KR102089477B1 - 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102089477B1
KR102089477B1 KR1020157008282A KR20157008282A KR102089477B1 KR 102089477 B1 KR102089477 B1 KR 102089477B1 KR 1020157008282 A KR1020157008282 A KR 1020157008282A KR 20157008282 A KR20157008282 A KR 20157008282A KR 102089477 B1 KR102089477 B1 KR 102089477B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
culture
hhcc
cell
phenotype
Prior art date
Application number
KR1020157008282A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150048868A (ko
Inventor
론 디. 티렐
헨드릭케 지세 스틴베르겐
마이클 에이. 조이스
Original Assignee
더 가버너스 오브 더 유니버시티 오브 알버타
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 가버너스 오브 더 유니버시티 오브 알버타 filed Critical 더 가버너스 오브 더 유니버시티 오브 알버타
Publication of KR20150048868A publication Critical patent/KR20150048868A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102089477B1 publication Critical patent/KR102089477B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5026—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell morphology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5067—Liver cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/30—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cancer cells, e.g. reversion of tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2730/10152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/24252—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 개시내용은 1차 인간 간세포 표현형을 나타내는 인간 간세포 세포주의 시험관내 배양물에 관한 방법 및 조성물을 제공한다. 그러한 세포주는 HCV 또는 HBV와 같은 간친화성 바이러스에 의한 감염에 대해 민감성이며, 바이러스 복제 및 고수준의 바이러스 입자 생성 둘 다를 뒷받침한다. 그러한 시험관내 배양물은 간친화성 바이러스의 생성 및 연구, 및 또한 스크리닝 방법(예를 들면, 항바이러스 약물에 대하여, 약물 대사를 평가하는 방법), 및 1차 인간 간세포의 연구에 있어서의 용도를 제공한다.

Description

1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물{METHODS FOR PRODUCING CELLS HAVING A PHENOTYPE OF A PRIMARY HUMAN HEPATOCYTES AND COMPOSITIONS}
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2012년 8월 31일자로 출원된 미국 가출원 시리즈 번호 제61/696,059호 및 2013년 2월 6일자로 출원된 미국 가출원 특허 시리즈 번호 제61/761,588호의 우선권 이점을 주장하며, 이러한 출원 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서론
C형 간염 바이러스(HCV)는 급성 및 만성 간염을 유발하는 플라비비리다에(Flaviviridae) 계열의 작은 외막형(enveloped) 양성-가닥(positive-strand) RNA 바이러스이다. 이는 감염된 개인에서 경화증, 간세포 암종 및 지방증을 유발할 수 있다. HCV의 9.6 kb 게놈은, 공- 및 후-해독적으로 절단되는 약 3,000개의 아미노산 다단백질을 암호화(encoding)하는, 단일 개방 판독 프레임(single open reading frame)으로 이루어진다. 수개의 연구 결과, HCV 감염을 뒷받침하는 인간 인자를 보고해 왔다 (Li et al. (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106: 16410-16415; Reiss et al. (2011) Cell Host Microbe 9: 32-45). 유의적인 수의 이러한 인자들이 소포 조직, 또는 막 및 지질 관련된 유전자에서 역할을 담당한다. 다른 한편으로는, HCV 단백질은 또한, 예를 들면, 막의 웹의 형성, 선천 면역 경로의 조절 및 지질 합성 경로의 유도에 의해, 감염된 세포에서 전사적 변화를 유발하는 것으로 알려져 있다 (Blais et al. (2010) J Proteome Res 9: 912-923; Blais et al. (2010) J Biol Chem 285: 25602-25612; Joyce et al. (2009) PLoS pathogens 5: el000291; Singaravelu et al. (2010) Proteome Sci 8:5; Walters et al. (2006) Virology Journal 3:37; Walters et al. (2006) PLoS pathogens 2: e59).
아게놈성(subgenomic), 전장 레플리콘 시스템(full-length replicon system) 및 JFH-1 감염 모델은 HCV 해독 및 RNA 복제, 도입 및 배출로의 통찰을 생성해 왔다. 이러한 모델 대부분은 HuH-7 또는 HuH-7 유래된 세포를 기반으로 한다. HuH-7(또는 -유래된) 세포의 사용은 HCV의 시험관내 연구를 위한 많은 이점을 갖는다. 이들은 용이하게 이용가능하고, 신속하게 분할되며, 이에 따라 대규모 실험이 가능하도록 한다. 그러나, 이러한 시스템은 생체내에서 천연 HCV 감염 동안에 발생하는 현상을 정확하게 나타낼 필요는 없는데, 그 이유는 간세포가 일반적으로 비-분할성이고 완전히 분화되기 때문이다. 1 내지 2% 디메틸 설폭사이드(DMSO, 극성의 비양자성 용매)를 세포 배양 배지(Sainz et al. (2006) J Virol 80: 10253-10257)에 부가하여 세포의 성장을 정지시켜서, 간세포-특이적 유전자의 발현을 유도함으로써, 이러한 것을 피하기 위한 노력이 수행되어 왔다.
새롭게 단리된 1차 인간 간세포는 HCV 감염성을 연구하기 위한 시험관내 모델에서 논리적으로 더 대표적이다. 그러나, 이들 세포에서 생성된 바이러스의 양은 낮으며(전형적으로, 103 RNA 카피/ml 미만), 장기간 실험(수일 초과)을 위하여, 이러한 세포는 다른 세포 유형과 공-배양(co-culturing)되어야 한다(Banaudha et al (2010) Hepatology, 51 : 1922-1932; Ploss et al. Proc. Natl. Acad. Sciences 2010 vol. 107 no. 7 3141-3145). 1차 간세포는 따라서 대규모 바이러스 생성에 적합하지 않다.
HCV 바이러스 역가(viral titer)는 대략 106 내지 107 RNA 카피/ml(약 1개의 바이러스/세포)의 HuH-7 또는 HuH-7-유래된 세포에서 성취되어 왔다. 그러나, 이러한 바이러스 역가는 일반적으로 너무 낮아서 바이러스 입자를 상업적인 규모로 제공할 수 없다. 또한, HuH7.5 세포에서의 감염은 이례적인 HCV 변이체, JFH-1을 사용하여서만이 가능해 왔다.
1차 인간 간세포의 시험관내 모델로서 작용할 수 있는 배양 시스템을 위한 당해 분야에서의 필요성이 존재한다.
요약
본 개시내용은, 1차 인간 간세포 표현형을 나타내는 인간 간세포 세포주의 시험관내 배양물과 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 그러한 세포주는 HCV 또는 HBV와 같은 간친화성 바이러스에 의한 감염에 민감하고, 바이러스 복제 및 고 수준의 바이러스 입자 생성 둘 다를 뒷받침한다. 이러한 시험관내 배양물은 스크리닝 방법(예를 들면, 항바이러스 약물을 위하여, 약물 대사를 평가함), 및 1차 인간 간세포의 연구 뿐만 아니라 간친화성 바이러스의 생성 및 연구에서의 용도를 발견한다.
본 개시내용은 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주를 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양함을 포함하여, 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포 배양물을 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 hHCC 세포주의 분화를 유도한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 약 1 내지 20%의 인간 혈청, 임의로 약 2% 내지 10%의 인간 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, hHCC 세포주는 HuH-7 또는 HuH-7-유래된 세포주이다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 배양한지 10일 후에 계대배양(subculturing)없이 수행된다. 본 개시내용은 그러한 배양 방법에 의해 생성된 세포를 포함하는 세포 배양물을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하며, 여기서 세포는 hHCC 세포주의 분화된 후대세포이며; 배양 배지는 인간 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 또는 적어도 21일 이상 동안 연속적으로 유지시켜 왔다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 약 1% 내지 20% 인간 혈청, 임의로 약 2% 내지 10% 인간 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, hHCC 세포주는 HuH-7 또는 HuH-7-유래된 세포주이다.
본 개시내용은, 본 개시내용의 분화된 세포 배양물을 후보 제제(candidate agent)와 접촉시키는 것; 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포의 표현형에 대한 후보 제제의 효과의 부재 또는 존재를 검정하는 것을 포함하는, 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포 상에서 후보 제제의 효과를 평가하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 검정은, 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포에 의한 지질 대사에 대한 후보 제제의 효과를 위한 것이다. 다른 구현예에서, 검정은 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포에 의한 매우 저밀도 리포단백질(VLDL), 저밀도 리포단백질(LDL), 및/또는 고밀도 리포단백질(HDL) 분비에 대한 후보 제제의 효과에 대한 것이다.
본 개시내용은, 본 개시내용의 분화된 세포 배양물을 제제와 접촉시키는 것; 제제의 대사물 및/또는 제제의 존재 또는 부재에 대해 검정하는 것을 포함하는, 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포에 의한 제제의 대사를 평가하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제제는 약물이다.
본 개시내용은, 본 개시내용의 분화된 세포 배양물을 제제와 접촉시키는 것; 세포에 대한 제제의 독성의 지표인 세포의 표현형에서의 변화의 존재 또는 부재에 대해 검정하는 것을 포함하는, 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포 상에서 제제의 독성을 평가하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 검정된 표현형은 배양 배지 속의 트랜스아미나아제의 증가 및/또는 세포 사멸의 마커(marker)를 위한 검정이다.
본 개시내용은, 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양(incubating)하는 것; 간친화성 바이러스의 게놈을 hHCC 세포주 또는 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포 중의 적어도 하나 내로 도입하는 것; 바이러스 입자의 생성에 적합한 조건하에 세포 배양물을 유지키는 것을 포함하며, 여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 hHCC 세포주의 분화를 유도하는, 바이러스 입자를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 감염성 바이러스 입자를 배양 배지에 부가함으로써 도입된다. 일부 구현예에서, 감염성 바이러스 입자는 상기 배양의 1일째에 부가한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 상기 배양 전에 hHCC 세포주 내로 도입된다. 이러한 방법들의 일부 구현예에서, 방법은 배양 배지로부터 바이러스 입자를 단리시키는 것을 포함한다.
본 개시내용은, 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양하는 것; 간친화성 바이러스의 게놈을 hHCC 세포주 또는 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포 중의 적어도 하나 내로 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된 세포를 제공하고, 여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 hHCC 세포주의 분화를 유도하는, 바이러스-감염된 세포 배양물을 제공한다.
본 개시내용은, 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양하는 것; 간친화성 바이러스의 게놈을 hHCC 세포주 또는 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포 중의 적어도 하나 내로 도입하는 것; 바이러스 복제에 적합한 조건하에 세포 배양물을 유지시키는 것; 바이러스 복제 시 후보 제제의 효과의 존재 또는 부재에 대해 검출하는 것을 포함하며, 여기서 상기 배양은 hHCC 세포주의 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 분화를 유도하며, 후보 제제의 부재와 비교하여 후보 제제의 존재하에서의 바이러스 입자 생성의 감소는, 후보 제제가 항바이러스 활성을 가짐을 나타내는, 항바이러스 활성을 위한 후보 제제를 스크리닝(screening)하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 감염성 바이러스 입자를 배양 배지에 부가함으로써 도입된다. 일부 구현예에서, 감염성 바이러스 입자는 상기 배양의 1일째에 부가한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 상기 배양 전에 hHCC 세포주 내로 도입된다.
본 개시 내용은 인간 간세포 암종 (hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양하는 것; 간친화성 바이러스의 게놈을 상기 hHCC 세포주 또는 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 상기 세포 중 적어도 하나에 도입하는 것; 상기 세포 배양물을 항체를 함유하는 것으로 추정되는 표본과 접촉시키는 것; 상기 세포 배양물을 바이러스 복제에 적합한 조건 하에 유지시키는 것; 및 바이러스 복제 시 상기 표본의 효과의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 상기 hHCC 세포주의 분화를 유도하며, 상기 표본의 부재와 비교하여 상기 표본의 존재하에서 바이러스 입자 생성에 있어서의 감소는, 상기 표본이 항바이러스 활성을 갖는 항체를 함유함을 나타내는, 항바이러스 활성에 대해 항체를 함유하는 것으로 추정되는 표본을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 감염성 바이러스 입자를 배양 배지에 부가함으로써 도입된다. 일부 구현예에서, 감염성 바이러스 입자는 상기 배양의 1일째에 부가한다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈은 상기 배양 전에 hHCC 세포주 내로 도입된다.
본 개시내용은 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 적어도 3일, 적어도 5일, 및 일부 구현예에서 적어도 14일 동안 배양하는 것; 세포 배양물을 항체를 함유하는 것으로 추정되는 표본과 접촉시키는 것; 및 세포 배양물을 대조군 표본과 비교하여 분화된 hHCC 세포주에 의해 분비된 리포단백질의 수준에 대한 후보 제제의 효과의 존재 또는 부재에 대해 검정하는 것을 포함하고, 여기서 상기 배양은 hHCC 세포주의 인간 간세포 표현형을 갖는 세포주로의 분화를 유도하고, 분화된 hHCC 세포주에 의해 분비된 리포단백질의 수준에 대한 후보 제제의 효과는, 후보 제제가 리포단백질 매개된 질병의 치료를 위해 사용될 수 있음을 나타내는, 리포단백질 매개된 질병을 치료하기 위한 후보 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 세포 배양물은 대조군 표본과 비교하여 배양 배지 속의 초저밀도 리포단백질(VLDL), 저밀도 리포단백질(LDL) 및/또는 고밀도 리포단백질(HDL)의 수준에 대한 후보 제제의 효과의 존재 또는 부재에 대해 검정된다. 특정 구현예에서, 이 방법은 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 후보 제제를 스크리닝하는 방법이며, 여기서 VLDL 또는 LDL의 감소 또는 HDL의 증가는, 후보 제제가 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
본 개시내용은 간친화성 미생물(예로, 바이러스)로 감염된 배양된 간세포 세포를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 배양된 간세포 세포를 LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 접촉은 간친화성 미생물을 갖는 배양된 간세포 세포의 감염을 제공하기에 충분한 시간 동안 수행한다. 일부 구현예에서, 배양된 세포는 1차 간세포 또는 불멸화(immortalized)된 간세포 세포주이다. 일부 구현예에서, 배양된 세포는 분화된 hHCC 세포이다. 일부 구현예에서, LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청은 LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 인간 혈청 또는 LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 소 태아 혈청이다. 일부 구현예에서, 감염성 간친화성 미생물은 간친화성 바이러스이다. 일부 구현예에서, 간친화성 바이러스는 C형 간염 바이러스 또는 B형 간염 바이러스이다. 일부 구현예에서, 간친화성 바이러스는 임상 단리물이다.
이들 및 기타 특징은 본 명세서를 검토하는 경우 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.
도 1은 배양 조건의 시간표의 예시를 나타내는 흐름도이다.
도 2a 내지 2b는 소 태아 혈청(FBS) 대 인간 혈청(HS)을 함유하는 배양 배지 내의 세포의 외관 및 성장에서의 차이를 나타낸다. 도 2a는 배양물 속의 인간 1차 간세포(우측 패널)과 비교한 FBS(좌측 패널) 및 HS(중앙 패널)이 보충된 매질에서 성장한 세포를 나타내는 사진 세트이다. 도 2b는 FBS-함유 배지(폐쇄 원) 대 HS-함유 배지(개방 원) 중에 유지된 세포 배양물에 대한 세포 수를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 1차 간세포 배지(PHM) 및 배양물 속의 인간 1차 간세포(prim. hep.) 속에 유지된 HuH7.5 세포뿐만 아니라 FBS 또는 HS 속에 유지된 세포 속에서, 간세포 분화 마커 LDL-수용체, 알부민, 및 알파1-안티트립신의 발현을 7 또는 21일 동안 발현시키는 것을 나타내는 그래프의 세트이다. 또한, 간에서 고도로 발현되는 2개의 치밀한 결합 단백질인 클라우딘-1 및 오클루딘의 발현이 포함된다.
도 3b는 주요한 지질 대사 조절제, 간 X 수용체 알파(LXRα), 페록시좀 증식기-활성화된 수용체 알파 및 감마(PPARα, PPARγ)가 HS에서 배양되는 세포에서 모두 고도로 발현된다는 것을 나타내는 그래프의 세트이다. 세포골격 단백질 비멘틴 및 E-카드헤린은 또한 인간 혈청에서 성장된 세포에서 증가한다.
도 4는 FBS 및 배양된 1차 간세포(prim.hep.)와 비교하여, 2% DMSO, 또는 2% 성인 소 혈청(ABS)의 존재하에 성장한 세포에 대한 위에서 언급한 분화 마커의 영향을 나타내는 그래프이다. ABS 및 DMSO 둘 다는 접촉 억제/성장 정지(growth arrest)를 유도하지만, 분화 마커의 증가된 발현을 유도하지 않는다.
도 5a는, 세포 지질 소적(droplet)이 FBS와 비교한 HS(우측 패널)에서 배양된 세포에서 증가함을 예시하는 사진의 세트이다.
도 5b는 FBS 또는 HS (n>4)에서 유지된 세포의 보디피 형광(Bodipy fluorescence)의 정량화를 나타내는 그래프이다.
도 6a 내지 6e는 HCV 균주 JFH-1("JFH")로의 세포의 감염의 결과를 나타내는 그래프의 세트이며, 여기서 세포는 FBS 또는 HS에서 배양된다. 도 6a: FBS에서 배양되고, 이후에 인간 혈청 또는 소 태아 혈청에서 배양된 세포로부터 생성된 JFH 바이러스로 감염된 바이러스 역가(JFH-HS, 원; JFH-FBS, 정사각형). 도 6b: 동일한 바이러스(JFH-HS)로 감염된 상이한 조건(FBS, 개방 원, HS, 폐쇄 원) 하에 성장한 세포로부터의 바이러스 역가. 도 6c는 HS 배양된 세포에서 JFH-HS와 비교한 FBS 배양된 세포 중의 JFH-FBS의 생성 사이의 바이러스 역가에서 1000배 차이를 나타낸다. 도 6d: FBS-함유 배지로부터 HS-함유 배지(개방 원)의 세포의 이동 시에 또는 FBS-함유 배지로부터 HS-함유 배지(폐쇄 원)으로의 이동 후 14일째에 감염된 인간 혈청에서 성장한 세포에서 고 바이러스 역가의 장기간 생성. 도 6e: 2% HS를 함유한 1차 간세포 배지(PHM, 2% HS)에서 또는 2% HS를 함유한 DMEM(DMEM, 2% HS)에서 성장한 세포의 바이러스 역가를 예시한다.
도 7은 HS-함유 배지(JFH-HS, 정사각형), 또는 조직-배양된 바이러스 HCVcc(삼각형)에서 배양된 HuH7.5 세포의 전기천공에 의해 생성된 HCV-감염된 환자 혈청(원), JFH 바이러스로의 키메라 SCID/Alb-uPA 마우스 모델의 감염의 결과를 나타내는 그래프이다,
도 8은 HCV에 대한 인간-혈청 함유 배양물의 영향을 나타내는 그래프의 세트이다. 패널 A: 슈크로즈 구배 원심분리에 의해 측정된 인간 혈청(정사각형) 또는 FBS(원)에서 배양된 세포로부터 생성된 바이러스의 바이러스 밀도; 패널 B: FBS 또는 인간 혈청(HS)에서 배양된 세포로부터 생성된 바이러스의 바이러스 밀도 분포의 정량화; 및 패널 C: 상이한 바이러스 변이체의 아포리포단백질 B 결합. JFH FBS: FBS에서 배양된 세포로부터 생성된 JFH-1; JFH HS: HS에서 배양된 세포로부터 생성된 JFH-1; 환자 혈청.
도 9는 차별화된 세포에 ApoB-함유 리포단백질을 부가한 효과를 나타내는 그래프의 세트이다. 좌측 패널: 바이러스 생성에 대한 분화된 세포에 인간 VLDL의 부가 효과; 우측 패널: 바이러스 생성에 대한 차별화된 세포에 인간 LDL의 부가 효과.
도 10은 2개의 상이한 환자로부터의 HCV 양성 혈청을 갖는 인간 혈청 내에 유지된 세포의 감염을 나타내는 그래프이다(환자 1: 원, 환자 2: 정사각형, 둘 다의 유전형 1a).
도 11은 패널 A 및 B는 각종 시간(B)에 대한 인간 혈청(HS)에서 배양된 Huh7.5 세포로부터 매질 및 인간 혈액(A)의 트리아실글리세라이드-계 리포단백질 프로파일을 나타내는 그래프이다. 리포단백질 분리는 크기 배제 고속-단백질 액체 크로마토트래프(FPLC)를 사용하여 수행하였다.
도 12는 각종 시간 길이에 대한 인간 혈청(HS) 속에서 배양된 Huh7.5 세포로부터 채득된 매질의 콜레스테롤계 리포단백질 프로파일을 나타내는 그래프이다. 리포단백질 분리는 크기 배제 고속-단백질 액체 크로마토그래프(FPLC)를 사용하여 수행하였다.
도 13은 인간 혈청(HS)에서 배양된 Huh7.5 세포의 감염 이후 HBV 생성을 나타내는 그래프이다.
도 14는 상이한 시간 기간 동안 FBS 또는 인간 혈청 속에서 배양된 Huh7.5 세포에서의 NTCP 발현을 나타내는 그래프이다.
도 15는 상이한 배양 배지(FBS, HS, 및 헤파린 처리된 FBS 및 HS(HepHS 및 HepFBS))에서 HCV 바이러스 생성의 비교를 나타내는 그래프의 세트이다. 패널 A: HS(정사각형) 또는 FBS(원)에서 배양된 세포 속의 바이러스 역가. 패널 B: HepFBS 또는 HepHS에서 배양된 세포 속의 바이러스 역가. 패널 C: 패널 B의 처음 8일의 확대.
도 16은 헤파린 컬럼을 사용한 HCV의 정제를 나타내는 그래프이다. HCV는 각각의 분획에서 HCV 코어 단백질의 정량화에 의해 검출되었다.
도 17은 헤파린 컬럼을 사용하여 정제한 바이러스를 사용하여, 2일 동안 FBS, 또는 HepHS 속에서 배양된 세포의 감염을 나타내는 이미지이다.
도 18은 패널 A(패널 B)에서 별표(*)로 나타낸 시점에서 세포로부터 상층액을 사용하거나 마우스 계대배양된(passaged) HCV 유전형 1a(패널 A)을 사용하여 HS-배양된 Huh7.5 세포의 감염을 나타내는 그래프를 제공한다. 패널 B내의 세포는 HS에서 분화시켰고, HepHS에서 2일 동안 정치시킨 다음, 감염시켰다.
도 19 및 도 20은 HS-배양된 Huh7.5 세포에서 상 I 대사 유전자의 유전자 발현 분석을 나타낸다.
도 21 및 도 22는 HS-배양된 Huh7.5 세포에서 상 II 대사 유전자의 유전자 발현 분석을 나타낸다.
본 발명을 추가로 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특수 구현예에 한정되지 않으며, 물론, 이는 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 전문용어는 특수한 구현예를 설명할 목적을 위한 것이며, 본 발명의 영역이 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이므로, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 내용이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 이러한 범위의 상한치와 하한치 사이의 하한치 단위의 1/10까지, 각각의 사이의 값 및 이러한 기술된 범위내 임의의 다른 기술되거나 사이의 값은 본 발명 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 이러한 보다 작은 범위의 상한치 및 하한치는 보다 작은 범위내에 독립적으로 포함될 수 있으며 또한 본 발명 내에 포괄되고, 기술된 범위내에 임의의 구체적으로 배제된 한계에 속할 수 있다. 기술된 범위가 한계 중의 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 다를 배제한 범위는 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는, 본 발명이 속한 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질을 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있다고 해도, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기술된다. 본원에 언급된 모든 공보는 이와 관련하여 공보가 인용하고 있는 방법 및/또는 물질을 개재하고 설명하기 위해 본원에 참조로 포함된다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 것으로서, 단수형 "하나(a)", "및", 및 "상기(the)"는, 내용이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수 참조를 포함함을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포"에 대한 참조는 다수의 이러한 세포를 포함하며 "그 바이러스"에 대한 참조는 당해 분야의 숙련가에게 알려진 하나 이상의 바이러스 및 이의 등가물 등에 대한 참조를 포함한다.
본원에 논의된 공보는 본원의 우선일 전에 이들의 개시내용에 대해 유일하게 제공되어 있다. 본원의 어느 것도, 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 공보를 선행하는 자격이 주어지지 않음을 허용하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 공보일은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공보일과 상이할 수 있다.
실시예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 기재내용 및 설명을 제공하기 위해 설정되어 있으며, 발명자가 이들의 발명으로서 고려하거나 이들이, 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위해 의도한 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들면, 양, 온도 등)와 관련하여 정밀도를 보증하기 위한 노력이 이루어져 왔으며 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
명확성을 위해, 별도의 구현예의 내용에 기술된, 본 발명의 특정한 특징은 또한 단일의 구현예와 함께 제공될 수 있음이 인식된다. 역으로, 단일의 구현예의 내용에 요약하여 기술된, 본 발명의 각종 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 소-조합으로 제공될 수 있다. 본 발명에 관한 구현예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 각각 및 모든 조합은, 이러한 조합이 예를 들면, 안정한 화합물(즉, 생물학적 활성을 위해 제조되어, 분리되고, 특성화되며, 시험될 수 있는 화합물)인 화합물인 대상 물질을 포함하는 정도까지 개별적으로 및 명백하게 개재되는 경우와 같이 개시된다. 또한, 각종 구현예의 모든 소-조합 및 이의 성분(예를 들면, 이러한 변수를 설명하는 구현예에서 열거된 화학 그룹의 성분)은, 또한 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 각각 및 모든 이러한 소-조합이 개별적으로 및 명백하게 본원에 개재되는 경우와 같이 본원에 개시된다.
정의
세포, 또는 세포의 실질적인 부위 및 세포 집단에서 이들의 후대세포가 분화되지 않은 모 세포의 형태학적 특징을 나타냄으로써, 이들을 미분화된 모 세포와는 상이한 바람직한 표현형, 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 1차 간세포의 표현형을 갖는 분화된 세포와 구별하는 경우, 세포 또는 세포 배양물은 "미분화된"으로 기술된다. 상기 집단내에서 미분화된 세포의 콜로니(colony)는 흔히 분화되어 있는 이웃한 세포에 의해 둘러싸여 있을 것으로 이해된다.
"성장 환경"은, 관심이 있는 세포가 시험관내에서 증식하고/하거나 분화하고/하거나 성숙할 환경이다. 환경의 특징은, 세포가 배양되는 배지, 존재할 수 있는 임의의 성장 인자 또는 분화-유도 인자, 및 존재할 경우 지지 구조물(예를 들면, 고체 표면 상의 기질)을 포함한다.
"표현형 마커(phenotypic marker)"는 세포형의 지표인 세포의 관찰가능한 특성을 말한다. 표현형 마커는 세포의 바이오마커(biomarker), 형태학적 특징, 및 생리학적 기능을 포함한다.
본원에 사용된 "바이오마커"는 일반적으로 상이한 표현형 상태의 세포(예를 들면, 1차 간세포와 비교된 미분화된 hHCC 세포)에서 차등적으로 존재하거나 알려진 표현형 상태를 갖는 제2 세포(예를 들면, 1차 간세포와 비교된 분화된 hHCC 세포)의 그것과 제1 세포에서 유사한 유기 생체분자(예를 들면, 폴리펩티드)를 지칭한다. 바이오마커는, 제2 표현형 상태에 대해 제1 표현형 상태의 바이오마커의 평균 또는 중간 수준이 계산되어 통계적으로 유의적인 차이를 나타내는 경우 상이한 표현형 상태 사이에 차등적으로 존재한다. 통계적 유의성에 대한 일반적인 시험은 다른 것들 중에서, t-시험, ANOVA, 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis), 윌콕손(Wilcoxon), 만-휘트니(Mann-Whitney) 및 오즈 비율(odds ratio)를 포함한다. 바이오마커는, 단독으로 또는 함께 세포가 관련된 표현형 상태에 속하게 되는 상대적 가능성의 척도를 제공한다.
개별 세포 또는 세포 집단에서 표현형 바이오마커의 평가시, 달리 기술하지 않는 한, 세포는, 세포가 배경(background) 또는 음성 대조군 수준을 유의적으로 초과하는 바이오마커의 검출가능한 수준을 나타내는 경우 바이오마커에 대해 "양성"인 것으로 일컬어진다. 달리 기술하지 않는 한, 세포는, 바이오마커의 발현이 배경 또는 대조군 수준을 유의적으로 초과하지 않는 경우 바이오마커에 대해 "음성"인 것으로 일컬어진다.
폴리뉴클레오티드가 인공 조작의 임의의 적합한 수단에 의해서 세포 내로 전달된 경우, 또는 세포가 폴리뉴클레오티드를 물려받은 원래의 유전적으로 변경된 세포의 후대세포인 경우 "유전적으로 변경된" 또는 "유전적으로 개질된"으로 언급된다. 상기 유전 변경은 상기 변경된 세포의 후대세포가 동일한 변경을 갖는 경우, "유전될 수 있는"으로 일컬어진다.
"조직 배양물 적응된 바이러스"는 시험관내(in vitro) 세포 배양물 속에서 사전에 배양되어, 배양 전에 모 바이러스에 비하여 시험관내 세포주에 있어서 개선된 복제, 시험관내 세포주의 감염성, 또는 이들 둘 다에 있어서 개선된 복제를 위하여 선택되어지는 바이러스를 의미한다.
본원에 사용된, 적응된 바이러스의 문맥에서 "적응성 돌연변이"는 적응성 돌연변이를 갖지 않은 복제 적격 바이러스와 비교하여 표적 세포를 복제하거나 감염시키거나 또는 표적 세포를 복제하고 감염시키는 것 둘 다의 능력을 증가시키는 유전적 변화를 지칭한다.
"유전적으로 개질된 바이러스"는 자연-발생의 바이러스와 비교하여 유전적으로 개질된 바이러스 게놈으로부터 생성된 바이러스를 의미한다.
"위형 바이러스(pseudotyped virus)"는 바이러스 속에 함유된 바이러스 게놈보다 상이한 기원(예를 들면, 상이한 바이러스)로부터 기원하는 적어도 하나의 바이러스 단백질(예를 들면, 외피 단백질)을 갖는 바이러스를 의미한다.
"1차 세포 배양물"은 조직으로부터(예를 들면, 간으로부터) 직접 수득되고 불멸화되지 않는(예를 들면, 암성 조직으로부터 기원하지 않거나 배양물로부터 불멸화하도록 변형되지 않은) 세포의 시험관내 배양물을 말한다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은, 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산을 포함할 수 있는, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 말한다. 당해 용어는 이종 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질, N-말단 메티오닌 잔기; 면역학적으로 태그된(tagged) 단백질 등이 있거나 없는, 이종 및 동종 리더 서열(leader sequence)을 갖는 융합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 융합 단백질을 포함한다. "NH2"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리 아미노 그룹을 말하고 "COOH"는 폴리펩티드의 카복실 말단에 존재하는 유리 카복실 그룹을 말한다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 측쇄의 또다른 공유 화학적 및 물리적 특성(예를 들면, 전하, 크기, 소수성/친수성)에 대한 하나의 아미노산 잔기의 치환을 지칭한다. "보존적 치환"은 다음의 아미노산 잔기의 그룹내 치환을 포함하는 것으로 의도된다: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr. 이러한 치환에 대한 안내는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 정렬로부터 이끌어낼 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 중합체 형태를 말한다. 이러한 용어는 이중- 및 단일-가닥의 DNA 및 RNA를 포함한다. 이는 또한 변형의 알려진 유형, 예를 들면, 메틸화와 같은 자연-발생의 변형을 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 비-자연발생의 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 하전되지 않은 연결(예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등)을 지니고 하전된 연결(예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 지닌 것들, 예를 들면, 단백질(예를 들면, 뉴클라아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등을 포함함)과 같은 측쇄 모이어티(pendant moiety)를 함유하는 것들, 삽입제(intercalator)(예를 들면, 아크리딘, 소랄렌 등)를 지닌 것들, 킬레이터(예를 들면, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)을 지닌 것들, 알킬화제를 함유하는 것들, 및 폴리뉴클레오티드의 변형되지 않은 형태뿐만 아니라 개질된 연결(예: 알파 아노머성 핵산 등)을 갖는 것들과 같은, 동족체, 뉴클레오티드간 변형을 갖는 자연-발생의 뉴클레오티드의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
"재조합 숙주 세포", 숙주 세포", "세포", "세포주", "세포 배양물", 및 단세포 실체로서 배양된 미생물 또는 고등 진핵 세포주를 나타내는 다른 이러한 용어들은, 재조합 벡터 또는 다른 전달 DNA에 대한 수용체일 수 있거나, 수용체이어 왔거나, 수용체로서 사용된, 형질감염된 원래의 세포의 후대세포를 포함하는 세포를 지칭한다. 단일 모 세포의 후대세포는 천연의, 우연적인, 또는 의도적인 돌연변이로 인하여, 형태학에서 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체에 있어서 원래의 모 세포와 필수적으로 완전히 동일하지 않을 수 있음이 이해된다.
"레플리콘"은 임의의 유전적 성분, 예를 들면, 세포내에서 폴리뉴클레오티드 복제의 자가 단위로서 거동하는, 즉, 이의 자체의 조절 하에 복제할 수 있는 플라스미드, 염색체, 바이러스, 코스미드 등을 말한다.
"벡터"는, 이의 내부로 선택된 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 선택된 폴리뉴클레오티드의 복제 및/또는 발현을 유발할 수 있는 레플리콘을 말한다.
"작동적으로 연결된"은, 이렇게 기술된 성분들이 이들을 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병치(juxtaposition)를 말한다. 부호화 서열에 "작동적으로 연결된", 프로모터와 같은 조절 서열은, 이러한 부호화 서열의 발현이 조절 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 달성되도록 하는 방식으로, 결합되어 있다.
본원에 사용된, "변형(transformation)"은 삽입, 예를 들면, 형질도입, 형질감염, 또는 전기영동을 위해 사용된 방법과 상관없이, 숙주 세포내로의 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입을 말한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 통합되지 않은 벡터, 예를 들면, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 대안으로 숙주 게놈내로 통합될 수 있다.
"단리된"은, 화합물이 천연적으로 발생할 수 있는 환경과는 상이한 환경에서의 관련된 독립체를 지칭한다. "단리된"은 관련된 화합물이 실질적으로 농축되고/되거나 관련된 화합물이 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 표본 속에 존재하는 화합물을 포함함을 의미한다.
"정제된"은 천연적으로 이를 동반하는 성분으로부터 분리된 관련된 화합물(예를 들면, 폴리펩티드)을 말한다. "정제된"은 또한 제조(예를 들면, 화학적 합성) 동안에 이를 동반할 수 있는 성분으로부터 분리된 관련된 화합물을 지칭하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은, 이것이 천연적으로 관련되어 있거나 이것이 제조 동안 관련되어 있는 유기 분자로부터 유리되어, 적어도 50중량% 내지 60중량%로 존재하는 경우 실질적으로 순수하다. 일부 구현예에서, 제조는 관련된 화합물의 적어도 75중량%, 적어도 90중량%, 적어도 95중량%, 또는 적어도 99중량%이다. 실질적으로 순수한 화합물은 예를 들면, 천연 공급원(예를 들면, 박테리아)으로부터 추출에 의해, 화합물을 화학적으로 합성함에 의해, 또는 정제 및 화학적 변형의 조합에 의해 수득될 수 있다. 실질적으로 순수한 화합물은 또한 예를 들면, 화합물을 함유하는 표본을 농축시킴으로써 수득될 수 있다. 실질적으로 순수한 화합물은 또한 재조합 또는 화학적 합성 생성에 의해 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예를 들면, 크로마토그래피, 질량 분광법, 고 성능 액체 크로마토그래피 분석 등으로 측정할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "측정하는(determining)", "평가하는", "검정하는", "측량하는(measuring)", 및 "검출하는"은 정량적인, 반-정량적인 및 정성적인 측정을 지칭하며, 따라서, 당해 용어 "측정하는"은 본원에서 "검정하는", "측량하는" 등과 상호교환적으로 사용된다. 정량적 측정이 의도되는 경우, 어구 분석물 등의 "양을 측정하는"이 사용된다. 정량적 및 반-정량적 측정이 의도되는 경우, 어구 분석물의 "수준을 측정하는" 또는 분석물을 "검출하는"이 사용된다.
시험관내 간세포 세포 배양 방법 및 조성물
본 개시내용은 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주를 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포로 분화시키기에 충분한 조건하에서 hHCC 세포주를 배양하는 방법을 제공한다. 세포, 배양 배지 및 배양 방법의 예는 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
배양 방법에서 사용하기 위한 세포
1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포를 생성하기 위해 본 개시내용의 방법을 사용하기에 적합한 세포는 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주를 포함한다. "hHCC 세포주"(또한 인간 간 세포주로 언급됨)는 불멸화된 세포주, 및 이의 후대세포를 지칭하며, 여기서, 불멸화된 세포주는 인간 간세포 기원(예를 들면, 자연-발생의 암성 인간 간 세포, 예를 들면, 간세포 암종 또는 간모세포종을 배양함으로써 수득된 세포주)이다. hHCC 세포주는 HuH-7 세포(JCRB0403), HuH-7로부터 유래된 세포주("HuH-7-기원 세포", 예를 들면, Huh7.5; ATCC 제PTA-8561호; 미국 특허 제7,455,969호), HuH-6(JCRB0401), HepG2(ATCC 제HB-8065호); HepG2-유래된 세포(예를 들면, C3A(ATCC 제CRL-10741호)); 및 HepaRG™ 세포(미국 뉴욕주 그랜드 아이슬랜드 소재의 Life Technologes로부터 시판됨)를 포함하나, 이에 필수적으로 한정되지는 않는다. "유래된 세포(derived 세포)"는 원하는 표현형(예를 들면, 바이러스(예를 들면, 모 세포에 대해 조직 배양물-적응된 바이러스(예를 들면, HCV))의 바이러스 복제의 개선된 지지체)를 선택함으로써 분리된, 참조된 모 세포의 소집단(또는 "소세포주(subline)")인 세포를 말한다. 하나의 예에서, hHCC 세포는 HuH-7 세포 또는 HuH-7-유래된 세포(예를 들면, Huh7.5)이다.
본 개시내용의 방법에서 사용하기에 적합한 세포는 재조합 유전적 변형, 예를 들면, 작제물을 사용한 형질감염에 대한 요구없이 사용되어 증가된 바이러스 역가 생성을 촉진하거나 1차 인간 간세포의 표현형으로의 분화를 촉진할 수 있다.
배양 배지
바이러스적으로 감염된 hHCC 세포를 포함하는, hHCC 세포의 유지 및 증식을 위한 배양 배지는 비-인간 혈청, 예를 들면, 송아지 태아 혈청(FCS)으로 또한 언급된, 소 태아 혈청(FBS), 또는 합성 혈청(예를 들면, Nu-Serum®)을 함유하는 임의의 적합한 배양 배지일 수 있다. 일반적으로, hHCC 세포주의 유지 및 증식을 위한 배양 배지는 세포주와 양립성이 되도록 선택할 수 있다.
hHCC 세포의 분화를 유도하여 1차 인간 간세포의 표현형을 가지도록 하는 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위한 배양 배지를 선택하여 사용된 출발 세포주와, 그러나 비-인간 혈청을 인간 혈청(HS)으로 치환(예를 들면, 소 태아 혈청(FBS) 대신에)하여 가장 양립성이 되도록 할 수 있다.
일반적으로, 배양 배지는 탄소원, 질소원, 무기염, 미량의 영양소, 완충제 및, 임의로, 항체를 포함한다. 탄소원은 아라비노즈, 셀로비오즈, 프럭토즈, 글루코즈, 글리세롤, 이노시톨, 락토즈, 말토즈, 만니톨, 만노즈, 람노즈, 라피노즈, 소르비톨, 소르보즈, 슈크로즈, 트레할로즈, 피루베이트, 석시네이트 또는 메틸아민 또는 당해 분야의 숙련가에 의해 측정될 수 있는 다른 기질을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 당 알코올, 폴리올, 알돌 당 또는 케토 당일 수 있다.
배지는 폴리올 또는 알돌 당을 함유할 수 있다. 보다 구체적인 구현예에서, 배지는 탄소원으로서 만니톨, 이노시톨, 소르보즈, 글리세롤, 소르비톨, 락토즈, 및 아라비노즈를 약 0.1 중량% 내지 약 20.0중량%의 농도로 포함한다. 탄소원(들) 모두를 배양 개시 전에 배지에 가하거나, 이를 배양 동안 단계별로 또는 연속적으로 가할 수 있다. 배양 배지는 또한 질소원, 적합한 무기 염, 및 경우에 따라, 다양한 미량 영양소, 성장 인자 등을 포함할 수 있다.
적합한 보충적 탄소원의 예는 글루코즈, 프럭토즈, 만니톨, 전분 또는 전분 가수분해물, 셀룰로즈 가수분해물 및 몰라세스와 같은 다른 탄수화물; 아세트산, 프로피온산, 락트산, 포름산, 말산, 시트르산, 및 푸마르산과 같은 유기산; 및 글리세롤, 이노시톨, 만니톨 및 소르비톨과 같은 알코올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
적합한 질소원의 예는 암모니아 가스 및 수성 암모니아를 포함하는 암모니아; 염화암모늄, 질산암모늄, 인산암모늄, 황화암모늄 및 아세트산암모늄과 같은 무기 또는 유기산의 암모늄염; 요소; 질산염 또는 아질산염, 및 순수한 또는 조 제제로서 아미노산을 포함하는, 다른 질소-함유 물질, 고기 추출물, 펩톤, 어분(fish meal), 어류 가수분해물, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카제인 가수분해물, 대두 케이크 가수분해물, 효모 추출물, 건조된 효모, 에탄올-효모 증류물, 대두 가루, 면실박(cottonseed meal) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
적합한 무기 염의 예는 칼륨, 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 망간, 철, 코발트, 아연, 구리, 몰리브덴, 텅스텐 및 다른 미량 성분, 및 인산의 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
적절한 미량 영양소, 성장 인자 등의 예는 순수하거나 부분적으로 정제된 화학적 화합물로서 또는 천연 물질 속에 존재하는 것으로서, 코엔자임 A, 판토텐산, 피리독신-HCl, 바이오틴, 티아민, 리보플라빈, 플라빈 모노뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드, DL-6,8-티옥트산, 엽산, 비타민 Bi2, 다른 비타민, 시스테인 및 하이드록시프롤린과 같은 아미노산, 아데닌, 우라실, 우리딘, 구아닌, 티민 및 사이토신과 같은 염기, 티오황산나트륨, p- 또는 r-아미노벤조산, 니아신아미드, 니트릴로아세테이트 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 우리딘 및/또는 사이티딘을 각각 50μΜ 미만 내지 200μΜ의 농도로 함유한다.
세포 배양물 속에 사용된 항생제의 예는 페니실린, 네오마이신, 테트라사이클린, 겐타마이신, 가나마이신, 스트렙토마이신 및 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
적합한 배양 배지의 예는 DMEM, DMEM/F-12, 레이보비츠(Leibovitz) L-15 배지, RPMI 1640, 및 1차 간세포 배지(본원에서 PHM으로 언급됨)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 배양 배지의 적합성은 용이하게 평가될 수 있으며, 본 발명의 방법은, 당해 배지가 hHCC 세포주의 성장을 지지하는데 적합하고 인간 혈청의 부가에 적합한 것을 제외하고는, 배양시 사용된 세포 배양 배지의 구체적인 유형에 대해 제한하지 않는다. 배양 배지는 비-인간 혈청을 함유하지 않도록(예를 들면, 소 태아 혈청을 함유하지 않도록) 제공될 수 있다.
일반적으로, 본 개시내용의 방법 및 조성물에 사용된 인간 혈청은 통상의 방법에 의해 인간 대상체로부터 수득된다. "인간 혈청"은 개인으로부터의 혈청 및 다수의 개인으로부터의 혼주된 혈청의 사용을 고려한다. "인간 혈청"은 인간 혈청 뿐만 아니라 이의 소분획을 포괄한다. 분화된 hHCC가 바이러스 입자를 생성하는데 있어서 고 수준으로 사용되어야 하는 경우, 인간 혈청 소분획은 인간 저 밀도 리포단백질(LDL)을 함유하거나, 인간 LDL로 보충된다. 인간 혈청은 신선하게 또는 저장(예를 들면, -20 섭씨도에서) 후 사용될 수 있다. 인간 혈청은 사용 전에 열-불활성화될 수 있다.
인간 혈청은 건강한 인간 대상체, 예를 들면, 병원체(예를 들면, 세포 속에서 배양될 병원체)에 의한 검출가능한 감염을 가지지 않고/않거나 병원체와 관련하여 미경험(naive)인(예를 들면, 항-병원체 항체가 인간 혈청 속에 존재하지 않는) 인간 대상체로부터 수득될 수 있다. 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 분화된 hHCC 세포의 배양물이 병원체를 지닌 세포의 감염 및/또는 세포(예를 들면, HCV를 지님) 속에서 병원체의 증식을 포함하는 방법에서 사용되어야 하는 경우에, 건강한 대상체로부터 수득된 인간 혈청의 사용이 특히 흥미로울 수 있다.
인간 혈청은 1차 인간 간세포의 표현형을 가지도록 하는 hHCC 세포주의 배양 및 이의 분화에 적합한 임의의 농도에서도 배양 배지 속에 존재할 수 있다. 예를 들면, 인간 혈청은 적어도 1%(v/v), 적어도 2%(v/v), 적어도 5%(v/v), 적어도 8%(v/v), 적어도 10%(v/v) 이상의 농도로 존재할 수 있으며, 약 1%(v/v) 내지 20%(v/v), 또는 약 2%(v/v) 내지 10%(v/v)를 지닐 수 있다.
hHCC 세포 분화를 촉진하기 위한 배양 방법
일반적으로, 본 개시내용의 배양 방법은 hHCC 세포주를 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 hHCC의 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포로의 분화의 유도를 제공하기에 충분한 조건 하에서 배양함을 포함한다. 도 1은 본 개시내용의 배양 방법의 예를 제공한다.
위에서 나타낸 바와 같이, HS 속에서 배양하기 전에, hHCC 세포를 보통 비-인간 혈청 또는 비-인간 혈청 대체물(예를 들면, NuSerum®)을 함유하는 임의의 적합한 배양 배지 내에도 배양할 수 있다. FBS-함유 배지 속에서 hHCC 세포 배양물은 필요에 따라, 예를 들면, 매 3 내지 4일마다 계대배양(예를 들면, 트립신처리에 의함)할 수 있다. FBS-함유 배지 속에서 또는 HS-함유 배지 속에서 배양 동안 유지시키는 것에 상관없이, 세포는 일반적으로 hHCC 세포주에 대해 적합한 배양 조건, 예를 들면, 37℃, 5% C02 하에서 배양된다.
FBS-배양된 hHCC 세포의 HS-함유 배지로의 전달은 FBS-배양된 hHCC 단층의 해리, 및 HS-함유 배지 속에서 hHCC 세포의 재현탁 및 플레이팅(plating)에 의해 달성될 수 있다. FBS-배양된 hHCC 세포 단층의 배양은 임의의 적합한 방법(예를 들면, 트립신을 사용한 처리에 의함)을 사용하여 해리시킬 수 있다. 트립신과 같은 효소를 사용하여 단층 해리를 촉진시키는 경우, 효소는 불활성화시킬 수 있다(예를 들면, 혈청, 예를 들면, FBS 또는 HS를 함유하는 배양 배지를 사용). 이후에, 해리된 세포를 원심분리하고 세포 펠렛(cell pellet)을 HS-함유 배양 배지 내에 재현탁시킨다. 이후에, 세포를 조직 배양 플레이트 상에서 적합한 밀도, 예를 들면, 약 30% 내지 50%에서 플레이팅(plating)한다. 이는 예를 들면, 3 내지 5ml의 106개의 세포/ml의 현탁액을 75cm2의 플레이트 위에 플레이팅하여 달성할 수 있다.
HS-함유 배지 속에서 배양을 개시한 후, 세포는 세포 배양물의 생명의 나머지를 위하여 계대배양할 필요가 없다. 세포 배양 배지는 일반적으로 매 3 내지 4일, 또는 매 2 내지 4일마다 변한다.
임의로, HS-함유 배지 속에서 플레이팅한 후 약 2 내지 7일, 약 2 내지 6일, 약 2 내지 5일, 약 2 내지 4일, 또는 약 2 내지 3일내에(예를 들면, HS-함유 배지 속에서 배양된 세포가 합치성에 있거나 근처에 있는 경우), 세포 배양물은 예를 들면, 단층 해리의 표준 기술(예를 들면, 트립신 처리에 이어 트립신 불활성화에 의함), 원심분리, HS-함유 배양 배지 속에 재현탁 및 조직 배양 디쉬(dish) 위에 플레이팅하는 표준 기술을 사용하여 계대배양("분열(split)")할 수 있다. 일반적으로 상기 단계에서, 이러한 임의의 계대배양의 가장 우수한 결과가 달성되는 경우 세포는 재플레이팅 전에 약 1:2 이하(즉, 약 50% 이하의 희석)에서 희석된다. 본 개시내용의 방법은, HS-배양된 세포를 HS-함유 배양 배지로 전달한 후 대략 1주까지 이러한 방식으로 나눌 수 있음(다시, 세포가 1:2 초과로 분열되지 않는 경우 가장 우수한 결과를 달성하면서)을 제공하지만, 인간 혈청 속에서 약 10일간 배양한 후 트립신처리 및 재플레이팅은 가장 우수한 결과를 제공하지 않았으며, 세포 배양물 사멸과 관련되었다. 약 10일 후 트립신처리의 부정적인 영향은 콜라겐-피복된 플레이트 위로 세포를 플레이팅함으로써 감소시킬 수 있다.
이론에 얽메이지 않고, HS-함유 배지 속에서 약 7일의 배양시, 세포는 성장 정지에 들어가는 것으로 여겨지며, 이 시점에서 FBS-함유 배지 속에서의 성장과 비교하여 세포의 분열이 지연되고 일반적으로 정지된다. (도 1) 따라서 배양 방법은 이러한 관찰을 고려할 수 있으며, HS-함유 배지 속에서 배양 동안 성장 정지의 개시 후 세포의 계대배양을 피할 수 있는데, 예를 들면, HS-함유 배지 속에서 약 7일, 약 8일, 약 9일, 또는 약 10일의 배양 후 계대배양을 피할 수 있다.
도 1에서 본 개시내용의 방법의 예에 설정된 바와 같이, 및 이론에 얽메이지 않고, HS-함유 배지 속에서 약 7일의 배양 시 세포의 명백한 성장 정지 후, hHCC 세포는 1차 인간 간세포의 표현형을 향한 분화의 증거를 나타내기 시작한다. HS-함유 배지 속에서 약 14일, 15일, 16일, 17일, 또는 18일 이상의 배양 시, 배양물은 1차 인간 간세포의 표현형으로 완전히 분화된 세포를 함유한다. 일반적으로, 이러한 분화된 세포 배양물은 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 이상의 분화된 세포를 함유한다.
hHCC에서 1차 인간 간세포의 표현형의 유도에 적합한 배양 조건은 일반적으로, hHCC를 인간 혈청(HS)(예를 들면, 적어도 2% vol/vol의 HS에서)을 함유하는 적합한 배양 배지 내에 적어도 7일, 일반적으로 11일 초과, 일반적으로 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17,일 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 또는 적어도 21일 이상의 기간 동안 배양함을 포함한다.
일반적으로, HS-함유 배양 배지 내에 hHCC 세포의 배양은 HS-함유 배지 속에서 처음 7일 내 또는 처음 10일 내 1회 초과 세포의 계대배양 없이 또는 계대배양 없이 수행할 수 있다. "계대배양"은 배양된 세포 집단을 나누어("분열시켜(splitting)") 배양물 속의 세포 밀도를 감소시키는 것을 말한다.
1차 인간 간세포의 표현형으로 분화된 hHCC 세포는 배양물 속에서 적어도 1 개월, 또는 적어도 2 개월 또는 그 이상 동안 유지될 수 있다. 이러한 장기간 배양은 계대배양없이 유지될 수 있다.
본 개시내용의 방법의 예는 도 1에 개략적으로 설명되어 있다. 예를 들면, hHCC 세포는 FBS-함유 배양 배지 내에, 매 3 내지 4일마다 계대배양(예를 들면, 트립신 처리에 의함)하면서 유지시킬 수 있다. hHCC 세포는 계대배양하여 HS를 함유하는 배양 배지내로 전달된다. HS-함유 배지에 전달한 후 2 내지 4일째에, 세포를 1:2 이하로 희석시키면서, 임의로 계대배양한다. HS-함유 배지로 전달한 후 2 내지 4일째에, 세포를 1:2 이하로 희석시키면서 임의로 계대배양한다. HS-함유 배지로 전달한 후 7일째에, hHCC 세포는 성장 정지, 예를 들면, 세포 분열의 정지(즉, 집단내 세포 수가 유의적으로 증가하지 않음)의 신호를 나타내기 시작하며, 세포는 응집되지 않고(예를 들면, 세포는 서로의 상부 위에 쌓이지 않음), 계대배양에 대한 요구없이 장기간 유지될 수 있다. 이러한 시점 후에 세포는 계대배양되지 않으며 배지는 매 3 내지 4일마다 신선한 HS-함유 배지로 변경된다. HS-함유 배지로 전달한 후 약 14 내지 18일째에, hHCC 세포는 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포로 완전히 분화하는 것으로 나타난다. 이들 세포는 배양물 속에서, 배지를 신선한 HS-함유 배지로 변경하면서 적어도 1개월, 2개월 이상 동안 유지시킨다.
분화된 hHCC 세포를 포함하는 조성물
본 개시내용은 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 분화된 hHCC 세포를 포함하는 세포 집단을 제공한다. 간단히 말해서, hHCC 세포로부터 분화되어 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포는 또한 본원에서 "분화된 hHCC 세포"로 언급될 수 있다. "1차 인간 간세포의 표현형"은, 1차의 인간 간세포의 특징적인 표현형 마커(예를 들면, 바이오마커, 세포의 생리학적 기능, 및 형태학적 특징)을 나타내는지의 여부에 따라 특성화된 세포를 의미한다. 표현형 마커의 외관 및 수(예를 들면, 하기 기술된 바와 같은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 모든 바이오마커 및/또는 형태학적 특징 및/또는 생리학적 특징)는 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 완전히 분화된 hHCC 세포로의 hHCC 세포의 분화 단계에 의존한다.
하기 제공된 것으로서 1차 인간 간세포의 표현형의 표현형 마커는 일반적으로 HS-함유 배지 속에서 적어도 7일 동안 배양한 후 hHCC에서 나타내기 시작한다. 추가의 표현형 마커, 및 또한 표현형 바이오마커의 증가하는 발현 수준은, HS-함유 배지 속에서 hHCC의 지속된 배양(예를 들면, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 또는 적어도 14일 이상 동안)으로 hHCC가 완전히 분화된 hHCC가 되는 것을 향해 진행함에 따라 나타난다.
1차 인간 간세포의 표현형적 바이오마커 특성은 2개, 3개, 4개 또는 모든 바이오마커 알부민, 알파 1-항트립신, 및 LxRα/NRlH3의 발현, 및 또한 강력한 결합의 형성과 관련된 클라우딘-1 및 옥쿨루딘의 발현을 포함한다. 1차 인간 간세포의 표현형은 적어도 알부민 및 알파1-안티트립신의 발현에 대해 양성인 것으로 정의될 수 있으며, 여기서 음성 대조군 수준을 초과하는 수준에서 이들 바이오마커 각각의 발현은, 1차 인간 간세포의 표현형의 지표(예를 들면, 하기 논의된 바와 같이, hHCC를 DMSO의 존재 또는 부재하에 인간 혈청의 부재하에서 배양하는 경우 알부민 및 알파1-안티트립신의 발현 수준을 초과함)이다. 1차 인간 간세포의 특징적인 추가의 표현형적 바이오마커는 LxRα/NRlH3, 클라우딘-1, 및 오클루딘을 포함한다. 분화된 hHCC는 음성 대조군 수준을 초과하는(예를 들면, 하기 논의된 바와 같이, hHCC를 DMSO의 존재 또는 부재하에, 인간 혈청의 부재하에서 배양된 hHCC의 발현 수준을 초과함) 적어도 1개, 2개, 또는 3개 모두의 LxRα/NRlH3, 클라우딘-1, 및 오클루딘의 발현에 대해 양성인 것으로 설명될 수 있다.
1차 인간 간세포의 특징을 갖는 분화된 hHCC, 예를 들면, 인간 혈청의 부재하에서(예를 들면, DMSO의 존재 또는 부재하에서 배양이 이루어질 수 있는, FBS 또는 성체 소 혈청(ABS)과 같은 비-인간 혈청의 존재하에서) 배양된 hHCC는 음성 대조군에 의해 발현된 것에 대해 하나 이상의 표현형적 바이오마커(들)의 차등적인 발현의 측면에서 설명될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 비-인간 혈청(예를 들면, DMSO의 존재 또는 부재하에서, FBS 또는 ABS) 속에서 배양된 hHCC 세포내 표현형적 바이오마커의 발현 수준은 1차 인간 간세포의 특징적인 수준에서 알부민, 알파1-안티트립신, LxRα/NRlH3, 오클루딘 및 클라우딘1의 1차 인간 간세포의 표현형적 마커의 발현에 대해 음성인 것으로 고려된다.
1차 인간 간세포의 특징인 표현형을 갖는 분화된 hHCC 세포는 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 알부민, 알파1-안티트립신, LxRα/NRlH3, 클라우딘-1, 및 오클루딘의 차등적인 발현을 나타내는 것으로 설명될 수 있으며, 여기서 차등화된 hHCC에서 바이오마커의 발현 수준은 인간 혈청의 부재하에서 배양된 hHCC의 바이오마커의 발현 수준보다 유의적으로 더 높고, 인간 혈청의 부재하에서 배양된 hHCC와 비교하여 분화된 hHCC에서 적어도 1.5배, 2배, 2.5배 이상 더 높을 수 있다.
1차 인간 간세포의 표현형의 표현형적 마커는 형태학적 특징을 포함한다. 1차 인간 간세포의 형태학적 특징은 과립형 외관, 세포의 다각형의(예를 들면, 입방형) 형태, 강력한 결합의 형성, 및 세포 집단의 유기화와 같은 포장(pavement)을, 1차 인간 간세포의 또한 흔한 대표적인 특징인 다핵화(multinucleation)와 함께 포함한다.
1차 인간 간세포의 표현형의 표현형적 마커는 세포의 생리학적 특징, 예를 들면, 1차 인간 간세포와 관련된 세포 활성을 포함한다. 1차 인간 간세포의 표현형의 생리학적 특징은 알부민의 분비, 및 또한 저 밀도 리포단백질(LDL)의 지질의 흡수 및 활용을 포함한다.
1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 완전히 분화된 hHCC는 본원에 설명된 표현형적 마커의 임의의 적합한 조합에 의해 설명될 수 있으며, 여기서 당해 조합은 1차 인간 간세포가 아닌 세포로부터 1차 인간 간세포를 구별하기에 충분하다. 일반적으로, 1차 간세포의 표현형을 갖는 완전히 분화된 hHCC는 알파1-안티트립신 및 알부민의 발현, 및 다각형(예를 들면, 입방형) 세포 형태의 발현에 대해 양성인 것으로 확인될 수 있다. 완전히 분화된 hHCC에서, 알부민 및 알파1-안티트립신은 각각 동일한 조건하에서 배양된 1차 인간 간세포에 있어서 알부민 및 알파1-안티트립신 발현의 수준보다 유의적으로 낮지 않은 수준에서 각각 발현될 수 있으며, 이와 거의 동일하거나 이보다 더 높을 수 있다.
1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 완전히 분화된 hHCC는 또한 강력한 결합 단백질 클라우딘-1 및 오클루딘 중 하나 또는 둘 다의 발현에 의해 임의로 특성화될 수 있다. 예를 들어, 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 완전히 분화된 hHCC는 클라우딘-1 및 오클루딘 각각을 동일한 조건하에서 배양된 1차 인간 간세포의 것보다 유의적으로 낮지 않은 수준, 및 이와 동일하거나 이보다 높을 수 있는 수준에서 발현할 수 있다. 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 완전히 분화된 hHCC는 또한 강력한 결합의 존재의 형태학적 특징에 의해 및/또는 LDL의 지질을 흡수하여 활용하는 능력의 생리학적 특징에 의해 특성화될 수 있다.
1차 인간 간세포 표현형의 마커는 임의의 적합한 방법을 사용하여서도 검출할 수 있다. 예를 들면, 마커는 세포-표면 마커용의 유동 면역세포화학, 또는 세포내 또는 세포-표면 마커용의 면역조직화학(예를 들면, 고정된 세포 또는 조직 분비의)과 같은 임의의 적합한 면역학적 기술을 사용하여서도 검출할 수 있다. 예를 들어, 세포-표면 항원의 발현은 임의로 세포의 고정 후, 및 임의로 표지된 제2 항체 또는 다른 접합체를 사용하여, 표준 면역세포화학 또는 유동 세포분석 검정 시 항원에 대한 특이적인 항체를 결합시켜 표지를 증폭시킴으로써 검출할 수 있다.
유전자 생성물 마커의 발현은 또한 노던 블롯 분석(Northern blot analysis), 도트-블롯 하이브리드화 분석(dot-blot hybridization analysis), 또는 표준 증폭 방법에서 서열-특이적인 프라이머를 사용한 역 트랜스크립타제 개시된 폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR)에 의해 mRNA 수준에서 검출할 수 있다. 특수한 마커에 대한 서열 데이타는 GenBank와 같은 공공의 데이타베이스로부터 수득할 수 있다.
본 개시내용은 분화되지 않은 hHCC 및 분화된 hHCC 둘다를 포함함으로써 집단내 세포의 비율이 1차 인간 간세포의 특성을 갖도록 하는 배양 세포 집단을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이러한 세포 배양물은, 집단내 적어도 약 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 98% 이상의 세포가 분화된 hHCC 세포인, 예를 들면, 위에서 기술한 바와 같이, 1차 인간 간세포의 특징인 표현형적 마커 및/또는 형태학적 마커 중의 어느 것의 1개, 2개, 3개 이상에 대해 양성인 것들을 포함할 수 있다. 또한, 세포 집단내 분화되지 않은 hHCC 세포의 비율을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 특정의 구현예에서, 분화된 hHCC 세포 집단은 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 분화되지 않은 hHCC 세포를 갖는다.
본 출원의 방법은 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 hHCC 분화된 세포의 거대 집단을 제공할 수 있다. 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 적어도 108, 1010, 또는 1012개의 세포의 집단이 생성될 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포를 포함하는 배양된 세포 집단; 및 인간 혈청을 포함하는 배양 배지를 포함하며, 여기서 세포는 hHCC 세포주의 분화된 후대세포이다. 일부 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17,일 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 또는 적어도 21일 이상 동안 연속적으로 유지되어 왔다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 약 1% 내지 20%의 인간 혈청, 임의로 약 2% 내지 10%의 인간 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, hHCC 세포주는 HuH-7 또는 HuH-7-유래된 세포주이다. 일부 구현예에서, 배양된 세포는 고체 지지체(예를 들면, 배양 플레이트의 웰, 비드 등) 위에 부착되며, 여기서 고체 지지체는 하나 이상의 세포외 기질 성분, 예를 들면, 콜라겐(예를 들면, 콜라겐 제I 형)을 임의로 포함함으로써 고체 지지체에 대한 배양된 세포의 부착을 촉진시킨다.
본 개시내용의 조성물은 배양물 속에서 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 또는 8주 이상 동안 배양물 속에서 유지되어 온 분화된 hHCC 세포를 포함하는 배양된 세포 집단을 포함한다.
hHCC 세포주로부터 분화된 세포는 1차 인간 간세포의 표현형을 나타내지만, 이들은 hHCC 세포주로부터 기원하므로, 또한 기원하는 세포 또는 세포주의 분화된 후대세포인 것으로 특성화될 수 있다. 따라서, 분화된 hHCC는, 이들이 기원하는 세포와 동일한 게놈을 가질 것이다. 이는, 임의의 핵형 변화에 걸쳐 및 이를 초과하여, 염색체 DNA가 원래의 모 hHCC 세포주와 이로부터 생성되고 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 분화된 hHCC 세포 사이에서 90%를 초과하여 동일할 것임을 의미한다. 통상의 배양 방법 하에 모 hHCC 세포주의 배양과 일반적으로 관련된 유전적 변화를 겪거나, 재조합 방법으로 처리되어 전이유전자(transgene)를 도입하거나 내인성 유전자를 녹 아웃(knock out)시킨 분화된 hHCC 세포는, 모든 비-재조합적으로 조작된 유전적 성분이 보존되므로, 이들이 기원하는 세포주와 동일한 게놈을 갖는 것으로 여전히 고려된다. 분화된 hHCC 세포 및 이들의 모 hHCC 세포는 표준 유전적 핑거프린팅 기술(standard genetic fingerprinting technique)에 의해 동일한 게놈을 갖는 것으로 확인될 수 있다.
상기 특성은 본 개시내용의 분화된 hHCC 세포의 가치있는 특징일 수 있다. 예를 들어, 분화된 hHCC 세포를 생성시키기 위한 동일한 hHCC 세포의 사용은 상이한 시간에 생성된 분화된 hHCC 세포의 집단 사이에 변화를 감소시킬 수 있다.
본 개시내용의 조성물의 특정의 구현예는 1차 인간 간세포의 특징을 지닌 분화된 세포와 함께 기원하는 세포(예를 들면, 분화되지 않은 hHCC 세포주, 또는 중간 집단)를 포함한다. 2개의 집단은 동일한 용기(예를 들면, 공배양), 동일한 설비의 별도의 용기, 또는 2개의 상이한 위치에 존재할 수 있다. 분화되지 않은 및 분화된 세포는, 분화되지 않은 세포의 배양물이 이의 실체를 분화된 hHCC로 분화하도록 하는 경우와 같이, 상이한 시점에 또는 동시에 존재할 수 있다.
LDL -수용체 결합 리포단백질 이 고갈된 혈청을 함유하는 배양 배지를 사용하는 방법 및 조성물
본 개시내용은 간친화성 미생물(예를 들면, 간친화성 바이러스, 간친화성 기생충(예를 들면, 말라리아) 등)에 의한 배양된 세포의 감염시 사용하기 위한 방법 및 조성물을 또한 제공한다. 일반적으로, 상기 방법은 배양된 세포를 LDL 및 VLDL을 포함하는, LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청을 함유하는 배양 배지의 존재하에서 간친화성 미생물에 노출시켜 간염 바이러스, 예를 들면, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염 또는 E형 간염 바이러스(HAV, HBV, HCV, HDV, HEV) 등, 및 사이토메갈로바이러스(CMV)와 같은 간친화성 미생물에 의한 배양된 세포의 감염을 촉진시키는 것을 포함한다. 간친화성 미생물이 간염 바이러스인 경우, 당해 바이러스는 임의의 유전형(예를 들면, HCV 유전형 1(예를 들면, 유전형 la, lb, lc), 2, 3, 4, 5, 6, 및 7) 상태일 수 있으며 자연-발생의 바이러스(예를 들면, 감염된 영장류로부터 수득된 바이러스, 예를 들면, 감염된 인간으로부터 수득된 임상 단리체), 조직 배양물-적응된 바이러스, 유전적으로 개질된 바이러스, 키메라 바이러스, 또는 위형 바이러스(pseudotyped virus)일 수 있다.
LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청을 사용하는 방법에서 사용하기 위한 세포는 영장류 간세포, 불멸화된 간세포 세포주(예를 들면, hHCC 세포), 및 본원에 개재된 방법에 따라 분화되어 1차 인간 간세포의 표현형을 나타내는 hHCC 세포와 같은 임의의 적합한 간세포의 세포일 수 있다. 본 방법은 간염 바이러스의 임상 단리체, 예를 들면, HCV의 임상 단리체를 지닌 배양된 간세포 세포(예를 들면, 분화되어 1차 인간 간세포의 표현형을 나타내는 hHCC 세포를 포함하는 1차 간세포 또는 불멸화된 간세포주)의 감염을 위해 제공 시 특수한 용도를 발견한다.
본 개시내용의 방법에서 배양 배지 속에 사용하기 위한 LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청은 당해 분야에서 이용가능한 임의의 적합한 방법에 의해서도 제조할 수 있다. 상기 방법에서 사용하기 위한 혈청은 인간, 소(예를 들면, 소 태아) 또는 임의의 다른 적합한 공급원일 수 있다. 하나의 실시예에서, LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청은 혈청을 LDL 수용체, 예를 들면, 인간 LDL 수용체(예를 들면, 항-LDL 수용체 결합 리포단백질 항체(예를 들면, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 항-VLDL 항체, 항-LDL 항체, 항-아포리포단백질 B 항체) 또는 헤파린)에 결합하는 리포단백질에 대한 결합제와, 결합제에 대한 결합을 제공하기에 충분한 기간 동안 접촉시킨 후, 배양 배지 내에 사용하기 위한 결합제에 의해 결합되지 않은 혈청 성분을 회수함으로써 제조된다. "LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청"은 처리 전 혈청("비처리된 혈청")과 관련하여 LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청을 의미하며 고갈 전 혈청에 대해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상까지 LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청을 포함한다. 하나의 구현예에서, LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청은, 처리 전 혈청과 비교하여 HDL(이는 LDL 수용체에 유의적으로 결합하지 않는다)이 실질적으로 고갈되어 있지 않다.
하나의 구현예에서, LDL-수용체 결합 리포단백질이 고갈된 혈청은 혈청을 결합제로서 헤파린과 접촉시켜 제조하며, 여기서, 접촉은 혈청 속의 헤파린-결합 성분(예: LDV, VDL)의 헤파린에 대한 결합에 이어 배양 배지 내에 사용하기 위한 헤파린에 의해 결합되지 않은 혈청 성분을 회수하는 것을 제공하기에 충분한 기간 동안 수행된다.
본 방법에서 사용하기 위한 혈청은, 고갈 전 혈청과 비교하여 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 리포단백질이 고갈된 혈청, 고갈 전 혈청과 비교하여 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 헤파린-결합 리포단백질이 고갈된 혈청, 및/또는 고갈 전 혈청과 비교하여 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 ApoB가 고갈된 혈청을 포함한다.
리포단백질-고갈된 혈청(예를 들면, 헤파린-처리된 혈청)을 사용하는 본 개시내용의 방법은 세포(예를 들면, hHCC 세포, 1차 인간 간세포, 또는 간친화성 미생물에 의한 감염에 민감한 다른 세포)를 간친화성 미생물로 감염시키는 것을 포함하며, 여기서, 세포는 리포단백질-고갈된 혈청을 함유하는 배지 속에서 배양된다. 감염에 이어서, 세포를 임의의 적합한 배양 배지(예를 들면, 분화를 원할 경우 hHCC 세포 또는 분화된 hHCC 세포의 유지를 위한 HS-함유 배지)로 전달할 수 있다.
용도
본 개시내용의 방법 및 조성물은 바이러스 입자의 생성(예를 들면, 바이러스 백신 생성에서와 같음), 간세포 기능의 연구, 및 스크리닝 방법과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 각종 방법에 사용될 수 있다. 사용의 예는 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
바이러스 입자 생성
본 개시내용의 방법 및 조성물은 바이러스 입자, 특히 간염 바이러스, 예를 들면, A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염 또는 E형 간염 바이러스(HAV, HBV,HCV, HDV, HEV) 등과 같은 간친화성 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 바이러스 입자의 생성 시 사용될 수 있다. 바이러스는 임의의 유전형(예를 들면, HCV 유전형 1(예를 들면, 유전형 la, lb, lc), 2, 3, 4, 5, 6, 및 7)일 수 있으며 자연-발생의 바이러스(예를 들면, 감염된 영장류, 예를 들면, 흔히 "임상 단리체"로 언급되는 감염된 인간으로부터 수득된 바이러스), 조직 배양-적응된 바이러스, 유전적으로 개질된 바이러스, 또는 위형 바이러스일 수 있다.
본 개시내용의 바이러스 입자를 생성하는, 분화된 hHCC 세포는 임의의 적합한 방법을 사용하여서도 달성할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 게놈을 감염, 전기천공, 형질감염 등에 의해 세포내로 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, hHCC 세포 및/또는 분화된 hHCC 세포는 게놈적으로 통합된 바이러스 게놈을 제공하기 위하여 재조합 기술에 의해 개질되지 않는다. 일부 구현예에서, hHCC 세포 및/또는 분화된 hHCC 세포는 유전적으로 개질되지 않음으로써 바이러스 게놈에 대해 천연적이지 않은 프로모터에 작동적으로 연결된 유전적으로 통합된 바이러스 게놈을 포함한다.
바이러스 게놈은 HS-함유 배지 속에서 분화 전에, FBS-함유 배지로부터 HS-함유 배지로 전달하는 시기에, HS-함유 배지 속에서 배양(예를 들면, HS-함유 배지로 전달한 후 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 째에)함에 의한 분화 동안에, 또는 성장 정지 및/또는 1차 인간 간세포의 표현형으로의 분화 후(예를 들면, HS-함유 배지로의 전달 후 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일째 이상에서)에 hHCC 세포내로 도입될 수 있다.
바이러스 게놈이 감염에 의해 도입되는 경우, 감염은 위에서 기술한 바와 같이 리포단백질이 고갈된(예를 들면, 헤파린-처리된) 혈청(예를 들면, 인간 혈청, 소 태아 혈청)을 함유하는 배양 배지 내에 수행할 수 있다. 임의로, 감염 후, 세포를 HS-함유 배지로 전달하여, 예를 들면, hHCC 세포의 분화를 제공하고/하거나 세포 생육력을 촉진할 수 있다. 하나의 구현예에서, 분화되지 않거나 분화된 hHCC 세포는 리포단백질이 고갈된 혈청을 함유하는 배지 속에서 세포에 부가된 바이러스 입자의 감염을 허용하는 기간 동안 배양한다. 감염 기간 후, 배양 배지를 HS-함유 배지 및 hHCC 세포의 분화를 제공하고/하거나, hHCC 세포의 분화를 지속하고/하거나 분화된 hHCC 세포의 유지를 제공하고 바이러스 입자 생성을 제공하기 위한 기간 동안 배양된 세포로 대체한다.
본 개시내용은 배양 배지 밀리리터당 적어도 105, 적어도 106, 적어도 107, 적어도 108, 또는 적어도 109 이상의 바이러스 입자를 포함하는 분화된 hHCC 세포의 배양물을 제공한다. 본 개시내용은 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 또는 8주 이상 동안 유지될 수 있는 그러한 바이러스 입자-생성 배양물을 추가로 제공한다.
HS 속에서 배양된 hHCC 세포로부터 생성된 바이러스 입자는 비-인간 혈청(예를 들면, FBS) 속에서 배양된 hHCC 세포 속에서 생성된 바이러스 입자로부터 이를 구별하는 구조적 특징을 나타낸다. 예를 들면, HS 속에 배양된 분화된 hHCC 세포 속에서 생성하는 경우, 바이러스 입자는 FBS 속에서 배양된 hHCC 세포로부터 생성된 경우보다 평균 보다 낮은 밀도를 갖는다. 예를 들어, HCV 입자가 FBS-배양된 hHCC 세포 속에서 생성된 경우, 바이러스 입자의 약 75%는 약 1.16g/ml보다 큰 밀도를 갖는다. 대조적으로, HCV 입자가 HS-배양된 hHCC 세포 속에서 생성된 경우, HCV 입자는, 평균 밀도가 보다 낮으며, 집단 내 HCV 입자의 약 25% 만이 1.16g/ml를 초과하는 밀도를 갖는다. 또한, HS-배양된 hHCC 세포로부터 생성된 HCV 입자는 ApoB와 관련되어 있으며, 생성된 바이러스 입자 집단의 HCV 입자들의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 이상은 일반적으로 ApoB-관련되어 생성된다.
분화된 hHCC 세포로부터 생성된 바이러스 입자는 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 분화된 hHCC 세포로부터 생성된 바이러스 입자는 세포 배양 배지로부터 단리되어, 제형화됨으로써 백신으로서 투여하기에 적합해질 수 있다. 바이러스 입자는 예를 들면, 인간 키메라 마우스 모델과 같은 동물 모델의 감염을 위한 연구 셋팅에서 사용될 수 있다. 분화된 hHCC 세포 집단은 또한 바이러스, 특히 간친화성 바이러스의 연구에서 사용하기 위한 연구 도구를 제공한다.
검정
본 개시내용의 분화된 hHCC는 다양한 검정에 있어서의 용도를 발견한다. 예를 들어, 분화된 hHCC는 인간 간세포의 모델, 및 따라서 간 기능 및 질병(예를 들면, 암형성, 지방증(지방간 질병))의 모델로서 제공할 수 있다. 다른 용도는 리포단백질 대사 및 분비의 연구, 및 생물학적 중간체 및 또한 생체이물성 화합물(xenobiotic compound)(예를 들면, 시토크롬 P450에 의한 산화) 둘 다의 대사 연구를 포함한다.
본 개시내용의 분화된 hHCC를 사용한 검정은 예를 들면, 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포 상에서 제제의 효과를 평가하는 것, 예를 들면, 인간 간세포 기능에 있어서 제제의 효과를 평가하고(예를 들면, 제제의 간 독성을 평가함); 인간 간세포에 의한 제제의 대사를 평가하는 것; 간세포 기능에 포함된 연구 메카니즘 등을 포함할 수 있다. 분화된 hHCC 세포는 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포의 특성에 영향을 미치는 제제(예를 들면, 용매, 소분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드)를 스크리닝하고/하거나 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포의 특성에 영향을 미치는 환경 조건(예를 들면, 배양 조건 또는 조작)에 대해 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
제제(예를 들면, 후보 제제)의 활성의 평가는 일반적으로 분화된 hHCC 세포를 제제 단독 또는 다른 제제(예를 들면, 알려진 활성을 갖는 약물)과 함께 접촉시키는 것을 포함한다. 충분한 양의 시간 동안 배양한 후, 적절한 검정을 수행하여, 경우에 따라, 분화된 hHCC 세포 상에서 후보 제제의 효과를 검출(예를 들면, 세포 형태, 세포 기능에 있어서의 변화, 인간 1차 간세포의 표현형의 마커에 있어서의 변화를 평가함으로써)한다. 표현형에 있어서 제제의 효과의 존재 또는 부재는 예를 들면, 대조군과 비교함으로써(예를 들면, 제제의 부재시 표현형에 대해 비교하고/하거나 간 세포에서 알려진 효과를 갖는 제제의 존재하에서 표현형과 비교함으로써) 검출하고 분석한다.
예를 들어, 검정이 리포단백질 대사에 있어서 후보 제제의 효과를 평가하는 것인 경우, 검정은 표현형 마커에 있어서의 변화, 예를 들면, 형태학적 변화(예를 들면, 분화된 hHCC 세포내에서 지질 유기화에 있어서의 변화(예를 들면, 지질 고갈의 존재 또는 부재 및/또는 이러한 지질 고갈 소적의 양식에 있어서의 변화에 의해 나타나는 바와 같음)의 존재 또는 부재) 또는 후보 제제의 부재와 비교한 후보 제제의 존재하에서 리포단백질 또는 지질과 같은 바이오마커에 있어서의 변화(예를 들면, 리포단백질 또는 지질의 수준에 있어서의 변화)를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 제제의 부재와 비교된 것으로서 후보 제제의 존재 시 표현형 마커에 있어서의 변화는, 후보 제제가 리포단백질 대사에 있어서 효과를 가짐을 나타낸다.
하나의 양태에서, 본원에 제공된 분화된 hHCC 세포 중 임의의 것의 리포단백질 분비에 있어서의 후보 제제의 효과를 평가하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 하기 실시예에서 논의된 바와 같이, 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 적어도 3 내지 5일 이상 동안 배양된 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주는 리포단백질(예를 들면, VLDL, LDL, HDL)을 분비한다. 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 14일 이상의 배양시, hHCC 세포는 배양물 속에서 1차 인간 간세포에 의해 분비된 것과 매우 유사하고, 또한 인간 혈청에서 발견된 리포단백질 수준과 매우 유사한 수준에서 리포단백질을 분비한다. 따라서, 인간 혈청 속에서 배양된 hHCC 세포의 분비된 리포단백질 프로파일은 1차 인간 간세포에 의해 분비된 리포단백질의 프로파일의 것 및 인간 혈청 속에서 발견된 리포단백질 프로파일의 것과 유사하다. 이와 같이, 제제의 부재와 비교하여 후보 제제의 존재하에서 리포단백질 분비의 수준에 있어서의 변화는, 후보 제제가 리포단백질 분비에 있어 효과를 가짐을 나타낸다.
특정의 구현예에서, 상기 방법은 HS-함유 배지 속에서 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 14일 이상 동안 배양하는 단계를 포함한다. hHCC 세포주는 본원에 설명된 임의의 HS-함유 배지 속에서도 3일 이상 동안 배양할 수 있다. 특정의 구현예에서 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주는 HS-함유 배지 속에서 후보 제제와 접촉하기 전에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 이상 동안 배양된다.
선택된 기간(예를 들면, 바람직한 분비된 리포단백질 프로파일을 제공하기 위한) 동안 hHCC 세포주를 배양한 후, 세포주를 이후에 후보 제제와 접촉시킨다. 후보 제제는 합성의, 자연-발생의, 또는 재조합적으로 생성된 분자(예를 들면, 소분자; 약물; 폴리뉴클레오티드; 폴리펩티드; 펩티드; 항체; 진핵 세포 또는 원핵세포 속에 존재하는 내인성 인자(예를 들면, 폴리펩티드 식물 추출물 등)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 후보 제제는, 이들이 전형적으로 유기 분자, 50 달톤 초과 및 2,500 달톤 미만의 분자량을 갖는 소 유기 화합물이라고 해도, 다수의 화학적 부류의 제제를 포괄한다. 후보 제제는 항체, 펩티드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체, 핵산 억제제 또는 이의 조합물과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 생물분자를 포함한다.
상기 방법은 다양한 양(후보 제제를 함유하지 않는 것으로부터 배양된 세포에 대한 독성 한계내에서 기원할 수 있는 양의 상한치에 이르는 후보 제제의 양)의 후보 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 상이한 제형 속에서 제제의 전달을 포함할 수 있다. 제제는 단독으로 투여할 수 있거나, 예를 들면, 후보물 조합 약물 치료요법의 효과가 평가되어야 하는 경우 2개 이상의 조합물로 합할 수 있다.
충분한 시간 동안 후보 제제와 함께 배양한 후, 적절한 검정을 수행하여, 리포단백질을 분비하는 분화된 hHCC 세포 상의 후보 제제의 효과를 검출한다. 특정의 구현예에서, 상기 방법은 HS-함유 배지 속에서 리포단백질(예를 들면, VLDL, LDL, 및/또는 HDL)의 수준을 평가하는 단계를 포함한다. hHCC 세포에 의해 분비된 리포단백질의 수준은 임의의 적합한 방법으로도 평가할 수 있다. 예를 들면, 분비된 리포단백질의 수준은 배양된 hHCC 세포로부터 수집된 배지를 검정하여 리포단백질 프로파일(HDL, LDL, 및/또는 VLDL 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 수준의 측정)을 수득함으로써 평가할 수 있다. 리포단백질 프로파일은 예를 들면, 한외-원심분리 또는 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들면, Brousseau et al. (1993) Clinical Chemistry 39(6): 960-964를 참고하라. 특정의 구현예에서, 리포단백질 프로파일은 hHCC 세포를 배양하는데 사용된 배지를 분리하고 배지로부터 크기 배제 고속 단백질 액체 크로마토그래피를 사용하여 리포단백질을 분리함으로써 수득한다. 지질 함량(예를 들면, 콜레스테롤 또는 트리아실글리세롤)은 형광성계 액체 검출 방법을 포함하는, 임의의 적합한 지질 검출 방법에 의해서도 후속적으로 측정할 수 있다. 예를 들면, Yang et al. (2012) Chem Phys Lipids 165(2): 133-41를 참고하라.
리포단백질 분비에 있어서 후보 제제의 효과의 존재 또는 부재는 대조군 표본(예를 들면, 제제와 접촉하지 않은 hHCC 세포의 배지로부터 수득된 대조군 리포단백질 프로파일)와 비교함으로써 측정한다. 그러한 구현예에서, 대조군 표본과 비교한 것으로서 후보 제제의 존재하에서 리포단백질 수준에 있어서의 차이는, 후보 제제가 리포단백질 분비에 있어서 효과를 가짐을 나타낸다. 임의의 적합한 표본도 후보 제제와 접촉된 hHCC 세포주로부터 수득된 리포단백질의 수준과 비교하기 위한 대조군 표본로서 제공될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 대조군 표본은 시험되는 표본과 동일한 조건 하에서 및 후보 제제의 부재하에서 HS-함유 배지 속에 배양된 인간 간세포 암종(hHCC) 세포주로부터 수득된 리포단백질 프로파일이다. 다른 구현예에서, 비교는 간세포 리포단백질 분비에 있어서 알려진 효과를 갖는 제제와 접촉된 표본로부터의 리포단백질 프로파일에 대해 이루어진다.
그러한 방법은 예를 들면, 이상지질혈증, 저지질혈증, 고지질혈증, 저지질단백혈증, 고지질단백혈증, 탄지에르병(tangiers disease), 고알파지질단백혈증, 관상동맥성 심장질환(CHD), 뇌혈관질환(CVD), 동맥경화증, 혈전증, 및 뇌졸중을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 상기 방법은 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위한 것이다. 그러한 구현예에서, 대조군 표본과 비교하여 배양 배지 내에 VLDL 또는 LDL에 있어서의 감소 또는 HDL에 있어서의 증가는, 후보 제제가 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다는 지표이다.
검정이 약물의 대사를 평가하는 경우, 상기 방법은 일반적으로 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 분화된 hHCC 세포의 배양물을 약물과 당해 약물의 대사산물의 생성에 충분한 시간 동안 접촉시키고, 당해 약물의 대사산물(예를 들면, 배양 상층액 속에서)을 검정함을 포함한다. 약물 대사산물은 당해 분야에 이용가능한 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 대사산물은 추가의 검정에 적용시켜, 예를 들면, 대사산물의 구조를 확인할 수 있다.
검정이 인간 간세포 상에서 제제의 독성을 평가하는 경우, 상기 방법은 일반적으로 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 분화된 hHCC 세포의 배양물을 제제와 접촉시키고, 표현형 마커 속에서의 변화(예를 들면, 형태학적 변화 및/또는 독성의 지표인 바이오마커에 있어서의 변화, 예를 들면 트랜스아미나아제의 수준에 있어서의 변화)를 검출함을 포함한다. 제제의 부재와 비교한 것으로서 제제의 존재 시 변화 (예를 들면, 제제의 존재하에서 세포 배지 속의 트랜스아미나아제에 있어서의 증가 및/또는 세포 사멸의 표현형적 마커(예를 들면, 세포자멸사적 세포 사멸, 괴사성 세포 사멸의 (예를 들면, TUNEL, 카스파제)의 표현형적 마커)에 있어서의 증가)의 검출은 분화된 hHCC 세포에 대한 제제의 독성의 지표이다.
분화된 hHCC를 간친화성 미생물(예를 들면, HCV, HBV와 같은 간친화성 바이러스)와 함께 배양하는 경우, 검정은 도입, 복제, 및 바이러스와 관련하여 바이러스 입자 생성의 연구를 포함할 수 있다. 상기 검정은 또한 항-간친화성 병원성 제제, 예를 들면, 항바이러스제에 대한 스크리닝을 위해 제공할 수 있다.
예를 들어, 검정이 항바이러스제에 대해 스크리닝하기 위한 것일 경우, 상기 검정은 일반적으로 분화된 hHCC 세포를 바이러스 게놈의 존재하에서 적어도 하나의 시험 후보 제제와 함께 배양하고, 바이러스에 있어서의 효과의 존재 또는 부재를 검출함을 포함할 수 있다. 이는 예를 들면, 바이러스 복제를 검정함으로써 달성할 수 있다. 바이러스 복제를 검정하는 것은 바이러스 입자(예를 들면, 바이러스 역가)의 수준을 평가하고, 바이러스 핵산을 검출하는 것 등에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 분화된 hHCC 세포가 HCV로 감염된 경우, HCV의 수준은 바이러스 역가를 측정하고, HCV RNA를 정량적으로 측정하며, HCV 바이러스 입자를 측정(예를 들면, 면역 검정에 의해, 예를 들면, 코어 단백질을 측정함으로써)하고, 현미경 등에 의해 평가할 수 있다. 바이러스 생성 및 바이러스 복제의 억제는 예를 들면, 핵산 수준에서 바이러스 복제의 억제, 바이러스 입자 생성의 억제, 및/또는 세포내로 바이러스 도입의 억제에 기인할 수 있다. 후보 제제의 부재와 비교하여 후보 제제의 존재시 바이러스 복제에 있어서의 감소는, 후보 제제가 항바이러스 활성을 가짐을 나타낸다.
항바이러스제에 대한 스크리닝 방법은 항체의 항바이러스 활성을 스크리닝하기 위해, 예를 들면, 분화된 hHCC의 억제 바이러스 감염성에 의해, 예를 들면, 바이러스를 중화시키는 항체에 대해 검정하기 위해 조절될 수 있다. 그러한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 하나의 구현예에서, 스크리닝될 항체는 바이러스(예를 들면, HCV)에 노출된 대상체 또는 이에 대해 백신(예를 들면, 후보물 백신)이 투여된 생물학적 표본 속에 존재한다. 생물학적 표본은 예를 들면, 항바이러스 항체를 함유하는 것으로 추정되는 혈액 또는 이의 분획일 수 있다. 하나의 구현예에서, 분화된 hHCC 세포는 임상 바이러스 단리체로 감염시킨다. 상기 검정은 항체 또는 항체를 함유하는 것으로 추정되는 표본의 존재하에서 바이러스 복제를 비교함을 포함할 수 있으며, 여기서 항체 또는 표본의 존재하에서 바이러스 복제에 있어서의 감소는 항바이러스 활성의 지표이다. 생물학적 표본이 면역화 후 대상체로부터 기원하는 경우, 면역화 후 표본의 항바이러스 활성을 면역화전 생물학적 표본(예를 들면, 동일한 대상체로부터의)의 항바이러스 활성과 비교할 수 있다.
다양한 후보 제제 중의 임의의 것이 스크리닝될 수 있다. "후보 제제"는 합성의, 자연-발생의, 또는 재조합적으로 생성된 분자(예를 들면, 소 분자; 약물; 폴리뉴클레오티드; 폴리펩티드; 펩티드; 항체; 진핵 또는 원핵 세포 속에 존재하는 내인성 인자(예를 들면, 폴리펩티드, 식물 추출물 등) 등)을 포함함을 의미한다. 후보 제제는, 전형적으로 이들이 유기 분자, 바람직하게는, 분자량이 50 달톤 초과 내지 약 2,500 달톤 미만의 분자량을 갖는 소 유기 화합물이라고 해도, 다수의 화학적 부류를 포괄한다. 후보 제제는 또한 항체, 펩티드, 다당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 이들의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합물과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 생물분자를 포함할 수 있다.
후보 제제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 다수의 방법이 무작위처리된 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 포함하는 광범위한 유기 화합물 및 생물분자의 무작위적 및 직접적인 합성에 이용가능하다. 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리는 이용가능하거나 용이하게 생성된다. 항체의 라이브러리는 당해 분야에서 이용가능한 방법으로 생성할 수 있다. 또한, 천연의 또는 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물은 통상의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 변형시켜서, 조합적 라이브러리를 생성하는데 사용할 수 있다. 알려진 약리학적 제제는 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등과 같은 직접적인 또는 무작위적인 화학적 변형에 적용시켜서 구조적 유사체를 생성할 수 있다.
검정 방법은 다양한 양의 후보 제제(제제를 함유하지 않는 것으로부터 배양된 세포에 대해 독성 한계 내에서 전달될 수 있는 양의 상한치에 이르는 제제의 양)를 투여함을 포함할 수 있으며, 상이한 제형 속에서 제제의 전달을 포함할 수 있다. 상기 제제는 단독으로 투여될 수 있거나 예를 들면, 후보물 조합 약물 치료요법의 효과가 평가되어야 하는 경우에, 2개 이상의 조합물로 조합될 수 있다.
검정은 다양한 양식으로 수행할 수 있고, 분화된 hHCC 세포와 바이러스 및 후보 제제의 접촉 순서는 변할 수 있음이 인식될 것이다. 예를 들면, 분화된 hHCC 세포는 후보 제제와 접촉하기 전의 감염된 바이러스일 수 있으며; 대안적으로, 분화된 hHCC 세포는 감염성 바이러스 입자에 노출되기 전 후보 제제와 접촉될 수 있다.
제제(예를 들면, 후보 제제, 약물, 및/또는 미생물(예를 들면, 바이러스))는 hHCC 세포의 HS-함유 배지로의 전달 시기에, hHCC 세포의 분화 동안, 또는 hHCC 세포의 인간 1차 간세포의 표현형으로의 분화 후에 배양 배지에 가할 수 있다.
키트( kit )
본 개시내용의 키트는 hHCC 세포, 인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 분화된 hHCC 세포, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. 키트는 임의로 배양 배지 성분, 예를 들면, 배양 배지(예를 들면, 혈청이 없거나 또는 인간 혈청을 함유함), 배양물 등에 사용하기 위한 인간 혈청을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 인간 혈청이 들어있거나 들어있지 않은 1차 간세포 배지(하기 실시예에 상세히 기술된 바와 같음)를 포함할 수 있다. 키트의 다양한 성분은 별도의 용기 속에 존재할 수 있거나 특정의 혼화성 성분을 경우에 따라 단일 용기내로 예비-조합할 수 있다.
키트는 본 개시내용의 방법을 실시하기 위한 키트의 성분을 사용하기 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 당해 지시사항은 일반적으로 종이, 플라스틱, 전자 저장 장치, 매체 등과 같은 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 지시사항은 키트 속의 용기의 표지 또는 이의 성분(예를 들면, 포장과 관련됨) 등 속에서, 포장 삽입물로서 키트 속에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 지시사항은 적합한 컴퓨터 판독가능한 저장 매체, 예를 들면, 컴팩트 디스크-읽기 전용 기억장치(CD-ROM), 디지탈 다용도 디스크(DVD), 디스켓 등 상에 존재하는 전자 저장 데이타 프로파일로서 존재한다. 다른 예에서, 제공된 지시사항은 많거나 모든 검정 세부사항을 함유하지 않지만, 오히려 예를 들면, 인터넷을 통해 상세한 지시사항을 수득하기 위한 원격 공급원에 대한 지시를 제공한다.
실시예
다음 실시예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 본 발명을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 기재 및 설명을 제공하기 위해 설정된 것이며 발명자들이 이들의 발명으로서 간주하는 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않으며 하기 실험이 모두 또는 수행된 실험 만이라는 것을 나타냄을 의도하지 않는다. 사용된 수치(예를 들면, 양, 온도 등)와 관련하여 정밀도를 보증하기 위한 노력이 이루어져 왔지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
물질 및 방법
다음의 방법 및 물질은 하기 실시예에서 사용된다.
표준 배양 조건(인간 혈청 속에서 배양하기 전 세포 증식을 위함). HuH-7(JCRB403) 세포는 연구 공급원의 일본 수집기관(Japanese Collection of Research Resources) - Cell bank(JCRB Cell bank)로부터 이용가능하다. Huh7.5 세포는 씨, 라이스(C. Rice) 박사의 기증품이었다. 세포주 둘 다를 기술된 프로토콜에 따라 유지시켰다(인간 혈청 속에서 배양하기 전). 요약하면, Huh7.5 또는 HuH-7 세포를 트립신 처리된 DMEM/10% 소 태아 혈청(FBS)/페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배양 배지 내에 유지시키고 매 3 내지 4일마다 분할하였다. 대략 20 내지 30회 계대배양(passage) 후, 세포를 폐기하고, 새로운 바이알(vial)을 해동시켰다.
인간 혈청의 사용은 세포의 성장 정지를 야기하므로, 세포 배양물을 일반적으로 FBS 함유 배지(위에서 기술한 바와 같은, DMEM/10% FBS/페니실린/스트렙토마이신)에 유지시켰다.
JFH -1 바이러스를 사용한 세포의 감염. JFH-1 바이러스(JFH)를 티, 와키타(T. Wakita)로부터 수득하였다. 감염 2일 전에, 세포를 30% 밀도로 재플레이팅하였다. 4시간 동안 감염시킨 후에, 세포를 세척하고 경우에 따라 FBS 또는 HS 함유 배지 속에서 배양하였다.
키메라 마우스의 감염. 인간 간세포가 이식된 키메라 SCID/uPA 마우스(참조: 예를 들면, WO 01/67854)를 앞서 기술한 바와 같이 감염시켰다(Steenbergen et al. (2010) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 299: G844-854; Mercer et al. (Aug 2001) Nat. Med. 7(8):927-33). 감염은 JFH-감염된 세포로부터의 조직 배양 상층액 또는 HCV-감염된 환자로부터의 혈청 100μl를 사용하여 달성하였다. 마우스 모델 키메라 마우스의 혈청 속의 HCV 역가 및 인간 알부민(hAlb)을 정량적 PCR 및 ELISA 각각에 의해 측정하였다.
면역형광성에 의한 지질 소적의 가시화 및 정량화. 세포를 커버슬립(coverslip) 위에서 성장시키고 FBS 또는 HS 속에서 배양하였다. 세포를 Bodipy 493/503(제조원: Invitrogen)으로 공급업자의 지시사항에 따라 염색하여 지질 소적을 가시화하였다. 중성 지질 염색의 양을 형광 현미경을 사용하여 가시화하였다. 상이한 세포 배양 조건 하에서 Bodipy 493/503 염색의 영상은 동일한 현미경 및 노출 셋팅을 사용하여 채득하였다. 형광의 양은 ImageJ 소프트웨어(제조원: National Institutes of Health)를 사용하여 정량화하였다. 데이타를 3개의 별도의 실험에서, 조건 당 측정된 4 내지 8개의 현미경 장(microscopic field)을 사용하여 수집하였다. 배경- 및 자가-형광성은 무시할 정도였다.
지질 소적의 분포 및 형태는 동일한 현미경 셋팅 하에 별도로 염색된 표본 속에서, 그러나 각각의 개개 조건에 대해 최적화된 노출을 사용하여 시험하였다.
슈크로즈 구배 /밀도 원심분리. 슈크로즈 밀도-구배 한외원심분리 분석을 앞서 기술한 바와 같이(Zhong et al. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102: 9294-9299) 수행하였다. HCV-감염된 세포로부터의 상층액을 300g에서 5분 동안 원심분리하여 프로테아제 억제제(참조: 인디애나폴리스 소재의 RocheApplied Science)를 함유하는 1ml의 TNE 완충액(50 mM 트리스 HCl, pH 8; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA) 속의 세포 부수러기를 제거하고, 20 내지 60% 슈크로즈 구배(12.5ml의 총 용적) 위에 로딩하고, 120,000g에서 16시간 동안 4℃에서 SW41Ti 로터(제조원: Beckman) 속에서 원심분리하였다. 각각 0.5ml의 분획을 구배의 상부로부터 수집하고, 각각의 분획에 있어서의 역가를 앞서 기술한 바와 같이 정량적 RT-PCR로 측정하였다. 각각의 분획의 밀도는 알려진 용적의 중량을 측정함으로써 측정하였다.
ApoB 함유 입자의 면역침전. 면역침전 실험은 필수적으로 앞서 기술한 바와 같이 수행하였다(Steenbergen et al. (2010) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 299: G844-854). 역가가 적어도 105 RNA 카피/ml인 혈청 또는 세포 배양 상층액 표본(50μl)를 밤새 7.5μl의 항 ApoB 항체(Chemicon AB742, 염소 항 인간 아포리포단백질 B; 인간, 마우스 및 소 ApoB와 교차-반응함)와 함께 4℃에서 밤새 회전시키면서 배양하였다. 단백질 G 슬러리(20μL, 제조원: GE healthcare, 단백질 세파로즈 4 고속 유량)을 각각의 표본에 가하고 최소 1시간 동안 회전기 상에서 배양하였다. 단백질 G 착물를 원심분리기 속에서 14000g로 침전시켰다. 펠렛을 PBS를 사용하여 1회 세척하고 바이러스 RNA를 펠렛으로부터 직접 분리하고(참조: QiaAmp Viral RNA kit, 제조원: Qiagen) 정량적 RT-PCR로 분석하였다. 다량의 면역글로불린(환자 혈청과 유사)을 함유하는 표본을 단백질 G 비드로 면역침전 전에 예비-세정하여, ApoB 착물의 정량적 면역침전을 보증하였다. 단백질 G 비드가 HCV 또는 HCV 착물에 직접 결합하지 않았음을 보증하기 위하여, 본 발명자들은 HCV 함유 마우스 혈청을 단백질 G 세파로즈 비드와 함께 항-ApoB 항체의 부재하에서 배양하였다. 이들 표본의 침전시 HCV 역가는 무시할 정도이었다.
간세포 마커의 정량적 RT - PCR . RNA를 트리졸을 사용하여, 제조업자의 지시사항에 따라 세포로부터 분리하였다. cDNA를 RNA로부터 Quantitect Reverse Transcription kit(제조원: Qiagen)를 사용하여 생성하였다. 유전자 특이적인 프라이머-프로브 세트는 Applied Biosystems에 의해 고안되었다. Applied Biosystems 7900HT 고속 실시간 PCR 시스템을 유전자 생성물의 정량화를 위해 사용하였다. 유전자 발현을 HPRT에 대해 파플(Pfaffl)(참조: Pfaffl MW. Nucleic Acids Res 29: e45, 2001)에 따라 계산하였다.
1차 간세포 배양물: 동결된 인간 1차 간세포는 Invitrogen으로부터 구입하거나, 앞서 기술된 바와 같이(참조: Mercer et al, 2001 Nat Med. 7 927-933) 분리하였다. 분리된 세포를 HypoThermosol HTS-Purge(제조원: BioLife Solutions)로 예비처리하고, Cryostor CS10(제조원: BioLife Solutions)으로 재현탁시키고 조절된 속도 냉동고 속에서 분당 1℃의 속도로 -40℃ 까지 냉각시켰다. 이후에, 세포를 액체 질소 속에서 저장하였다. 세포를 해동시키고 예비-가온된 1차 간세포 매질(DMEM, 1.2μg/ml의 인슐린, 11μΜ의 하이드로코르티손 헤미석시네이트, 15mM 헤페스(Hepes), 페니실린/스트렙토마이신, 200mmol 글루코즈, 2% 인간 혈청) 속에 재현탁시키고 콜라겐 제I 형 피복된 플레이트(웰당 1백만개의 세포의 밀도에서 Millicoat 6 웰 플레이트, 제조원: Millipore) 위에 플레이팅하였다. 12 내지 18시간 후, 조직 배양 배지를 재재생시켜 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 세포를 플레이팅 후 3일 내에 사용하였다.
분비된 리포단백질의 FPLC 분석: 크기-배제 고속-단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 사용하여 배양된 Huh7.5 세포에 의해 분비된 리포단백질 입자를 배지 내로 분리하였다. 이러한 시스템에서, 컬럼으로부터 우선 용출된 최대 입자(VLDL)에 이어 LDL 및 HDL 크기의 입자들이 분리되었다. 분리 후, 트리아실글리세롤(TG, 또한 트리글리세라이드로 언급됨) 또는 콜레스테롤 함량을 일렬로(in-line) 측정하였다.
표본을 제조하기 위하여, 세포를 혈청을 함유하지 않는 OptiMEM(제조원: Gibco/Invitrogen)으로 완전히 세척하여 혈청을 함유하는 배지 속에 존재하는 리포단백질을 제거하였다. 마지막 세척물을 수집하여 기본선 측정으로서 제공하였다. 이후에, 세포를 혈청을 함유하지 않는 OptiMEM 속에 밤새 두었다. 다음날, 배지를 수집하고 세포 부수러기를 원심분리(300g, 10분)에 의해 제거하였다. 이후에, 배지를 원심분리 여과기 유닛(Amicon Ultra-100, 제조원: Millipore)을 사용하여 농축시켰다. 농축된 배지(65μl)를 슈퍼로즈 6 10/300 FPLC 컬럼이 장착된 Agilent 1200 HPLC 장치내로 주입하였다. 전체 콜레스테롤 및 TG(인피니티 콜레스테롤(Infinity Cholesterol) 및 트리글리세라이드 시약, 제조원: Thermo Scientific)에 대한 일련의 검정을 37℃에서 컬럼 후 반응을 사용하여 수행하였다. 반응 생성물을 500nm에서 실시간으로 모니터링하고 Agilent Chemstation 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 리포단백질은 TG 및 콜레스테롤 둘 다를 함유한다. 그러나, VLDL은 TG가 풍부하며 콜레스테롤은 거의 없는 반면, HDL은 콜레스테롤이 풍부하며 TG는 거의 없었다. 따라서, 콜레스테롤 프로파일은 분비된 HDL 수준에 있어서의 차이를 검출하는데 보다 적합한 반면, TG 프로파일은 VLDL 수준을 분석하는데 보다 적합하다.
실시예 1: 인간 혈청 속에서 배양된 HUH7 .5 세포의 성장 및 외관
도 1은 인간 혈청(HS) 속에서 세포를 배양하는데 사용되어 분화된 세포를 제공하는 단계들의 예를 나타내는 흐름도를 제공한다. FBS-함유 배양 배지 속에 이미 유지시킨 Huh7.5 세포를 트립신처리하여 단층의 해리를 촉진시켰다. 트립신을 DMEM/10% FBS로 불활성화시켰다. 이후에, 세포를 300g에서 원심분리하고, 세포 펠렛을 DMEM/2% HS/페니실린/스트렙토마이신 속에 재현탁시키고 30 내지 50%의 밀도에서 플레이팅하였다. 합치(confluency) (전형적으로 배양한지 2일 후)에서, 세포를 한번 더 트립신 처리한 다음, 50%의 밀도에서 둔다. 이러한 시점으로부터, 세포를 추가의 분할없이 배양하여 분열되지 않은 세포의 합치 층이 형성되도록 하였다. 임의로, 인간 혈청 속에서 배양된 세포를 대략 1주까지 동안 분열시킬 수 있으며, 단, 이들은 1:2 초과로 분열하지 않는다. 그러나, 인간 혈청 속에서 10일 배양 후 반복된 트립신 처리는 80 내지 90% 이상의 세포의 사멸과 함께, 세포 배양물의 생육력의 손실을 야기하였다.
소 태아 혈청(FBS) 대신에, 인간 혈청(HS)이 보충된 배지 속에서 성장시킨 Huh7.5 세포는 일련의 형태학적 변화를 겪었으며 추가의 분할을 요구하지 않으면서 2개월 이상 동안 합치 층으로 유지되었다. HS-배양된 세포는 조직 배양 기질에 매우 강력하게 부착된 강력하게 패킹된 단층을 형성한, 보도형 구조(pavement like structure)에서 구조화되었다. 대략 1주일 후, 세포 분열이 HS-함유 배지 속에서 배양된 세포에서 지연되었으며, 궁극적으로 완전한 억제를 겪고 성장 정지되었다. 배양물 속에서 1차 간세포와 유사하게(우측 패널), HS-배양된 세포는 단일- 또는 이핵화되었으며 FBS-배양된 세포와 비교하여 과립성 외관(도 2a, 중간 패널)을 가졌다. 대략 14 내지 18일 후, HS에서 세포 크기는 유의적으로 증가하였다.
HS 속에서 배양의 명백한 성장 정지 효과를 관찰하기 위하여, 3주의 기간 내 계수하는 경우 세포 수는 HS-배양된 세포 및 FBS-배양된 세포에서 초기 플레이팅 후 확장한다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, HS-함유 배지 속에서 배양된 세포의 성장은 FBS-함유 배지 속에서의 성장과 비교하여 유의적으로 지연되었다.
규칙적인 배지 교환으로, HS-함유 배지 속에서 배양된 세포는 적어도 2개월 동안 분할 및 재플레이팅없이 유지될 수 있었다.
실시예 2: HS 속에서 HUH7 .5 세포의 배양은 1차 간세포-형 표현형으로의 분화를 촉진한다
HS-함유 배지 속에서 세포를 배양하는 효과를 추가로 평가하고, 이들 세포가 1차 간세포-유사 세포로의 분화를 겪는지를 평가하기 위하여, 간세포 분화 마커의 발현 수준을, Huh7.5 세포를 HS-보충된 배지로 전달한 후 7일 및 21일째에 평가하였다. 7일 후에, 간세포 마커에 있어서 단지 약간의 변화가 관찰되었다. (도 3a) 그러나, 21일 후에, 간 분화 마커 알부민 및 알파1-안티트립신의 발현은 FBS와 비교하여 인간 혈청 속에서 성장한 세포에서 대략 4배 증가하였다. 이들 단백질의 발현의 수준은 배양물 속에서 인간 1차 간세포의 발현 수준과 유사하다. 1차 간세포 배지(PHM) 속에서 Huh7.5 세포를 배양하는 것은 알부민 또는 알파1-안티트립신의 발현에 있어서 유의적인 추가의 효과를 가지지 않았다. LDL-수용체(LDL-R)에 있어서의 변화는 HS 속에서 성장한 세포 내에서 유의적이지 않았지만, Huh7.5 세포를 1차 간세포 배지(PHM) 속에서 성장시킨 경우, LDL-R 발현이 증가하였다.
강력한 결합 성분인, 클라우딘-1 및 오클루딘의 발현은 또한 21일 후 인간 혈청 속에서 정장시킨 세포 속에서 증가하였으며, 배양물 속에서 인간 1차 간세포에서의 발현과 비교가능하였다(도 3a). 고 수준의 강력한 연결이 간 조직 속에서 존재한다. 추가로, 세포의 면역화를 통하여, 이들 단백질은 또한 강력한 종양 억제제로서 알려져 있으며, 세포의 보다 분화된 상태에 대한 종양원성 상태의 이전을 나타낸다. 클라우딘-1 및 오클루딘은 또한 HCV에 대한 도입 수용체로서 기능한다.
주요 지질 대사 조절인자의 발현은 FBS에서 성장시킨 세포와 비교하여 HS에서 성장시킨 세포 내에서 증가하였다(도 3b). LXRα(간 X 수용체 알파)는 간에서 고도로 발현되며, 지질 항상성 및 염증에 관여된 전사 프로그램을 조절한다. 페록시좀 증식인자-활성화된 수용체(PPAR)는 분화 및 대사의 주요 조절인자이다. PPARα는 간에서 지질 대사의 주요 조절인자이다. PPARα의 활성화는 지방산 수송 및 지방산 산화에 관여된 유전자의 상향조절에 의해 지방산의 흡수 및 활용을 촉진시킨다. PPARγ는 지방산 흡수 및 저장, 뿐만 아니라 글루코즈 대사를 조절한다. 세포골격 단백질 비멘틴 및 e-카드헤린은 또한 인간 혈청 속에서 배양된 세포 속에서 증가한다. 비멘틴은 형태를 유지하고 제자리의 세포기관(organelle)을 유지하는데 필수적이며, 이는 또한 세포 내부의 저 밀도 리포단백질의 수송을 조절한다. E-카드헤린은 세포 대 세포 부착에 있어서 중요한 역할을 담당하므로, 세포의 비-증식성/비-종양원성 상태의 지표인, 유사한 강력한 연결 단백질이다.
실시예 3: 다른 배양 상태의 실험
인간 혈청 속에서 HuH-7 또는 HuH-7-유래된 세포의 배양 효과를 비교하기 위하여, 다른 배양 조건을 시험하였다.
DMSO(디메틸 설폭사이드)는 HuH-7 또는 -유래된 세포, 및 다른 간 세포암 세포에서 성장 정지를 유도하는 것으로 보고되어왔다. (Sainz et al. (2006) J Virol 80: 10253-10257). DMSO의 효과를 평가하기 위하여, DMEM(DMEM, 10% FBS, 1% 또는 2% DMSO, 페니실린/스트렙토마이신) 속에서 1% 또는 2% DMSO의 존재하에서 3주 동안 성장시킨 Huh7.5 세포에 있어서 간세포-특이적인 유전자의 발현 수준을 실험하였다. 추가로, Huh7.5 세포를 소 태아 혈청(DMEM, 2% ABS, 페니실린/스트렙토마이신) 대신에 DMEM 속에서 2 내지 10% 성체 소 혈청(ABS, 제조원: Invitrogen) 속에서 배양하였다.
배양 조건 둘 다는 대략 7일 내에 성장 정지를 야기하였다. DMSO 또는 ABS를 함유하는 배지 속에서 배양시킨 세포는 일부 형태학적 변화를 겪었지만, 인간 혈청 속에서 배양시킨 세포의 정도는 아니었다. 임의의 배양물에서도, 1차 인간 간세포 표현형의 지표인 세포질에서의 반점 모양의 패턴은 전형적으로 관찰되지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
ABS 또는 DMSO 속에서 배양시킨 세포의 분화 상태는 상기 기술된 바와 같이 동일한 간세포 분화 마커의 발현 수준을 평가함으로써 실험하였다(도 4). 2% DMSO 속에서의 배양은 알부민 발현에 있어서 약간의 증가를 야기한 반면, ABS는 강력한 연결 단백질인, 클라우딘-1 및 오클루딘의 발현에 있어서 약간의 증가를 야기하였고, 이들 단백질들 중 어느 것도 배양물 속에서 1차 인간 간세포내 것들과 비교가능한 수준에서 또는 인간 혈청 속에서 배양된 Huh7.5 세포 속에서 발현과 비교가능한 수준에서 발현되었다. 시험한 다른 바이오마커의 발현 수준은 FBS를 함유하는 배지 속에서의 배양과 비교하여 유의적으로 증가하지 않았다.
실시예 4: 세포 지질 소적의 외관에 있어서 배양 배지의 효과
FBS 대 HS 속에서 Huh7.5 세포의 배양 후 세포 지질 소적의 외관을 실험하였다. 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 지질의 지표인 보디피 형광(Bodipy fluorescence)은 FBS와 비교하여, HS 속에서 배양된 세포에서 훨씬 더 강렬하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화한 경우, 보디피 형광 강도는 FBS(도5b) 속에서 배양된 세포에서 보다 HS 속에서의 세포 배양물에서 대략 4배 더 높았다.
또한, 지질 소적의 분포는 상이한 배양 조건에 의해 영향받는다. FBS 배지 속에서, 세포 속의 지질 소적 크기는 불균일하다. HS 배지 속에서, 세포 속의 지질 소적은 일반적으로 FBS-배양된 세포 속에서 더 작으며, 크기에 있어서 훨씬 더 균일하다.
실시예 5: JFH -1의 바이러스 역가의 생성
JFH-1을 FBS-배양된 세포내로 전기천공하였다. 이후에, 실시예 1에 따라서, 전기천공된 세포를 FBS 속에 유지시키거나 전기 전공 직후 HS-함유 배지로 전달하였다. 전기천공한지 4 내지 6일째에, 바이러스를 배양물 상층액의 수집으로 수거하였다.
FBS 배지 속에 유지시킨 세포의 전기천공으로 생성된 바이러스를 "JFH-FBS"로 언급하며; 전기천공 직후 HS 배지로 전달하고 이 속에서 유지시킨 세포의 전기천공에 의해 생성된 바이러스를 "JFH-HS"로 언급한다.
도 6a는 2개의 상이한 바이러스와 함께 FBS 속에서 배양된 세포의 감염을 나타낸다. FBS 유지된 세포를 전기천공 후 4일째에 분리한 JFH-FBS로 감염시킨 경우(JFH-HS와 유사함), 이들 바이러스 스톡의 RNA 역가가 너무 낮으므로, 감염은 이들 세포에서 검출되지 않았다. 대조적으로, JFH-HS는 FBS 성장된 세포 속에서 고 바이러스 역가를 야기하였다. 바이러스 역가는 신속하게 정체기에 도달하였다. 비교를 위해, 전기천공 후 15일째에 분리한 JFH-FBS를 사용하였다(JFH-FBS(15)로 언급함). JFH-FBS(15)의 바이러스 역가는 JFH-HS와 비교하여 감염 과정 전체에서 낮게 남았다.
도 6b는 상이한 조건(FBS 및 HS) 하에서 성장시켰지만 동일한 바이러스(JFH-HS)를 사용하여 감염시킨 세포의 바이러스 역가를 나타낸다. 특히, HS 속에서의 처음 10 내지 11일의 배양 동안에, 바이러스 생성을 위해 HS를 사용하는 이점은 명백하지 않았다. 그러나, 약 11일 후에 바이러스 역가는 증가하기 시작하여 세포의 HS 배지로의 전달 후 약 14일째에, 바이러스 생성은 HS 유지된 세포 속에서 신속하게 증가하였다. 바이러스 생성에 있어서 이러한 증가는 FBS-배양된 세포에서 관찰되지 않았다. 이러한 시기조절은, HS-배양된 세포가 1차 인간 간세포의 것과 유사한 표현형을 향해 분화된 표현형을 나타낸 대략적인 시기에 상응한다. 유사한 감염을 HuH-7 세포에서 수행하였다. HuH-7 세포에서 관찰된 경향성(배수 증가가 유사하였다)은 Huh7.5 세포에서 관찰된 것과 유사하였다.
도 6c는, HS 속에서 성장한 세포가 JFH-HS로 감염된 경우, 바이러스 생성(HCV RNA 카피/ml)가 FBS-배양된 세포 속에서 FFH-FBS를 사용한 표준 조직 배양 조건과 비교하여 약 1,000배 증가함을 나타낸다. HS-함유 배지 속에서 세포의 배양은 매 3 내지 4일마다 신선한 HS-함유 배지로의 교환 시, 적어도 45일 동안 108개 RNA 카피/ml 이상에 도달하는 연속적인 바이러스 역가의 생성을 허용하였다(도 6d). 세포를 우선 1차 간세포-유사 표현형(HS-함유 배지 속에서 약 14일 동안 배양함으로써)으로 분화시킨 후 JFH-HS로 감염시킨 경우, 유사한 바이러스 역가가 달성되었다(도 6c).
도 6e는, 바이러스 역가에 있어서 1차 간세포 배지를 사용하는 효과를 나타낸다. 감염되고, HS를 사용하여 우선 분화시킨 세포를 1차 간세포 배지(DMEM, 1.2 μg/ml 인슐린, 11μΜ 하이드로코르티손 헤미석시네이트, 15mM 헤르페스 페니실린/스트렙토마이신, 200mmol 글루코즈, 2% 인간 혈청)에 전달하고 바이러스 생성에 있어서의 효과를 평가하였다. 전달 후 3일내에, HS 속에서 배양한 결과로서 관찰된 형태학적 변화는 보다 명백하게 되었다(나타내지 않음). 또한, 바이러스 역가는 DMEM/2% HS/페니실린/스트렙토마이신 속에서 유지된 동일한 세포와 비교하여 대략 5배 증가하였다.
실시예 6: JFH - HS 및 JFH - FBS 를 사용한 마우스의 감염
JFH-HS 및 JFH-FBS 둘 다의 생체내 감염성을 키메라 SCID/Alb-uPA 마우스 모델에서 시험하였다. 전기천공 후 수집한 JFH-HS 스톡을 사용하여 새로운 세포를 감염시키고, 이들 감염된 세포로부터의 상층액을 사용하여 마우스를 감염시켰다. FBS 속에서 생성된 동일한 바이러스에 대한 직접적인 비교는, 바이러스 역가가 검출가능한 감염을 예측하기에 너무 낮아서, 가능하지 않았다. 따라서, 조직 배양물 조절된 JFH 변이체(HCVcc)를 비교 목적을 위해 단독으로 유사한 역가에서 사용하였다.
HCVcc, JFH 바이러스 스톡을 FBS 속에서 세포 배양물의 전기천공으로 생성하였다. 혼주된 바이러스를 감염 후 15일로부터 30일째까지 매 5일마다 분리하였다. 이들 혼주된 바이러스를 사용하여 FBS 속에서 성장한 세포를 감염시켰다. 후속적으로, 감염된 세포의 상층액을 사용하여 새로운 세포를 감염시켰다. 상기 과정을 수회 라운드의 감염에 대해 반복하였다. 따라서, 수득되는 바이러스는 조직-배양물에 적응되었다. HCV-감염된 환자로부터의 혈청을 양성 대조군으로서 제공하였다.
도 7은 감염후 25일째까지 동안 마우스 혈청 속의 바이러스 역가를 나타낸다. JFHHS는 키메라 마우스의 신속한 감염을 유발하였다. JFHHS 역가는 감염 후 4일 째에 고 역가로 검출가능하였으며, 다음 3주에 걸쳐 추가로 단지 미미하게 증가하였다. 대조적으로, 조직 배양물 적응된 JFHFBS의 바이러스 역가는 처음 2주에 걸쳐 서서히 증가한 후 동일한 정체기도 이른 것으로 여겨졌다. JFHHS와 유사하게, 고 감염성 환자 혈청 HCV의 바이러스 역가는 또한 4일내에 검출가능하다.
실시예 7: HCV 입자:바이러스 밀도, 리포단백질 연합에 있어서 HS -배양된 세포의 효과
바이러스의 생리학적 특성이 HS 대 FBS 속에서 배양함에 의해 영향받았는지를 평가하기 위하여, 바이러스 밀도 및 바이러스의 ApoB 연합을 평가하였다.
도 8, 패널 A에 나타낸 바와 같이, HS 속에서 배양된 바이러스의 밀도는 보다 낮은 밀도를 향하여 이동한다. FBS를 사용하는 표준 조직 배양 조건 하에서, JFH의 중간 밀도는 1.16g/ml이었으며, 이는 앞선 보고와 일치한다. HS 속에서 세포의 배양 시, 바이러스 입자의 전체적인 밀도는, 중간 밀도가 1.09g/ml이고, 매우 낮은 밀도 피크의 추가의 외관을 지닌, 보다 낮은 밀도를 향해 이동한다. 바이러스 밀도를 HuH-7 및 Huh7.5 세포에 의해 생성된 것 둘 다에서 측정하였으며, 결과는 세포 유형 둘 다에서 유사하였다.
대안의 표시를 도 8, 패널 B에 나타낸다. FBS-배양된 세포 속에서 생성된 경우, 바이러스의 약 75%가 1.16g/ml 보다 더 높은 밀도를 가진 반면, HS-배양된 세포 속에서 생성된 경우, 바이러스의 약 25% 만이, 밀도가 >1.16g/ml이었다.
조직 배양물 속에서 생성된 바이러스가 ApoB와 관련되지 않지만, ApoE와는 관련되어 있다는 것이 이미 보고되어 왔다. 인간 혈청, 및 HCV 감염 마우스 모델에서, HCV의 유의적인 부위가 ApoB(약 60%)와 관련되어 있다. 따라서, ApoB와의 HCV 연합에 있어서 변경된 조직 배양 조건의 효과를 실험하였다.
FBS를 사용한 표준 조직 배양 조건 하에서, JFH의 대략 5% 만이 ApoB와 관련되었다. 세포를 인간 혈청 속에서 배양하는 경우, 바이러스의 대략 90%가 ApoB 관련되었다(도 8, 패널 C). 비교를 위해, 환자 혈청 속에서 HCV의 약 30 내지 80%는 ApoB와 관련된 것으로 관찰되었으며, 키메라 마우스에서 HCV의 약 40 내지 70%는 ApoB와 관련된 것으로 관찰되었다. ApoB 연합은 HuH-7 및 Huh7.5 세포에 의해 생성된 바이러스에서 측정되었으며, 결과는 유사하였다.
실시예 8: HS -배양된 세포에서 바이러스 생성시 인간 저 밀도 리포단백질( HLDL)의 효과
바이러스 생성에 있어서 리포단백질의 효과를 관찰하기 위해, 리포단백질(VLDL 및 LDL)을 함유하는 아포리포단백질 B가 결여된 인간 혈청을 제조하였다. 저(LDL) 리포단백질- 및 초 저 밀도(VLDL) 리포단백질-고갈된 HS를 제조업자(HiTRAP Heparin HP, GE Healthcare)가 제공한 지시사항에 따라서 헤파린 컬럼 위에 혈청을 이동시켜 제조하였다. 헤파린은 ApoB 함유 리포단백질, VLDL 및 LDL에 고 친화성으로 결합한 반면, HDL은 헤파린에 결합하지 않는다. 따라서, 수득되는 혈청은 VLDL 및 LDL 만을 고갈된다. 요약하면, 결합 완충액을 사용한 평형 후, 혈청을 컬럼에 적용하여, ApoB 함유 리포단백질이 결합하도록 하였다. ApoB 고갈된 분획을 수집하고 여과기 멸균시키고 -20℃에서 저장하였다.
세포를 리포단백질-고갈된 HS 속에서 배양한 경우, Huh7.5 세포의 1차 간세포-유사 표현형으로의 분화가 여전히 발생하였지만, 고 바이러스 역가의 생성에 있어서 인간 혈청의 유리한 효과의 대부분은 상실되었다. 인간 VLDL의 역 부가는 바이러스 생성을 구제하지 않았다. 그러나, 인간 LDL의 부가는 바이러스 생성에 있어서 1000배 증가를 야기하였다. 인간 LDL의 이러한 효과는 용량 의존적이며, 단지 (부분적으로)분화된 세포 속에서 달성될 수 있다(도 9).
실시예 9: HCV 감염된 환자로부터의 혈청을 사용한 세포의 감염
인간 혈청 속에서 배양된 Huh7.5 세포를 HCV 유전형으로 감염된 HCV 환자로부터의 혈청에 의한 감염에 대해 민감성에 대해 시험하였다. 성공적인 감염을 약 105개 이하의 RNA 카피/ml의 바이러스 역가를 사용하여 달성하였다. (도 10) 대조적으로, FBS-함유 배지 속에서 배양하고 동일한 혈청으로 감염시킨 Huh7.5 세포는 RT-PCR에 의해 평가된 것으로서 검출가능한 바이러스를 생성하지 않았다.
상기 실시예는 인간 혈청 속에서 HuH-7-유래된 세포와 같은 hHCC 세포의 배양이 1차 간세포의 표현형으로의 분화를 야기함을 예시한다. 인간 혈청(통상의 조직 배양 프로토콜에 따른 FBS보다는 오히려) 인간 혈청을 함유하는 배지 속에서 배양된 HuH-7 또는 Huh7.5 세포는 접촉 억제되어 HCV에 대한 도입 수용체로서 관련되어 온 2개 인자, 클라우딘-1 및 오클루딘을 포함하는 수개의 간세포 분화 마커의 발현에 있어서 증가를 나타낸다. 또한, HS-배양된 세포는 HCV 복제 및/또는 조립 부위로서 관련되어온 세포기관인, 세포 지질 소적에 있어서의 증가를 나타낸다.
HCV에 의한 HS-배양된 hHCC 세포의 감염은 FBS로 보충된 DMEM을 사용한 표준 조직 배양 방법과 비교하여 바이러스 생성에 있어서 1,000배 증가를 나타낸다. hHCC 세포 배양물의 FBS-함유 배지를 HS-함유 배지로 대체한 직후, 약 10 내지 100배의 바이러스 역가에 있어서의 증가가 관찰된다. 1차 간세포 표현형에 대한 HS-배양된 hHCC 세포의 분화가 달성되는 시점 근처에서(약 14일), 바이러스 복제는 FBS-함유 배지 속에서 유지된 hHCC 세포와 비교하여 약 1,000배 증가한다. 결과는 도 9에 나타낸다.
인간 LDL은 바이러스 역가의 증가에 있어 역할을 담당한다. 혈청으로부터 VLDL 및 LDL의 제거는 HS-배양 조건과 관련된 바이러스 역가에 있어서의 증가를 방지하였다. 인간 VLDL이 아닌, 인간 LDL의 선택적인 부가는 HS-배양 조건의 바이러스 생성 수준을 구제하였다. hHCC 세포의 분화 상태는 바이러스 역가에 있어서 LDL의 유리한 효과에 역할을 담당하였다.
HS-배양된 hHCC 세포로부터 생성된 HCV 입자는 FBS-배양된 hHCC 세포로부터 생성된 HCV와는 구조적으로 상이하다. HS-배양된 hHCC 세포로부터 생성된 HCV는 낮은 밀도를 가지며 ApoB 관련되어 있다. HCV 분획의 보다 낮은 밀도는 보다 높은 감염성과 연관되어 있다. 보다 높은 감염성은 실제로 키메라 마우스 모델에서 관찰되었다. HS-배양된 세포로부터 생성된 바이러스는 FBS-배양된 hHCC 세포로부터 생성된 바이러스와 비교하여 보다 높은 감염성의 지표인, 고도로 감염성인 환자 혈청으로부터의 HCV와 유사한 감염 시간 경로를 나타내었다. HS-배양된 hHCC 세포내에서 생성된 HCV의 보다 낮은 밀도 및 ApoB 연합은 환자의 혈류 속에서 순환하는 바이러스와 보다 밀접하게 닮아있다.
HS-배양된 세포를 사용하여 FBS-배양된 세포에서 생성된 동일한 바이러스와 비교한 것으로서 바이러스의 보다 높은 역가를 생성할 수 있다. 위에서 나타낸 바와 같이, JFH-1은 바이러스의 유전적 변형에 대한 요구없이 및/또는 적응된 돌연변이를 선택하기 위한 조직 배양물-적응 전에 FBS-배양된 세포에서보다 더 높은 역가에서 HS-배양된 세포로부터 생성되었다. JFH-1으로 형질감염시키고 13일 동안 배양된 HS 배양된 세포는 HS 배양된 세포에 대해 감염성인 바이러스 입자를 생성하였으며 이들 세포에 의해 생성된 바이러스는 키메라 마우스 속에서 고도로 감염성이었다.
실시예 10: HS -배양된 세포에서 리포단백질 분비
VLDL 분비와 같은 간세포-특이적인 기능은 FBS 보충된 혈청 속에서 성장시킨 hHCC에서는 부재한다. VLDL 분비는 인간 혈청 속에서 배양된 hHCC 속에서 일어나며, FBS 보충물 혈청 속에서 배양된 Huh7.5 세포는 실시예 1에서 기술된 바와 같은 인간 혈청(HS) 속에 보충된 배지에 대해 스위칭(switching)되었으며 트리아실글리세라이드(도 11) 및 콜레스테롤(도 12)계 리포단백질 프로파일은 크기 배제 고속-단백질 액체 크로마토그래피를 사용하여, 다양한 시점에서 배양된 세포의 배지로부터 수득하였다.
앞선 관찰에 따라(Ling et al. (2013) Biochim Biophys Acta 1831(2): 387-97; and Meex et al. (2011) J Lipid Res 52: 152-158), VLDL 분비는 FBS 보충된 혈청 속에서 성장한 Huh7.5 세포 속에서 부재하였으며(도 11, 패널 B 및 도 12), 작은 LDL-크기의 피크만이 관찰되었다. 인간 혈청 속에서 배양한지 5일 후, VLDL 분비에 있어서 약간의 증가가 있었으며, 약간의 변화가 콜레스테롤 프로파일에서 LDL 및 HDL 크기의 분획에서 관찰되었다(도 12).
그러나, VLDL 분비는 리포단백질 프로파일에 나타낸 우세한 VLDL 피크에 의해 나타난 바와 같이(도 11, 패널 B 및 도 12), 세포 분화(14일째로부터) 시 인간 혈청 속에서 배양된 세포내에 존재하였다. 또한, 세포의 분화시, 크기에 있어서 증가한(곡선하 영역(area under the curve)이 보다 크다) 및 보다 큰 LDL 입자 둘다에서 LDL 피크가 존재하였다(LDL 피크는 좌측으로(보다 큰 입자 용출물 우선) 이동하였다). HS 속에서 배양한지 30일째에, HS 배양된 세포로부터 배지의 리포단백질 프로파일은 배양물 속에서 1차 인간 간세포에 의해 분비된 리포단백질(Ling et al. (2013) Biochim Biophys Acta 1831(2): 387-97) 및 인간 혈액 혈청의 리포단백질 프로파일(도 11, 패널 A, 참조: Steenbergen et al. (2010) 299:G844-854)과 매우 유사하였다. HDL 피크에 있어서의 증가는 또한 콜레스테롤계 리포단백질 프로파일에서 관찰되었다(도 12). 이와 함께, 당해 데이타는, 리포단백질 분비가 HS 배양된 세포 분비물 리포단백질 속에서 회복될 수 있으며 인간 혈청 속에서 발견되고 1차 인간 간세포에 의해 생성된 것과 유사한 분비된 리포단백질 프로파일을 나타냄을 나타낸다.
실시예 11: HBV 에 의한 세포의 감염
B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 감염에 대한 hHCC 세포의 민감성을 시험하였다. 추정된 HBV 도입 수용체의 발현 수준, 나트륨 타우로콜레이트 동시-수송 폴리펩티드(NTCP, SLC10A1)를 또한 모니터링하였다.
Huh7.5 세포를 인간 혈청(HS) 함유 배지 속에서 21일 동안 위에서 기술한 바와 같이 배양하여 분화된 세포를 생성하였다. 이러한 시기 후, 세포를 HBV로 24시간 또는 48시간 동안 감염시켰다. 감염은 감염된 환자로부터의 HBV 양성 혈청 50 내지 100μL를 세포 배양물에 세포당 15 내지 30개 바이러스의 감염 다중도(MOI)로 가하거나, HBV 입자를 발현하도록 유전적으로 개질된 세포주인, 배양된 HepAD38 세포로부터의 세포 상층액의 50X 농축된 표본 10μl를 가함으로써 달성하였다. HepAD38 세포의 경우 세포당 대략 1000개의 바이러스의 MOI를 사용하였다.
세포를 감염 후 완전히 세척하여 혼입되지 않은 바이러스를 제거하였다. 배지로의 바이러스 분비는 정량적 PCR을 사용하여 감염 후 상이한 날에 배지 속의 바이러스 게놈의 양을 측정함으로써 모니터링하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, HS-배양된 세포는 HBV의 2개의 상이한 임상 단리체(개방 원 및 폐쇄 원), 및 또한 HepAD38 세포(개방 삼각형)에 의해 생성된 바이러스로 성공적으로 감염시켰다. 감염 후 대략 4일 후에, 각각의 세척물(여기서 세척물은 감염(0일째) 후 1일 또는 2일째였다)에서 바이러스 역가를 초과하는 바이러스 역가가 검출되었다. 바이러스 역가는 대략 5 내지 14일째에 최대에 도달하였다. 감염 후 15일 째에 바이러스 역가가 감소하여, 감소하는 도입 수용체 수준과 일치하였다.
실시예 12: HS -배양된 세포에서 HBV 도입 수용체의 발현
나트륨 타우로콜레이트 공수송 폴리펩티드(NTCP)는 인간 세포 속에서 HBV에 대한 도입 수용체인 것으로 보고되어 왔다(Yan et al. (2012) eLife 1 :e00049). mRNA 수준에서 NTCP의 발현은 상이한 기간(0 내지 35일) 동안 위에서 기술한 바와 같이 HS 속에서 배양된 Huh7.5 세포 속에서 평가하였다. FBS 속에서 배양하여 동일한 계대배양 수에서 분리한 Huh7.5 세포를 대조군으로서 제공하였다. 각각의 배양 주기 말기에, 세포 분해물을 제조업자에 의한 지시에 따라서 TRIZOL®(제조원: Invitrogen) 속에서 제조하였다. NTCP의 상대적인 mRNA 수준을 적량적 PCR을 사용하여 HPRT와 비교하여 측정하였다.
도 14에 나타낸 바와 같이, HS-배양된 세포는 인간 혈청-함유 배지로 전달된 직후 NTCP의 증가된 수준을 나타내었다. NTCP의 발현의 최대 수준은 HS로의 전달 된 후 25일째에 관찰되었으며, FBS와 비교하여 60배 증가를 나타내었다. 약 28일째에, NTCP 수준은 감소하기 시작하였다.
NTCP는 담즙 교환기로서의 기능을 가지므로, 이들 데이타는, 간 특이적 기능인, 담즙 분비가 HS-배양된 세포 속에서 증가하거나 회복됨을 나타낸다. 또한, NTCP 발현 수준의 측면에서, 이들 데이타는, HS-함유 배지 속에서 hHCC의 보다 짧은 분화 시간(예를 들면, 10 내지 14일)이 HBV 감염을 제공하는데 충분함을 나타낸다.
실시예 13: 조직 배양 배지 내에 헤파린-처리된 혈청의 사용은 감염을 향상시키고 바이러스 역가를 증가시킨다.
리포단백질을 헤파린 컬럼(제조업자의 지시에 따름; HiTrap Heparin column, 제조원: GE Healthcare) 위에서 혈청을 용출시켜 혈청으로부터 제거하였다. 헤파린은 아포리포단백질 B(ApoB)에 고 친화성으로 결합한다. 혈청(FBS 또는 HS)을 컬럼에 적용시키고 완전히 이동한 것(run-through)을 수집하였다. 상기 완전히 이동한 분획은 LDL 및 VLDL과 같은 ApoB 함유 리포단백질을 필수적으로 함유하지 않는다.
FBS 속에서 초기 배양된 Huh7.5 세포를 동일한 양의 바이러스(HS 생성된 바이러스, 따라서 ApoB 관련된 바이러스)로 감염시킨 후 FBS, HS, 헤파린-처리된 FBS(HepFBS) 또는 헤파린-처리된 HS(HepHS) 속에서 28일까지 추가로 유지시켰다. 세포 생육력은 HepFBS 또는 HepHS 속에서 배양함에 의해 영향받지 않았다. 바이러스 역가를 28일 동안 모니터링하였다.
도 15에서, 패널 A는 HS 또는 FBS 속에서 배양된 세포내 바이러스 역가를 나타낸다. 예측된 바와 같이, HS 속에서 바이러스 역가(사각형)는 FBS(원형)에서의 바이러스 역가를 많이 초과하였다. 도 15, 패널 B는 HepFBS 또는 HepHS 속에서 배양된 세포내 바이러스 역가를 나타낸다. 처음 10 내지 15일내에, HepHS 및 HepFBS 속의 바이러스 역가는 FBS에서의 역가를 초과하였으나, 시간이 경과함에 따라, HepHS, HepFBS 및 FBS는 유사한 역가를 생성하였다. 도 15, 패널 C는 패널 B의 처음 8일의 확장이며, 이는, HS, HepFBS 및 HepHS 배양이 이러한 기간 동안 FBS 속에서 배양된 세포에 대해 유사하게 향상된 역가를 생성함을 나타낸다.
이들 데이타는, 처리되지 않은 FBS를 사용하여 달성된 것과 비교하여 향상된 바이러스 역가가 세포를 리포단백질이 고갈된 혈청의 사용 시(예를 들면, 헤파린 처리에 의해) 바이러스 감염 시기에 달성될 수 있음을 나타낸다. 놀랍게도, 향상된 바이러스 역가는 헤파린-처리된 인간 혈청 또는 헤파린-처리된 소 태아 혈청을 사용하여 달성될 수 있다.
실시예 14: 정제된, 리포단백질 관련된 바이러스( HS 생성된 바이러스)의 증가하는 감염율
인간 혈청 속에서 생성된 바이러스는 인간 리포단백질 B(ApoB)와 관련되어 있다. 이러한 특성은 헤파린에 대한 ApoB의 고 결합 친화성을 사용하여 HCV-감염된 환자로부터의 혈청으로부터 바이러스를 정제하기 위해 탐색되었다. HS-배양된 세포 속에서 생성된 바이러스는 300kDa 여과기를 사용하여 Centrimate 500S 탄젠트 유동 장치(tangential flow apparatus) 속에서 60 ml로 농축시켰다. 이를 HiTrap 헤파린 컬럼(1 내지 10 분획[바이러스 코어 단백질 ELISA에 의해 검출된 것으로서 HCV 부재)) 위로 로딩(loading)하였다. 컬럼을 120ml의 세척 완충액(0.1M NaCl 20mM NaP04 완충액 ph7.4- 표준 기술로 제조됨)(분획 11 내지 17)으로 세척하였다. 이후에, 컬럼을 0.2M NaCl, 20mM NaP04 완충액 ph7.4(분획 18 내지 27), 0.4M NaCl, 20mM NaP04 완충액 ph7.4(분획 28 내지 34) 및 최종적으로 1M NaCl, 20mM NaP04 완충액 ph7.4(분획 35 내지 38)을 사용하여 용출시켰다. HCV 코어 단백질을 각각의 분획 속에서 ELISA를 사용하여 정량화하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 2개의 피크가 존재하였다(혼주된 분획 28 내지 30, 및 35 내지 37).
각각의 분획으로부터의 정제된 바이러스를 100배로 희석시키고, 바이러스의 감염성을 FBS 또는 헤파린-고갈된 HS(HepHS) 속에서 배양된 세포의 4시간 감염으로 시험하였다. 동일한 양의 정제된 바이러스를 조건 둘 다에 대해 사용하였다. 감염율을 HCV NS5a에 대해, 앞서 기술한 바와 같이 감염 후 2일 째에 염색함으로써 측정하였다(참조: Lindenbach et al, 2005 Science Vol. 309 pp. 623-626) 감염된 세포는 암갈색 색상(회색 규모의 암회색)으로 발색될 것이다.
분획 35 내지 37은 비교적 불량하게 감염성(FBS 속에서 정제되지 않은 바이러스의 것과 유사한 감염성을 지님)이었으며, 감염율은 리포단백질의 제거에 의해 영향받지 않았다(나타내지 않음). 분획 28 내지 30으로부터의 바이러스는 세포를 성공적으로 감염시켰다. 도 17에 제공된 실시예에 나타낸 바와 같이, 훨씬 더 높은 감염율은, 헤파린-결합 리포단백질이 고갈된 혈청 속에서 달성될 수 있다.
실시예 15: HCV (유전형 1A)의 임상 단리체를 사용한 HUH7 .5 세포의 감염
HCV의 임상 단리체에 의한 감염에 대한 HS-배양된 Huh7.5 세포의 민감성을 시험하였다. 감염 프로토콜을 개발하여 리포단백질 관련된-HCV의 도입을, HCV의 임상 단리체를 사용한 성공적인 감염을 야기할 수 있었던 리포단백질을 분비하는 세포를 사용함으로써 촉진시켰다.
환자로부터 직접 수득된 혈청 속에서 인간 항체의 존재를 피하기 위하여, HCV 임상 단리체를 인간 간 세포를 이식시킨 SCID/Alb-uPA 마우스("키메라 마우스")(미국 특허 제6,509,514호; Mercer et al. (2001) Nat. Med. 7:927-33) 속에서 우선 계대배양(passaging)하였다. 인간은 중화 항체를 생성할 수 있지만, 키메라 마우스는 그렇지 않다. 따라서, HCV-감염된 키메라 마우스로부터의 HCV 양성 혈청은 HCV 중화 항체를 함유하지 않는다.
키메라 마우스를 HCV 유전형 la 임상 단리체로 감염시켰다. 혈액 표본을 상이한 시점에서 수거하고, 혈청 속의 바이러스의 양을 정량적 RT PCR로 평가하였다. 바이러스 역가가 107개의 RNA 카피/ml인 HCV 양성 마우스 혈청 표본(마우스 A578)를 사용하여 배양된 세포를 감염시켰다.
세포를 인간 혈청 함유 배지 속에서 10 내지 21일까지 배양하여 세포를 분화시켰다. 감염 2일 전에, 세포를 위에서 기술한 바와 같이 HepHS 속에 두었다. 이후에, 세포를 HCV 양성 마우스 혈청으로, 세포당 1 내지 3개의 바이스 게놈에서 감염시켰다. 동시에 정상 혈청(HS)을 함유하는 배지 속에서 배양된 세포를 동량의 바이러스로 감염시켰다. 세포를 24시간 동안 감염시킨 후; 배지를 정상의 인간 혈청(HS)을 함유하는 혈청으로 대체하였다. 바이러스 역가를 정량적 RT PCR을 사용하여 모니터링하였다. 이후에, 바이러스 역가가 최대인 표본을 사용하여 동일한 세포 감염 프로토콜로, 새로운 세포를 직접 접종하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 정상의 인간 혈청 속에서 배양된 세포는 HCV 양성 마우스 혈청 A578(폐쇄 원, A578)로 검출가능하게 감염될 수 없었다. 그러나, 세포를 감염 단계 동안에 리포단백질-고갈된 혈청 속에서 배양한 경우, 105개 이하의 RNA 카피/ml의 바이러스 역가가 수득되었다(A578 HepHS; 개방 원). 이후에, A578 HepHS로부터의 15일째 표본(별표로 표시)를 사용하여 동일한 프로토콜로, 새로운 세포를 감염시켰다. 7일 후에, 바이러스 역가는 ml당 대략 104개 RNA 카피이었으며, 14일 후 바이러스 역가는 ml당 107개 RNA 카피에 도달하였다.
실시예 16: 약물 대사에 관여된 유전자 발현의 분석
위에 나타낸 바와 같이, 표준 소 태아 혈청(FBS) 함유 배지 대신에, 인간 혈청(HS) 함유 배지 속에서 인간 간세포 암종(hHCC) 세포(예를 들면, HuH-7 또는 Huh7.5 세포)를 배양하는 것은, 이들 세포가 분화하도록 한다. 위에서 추가로 나타낸 바와 같이, 인간 혈청 속에서 hHCC 세포를 배양하면 알부민 및 VLDL 분비를 회복하며, 이들 세포는 보다 간세포-유사하게 됨을 나타낸다. 여기서, 분화된 세포를 시험하여 이들 세포가 약물 대사와 관련하여 1차 인간 간세포의 모델로서 제공될 수 있는지를 평가하였다.
HS 함유 배지 속에서 다양한 시간 동안 배양된 세포를 FBS 함유 배지 속에서 성장된 세포와 비교하는 게놈 전체 미세배열 연구(genome wide microarray study)를 수행하였다. 세포를 HS 함유 배지 속에서 앞서와 같이 8, 15, 또는 23일 동안 배양하고, 이중의 웰을 트리졸(제조원: Invitrogen)을 사용하여 수거하였다. FBS 배지 속의 세포를 합치성에서 수거하였다. RNA를 제조업자의 지시에 따라 추출하고, cDNA를 무작위 프라이머 및 MMLV 역 전사효소를 사용하여 합성하였다. 이후에, Affymetrix Human Prime View 배열을 수행하고 데이타를 로부스트 다중-배열 분석 방법(Robust Multi-Array Analysis method: RMA)을 사용하여 분석하였다.
약물 대사를 3개의 상으로 나눈다. 상 I 에서, 시토크롬 P450 옥시다제와 같은 효소는 반응성 또는 극성 그룹을 생체이물작용제(xenobiotics)(소분자 약물과 같음) 내로 도입시킨다. 이후에, 이들 개질된 화합물을 P 속에서 극성 화합물에 공액시키고, 이를 글루타티온 S-트랜스퍼라제와 같은 트랜스퍼라제 효소로 촉매화시킨다. 상 III 에서, 공액된 생체이물작용제를 유출 운반체(efflux transporter)에 의해 인지되어 세포 외부로 펌핑되기 전에, 추가로 가공할 수 있다. 상기 분석은 상 I 및 상 II 대사 유전자, 및 앞선 연구에서 약물 대사에 관여되는 것으로 예측된 운반체에 초점을 맞추었다. (Jennen et al. (2010) Drug Discovery Today 15:851-858). 유전자의 일반적인 계열은 시토크롬(16개 유전자), 알코올 데하이드로게나제(8개 유전자), 알데하이드 데하이드로게나제(18개 유전자), 메틸 트랜스퍼라제(8개 유전자), 글루타티온 트랜스퍼라제(13개 유전자), 설포트랜스퍼라제(11개 유전자), UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제(11개 유전자), 및 ABC 운반체(26개 유전자)였다. 당해 결과는 도 19 내지 도 22에 나타낸다.
놀랍게도, 다수의 시토크롬 및 플라빈 모노옥시게나제 및 알도-케토 리덕타제를 포함하는 다수의 상 I 유전자가 상향조절되었다(도 19 내지 20). 또한, 글루쿠로노실트랜스퍼라제 및 일부 다른 상 II 유전자가 상향조절되었다(도 20 및 도 21). 다양한 계열에서 많은 다른 유전자는 상향조절되지 않았으며, 이는 약물이 세포에 부가되지 않았기 때문인 것으로 예측된다.
약물 대사에 관여한 에스트로겐 선호 설포트랜스퍼라제인, SULTE1은 23배 상향조절되었고, 담즙산 아실 트랜스퍼라제인, 상 II 효소 BAAT는 13배 상향조절되었다. 이들 연구에서 상향조절된, 많은 mRNA는 담즙산 대사에 관여한 효소를 암호화하는 것으로 여겨지며, 이는, 분화된 간 세포 및 증가된 탈독성화 기능 둘 다와 일치한다, 이는 HS 배양된 세포가 1차 간세포를 보다 잘 반영함을 나타낸다. 1차 간세포가 아-표준 조직으로부터 일반적으로 분리되므로(가장 우수한 간이 일반적으로 운반용으로 예정되기 때문), 그러한 분화된 세포는 1차 간세포보다 더 일관된 모델을 제공할 수 있다.
본 발명을 이의 구체적인 구현예를 참조로 하여 기술해 왔지만, 당해 분야의 숙련가는, 다양한 변화가 본 발명의 취지 및 영역으로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있고 등가물이 치환될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 많은 변형이 본 발명의 특수한 상황, 물질, 물질의 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들, 목적, 취지 및 영역을 조정하기 위해 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본원에 첨부된 특허청구범위의 영역 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (40)

1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포를 포함하는 세포 배양물을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
인간 간세포 암종 (hHCC) 세포주를 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양하는 것을 포함하며,
여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로 상기 hHCC 세포주의 분화를 유도하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 배양 배지는 1% 내지 20%의 인간 혈청을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 배양 배지는 2% 내지 10%의 인간 혈청을 포함하는, 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 hHCC 세포주는 HuH-7 또는 HuH-7-유도된 세포주인, 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 10일의 배양 후 계대배양(subculturing)이 없는, 방법.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 세포를 포함하는, 세포 배양물.
인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포; 및 인간 혈청을 포함하는 배양 배지를 포함하는 세포 배양물로서, 여기서 상기 세포는 hHCC 세포주의 분화된 자손(progeny)인, 세포 배양물.
인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포 상에서 후보 제제(candidate agent)의 효과를 평가하는 방법으로서, 상기 방법은:
청구항 7의 상기 세포 배양물을 후보 제제와 접촉시키는 것; 및
인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 상기 세포의 표현형에 있어서 상기 후보 제제의 효과의 존재 또는 부재에 대해 검정하는 것을 포함하는, 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 검정은 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 상기 세포에 의해 지질 대사 상에서 상기 후보 제제의 효과를 위한, 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 검정은 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 상기 세포에 의한 초 저밀도 리포단백질(VLDL), 저밀도 리포단백질(LDL), 또는 고밀도 리포단백질(HDL) 분비 상에서의 상기 후보 제제의 효과를 위한, 방법.
인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포에 의한 제제의 대사를 평가하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
청구항 7의 상기 세포 배양물을 제제와 접촉시키는 것; 및
상기 제제의 대사체 또는 상기 제제의 존재 또는 부재에 대해 검정하는 것을 포함하는, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 제제는 약물인, 방법.
인간 1차 간세포의 표현형을 갖는 세포에 의한 제제의 독성을 평가하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
청구항 7의 상기 세포 배양물을 제제와 접촉시키는 것; 및
상기 세포에 대한 상기 제제의 독성을 나타내는 상기 세포의 표현형에서의 변화의 존재 또는 부재에 대해 검정하는 것을 포함하는, 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 표현형은 배양 배지 내에 트랜스아미나제의 증가인, 방법.
청구항 13에 있어서, 상기 표현형은 세포 사멸의 마커의 증가인, 방법.
바이러스 입자를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
인간 간세포 암종 (hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양하는 것;
간친화성 바이러스의 게놈을 상기 hHCC 세포주 또는 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 상기 세포 중 적어도 하나에 도입하는 것; 및
상기 세포 배양물을 바이러스 입자의 생성에 적합한 조건하에서 유지시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로 상기 hHCC 세포주의 분화를 유도하는, 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 도입은 감염성 바이러스 입자를 상기 배양 배지에 부가하는 것에 의한, 방법.
청구항 17에 있어서, 상기 감염성 바이러스 입자는 상기 배양의 1일째에 부가되는, 방법.
청구항 16 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 게놈은 상기 배양 전에 상기 hHCC 세포주 내로 도입되는, 방법.
청구항 16 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입은 상기 간친화성 바이러스의 감염에 의한 것이고, 상기 세포 배양물은 리포단백질-고갈된 혈청을 포함하는, 방법.
청구항 16 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 배양 배지로부터 바이러스 입자를 단리하는 것을 포함하는, 방법.
다음을 포함하는 방법에 의하여 생성된 세포를 포함하는 바이러스적으로 감염된 세포 배양물로서, 상기 방법은:
인간 간세포 암종 (hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양하는 것; 및
간친화성 바이러스의 게놈을 상기 hHCC 세포주 또는 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 상기 세포 중 적어도 하나 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 hHCC 세포주의 분화를 유도하는, 방법.
항바이러스 활성에 대하여 후보 제제를 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
인간 간세포 암종 (hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양하는 것;
간친화성 바이러스의 게놈을 상기 hHCC 세포주 또는 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 상기 세포 중 적어도 하나에 도입하는 것;
상기 세포 배양물을 후보 항바이러스제와 접촉시키는 것;
상기 세포 배양물을 바이러스 복제에 적합한 조건 하에 유지시키는 것; 및
바이러스 복제 시 상기 후보 제제의 효과의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며,
여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 상기 hHCC 세포주의 분화를 유도하며, 상기 후보 제제의 부재와 비교하여 상기 후보 제제의 존재하에서 바이러스 입자의 생성에 있어서의 감소는, 상기 후보 제제가 항바이러스 활성을 가짐을 나타내는, 방법.
청구항 23에 있어서, 상기 도입은 감염성 바이러스 입자를 상기 배양 배지에 부가하는 것에 의한, 방법.
청구항 24에 있어서, 상기 감염성 바이러스 입자는 상기 배양의 1일째에 부가되는, 방법.
청구항 25에 있어서, 상기 바이러스 게놈은 상기 배양 전에 상기 hHCC 세포주 내로 도입되는 방법.
항바이러스 활성에 대해 항체를 함유하는 것으로 추정되는 표본을 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
인간 간세포 암종 (hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 11일 초과 동안 배양하는 것;
간친화성 바이러스의 게놈을 상기 hHCC 세포주 또는 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 상기 세포 중 적어도 하나에 도입하는 것;
상기 세포 배양물을 항체를 함유하는 것으로 추정되는 표본과 접촉시키는 것;
상기 세포 배양물을 바이러스 복제에 적합한 조건 하에 유지시키는 것; 및
바이러스 복제 시 상기 표본의 효과의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며,
여기서 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 상기 hHCC 세포주의 분화를 유도하며, 상기 표본의 부재와 비교하여 상기 표본의 존재하에서 바이러스 입자 생성에 있어서의 감소는, 상기 표본이 항바이러스 활성을 갖는 항체를 함유함을 나타내는, 방법.
청구항 27에 있어서, 상기 도입은 감염성 바이러스 입자를 상기 배양 배지에 부가하는 것에 의한, 방법.
청구항 28에 있어서, 상기 감염성 바이러스 입자는 상기 배양의 1일째에 부가되는, 방법.
청구항 27에 있어서, 상기 바이러스 게놈은 상기 배양 전에 상기 hHCC 세포주 내로 도입되는, 방법.
리포단백질 매개된 질병의 치료를 위해 후보 제제를 스크리닝하기 위한 방법으로서, 상기 방법은:
인간 간세포 암종 (hHCC) 세포주를 포함하는 세포 배양물을 인간 혈청을 포함하는 배양 배지 내에 적어도 11일 동안 배양하는 것;
상기 세포 배양물을 상기 후보 제제와 접촉시키는 것; 및
분화된 hHCC 세포주에 의해 분비된 리포단백질의 수준에 있어서 상기 후보 제제의 효과의 존재 또는 부재에 대해 상기 세포 배양물을 대조군 표본과 비교하여 검정하는 것을 포함하며;
여기서, 상기 배양은 1차 인간 간세포 표현형을 갖는 세포로의 상기 hHCC 세포주의 분화를 유도하며, 상기 분화된 hHCC 세포주에 의해 분비된 리포단백질의 수준에 있어서 상기 후보 제제의 효과는, 상기 후보 제제가 상기 리포단백질 매개된 질병의 치료를 위해 사용될 수 있음을 나타내는, 방법.
청구항 31에 있어서, 상기 세포 배양물은 대조군 표본과 비교하여 상기 배양 배지 속에서 초 저밀도 리포단백질(VLDL), 저밀도 리포단백질(LDL), 또는 고밀도 리포단백질(HDL)의 수준에 있어서 상기 후보 제제의 효과의 존재 또는 부재에 대해 검정되는 방법.
청구항 31에 있어서, 상기 방법은 죽상경화증 치료용 후보 제제에 대해 스크리닝하기 위한 것이며, 여기서 VLDL 또는 LDL에 있어서의 감소 또는 HDL에 있어서의 증가는, 상기 후보 제제가 죽상경화증의 치료를 위하여 사용될 수 있다는 것을 나타내는, 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
KR1020157008282A 2012-08-31 2013-08-30 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물 KR102089477B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261696059P 2012-08-31 2012-08-31
US61/696,059 2012-08-31
US201361761588P 2013-02-06 2013-02-06
US61/761,588 2013-02-06
PCT/IB2013/002501 WO2014033546A2 (en) 2012-08-31 2013-08-30 Methods for producing cells having a phenotype of a primary human hepatocytes and compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150048868A KR20150048868A (ko) 2015-05-07
KR102089477B1 true KR102089477B1 (ko) 2020-03-17

Family

ID=50184510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157008282A KR102089477B1 (ko) 2012-08-31 2013-08-30 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9969979B2 (ko)
EP (1) EP2890779B1 (ko)
JP (1) JP6427100B2 (ko)
KR (1) KR102089477B1 (ko)
CN (1) CN104755606B (ko)
AU (1) AU2013308113B2 (ko)
CA (1) CA2883146C (ko)
DK (1) DK2890779T3 (ko)
ES (1) ES2651414T3 (ko)
HK (1) HK1207884A1 (ko)
IL (1) IL237435B (ko)
SG (1) SG11201501505WA (ko)
WO (1) WO2014033546A2 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112016024296B1 (pt) 2014-04-18 2023-10-10 Novartis Ag Métodos para produzir proteínas recombinantes ou partículas virais, proteína de influenza ou cepa de influenza b e métodos para produzir vacina de influenza
EP3289074B1 (en) * 2015-04-28 2023-10-04 Université de Strasbourg Clinical gene signature-based human cell culture model and uses thereof
JP6869543B2 (ja) * 2015-12-22 2021-05-12 公立大学法人横浜市立大学 ウイルス感染モデル、その作製方法及びその利用
JP7039045B2 (ja) * 2019-08-26 2022-03-22 株式会社フェニックスバイオ ヒト脂肪肝モデル細胞

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010028999A2 (en) * 2008-09-12 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Production of infectious hepatitis c virus particles in cell culture

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698390A (en) 1987-11-18 1997-12-16 Chiron Corporation Hepatitis C immunoassays
US6146873A (en) 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
WO1996015231A2 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Immuno Aktiengesellschaft Method for producing biologicals in protein-free culture
AU1822195A (en) 1995-02-10 1996-08-27 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Process to "in vitro" propagate the hepatitis c virus (hcv) in non lymphoblastoid animal cell cultures and products thereof
US5798250A (en) 1996-04-15 1998-08-25 Icn Pharmaceuticals, Inc. Facilitating hepatitus virus infection in cell culture using a membrane stressor
US6458585B1 (en) 1996-08-14 2002-10-01 Nexell Therapeutics Inc. Cytokine-free culture of dendritic cells
AU4052197A (en) 1996-08-14 1998-03-06 Nexell Therapeutics Inc. Cytokine-free culture of dendritic cells
CA2269097C (en) 1996-11-08 2007-01-09 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthesis and purification of hepatitis c virus-like particles
US6627426B2 (en) 1997-02-14 2003-09-30 Invitrogen Corporation Methods for reducing adventitious agents and toxins and cell culture reagents produced thereby
EP0972828A1 (en) 1998-06-24 2000-01-19 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Process for the in vitro replication of HCV
US20040229336A1 (en) 1999-07-30 2004-11-18 Bio Merieux Method for in vitro culture of viruses of the togaviridae and flaviviridae families and uses
ES2328466T3 (es) * 2001-03-27 2009-11-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Composiciones y metodos utiles para la infeccion por hcv.
JP4711381B2 (ja) 2001-07-06 2011-06-29 アーンスティテュ ナシオナール ド ラ サント エ ド ラ ルシェルシェ メディカル（イー．エンヌ．エス．ウー．エール．エンム．） 新規なヒト肝臓癌細胞株、この細胞を取得する方法およびその使用
AU2002324307A1 (en) 2001-07-31 2003-02-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of sensitizing hepatocyte cell cultures to hepatitis infection, beads coated with hbv or hcv polypeptides and methods of using such beads to model viral infection or deliver substances into hepatocytes
AU2003217700A1 (en) 2002-02-26 2003-09-09 Stelsys Llc Hepatocyte bioreactor system for long term culture of functional hepatocyte spheroids
JP2006506074A (ja) 2002-11-13 2006-02-23 ワシントン ユニヴァーシティー Ｃ型肝炎ウイルスの複製に対して高許容性である細胞系
DK2423216T3 (en) 2003-12-01 2015-07-20 Univ Texas Replication-competent hepatitis C virus and methods of using
US20080286752A1 (en) 2005-04-08 2008-11-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for the production of HCV, assaying HCV entry, and screening drugs and cellular receptors for HCV
WO2007046962A2 (en) * 2005-09-02 2007-04-26 The University Of Maryland, Baltimore Cell lines harboring hepatitis virus and methods for using thereof
US7759087B1 (en) 2005-09-28 2010-07-20 The Florida State University Research Foundation, Inc. Method of indefinite culture of hepatitis C virus
WO2009025759A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. Tight junction proteins associated with infection and entry of hepatitis c virus (hcv), methods and uses thereof
US8921108B2 (en) 2009-04-21 2014-12-30 Academisch Ziekenhuis Bij De Universiteit Van Amsterdam Differentiated human liver cell cultures and their use in bioartificial liver systems
ES2360782B1 (es) 2009-07-28 2012-03-12 Grifols, S.A. Medios para cultivo de células de mamíferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de Cohn y uso de los mismos.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010028999A2 (en) * 2008-09-12 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Production of infectious hepatitis c virus particles in cell culture

Also Published As

Publication number Publication date
US20150184124A1 (en) 2015-07-02
US9969979B2 (en) 2018-05-15
SG11201501505WA (en) 2015-03-30
ES2651414T3 (es) 2018-01-26
IL237435A0 (en) 2015-04-30
CA2883146C (en) 2022-05-17
JP6427100B2 (ja) 2018-11-21
CN104755606B (zh) 2019-04-12
HK1207884A1 (en) 2016-02-12
JP2015528291A (ja) 2015-09-28
WO2014033546A3 (en) 2014-04-17
DK2890779T3 (da) 2017-11-27
AU2013308113B2 (en) 2019-01-17
EP2890779A2 (en) 2015-07-08
AU2013308113A1 (en) 2015-03-19
IL237435B (en) 2019-11-28
CA2883146A1 (en) 2014-03-06
KR20150048868A (ko) 2015-05-07
CN104755606A (zh) 2015-07-01
EP2890779B1 (en) 2017-10-04
WO2014033546A2 (en) 2014-03-06
EP2890779A4 (en) 2016-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Podevin et al. Production of infectious hepatitis C virus in primary cultures of human adult hepatocytes
Sakurai et al. Human induced-pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cells as an in vitro model of human hepatitis B virus infection
Hassan et al. Hepatitis C virus core protein triggers hepatic angiogenesis by a mechanism including multiple pathways
Lázaro et al. Hepatitis C virus replication in transfected and serum-infected cultured human fetal hepatocytes
CA2603711C (en) Infectious, chimeric hepatitis c virus, methods of producing the same and methods of use thereof
Andrus et al. Expression of paramyxovirus V proteins promotes replication and spread of hepatitis C virus in cultures of primary human fetal liver cells
Steenbergen et al. Human serum leads to differentiation of human hepatoma cells, restoration of very‐low‐density lipoprotein secretion, and a 1000‐fold increase in HCV Japanese fulminant hepatitis type 1 titers
US20080131404A1 (en) Hepatocytes
KR102089477B1 (ko) 1차 인간 간세포의 표현형을 갖는 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물
Yuan et al. A chimeric humanized mouse model by engrafting the human induced pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like cell for the chronic hepatitis B virus infection
Rao et al. 3D human liver organoids: An in vitro platform to investigate HBV infection, replication and liver tumorigenesis
Xu et al. Advances in HBV infection and replication systems in vitro
JP2006254896A (ja) ヒト肝細胞様細胞およびその利用
Nitahara-Kasahara et al. Cellular vimentin content regulates the protein level of hepatitis C virus core protein and the hepatitis C virus production in cultured cells
JP2009153383A (ja) 成熟肝細胞様細胞の製造方法
Tang et al. Responses of nontransformed human hepatocytes to conditional expression of full-length hepatitis C virus open reading frame
Guo et al. Efficient replication of blood‐borne hepatitis C virus in human fetal liver stem cells
JP2018501820A (ja) 血清由来ｃ型肝炎ウイルスを増殖させるためのヒト脂肪由来幹細胞の使用およびその用途
EP2319916B1 (en) Cell capable of replicating novel hcv replicon, cell capable of replicating full-length hcv rna, and use of those cells
Rajalakshmy et al. Mebiolgel, a thermoreversible polymer as a scaffold for three dimensional culture of Huh7 cell line with improved hepatocyte differentiation marker expression and HCV replication
Kang et al. Cell culture-adaptive mutations in the NS5B gene of hepatitis C virus with delayed replication and reduced cytotoxicity
Li et al. Acute hepatic failure-derived bone marrow mesenchymal stem cells express hepatic progenitor cell genes
KR101122244B1 (ko) 효율적으로 복제할 수 있는 변이 c형 간염 바이러스, 리포터 유전자를 포함하는 변이 c형 간염 바이러스, 상기 변이 c형 간염 바이러스를 이용한 c형 간염 바이러스 백신 제조방법 및 상기 변이 c형 간염 바이러스를 이용한 항c형 간염 바이러스 조성물의 스크리닝 방법
EP2927685A1 (en) Suitable hepatocytes for in-vitro hepatitis tests
JP2006500918A (ja) ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＨＣＶウイルスの培養方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant