JP2015528291A - 初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞を産生する方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年8月31日出願の米国特許仮出願第61/696,059号および2013年2月6日出願の米国特許仮出願第61/761,588号の優先権の利益を主張し、それぞれの出願は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
C型肝炎ウイルス(HCV)は、急性および慢性肝炎を引き起こす、フラビウイルス科の小型でエンベロープを有するプラス鎖RNAウイルスである。罹患した個体に硬変症、肝細胞癌および脂肪症を引き起こし得る。9.6kbゲノムのHCVは、同時翻訳で、および翻訳後に切断される約3,000アミノ酸ポリタンパク質をコードする、単一のオープンリーディングフレームから構成される。幾つかの研究は、HCV感染を支持するヒト因子を報告している(Li et al.(2009)Proc Natl Acad Sci USA 106:16410−16415;Reiss et al.(2011)Cell Host Microbe 9:32−45)。これらの因子の相当数が、小胞組織化、または膜および脂質関連遺伝子において役割を果たす。一方、HCVタンパク質も、例えば、膜状網の形成、先天性免疫経路の調節、および脂質合成経路の誘発により、感染した細胞において転写変化を誘発することが知られている(Blais et al.(2010)J Proteome Res 9:912−923;Blais et al.(2010)J Biol Chem 285:25602−25612;Joyce et al.(2009)PLoS pathogens 5:e1000291;Singaravelu et al.(2010)Proteome Sci 8:5;Walters et al.(2006)Virology Journal 3:37;Walters et al.(2006)PLoS pathogens 2:e59)。
定義
インビトロ肝細胞の培養の方法および組成物
初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞を産生する本開示の方法による使用に適した細胞には、ヒト肝細胞癌(hHCC)細胞系が含まれる。「hHCC細胞系」(ヒト肝細胞腫細胞系とも呼ばれる)は、不死化細胞系およびその後代を意味し、不死化細胞系は、ヒト肝細胞起源のもの(例えば、天然に生じる癌性ヒト肝臓細胞、例えば肝細胞癌または肝芽腫を培養して得られる細胞系)である。hHCC細胞系には、HuH−7細胞(JCRB0403)、HuH−7から誘導された細胞系(「HuH−7誘導細胞」、例えばHuh7.5、ATCC PTA−8561、米国特許第7,455,969号)、HuH−6(JCRB0401)HepG2(ATCC番号HB−8065)、HepG2誘導細胞(例えば、C3A(ATCC番号CRL−10741)、およびHepaRG(商標)細胞(Life Technologes,Grand Island,NY,USAから入手可能)が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。「誘導細胞」とは、所望の表現型(例えば、親細胞と比べて、ウイルス(例えば、組織培養適応ウイルス(例えばHCV))のウイルス複製の改善された支持)の選択により単離された参照親細胞の下位個体群(または「亜系」)である細胞を意味する。一例において、hHCC細胞は、HuH−7細胞またはHuH−7誘導細胞(例えば、Huh7.5)である。
ウイルス感染hHCC細胞を含むhHCC細胞の維持および繁殖のための培養培地は、非ヒト血清、例えば、子ウシ血清(FCS)とも呼ばれる胎児ウシ血清(FBS)、または合成血清(例えばNu−Serum(登録商標))を含有する任意の適切な培養培地である。一般に、hHCC細胞系の維持および繁殖のための培養培地は、細胞系に適合するように選択され得る。
一般に、本開示の培養方法は、hHCC細胞系を、初代ヒト肝細胞の表現型を有する細胞へのhHCCの分化の誘発をもたらすのに十分な条件下で、ヒト血清を含む培養培地に培養することを伴う。図1は、本開示の培養方法の例を提供する。
本開示は、初代ヒト肝細胞の表現型を有する分化hHCC細胞を含む細胞個体群を提供する。簡潔さのため、hHCC細胞から分化した、およびヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞は、また、本明細書において「分化hHCC細胞」と呼ばれ得る。「初代ヒト肝細胞の表現型」とは、初代ヒト肝細胞に特徴的な表現型マーカー(例えば、バイオマーカー、細胞の生理学的特徴、および形態的特徴)を発現するか、に従って特徴決定される細胞を意味する。表現型マーカーの外観および数(例えば、下記に記載されるようなバイオマーカー、および/または形態的特徴、および/または生理学的特徴の2つ以上、または3つ以上、または4つ以上、または全て)は、初代ヒト肝細胞の表現型を有する完全分化hHCCへのhHCC細胞の分化の段階によって決まる。
本開示は、向肝性微生物(例えば、向肝性ウイルス、向肝性寄生虫(例えば、マラリア)など)による培養細胞の感染に使用される方法および組成物も提供する。一般に、方法は、培養細胞を、LDLおよびVLDLを含むLDL受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清を含有する培養培地の存在下で、向肝性微生物に曝露して、向肝性ウイルス、例えばA、B、C、D、またはE型肝炎ウイルス(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV)など、サイトメガロウイルス(CMV)のような向肝性微生物による、培養細胞の感染を促進することを伴う。向肝性微生物が肝炎ウイルスである場合、ウイルスは、任意の遺伝子型(例えば、HCV遺伝子型1(例えば、遺伝子型1a、1b、1c)、2、3、4、5、6、および7)であり得、天然に生じるウイルス(例えば、感染した霊長類から得たウイルス、例えば、感染したヒトから得た臨床分離株)、組織培養適応ウイルス、遺伝子修飾ウイルス、キメラウイルス、または偽型ウイルスであり得る。
本開示の方法および組成物を、ウイルス粒子の産生(例えば、ウイルスワクチン生産)、肝細胞機能の研究、およびスクリーニング方法のなどであるが、これらに限定されない様々な方法に使用することができる。使用の例は、下記により詳細に記載される。
本開示の方法および組成物を、ウイルス粒子、とくに肝炎ウイルス、例えばA、B、C、D、またはE型肝炎ウイルス(HAV,HBV、HCV、HDV、HEV)など、サイトメガロウイルス(CMV)のような向肝性ウイルスのウイルス粒子の産生に使用することができる。ウイルスは、任意の遺伝子型(例えば、HCV遺伝子型1(例えば、遺伝子型1a、1b、1c)、2、3、4、5、6、および7)であり得、天然に生じるウイルス(例えば、感染した霊長類から得たウイルス、例えば、感染したヒトから得た臨床分離株)、組織培養適応ウイルス、遺伝子修飾ウイルス、または偽型ウイルスであり得る。
本開示の分化hHCCは、様々なアッセイにおける使用が見出される。例えば、分化hHCCは、ヒト肝細胞のモデルとして、したがって肝臓機能および疾患(例えば、発癌、脂肪症(脂肪肝疾患))のモデルとして役立ち得る。他の使用には、リポタンパク質代謝および分泌、ならびに生物学的中間体と生体異物化合物(例えば、チトクロームP450による酸化)の両方についての代謝研究が含まれる。
本開示のキットは、hHCC細胞、ヒト初代肝細胞の表現型を有する分化hHCC細胞、またはその両方を含むことができる。キットは、任意に、培養培地構成成分、例えば培養培地(例えば、血清を有さない、またはヒト血清を含有する)、培養に使用されるヒト血清など)を含む。例えば、キットは、ヒト血清を有する、または有さない初代肝細胞培地(例えば、下記に実施例に詳細が記載されている)を含むことができる。キットの様々な構成成分は、別々の容器に存在し得る、またはある特定の適合性構成成分を、望ましい場合、単一の容器内で予め組み合わせることができる。
実施例
以下の方法および材料が下記の実施例に使用される。
図1は、分化細胞をもたらすためにヒト血清(HS)における細胞の培養に使用されるステップの例を示す流れ図を提供する。FBS含有培養培地に予め維持されているHuh7.5細胞を、トリプシン処理して、単層の解離を促進した。トリプシンを、DMEM/10%FBSにより不活性化した。次に細胞を300gにより遠心分離し、細胞ペレットをDMEM/2%HS/ペニシリン/ストレプトマイシンに再懸濁し、30〜50%の密度で平板培養した。培養密度で(典型的には、接種の2日後に)、細胞を再度トリプシン処理し、次に50%の密度で平板培養した。この時点から、細胞を、更に分割させることなく培養して、未分裂細胞の培養密度層の形成を可能にした。任意には、ヒト血清において培養された細胞をおよそ1週間まで分裂させることができるが、これらが1:2を越えて分裂しないことが条件である。しかし、ヒト血清における10日間の培養後の反復トリプシン処理は、80〜90%あるいはそれ以上の細胞死を伴う、細胞培養物の生存力の損失をもたらした。
HS含有培地における細胞の培養の効果を更に評価するため、およびこれらの細胞が分化を受けて初代肝細胞様細胞になるかを評価するため、肝細胞分化マーカーの発現レベルを、Huh7.5細胞の、HS補充培地への移行後の7日および21日目にアッセイした。7日後では、肝細胞マーカーにおいて僅かな変化しか観察されなかった。(図3A)しかし、21日後では、肝臓分化マーカーのアルブミンおよびアルファ1−抗トリプシンの発現は、FBSと比較して、ヒト血清において増殖した細胞においておよそ4倍に増加した。これらのタンパク質の発現レベルは、培養物中のヒト初代肝細胞の発現レベルと類似している。初代肝細胞培地(PHM)におけるHuh7.5細胞の培養は、アルブミンおよびアルファ1−抗トリプシンの発現に対して、有意な追加的な効果を有さなかった。LDL受容体(LDL−R)の変化は、HSにおいて増殖された細胞では有意ではなかったが、Huh7.5細胞が初代肝細胞培地(PHM)において増殖されたとき、LDL−R発現は、増加した。
ヒト血清におけるHuH−7またはHuH−7誘導細胞の培養の効果を比較するため、他の培養条件を検査した。
HSと比べた、FBSにおけるHuh7.5細胞の培養後の細胞脂肪滴の外観を検査した。図5Aおよび5Bに示されているように、脂質を示すBodipy蛍光は、FBSと比較して、HSに培養された細胞においてはるかに強力であった。ImageJソフトウエアを使用して定量化したとき、Bodipy蛍光強度は、FBSに培養した細胞より、HS中の細胞培養物においておよそ4倍高かった(図5B)。
JFH−1をFBS培養細胞の中に電気穿孔した。次に、電気穿孔された細胞をFBSに維持した、または実施例1に従って、電気穿孔の直後にHG含有培地に移動した。電気穿孔後の4〜6日目に、ウイルスを、培養上澄みの回収により採取した。
JFH−HSおよびJFH−FBSの両方によるインビボ感染性を、キメラSCID/Alb−uPAマウスモデルにおいて試験した。電気穿孔後に収集したJFH−HS株を使用して、新たな細胞を感染させ、これらの感染細胞の上澄みを使用して、マウスを感染させた。FBSにおいて産生された同じウイルスとの直接的な比較は、ウイルス力価が検出可能な感染を予想するには低すぎたので、可能ではなかった。したがって、組織培養適応JFH変種(HCVcc)を、比較の目的のためだけに同じ力価で使用した。
ウイルスの生物物理学的特徴が、FBSと比べて、HSにおける培養により影響をうけたかを評価するため、ウイルス密度およびウイルスのアポリポタンパク質Bの会合を評価した。
ウイルス産生に対するリポタンパク質の効果を検査するため、アポリポタンパク質B含有リポタンパク質(VLDLおよびLDL)を欠乏しているヒト血清を、調製した。低(LDL)リポタンパク質および超低密度(VLDL)リポタンパク質枯渇HSは、製造会社(HiTRAP Heparin HP,GE Healthcare)により提供された使用説明書に従ってヘパリンカラムにより血清を処理することによって、製造した。ヘパリンは、アポリポタンパク質B含有リポタンパク質のVLDLおよびLDLに、高い親和性で結合し、一方、HDLはヘパリンと結合しない。したがって、得られた血清は、VLDLおよびLDLのみを枯渇している。簡潔には、結合緩衝液による平衡の後、血清をカラムに適用して、アポリポタンパク質B含有リポタンパク質を結合させた。アポリポタンパク質B枯渇画分を収集し、フィルターを滅菌し、−20℃で保存した。
ヒト血清において培養されたHuh7.5細胞を、HCV遺伝子型1aを感染したHCV患者の血清により、感染に対する感受性について試験した。感染の成功は、約105RNAコピー/mlまでのウイルス力価によって達成された。(図10)対照的に、FBS含有培地において培養され、かつ同じ血清を感染させたHuh7.5細胞は、RT−PCRによりアッセイして、検出可能なウイルスを産生しなかった。
VLDL分泌のような肝細胞特異的機能は、FBS補充血清において増殖されたhHCCに不在である。VLDL分泌は、ヒト血清に培養されたhHCCにおいて生じ、FBS補充血清に培養されたHuh7.5細胞を、実施例1に記載されたヒト血清(HS)が補充された培地に交換し、トリアシルグリセリド(図11)およびコレステロール(図12)に基づいたリポタンパク質プロファイルを、サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィーの使用により、様々な時点で培養細胞の培地から得た。
B型肝炎ウイルス(HBV)による感染に対するhHCC細胞の感受性を検査した。推定HBV侵入受容体である、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(NTCP、SLC10A1)の発現レベルもモニターした。
タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(NTCP)は、ヒト細胞におけるHBVの侵入受容体であることが報告されている(Yan et al.(2012)eLife 1:e00049)。mRNAレベルでのNTCPの発現を、異なる長さの期間(0〜35日間)で上記に記載されたようにHSに培養されたHuH7.5細胞において評価した。FBSに培養され、同じ継代数で単離されたHuh7.5細胞は、対照として機能した。それぞれの培養期間の終了時、細胞溶解産物は、製造会社の使用説明書に従ってTRIZOL(登録商標)(Invitrogen)によって調製した。NTCPの相対mRNAレベルを、定量的PCRの使用によりHPRTと比較して決定した。
リポタンパク質を、ヘパリンカラムから(製造会社の使用説明書に従って、HiTrap Heparin column,GE Healthcare)血清を溶出することにより血清から除去した。ヘパリンは、アポリポタンパク質B(ApoB)と高い親和性で結合する。血清(FBSまたはHS)をカラムに適用し、通過したものを収集した。通過した画分は、LDLおよびVLDLのようなApoB含有リポタンパク質を本質的に含まない。
ヒト血清において産生されたウイルスは、ヒトアポリポタンパク質B(ApoB)と会合する。この特性を利用し、ヘパリンへのApoBの高結合親和性を使用して、HCV感染患者の血清からウイルスを精製した。HS培養細胞により産生されたウイルスを、Centrimate 500S接線流装置の300kDaフィルターを使用して60mlに濃縮した。これを、HiTrapヘパリンカラムに装填した(画分1〜10を通過させた[ウイルスコアタンパク質ELISAにより検出されたように、HCVは存在しなかった])。カラムを、120mlの洗浄緩衝液(0.1M NaCl 20mM NaPO4の緩衝液 ph7.4−標準的な技術で作製)により洗浄した(画分11〜17)。次にカラムを、0.2M NaCl、20mM NaPO4の緩衝液 ph7.4(画分18〜27)、0.4M NaCl、20mM NaPO4の緩衝液 ph7.4(画分28〜34)、最後に1M NaCl、20mM NaPO4の緩衝液 ph7.4(画分35〜38)により溶出させた。HCVコアタンパク質を、ELISの使用によりそれぞれの画分において定量化した。図16に示されているように、2つのピークが存在した(集めた画分28〜30および35〜37)。
HCVの臨床分離株による感染に対するHS培養Huh7.5細胞の感受性を試験した。感染プロトコールを、リポタンパク質会合HCVの侵入を促進するために開発し、リポタンパク質を分泌する細胞を使用することは、HCVの臨床分離株による感染の成功をもたらす可能性がある。
上記に記載されたように、標準的な胎児ウシ血清(FBS)含有培地の代わりに、ヒト血清(HS)含有培地においてヒト肝細胞癌(hHCC)細胞(例えば、HuH−7またはHuh7.5細胞)を培養することは、これらの細胞が分化することを誘発する。上記に更に示されたように、ヒト血清においてhHCC細胞を培養することは、アルブミンおよびVLDLの分泌を回復し、これらの細胞がより肝細胞様になることを示している。ここで、分化細胞を試験して、これらの細胞が薬剤代謝に関して初代ヒト肝細胞のモデルとして機能し得るかを評価した。
Claims (40)
- 初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞を含む細胞培養物を産生する方法であって、
ヒト肝細胞癌(hHCC)細胞系を、ヒト血清を含む培養培地において11日間を越えて培養することを含み、
前記培養することが、前記hHCC細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発する、方法。 - 前記培養培地が、約1%〜20%のヒト血清を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記培養培地が、約2%〜10%のヒト血清を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記hHCC細胞系が、HuH−7またはHuH−7誘導細胞系である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養することが、ヒト血清を含む前記培養培地における10日間の培養の後の継代培養を伴わない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法により産生される細胞を含む、細胞培養物。
- ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞であって、前記細胞がhHCC細胞系の分化後代である、細胞と、
ヒト血清を含む培養培地と、
を含む、細胞培養物。 - ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞に対する候補作用物質の効果を評価する方法であって、
請求項7に記載の細胞培養物を、候補作用物質と接触させることと、
ヒト初代肝細胞の表現型を有する前記細胞の表現型に対する前記候補作用物質の効果の不在の存在についてアッセイすることと、
を含む、方法。 - 前記アッセイすることが、初代ヒト肝細胞の表現型を有する前記細胞による脂質代謝に対する前記候補作用物質の効果についてである、請求項8に記載の方法。
- 前記アッセイすることが、初代ヒト肝細胞の表現型を有する前記細胞による超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、および/または高密度リポタンパク質(HDL)の分泌に対する前記候補作用物質の効果についてである、請求項8に記載の方法。
- ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞による作用物質の代謝を評価する方法であって、
請求項7に記載の細胞培養物を、作用物質と接触させることと、
前記作用物質の代謝産物および/または前記作用物質の不在の存在についてアッセイすることと、
を含む、方法。 - 前記作用物質が薬剤である、請求項11に記載の方法。
- ヒト初代肝細胞の表現型を有する細胞に対する作用物質の毒性を評価する方法であって、
請求項7に記載の細胞培養物を、作用物質と接触させることと、
前記細胞に対する前記作用物質の毒性を示す、前記細胞の表現型における変化の不在の存在についてアッセイすることと、
を含む、方法。 - 前記表現型が、培養培地におけるトランスアミナーゼの増加である、請求項13に記載の方法。
- 前記表現型が、細胞死のマーカーの増加である、請求項13に記載の方法。
- ウイルス粒子を産生する方法であって、
ヒト肝細胞癌(hHCC)細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において11日間を越えてインキュベートすることであって、
前記hHCC細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発する、インキュベートすることと、
向肝性ウイルスのゲノムを、前記hHCC細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する前記細胞のうちの少なくとも1つに導入することと、
前記細胞培養物を、ウイルス粒子の産生に適した条件下で維持することと、
を含む、方法。 - 前記導入することが、感染性ウイルス粒子を前記培養培地に添加することによる、請求項16に記載の方法。
- 前記感染性ウイルス粒子が、前記培養の1日目に添加される、請求項16に記載の方法。
- 前記ウイルスゲノムが、前記インキュベートする前に前記hHCC細胞系に導入される、請求項16〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記導入することが、前記向肝性ウイルスの感染によるものであり、前記細胞培養物が、リポタンパク質枯渇血清を含む、請求項16〜19のいずれかに記載の方法。
- 前記方法が、ウイルス粒子を前記培養培地から単離することを含む、請求項16〜19のいずれかに記載の方法。
- ヒト肝細胞癌(hHCC)細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において11日間を越えてインキュベートすることであって、前記培養することが、前記hHCC細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発し、
向肝性ウイルスのゲノムを、前記hHCC細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する前記細胞のうちの少なくとも1つに導入することと、
を含む方法により産生される細胞を含む、ウイルス感染細胞培養物。 - 候補作用物質を抗ウイルス活性についてスクリーンする方法であって、
ヒト肝細胞癌(hHCC)細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において11日間を越えてインキュベートすることであって、前記hHCC細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発する、インキュベートすることと、
向肝性ウイルスのゲノムを、前記hHCC細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する前記細胞のうちの少なくとも1つに導入することと、
前記細胞培養物を候補抗ウイルス剤と接触させることと、
前記細胞培養物を、ウイルス複製に適した条件下で維持することと、
ウイルス複製に対する前記候補作用物質の効果の存在または不在を検出することと、を含み、
前記候補作用物質の不在下と比較した、前記候補作用物質の存在下でのウイルス粒子産生の減少が、前記候補作用物質が抗ウイルス活性を有することを示す、方法。 - 前記導入することが、感染性ウイルス粒子を前記培養培地に添加することによる、請求項23に記載の方法。
- 前記感染性ウイルス粒子が、前記培養の1日目に添加される、請求項24に記載の方法。
- 前記ウイルスゲノムが、前記インキュベートの前に前記hHCC細胞系に導入される、請求項25に記載の方法。
- 抗体を含有することが疑われる試料を抗ウイルス活性についてスクリーンする方法であって、
ヒト肝細胞癌(hHCC)細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において11日間を越えてインキュベートすることであって、前記hHCC細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発する、インキュベートすることと、
向肝性ウイルスのゲノムを、前記hHCC細胞系、または初代ヒト肝細胞表現型を有する前記細胞のうちの少なくとも1つに導入することと、
前記細胞培養物を、抗体を含有することが疑われる試料と接触させることと、
前記細胞培養物を、ウイルス複製に適した条件下で維持することと、
ウイルス複製に対する前記試料の効果の存在または不在を検出することと、を含み、
前記試料の不在下と比較した、前記試料の存在下でのウイルス粒子産生の減少が、前記試料が、抗ウイルス活性を有する抗体を含有することを示す、方法。 - 前記導入することが、感染性ウイルス粒子を前記培養培地に添加することによる、請求項27に記載の方法。
- 前記感染性ウイルス粒子が、前記培養の1日目に添加される、請求項28に記載の方法。
- 前記ウイルスゲノムが、前記インキュベートの前に前記hHCC細胞系に導入される、請求項27に記載の方法。
- リポタンパク質仲介疾患の治療のために候補作用物質をスクリーンする方法であって、
ヒト肝細胞癌(hHCC)細胞系を含む細胞培養物を、ヒト血清を含む培養培地において少なくとも3日間インキュベートすることであって、前記hHCC細胞系の、初代ヒト肝細胞表現型を有する細胞への分化を誘発する、インキュベートすることと、
前記細胞培養物を、前記候補作用物質と接触させることと、
対照試料と比較した、前記分化hHCC細胞系により分泌されたリポタンパク質のレベルに対する前記候補作用物質の効果の存在または不在について前記細胞培養物をアッセイすることと、を含み、
前記分化hHCC細胞系により分泌されたリポタンパク質のレベルに対する前記候補作用物質の効果が、前記候補作用物質が前記リポタンパク質仲介疾患の前記治療に使用され得ることを示す、方法。 - 前記細胞培養物が、対照試料と比較した、前記培養培地における超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、および/または高密度リポタンパク質(HDL)のレベルに対する前記候補作用物質の効果の存在または不在についてアッセイされる、請求項31に記載の方法。
- 前記方法が、アテローム動脈硬化症の治療のために候補作用物質をスクリーンするためのものであり、VLDLもしくはLDLの減少、またはHDLの増加が、前記候補作用物質がアテローム動脈硬化症の前記治療に使用され得ることを示す、請求項31に記載の方法。
- 培養肝細胞に向肝性微生物を感染させる方法であって、
培養肝細胞を、LDL受容体結合リポタンパク質を枯渇している血清を含む培養培地において感染性向肝性微生物と接触させることを含み、
前記接触させることが、前記培養肝細胞の前記向肝性微生物による感染をもたらすのに十分な時間にわたるものである、方法。 - 前記培養細胞が、初代肝細胞または不死化肝細胞の細胞系である、請求項34に記載の方法。
- 前記培養細胞が分化hHCC細胞である、請求項34に記載の方法。
- LDL受容体結合リポタンパク質を枯渇している前記血清が、LDL受容体結合リポタンパク質を枯渇しているヒト血清、またはLDL受容体結合リポタンパク質を枯渇しているウシ胎児血清である、請求項34に記載の方法。
- 前記感染性向肝性微生物が向肝性ウイルスである、請求項34〜47のいずれかに記載の方法。
- 前記向肝性ウイルスが、C型肝炎ウイルスまたはB型肝炎ウイルスである、請求項38に記載の方法。
- 前記向肝性ウイルスが臨床分離株である、請求項38または39に記載の方法。
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