンパク質Ｂの会合を評価した。

図８、パネルＡに示されているように、ＨＳに培養されたウイルスの密度は、より低密度にシフトしている。ＦＢＳを使用する標準的な組織培養条件下において、ＪＦＨの培地密度は、１．１６ｇ／ｍｌであり、これは以前の報告と十分に一致している。ＨＳにおいて細胞を培養すると、ウイルス粒子の全体的な密度は、より低密度にシフトしており、１．０９ｇ／ｍｌの密度中央値および超低密度ピークの追加的外観を有する。ウイルス密度は、ＨｕＨ−７およびＨｕｈ７．５細胞により産生されたものの両方において決定され、結果は両方の細胞型において類似していた。

代替的な表示は、図８、パネルＢに示されている。ＦＢＳ培養細胞において産生されたとき、約７５％のウイルスは、１．１６ｇ／ｍｌを越える密度を有し、一方、ＨＳ培養細胞において産生されたとき、わずか約２５％のウイルスが、＞１．１６ｇ／ｍｌの密度を有した。

組織培養物において産生されたウイルスは、アポリポタンパク質Ｂと会合しないが、アポリポタンパク質Ｅと会合することが、以前に報告されている。ヒト血清において、およびＨＣＶ感染マウスモデルにおいて、有意な割合のＨＣＶがアポリポタンパク質Ｂと会合している（約６０％）。したがって、アポリポタンパク質ＢとのＨＣＶ会合に対する改変組織培養条件の効果を検査した。

ＦＢＳを使用する標準的な組織培養条件下において、僅かおよそ５％のＪＦＨがアポリポタンパク質Ｂと会合した。細胞がヒト血清において培養される場合、およそ９０％のウイルスがアポリポタンパク質Ｂ会合性であった（図８、パネルＣ）。比較として、患者血清において、３０〜８０％のＨＣＶがアポリポタンパク質Ｂと会合していることが観察され、キメラマウス血清における約４０〜７０％のＨＣＶが、アポリポタンパク質Ｂと会合していることが観察された。アポリポタンパク質Ｂ会合は、ＨｕＨ−７およびＨｕｈ７．５細胞により産生されたウイルスにおいて決定され、結果は類似していた。

実施例８：ＨＳ培養細胞におけるウイルス産生に対するヒト低密度リポタンパク質（ＨＬＤＬ）の効果
ウイルス産生に対するリポタンパク質の効果を検査するため、アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質（ＶＬＤＬおよびＬＤＬ）を欠乏しているヒト血清を、調製した。低（ＬＤＬ）リポタンパク質および超低密度（ＶＬＤＬ）リポタンパク質枯渇ＨＳは、製造会社（ＨｉＴＲＡＰ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により提供された使用説明書に従ってヘパリンカラムにより血清を処理することによって、製造した。ヘパリンは、アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質のＶＬＤＬおよびＬＤＬに、高い親和性で結合し、一方、ＨＤＬはヘパリンと結合しない。したがって、得られた血清は、ＶＬＤＬおよびＬＤＬのみを枯渇している。簡潔には、結合緩衝液による平衡の後、血清をカラムに適用して、アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質を結合させた。アポリポタンパク質Ｂ枯渇画分を収集し、フィルターを滅菌し、−２０℃で保存した。

細胞を、リポタンパク質枯渇ＨＳにおいて培養したとき、高ウイルス力価の産生に対するヒト血清のほとんどの利益効果は失われたが、初代肝細胞様表現型へのＨｕｈ７．５細胞の分化は依然として生じた。ヒトＶＬＤＬを添加しても、ウイルス産生は救出されなかった。しかし、ヒトＬＤＬの添加は、ウイルス産生に１０００倍の増加をもたらした。ヒトＬＤＬのこの効果は、用量依存性であり、（部分的に）分化している細胞においてのみ達成され得る（図９）。

実施例９：ＨＣＶ感染患者の血清による細胞の感染
ヒト血清において培養されたＨｕｈ７．５細胞を、ＨＣＶ遺伝子型１ａを感染したＨＣＶ患者の血清により、感染に対する感受性について試験した。感染の成功は、約１０^５ＲＮＡコピー／ｍｌまでのウイルス力価によって達成された。（図１０）対照的に、ＦＢＳ含有培地において培養され、かつ同じ血清を感染させたＨｕｈ７．５細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイして、検出可能なウイルスを産生しなかった。

上記の実施例は、ヒト血清におけるＨｕＨ−７誘導細胞のようなｈＨＣＣ細胞の培養が、初代肝細胞の表現型への分化をもたらすことを例示している。（従来の組織培養プロトコールによるＦＢＳではなく）ヒト血清含有培地において培養されたＨｕＨ−７またはＨｕｈ−７．５細胞は、接触阻害になり、ＨＣＶの侵入受容体として関与する２つの因子であるクローディン−１およびオクルーディンを含む幾つかの肝細胞分化マーカーの発現の増加を示す。加えて、ＨＳ培養細胞は、ＨＣＶ複製および／または組み立ての部位として関与する細胞小器官である、細胞脂肪滴の増加を示す。

ＨＣＶによるＨＳ培養ｈＨＣＣ細胞の感染は、ＦＢＳを補充したＤＭＥＭを使用する標準的な組織培養方法と比較して、ウイルス産生に１，０００倍の増加を示す。ｈＨＣＣ細胞培養物のＦＢＳ含有培地がＨＳ含有培地に交換された直ぐ後に、約１０〜１００倍のウイルス力価の増加が観察される。初代肝細胞表現型への、ＨＳ培養ｈＨＣＣ細胞の分化が達成されたおよその時間（およそ１４日間）で、ウイルス複製は、ＦＢＳ含有培地に維持されたｈＨＣＣ細胞と比較するよう比較して、約１，０００倍増加している。結果を図９に示す。

ヒトＬＤＬは、ウイルス力価の増加において役割を果たす。血清からのＶＬＤＬおよびＬＤＬの除去は、ＨＳ培養条件に関連するウイルス力価の増加を防止した。ヒトＶＬＤＬではなくヒトＬＤＬの選択的添加は、ＨＳ培養条件のウイルス産生レベルを救出した。ｈＨＣＣ細胞の分化状態は、ウイルス力価に対するＬＤＬの利益効果において役割を果たした。

ＨＳ培養ｈＨＣＣ細胞から産生されたＨＣＶ粒子は、ＦＢＳ培養ｈＨＣＣ細胞から産生されたＨＣＶと構造的に異なっている。ＨＳ培養ｈＨＣＣ細胞から産生されたＨＣＶ粒子は、より低い密度を有し、アポリポタンパク質Ｂ会合性である。ＨＣＶ画分のより低い密度は、より高い感染性に関連している。より高い感染性は、事実、キメラマウスモデルにおいて観察された。ＨＳ培養細胞から産生されたウイルスは、高感染性患者血清からのＨＣＶと同様の感染経過を示し、ＦＢＳ培養ｈＨＣＣ細胞から産生されたウイルスと比較して、高い感染性を示した。ＨＳ培養ｈＨＣＣ細胞において産生されたＨＣＶのより低い密度およびアポリポタンパク質Ｂ会合性は、患者の血流に循環しているウイルスと酷似している。

ＨＳ培養細胞を使用して、ＦＳ培養細胞において産生された同じウイルスと比較して、高い力価のウイルスを産生することができる。上記に示されているように、ＪＦＨ−１は、ウイルスの遺伝子修飾、および／または適応突然変異を選択する前組織培養適応の必要がなく、ＦＢＳ培養培地よりもはるかに高い力価でＨＳ培養細胞から産生された。ＪＦＨ−１により形質移入され、１３日間培養されたＨＳ培養細胞は、ＨＳ培養培地にとって感染性であるウイルス粒子を産生し、これらの細胞により産生されたウイルスは、キメラマウスにおいて高感染性であった。

実施例１０：ＨＳ培養細胞におけるリポタンパク質分泌
ＶＬＤＬ分泌のような肝細胞特異的機能は、ＦＢＳ補充血清において増殖されたｈＨＣＣに不在である。ＶＬＤＬ分泌は、ヒト血清に培養されたｈＨＣＣにおいて生じ、ＦＢＳ補充血清に培養されたＨｕｈ７．５細胞を、実施例１に記載されたヒト血清（ＨＳ）が補充された培地に交換し、トリアシルグリセリド（図１１）およびコレステロール（図１２）に基づいたリポタンパク質プロファイルを、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィーの使用により、様々な時点で培養細胞の培地から得た。

以前の観察（Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８３１（２）：３８７−９７およびＭｅｅｘ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ５２：１５２−１５８）と一致して、ＶＬＤＬ分泌は、ＦＢＳ補充血清において増殖されたＨｕｈ７．５細胞に不在であり（図１１、パネルＢおよび図１２）、僅か小さなＬＤＬサイズのピークが観察された。ヒト血清における５日間の培養の後、ＶＬＤＬ分泌に小さな増加があり、小さな変化がコレステロールプロファイルに対するＬＤＬおよびＨＤＬサイズの画分において観察された（図１２）。

しかしＶＬＤＬ分泌は、リポタンパク質プロファイルに示されている顕著なＶＬＤＬピークにより示されているように、細胞分化により（１４日目から）ヒト血清において培養された細胞に存在した（図１１、パネルＢおよび図１２）。加えて、細胞の分化によって、ＬＤＬピークは、両方とも、サイズを増加し（曲線下の面積がより大きい）、大型ＬＤＬ粒子が存在した（ＬＤＬピークは左にシフトした（大型粒子が最初に溶出する））。ＨＳにおける培養の３０日目、ＨＳ培養細胞の培地のリポタンパク質プロファイルは、培養物中の初代ヒト肝細胞により分泌されたリポタンパク質（Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８３１（２）：３８７−９７）、およびヒト血清のリポタンパク質プロファイル（図１１、パネルＡ、Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）２９９：Ｇ８４４−８５４）と酷似していた。ＨＤＬピークの増加も、コレステロールに基づいたリポタンパク質プロファイルにおいて観察された（図１２）。まとめると、このデータは、リポタンパク質分泌がＨＳ培養細胞分泌リポタンパク質において回復し得ること、およびヒト血清に見出され、かつ初代ヒト肝細胞により産生されるものと類似した分泌リポタンパク質プロファイルを示し得ることを示す。

実施例１１：ＨＢＶによる細胞の感染
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による感染に対するｈＨＣＣ細胞の感受性を検査した。推定ＨＢＶ侵入受容体である、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ、ＳＬＣ１０Ａ１）の発現レベルもモニターした。

Ｈｕｈ７．５細胞を、上記に記載されたように、ヒト血清（ＨＳ）含有培地に２１日間培養して、分化細胞を産生した。この期間の後、細胞にＨＢＶを２４時間または４８時間感染させた。感染は、感染患者からの５０〜１００μｌのＨＢＶ陽性血清を、細胞１個あたり１５〜３０個のウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）（もしくはそれ以上）により細胞培養物に添加すること、またはＨＢＶ粒子を発現するように遺伝子修飾された細胞系である、培養ＨｅｐＡＤ３８細胞からの細胞上澄みの１０μｌの５０X 濃縮試料を添加することによって、達成された。ＨｅｐＡＤ３８細胞では、細胞１個あたりおよそ１０００個のウイルスのＭＯＩを使用した。

細胞を、感染後に十分に洗浄して、非組み込みウイルスを除去した。培地へのウイルス分泌は、定量的ＰＣＲを使用して、感染後の異なる日に培地におけるウイルスゲノムの量を決定することによってモニターした。

図１３に示されているように、ＨＳ培養細胞に、ＨＢＶの２つの異なる臨床分離株（中空円および中実円）、ならびにＨｅｐＡＤ３８細胞により産生されたウイルス（中空三角）を成功裏に感染させた。感染のおよそ４日後、ウイルス力価を検出し、洗浄液におけるウイルス力価を越えていた（洗浄液は、感染（０日目）の１日または２日後のいずれかのものであった）。ウイルス力価は、およそ５〜１４日で最大に達した。感染の１５日後、ウイルス力価は減少し、侵入受容体レベルの減少と一致した。

実施例１２：ＨＳ培養細胞におけるＨＢＶ侵入受容体の発現
タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）は、ヒト細胞におけるＨＢＶの侵入受容体であることが報告されている（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ｅＬｉｆｅ １：ｅ０００４９）。ｍＲＮＡレベルでのＮＴＣＰの発現を、異なる長さの期間（０〜３５日間）で上記に記載されたようにＨＳに培養されたＨｕＨ７．５細胞において評価した。ＦＢＳに培養され、同じ継代数で単離されたＨｕｈ７．５細胞は、対照として機能した。それぞれの培養期間の終了時、細胞溶解産物は、製造会社の使用説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって調製した。ＮＴＣＰの相対ｍＲＮＡレベルを、定量的ＰＣＲの使用によりＨＰＲＴと比較して決定した。

図１４に示されているように、ＨＳ培養細胞は、ヒト血清含有培地への移動の直ぐ後にＮＴＣＰのレベルの増加を示した。ＮＴＣＰの最高レベルの発現は、ＨＳへの移動の２５日後に観察され、ＦＢＳと比較して６０倍の増加を示した。約２８日目に、ＮＴＣＰレベルは低下し始めた。

ＮＴＣＴＰが胆汁交換体としての機能を有するので、これらのデータは、肝臓に特異的な機能である胆汁分泌がＨＳ培養細胞によって増加または回復することを示す。加えて、ＮＴＣＰ発現レベルの観点から、これらのテータは、ＨＧ含有培地におけるｈＨＣＣの短い分化時間（例えば、１０〜１４日間）が、ＨＢＶ感染をもたらすために十分であることを示す。

実施例１３：組織培養培地におけるヘパリン処理血清の使用は、感染を増強し、ウイルス力価を増加する。
リポタンパク質を、ヘパリンカラムから（製造会社の使用説明書に従って、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）血清を溶出することにより血清から除去した。ヘパリンは、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）と高い親和性で結合する。血清（ＦＢＳまたはＨＳ）をカラムに適用し、通過したものを収集した。通過した画分は、ＬＤＬおよびＶＬＤＬのようなＡｐｏＢ含有リポタンパク質を本質的に含まない。

ＦＢＳにおいて最初に培養されたＨｕｈ７．５細胞に、同じ量のウイルス（ＨＳ産生ウイルス、したがってＡｐｏＢ会合ウイルス）を感染させ、次に、ＦＢＳ、ＨＳ、ヘパリン処理ＦＢＳ（ＨｅｐＦＢＳ）、またはヘパリン処理ＨＳ（ＨｅｐＨＳ）に２８日間まで更に維持した。細胞生存力は、ＨｅｐＦＢＳまたはＨｅｐＨＳにおける培養により影響を受けなかった。ウイルス力価を２８日間にわたってモニターした。

図１５、パネルＡは、ＨＳまたはＦＢＳに培養された細胞のウイルス力価を示す。予想されたように、ＨＳ（四角）のウイルス力価は、ＦＢＳ（円）のウイルス力価をはるかに越えていた。図１５、パネルＢは、ＨｅｐＦＢＳまたはＨｅｐＨＳに培養された細胞のウイルス力価を示す。最初の１０〜１５日間において、ＨｅｐＨＳおよびＨｅｐＦＢＳのウイルス力価はＦＢＳの力価を越えているが、経時的に、ＨｅｐＨＳ、ＨｅｐＦＢＳ、およびＦＢＳは、類似した力価をもたらした。図１５、パネルＣは、パネルＢの最初の８日間の拡大図であり、ＨＳ、ＨｅｐＦＢＳ、およびＨｅｐＨＳ培養が、この期間にわたってＦＢＳに培養された細胞と比べて、類似して増強された力価をもたらすことを示す。

これらのデータは、未処理ＦＢＳを使用して達成されたものと比べて増強されたウイルス力価が、ウイルス感染時に、リポタンパク質が（例えば、ヘパリン処理により）枯渇している血清を使用して細胞を培養することにより達成され得ることを示す。驚くべきことに、増強されたウイルス力価は、ヘパリン処理ヒト血清またはヘパリン処理胎児ウシ血清のいずれかを使用して達成され得る。

実施例１４：精製されたリポタンパク質会合ウイルス（ＨＳ産生ウイルス）の感染率の増加
ヒト血清において産生されたウイルスは、ヒトアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）と会合する。この特性を利用し、ヘパリンへのＡｐｏＢの高結合親和性を使用して、ＨＣＶ感染患者の血清からウイルスを精製した。ＨＳ培養細胞により産生されたウイルスを、Ｃｅｎｔｒｉｍａｔｅ ５００Ｓ接線流装置の３００ｋＤａフィルターを使用して６０ｍｌに濃縮した。これを、ＨｉＴｒａｐヘパリンカラムに装填した（画分１〜１０を通過させた［ウイルスコアタンパク質ＥＬＩＳＡにより検出されたように、ＨＣＶは存在しなかった］）。カラムを、１２０ｍｌの洗浄緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ ２０ｍＭ ＮａＰＯ４の緩衝液 ｐｈ７．４−標準的な技術で作製）により洗浄した（画分１１〜１７）。次にカラムを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４の緩衝液 ｐｈ７．４（画分１８〜２７）、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４の緩衝液 ｐｈ７．４（画分２８〜３４）、最後に１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ４の緩衝液 ｐｈ７．４（画分３５〜３８）により溶出させた。ＨＣＶコアタンパク質を、ＥＬＩＳの使用によりそれぞれの画分において定量化した。図１６に示されているように、２つのピークが存在した（集めた画分２８〜３０および３５〜３７）。

それぞれの画分からの精製されたウイルスを、１００倍に希釈し、ウイルスの感染性を、ＦＢＳにおいて、またはヘパリン枯渇ＨＳ（ＨｅｐＨＳ）において培養した細胞の４時間の感染により試験した。同じ量の精製ウイルスを両方の条件に使用した。感染率は、以前に記載されたように、感染の２日後にＨＣＶ ＮＳ５ａを染色することによって決定した（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ，２００５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３０９ ｐｐ．６２３−６２６）。感染した細胞は、暗褐色（グレースケールの暗灰色）を発生する。

画分３５〜３７は、比較的不十分に感染され（ＦＢＳにおける未精製ウイルスと同様の感染性）、感染率は、リポタンパク質の除去により影響を受けなかった（示されず）。画分２８〜３０のウイルスは、細胞を成功裏に感染した。図１７に提供された例に示されているように、はるかに高い感染率が、ヘパリン結合リポタンパク質が枯渇している血清において達成され得る。

実施例１５：ＨＣＶの臨床分離株（遺伝子型１Ａ）によるＨＵＨ７．５細胞の感染
ＨＣＶの臨床分離株による感染に対するＨＳ培養Ｈｕｈ７．５細胞の感受性を試験した。感染プロトコールを、リポタンパク質会合ＨＣＶの侵入を促進するために開発し、リポタンパク質を分泌する細胞を使用することは、ＨＣＶの臨床分離株による感染の成功をもたらす可能性がある。

患者から直接得た血清においてヒト抗体の存在を回避するため、ＨＣＶ臨床分離株を、ヒト肝臓細胞を移植したＳＣＩＤ／Ａｌｂ−ｕＰＡマウス（「キメラマウス」）により最初に継代した（米国特許第６，５０９，５１４号、Ｍｅｒｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：９２７−３３）。ヒトは中和抗体を生成することができるが、キメラマウスは生成しない。したがって、ＨＣＶ感染キメラマウスのＨＣＶ陽性血清は、ＨＣＶ中和抗体を含まない。

キメラマウスにＨＣＶ遺伝子型１ａ臨床分離株を感染させた。血液試料を異なる時点で採取し、血清中のウイルスの量を定量的ＲＴ ＰＣＲにより評価した。１０^７ＲＮＡコピー／ｍｌのウイルス力価を有するＨＣＶ陽性マウス血清試料（マウスＡ５７８）を使用して、培養細胞を感染させた。

細胞を、ヒト血清含有培地に１０〜２１日間まで培養して、分化細胞にした。感染の２日前、細胞を、上記に記載されたように、ＨｅｐＨＳにおいて平板培養した。次に細胞に、ＨＣＶ陽性マウス血清を細胞１個あたり１〜３個のウイルスゲノムで感染させた。同時に、正常な血清（ＨＳ）を含有する培地において培養された細胞に、同じ量のウイルスを感染させた。細胞を２４時間感染させ、その後、培地を、正常なヒト血清（ＨＳ）を含有する培地に交換した。ウイルス力価を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ使用によりモニターした。次に、最高のウイルス力価を有する試料を使用し、同じ細胞感染プロトコールを使用して新たな細胞に直接接種した。

図１８に示されているように、正常なヒト血清に培養された細胞を、ＨＣＶ陽性マウス血清Ａ５７８により検出可能に感染させることができなかった（中実円、Ａ５７８）。しかし、細胞が感染段階の際にリポタンパク質枯渇血清に培養されたとき、１０^５ＲＮＡコピー／ｍｌまでのウイルス力価を得た（Ａ５７８ ＨｅｐＨＳ、中空円）。次に、Ａ５７８ ＨｅｐＨＳからの１５日目の試料（星印により示されている）を使用し、同じ感染プロトコールを使用して新たな細胞を感染させた。７日後、ウイルス力価は、１ｍｌあたりおよそ１０^４ＲＮＡコピーのウイルス力価であり、１４日後、ウイルス力価は、１ｍｌあたりおよそ１０^７ＲＮＡコピーのウイルス力価である。

実施例１６：薬剤代謝に関与する遺伝子発現の分析
上記に記載されたように、標準的な胎児ウシ血清（ＦＢＳ）含有培地の代わりに、ヒト血清（ＨＳ）含有培地においてヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞（例えば、ＨｕＨ−７またはＨｕｈ７．５細胞）を培養することは、これらの細胞が分化することを誘発する。上記に更に示されたように、ヒト血清においてｈＨＣＣ細胞を培養することは、アルブミンおよびＶＬＤＬの分泌を回復し、これらの細胞がより肝細胞様になることを示している。ここで、分化細胞を試験して、これらの細胞が薬剤代謝に関して初代ヒト肝細胞のモデルとして機能し得るかを評価した。

ＨＳ含有培地において様々な時間にわたって培養した細胞を、ＦＢＳ含有培地において増殖させた細胞と比較する、全ゲノムマイクロアレイ研究を実施した。細胞を、ＨＳ含有培地において８、１５、または２３日間にわたって前記と同様に培養し、二重ウエルをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用により採取した。ＦＢＳ培地中の細胞を培養密度で採取した。ＲＮＡを製造会社の使用説明書に従って抽出し、ｃＤＮＡを、ランダムプライマーおよびＭＭＬＶ逆転写酵素の使用により合成した。次にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍｅ Ｖｉｅｗアレイを実施し、データを、Ｒｏｂｕｓｔ Ｍｕｌｔｉ−Ａｒｒａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ法（ＲＭＡ）の使用により分析した。

薬剤代謝を３つの相に分けた。第Ｉ相では、チトクロームＰ４５０オキシダーゼのような酵素が、反応性または極性基を生体異物（例えば、小分子薬剤）に導入する。次にこれらの修飾化合物を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのようなトランスフェラーゼ酵素により触媒される極性化合物と、Ｐにおいて抱合させる。第ＩＩＩ相では、抱合生体異物を、排出トランスポーターにより認識されて細胞外に送り出される前に、更に処理することができる。本分析は、第Ｉ相および第ＩＩ相代謝遺伝子、ならびに以前の研究において薬剤代謝に関与していると予測されるトランスポーターに焦点を合わせている。（Ｊｅｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １５：８５１−８５８）。一般的な遺伝子ファミリーは、チトクローム（遺伝子１６個）、アルコールデヒドロゲナーゼ（遺伝子８個）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（遺伝子１８個）、メチルトランスフェラーゼ（遺伝子８個）、グルタチオントランスフェラーゼ（遺伝子１３個）、スルホトランスフェラーゼ（遺伝子１１個）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（遺伝子１１個）、およびＡＢＣトランスフェラーゼ（遺伝子２６個）であった。結果を表１９〜２２に示す。

驚くべきことに、チトクローム、フラビンモノオキシゲナーゼ、およびアルド−ケトレダクターゼの数を含む第Ｉ相の遺伝子の数が、上方制御された（図１９〜２０）。加えて、グルクロノシルトランスフェラーゼ、および第ＩＩ相の幾つかの他の遺伝子が、上方制御された（図２０〜２１）。様々なファミリーにおける他の多くの遺伝子は、上方制御されておらず、このことは、薬剤が細胞に添加されていないので予想された。

薬剤代謝に関与するスルホトランスフェラーゼを好むエストロゲンであるＳＵＬＴＥ１は、２３倍上方制御され、胆汁酸トランスフェラーゼである第ＩＩ相酵素ＢＡＡＴは、１３倍上方制御された。これらの研究において上方制御された多くのｍＲＮＡは、胆汁酸代謝に関与する酵素をコードすると思われ、このことは、分化肝臓細胞および増加した解毒機能の両方と一致している。このことは、ＨＳ培養細胞が初代肝細胞をより良好に反映していることを示す。そのような分化細胞は、初代肝細胞が、通常、標準以下の組織から単離されるので（最適な肝臓が一般に移植向けであるので）、初代肝細胞よりも一致したモデルを提供することができる。

本発明は特定の実施態様を参照して記載されてきたが、様々な変更を行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り同等物を置換し得ることが、当業者に理解されるべきである。加えて、多くの変更を行って、特定の状況、材料、物質の組成、方法、方法のステップ、またはステップを、本発明の目的、精神、および範囲に適合させることができる。そのような変更は、全て本明細書に添付された特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (33)

1. 初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞を含む細胞培養物を産生する方法であって、
   ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えて培養することを含み、
   前記培養することが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発する、方法。
2. 前記培養培地が、１％〜２０％のヒト血清を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記培養培地が、２％〜１０％のヒト血清を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記ｈＨＣＣ細胞系が、ＨｕＨ−７またはＨｕＨ−７誘導細胞系である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記培養することが、ヒト血清を含む前記培養培地における１０日間の培養の後の継代培養を伴わない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により産生される細胞を含む、細胞培養物。
7. ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞であって、前記細胞がヒト肝細胞癌(ｈＨＣＣ)細胞系の分化後代である、細胞と、
   ヒト血清を含む培養培地と、を含む、細胞培養物。
8. ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞に対する候補作用物質の効果を評価する方法であって、
   ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、
   前記インキュベートすることが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、
   前記初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞を、候補作用物質と接触させることと、
   ヒト初代肝細胞の表現型を有する前記細胞の表現型に対する前記候補作用物質の効果の存在または不存在についてアッセイすることと、を含む、方法。
9. 前記アッセイすることが、初代ヒト肝細胞の表現型を有する前記細胞による脂質代謝に対する前記候補作用物質の効果についてである、請求項８に記載の方法。
10. 前記アッセイすることが、初代ヒト肝細胞の表現型を有する前記細胞による超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および／または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の分泌に対する前記候補作用物質の効果についてである、請求項８に記載の方法。
11. ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞による作用物質の代謝を評価する方法であって、
    ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、
    前記インキュベートすることが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、
    前記初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞を、作用物質と接触させることと、
    前記作用物質の代謝産物および／または前記作用物質の存在または不存在についてアッセイすることと、を含む、方法。
12. 前記作用物質が薬剤である、請求項１１に記載の方法。
13. ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞に対する作用物質の毒性を評価する方法であって、
    ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、
    前記インキュベートすることが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、
    前記初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞を、作用物質と接触させることと、
    前記細胞に対する前記作用物質の毒性を示す、前記細胞の表現型における変化の存在または不存在についてアッセイすることと、を含む、方法。
14. 前記表現型が、培養培地におけるトランスアミナーゼの増加である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記表現型が、細胞死のマーカーの増加である、請求項１３に記載の方法。
16. ウイルス粒子を産生する方法であって、
    ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、
    前記インキュベートすることが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、
    向肝性ウイルスのゲノムを、前記ｈＨＣＣ細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する前記細胞のうちの少なくとも１つに導入することと、
    前記細胞培養物を、ウイルス粒子の産生に適した条件下で維持することと、を含む、方法。
17. 前記導入することが、感染性ウイルス粒子を前記培養培地に添加することによる、請求項１６に記載の方法。
18. 前記感染性ウイルス粒子が、前記インキュベートの１日目に添加される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ウイルスゲノムが、前記インキュベートする前に前記ｈＨＣＣ細胞系に導入される、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記導入することが、前記向肝性ウイルスの感染によるものであり、前記細胞培養物が、リポタンパク質枯渇血清を含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記方法が、ウイルス粒子を前記培養培地から単離することを含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
22. ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、
    前記インキュベートすることが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、
    向肝性ウイルスのゲノムを、前記ｈＨＣＣ細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する前記細胞のうちの少なくとも１つに導入することと、
    を含む方法により産生される細胞を含む、ウイルス感染細胞培養物。
23. 候補作用物質を抗ウイルス活性についてスクリーンする方法であって、
    ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、
    前記インキュベートすることが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、
    向肝性ウイルスのゲノムを、前記ｈＨＣＣ細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する前記細胞のうちの少なくとも１つに導入することと、
    前記細胞培養物を候補抗ウイルス剤と接触させることと、
    前記細胞培養物を、ウイルス複製に適した条件下で維持することと、
    ウイルス複製に対する前記候補作用物質の効果の存在または不在を検出することと、を含み、
    前記候補作用物質の不在下と比較した、前記候補作用物質の存在下でのウイルス粒子産生の減少が、前記候補作用物質が抗ウイルス活性を有することを示す、方法。
24. 前記導入することが、感染性ウイルス粒子を前記培養培地に添加することによる、請求項２３に記載の方法。
25. 前記感染性ウイルス粒子が、前記インキュベートの１日目に添加される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ウイルスゲノムが、前記インキュベートの前に前記ｈＨＣＣ細胞系に導入される、請求項２５に記載の方法。
27. 抗体を含有することが疑われる試料を抗ウイルス活性についてスクリーンする方法であって、
    ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間を越えてインキュベートすることであって、
    前記インキュベートすることが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、
    向肝性ウイルスのゲノムを、前記ｈＨＣＣ細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する前記細胞のうちの少なくとも１つに導入することと、
    前記細胞培養物を、抗体を含有することが疑われる試料と接触させることと、
    前記細胞培養物を、ウイルス複製に適した条件下で維持することと、
    ウイルス複製に対する前記試料の効果の存在または不在を検出することと、を含み、
    前記試料の不在下と比較した、前記試料の存在下でのウイルス粒子産生の減少が、前記試料が、抗ウイルス活性を有する抗体を含有することを示す、方法。
28. 前記導入することが、感染性ウイルス粒子を前記培養培地に添加することによる、請求項２７に記載の方法。
29. 前記感染性ウイルス粒子が、前記インキュベートの１日目に添加される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ウイルスゲノムが、前記インキュベートの前に前記ｈＨＣＣ細胞系に導入される、請求項２７に記載の方法。
31. リポタンパク質仲介疾患の治療のために候補作用物質をスクリーンする方法であって、
    ヒト肝細胞癌（ｈＨＣＣ）細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において１１日間以上インキュベートすることであって、
    前記インキュベートすることが、前記ｈＨＣＣ細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発することと、
    前記細胞培養物を、前記候補作用物質と接触させることと、
    対照試料と比較した、前記分化ｈＨＣＣ細胞系により分泌されたリポタンパク質のレベルに対する前記候補作用物質の効果の存在または不在について前記細胞培養物をアッセイすることと、を含み、
    前記分化ｈＨＣＣ細胞系により分泌されたリポタンパク質のレベルに対する前記候補作用物質の効果が、前記候補作用物質が前記リポタンパク質仲介疾患の前記治療に使用され得ることを示す、方法。
32. 前記細胞培養物が、対照試料と比較した、前記培養培地における超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および／または高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のレベルに対する前記候補作用物質の効果の存在または不在についてアッセイされる、請求項３１に記載の方法。
33. 前記方法が、アテローム動脈硬化症の治療のために候補作用物質をスクリーンするためのものであり、ＶＬＤＬもしくはＬＤＬの減少、またはＨＤＬの増加が、前記候補作用物質がアテローム動脈硬化症の前記治療に使用され得ることを示す、請求項３１に記載の方法。

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