CN104755606A - 用于产生具有原代人肝细胞表型的细胞的方法和组合物 - Google Patents

用于产生具有原代人肝细胞表型的细胞的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本公开提供涉及表现出原代人肝细胞表型的人肝细胞细胞系的体外培养物的方法和组合物。这类细胞系易于被嗜肝病毒诸如HCV或HBV感染，并且支持病毒复制和高水平的病毒颗粒产生。这类体外培养物可用于嗜肝病毒的产生和研究，以及筛选(例如，抗病毒药物、评估药物代谢)方法、和原代人肝细胞的研究。

Description

用于产生具有原代人肝细胞表型的细胞的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年8月31日提交的美国临时申请序列号61/696,059和于2013年2月6日提交的美国临时申请序列号61/761,588的优先权权益，这两个申请各自以引用的方式整体并入本文。
引言
丙型肝炎病毒(HCV)是引起急性和慢性肝炎的黄病毒科家族的小型包膜的正链RNA病毒。它可在受感染的个体中引起肝硬化、肝细胞癌和脂肪变性。HCV的9.6kb基因组由单个开放阅读框组成，所述开放阅读框编码在翻译同时和之后裂解的约3000个氨基酸的多蛋白。若干研究已经报告了支持HCV感染的人为因素(Li等(2009)Proc Natl Acad Sci USA 106:16410-16415；Reiss等(2011)Cell HostMicrobe 9:32-45)。相当数量的这些因素在囊组织、或膜和脂质相关的基因中起作用。另一方面，还已知HCV蛋白例如通过膜性网络的形成、先天免疫途径的调节以及脂质合成途径的诱导来诱导受感染细胞中的转录变化(Blais等(2010)J Proteome Res 9:912-923；Blais等(2010)J Biol Chem 285:25602-25612；Joyce等(2009)PLoS pathogens 5:e1000291；Singaravelu等(2010)Proteome Sci 8:5；Walters等(2006)Virology Journal 3:37；Walters等(2006)PLoS pathogens 2:e59)。
次基因组全长复制子系统和JFH-1感染模型已经洞察HCV翻译和RNA复制、出入。这些模型中的大多数是基于HuH-7或HuH-7来源的细胞。HuH-7(或HuH-7来源的)细胞的使用对于HCV的体外研究来说具有许多益处。这些细胞是容易获得的、快速分裂的并且因此允许进行大规模实验。然而，这些系统并不一定准确表现在天然体内HCV感染期间发生的事件，因为肝细胞通常不分裂且是完全分化的。已尝试通过以下措施来规避这一问题：通过将1-2％二甲基亚砜(DMSO，一种极性质子惰性溶剂)添加到细胞培养基中实现细胞的生长停滞(Sainz等(2006)J Virol 80:10253-10257)，从而使得诱导肝细胞特异性基因的表达。
新鲜分离的原代人肝细胞在逻辑上是研究HCV感染性的更具带代表性的体外模型。然而，这些细胞中所产生的病毒的量很低(通常小于103个RNA拷贝/ml)，并且对于长期实验(多于几天)必须将这些细胞与其它细胞类型共同培养(Banaudha等(2010)Hepatology,51:1922-1932；Ploss等Proc.Natl.Acad.Sciences 2010第107卷第73141-3145期)。因此原代肝细胞不适合大规模病毒产生。
在HuH-7或HuH-7来源的细胞中已经实现大约106至107个RNA拷贝/ml(约1个病毒/细胞)的HCV病毒滴度。然而，这些病毒滴度通常太低以致于不能实现商业规模的病毒颗粒产生。另外，HuH7.5细胞中的感染仅利用非典型性HCV变体JFH-1才可能实现。
本领域需要可以用作原代人肝细胞体外模型的培养系统。
概述
本公开提供涉及表现出原代人肝细胞表型的人肝细胞细胞系的体外培养物的方法和组合物。这类细胞系易于被嗜肝病毒诸如HCV或HBV感染，并且支持病毒复制和高水平的病毒颗粒产生。这类体外培养物可用于嗜肝病毒的产生和研究，以及筛选(例如，抗病毒药物、评估药物代谢)方法、和原代人肝细胞的研究。
本公开提供产生包含具有原代人肝细胞表型的细胞的细胞培养物的方法，所述方法包括将人肝细胞癌(hHCC)细胞系在包含人血清的培养基中培养超过11天，其中所述培养诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞。在一些实施方案中，所述培养基包含约1％至20％的人血清，任选地约2％至10％的人血清。在一些实施方案中，所述hHCC细胞系为HuH-7或HuH-7来源的细胞系。在一些实施方案中，所述培养并未在于包含人血清的培养基中培养10天后进行传代培养。本公开进一步提供包含通过这类培养方法产生的细胞的细胞培养物。
本公开提供具有人原代肝细胞表型的细胞的细胞培养物，其中所述细胞是hHCC细胞系的分化子代；以及包含人血清的培养基。在一些实施方案中，细胞培养物已被连续地保持至少7天、至少8天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少有18天、至少19天、至少20天、或至少21天或更久。在一些实施方案中，所述培养基包含约1％至20％的人血清，任选地约2％至10％的人血清。在一些实施方案中，所述hHCC细胞系为HuH-7或HuH-7来源的细胞系。
本公开提供用于评估候选试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的影响的方法，所述方法包括使本公开的分化细胞培养物与候选试剂接触；以及测定所述候选试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的表型的影响的存在与否。在一些实施方案中，测定是针对所述候选试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的脂质代谢的影响。在其它实施方案中，测定是针对所述候选试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和/或高密度脂蛋白(HDL)分泌的影响。
本公开提供用于评估具有人原代肝细胞表型的细胞的试剂代谢的方法，所述方法包括使本公开的分化细胞培养物与试剂接触；以及测定所述试剂和/或所述试剂的代谢物的存在与否。在一些实施方案中，所述试剂是药物。
本公开提供用于评估试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的毒性的方法，所述方法包括使本公开的分化细胞培养物与试剂接触；以及测定指示所述试剂对细胞的毒性的细胞表型变化的存在与否。在一些实施方案中，所测定的表型是培养基中转氨酶的增加和/或细胞死亡标志物的测定。
本公开提供产生病毒颗粒的方法，所述方法包括将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育多于11天，其中所述孵育诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；将嗜肝病毒的基因组引入hHCC细胞系或具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；以及将细胞培养物保持在适合产生病毒颗粒的条件下。在一些实施方案中，所述病毒基因组是通过将感染性病毒颗粒添加到培养基中来引入的。在一些实施方案中，所述感染性病毒颗粒是在所述培养的第1天添加的。在一些实施方案中，所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到hHCC细胞系中。在这些方法的一些实施方案中，所述方法包括将病毒颗粒从培养基中分离。
本公开提供包含通过一种方法所产生的细胞的病毒感染的细胞培养物，所述方法包括将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育多于11天，其中所述培养诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；以及将嗜肝病毒的基因组引入hHCC细胞系或具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中。
本公开提供用于筛选候选试剂的抗病毒活性的方法，所述方法包括将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育多于11天，其中所述孵育诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；将嗜肝病毒基因组引入hHCC细胞系或具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；使细胞培养物与候选抗病毒试剂接触；将细胞培养物保持在适合病毒复制的条件下；以及检测候选试剂对病毒复制的影响存在与否；其中相较于不存在候选试剂时在存在候选试剂时病毒颗粒产生的降低表明候选试剂具有抗病毒活性。在一些实施方案中，所述病毒基因组是通过将感染性病毒颗粒添加到培养基中来引入的。在一些实施方案中，所述感染性病毒颗粒是在所述培养的第1天添加的。在一些实施方案中，所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到hHCC细胞系中。
本公开提供用于筛选疑似含有抗体的样品的抗病毒活性的方法，所述方法包括将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育多于11天，其中所述孵育诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；将嗜肝病毒的基因组引入hHCC细胞系或具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；使细胞培养物与疑似含有抗体的样品接触；将细胞培养物保持在适合病毒复制的条件下；以及检测样品对病毒复制的影响存在与否；其中相较于不存在样品时在存在样品时病毒颗粒产生的降低表明样品含有具有抗病毒活性的抗体。在一些实施方案中，所述病毒基因组是通过将感染性病毒颗粒添加到培养基中来引入的。在一些实施方案中，所述感染性病毒颗粒是在所述培养的第1天添加的。在一些实施方案中，所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到hHCC细胞系中。
本公开提供用于针对脂蛋白介导的疾病的治疗筛选候选试剂的方法，所述方法包括：将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育至少3天、至少5天以及在一些实施方案中孵育至少14天，其中所述孵育诱导hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；使细胞培养物与候选试剂接触；以及针对候选试剂相较于对照样品对分化的hHCC细胞系所分泌的脂蛋白的水平的影响的存在与否测定细胞培养物；其中候选试剂对分化的hHCC细胞系所分泌的脂蛋白的水平的影响表明候选试剂可用于治疗脂蛋白介导的疾病。在某些实施方案中，针对候选试剂相较于对照样品对培养基中极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和/或高密度脂蛋白(HDL)的水平的影响的存在与否测定细胞培养物。在具体实施方案中，所述方法是用于针对动脉粥样硬化的治疗筛选候选试剂，其中VLDL或LDL的降低或HDL的增加表明候选试剂可用于预防或治疗动脉粥样硬化。
本公开提供用于产生感染嗜肝微生物(例如，病毒)的培养肝细胞的方法，所述方法包括使培养肝细胞与感染性嗜肝微生物在包含耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清的培养基中接触，其中接触持续足以使培养肝细胞感染嗜肝微生物的时间。在一些实施方案中，所述培养细胞是原代肝细胞或永生化肝细胞细胞系。在一些实施方案中，培养细胞是分化的hHCC细胞。在一些实施方案中，耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清为耗尽LDL受体结合脂蛋白的人血清或耗尽LDL受体结合脂蛋白的胎牛血清。在一些实施方案中，感染性嗜肝微生物为嗜肝病毒。在一些实施方案中，嗜肝病毒为丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒。在一些实施方案中，嗜肝病毒为临床分离株。
在阅读了本说明书之后这些和其它特征将对于普通技术人员是明显的。
附图简述
图1是示出培养条件的时间线的实施例的流程图。
图2A-2B示出含胎牛血清(FBS)的培养基相对含人血清(HS)的培养基中的细胞的外观和生长的差异。图2A是示出相比培养的人原代肝细胞(右图)，在补充FBS(左图)和HS(中图)的培养基中生长的细胞的一组照片。图2B是示出保持在含FBS的培养基(闭合圆圈)相对含HS的培养基(空心圆圈)中的细胞培养物的细胞数目的图。
图3A是示出在保持在FBS或HS(7天或21天)中的细胞、以及保持在原代肝细胞培养基(PHM)中的HuH7.5细胞和培养的人原代肝细胞(prim,hep.)中的肝细胞分化标志物LDL受体、白蛋白和α1-抗胰蛋白酶的表达的一组图。还包括密蛋白-1(claudin-1)和紧蛋白(occludin)的表达，它们是在肝脏中高度表达的两种紧密连接蛋白
图3B是示出关键脂质代谢调节剂(肝X受体α(LXRα)、过氧化物酶体增殖物活化的受体α和γ(PPARα、PPARγ)，在HS中所培养的细胞中高度表达的一组图。在人血清中生长的细胞中，细胞骨架蛋白波形蛋白和E-钙粘蛋白也增加。
图4是示出相比FBS和培养的原代肝细胞(prim.hep.)，对在2％DMSO或2％成牛血清(ABS)存在下生长的细胞上的上述分化标志物的影响的图。ABS和DMSO都诱导接触抑制/生长停滞，但不会诱导分化标志物的表达增加
图5A是示出相比FBS在HS中培养的细胞(右图)中细胞脂质小滴增加的一组照片。
图5B是示出对保持在FBS或HS中的细胞的Bodipy荧光的定量的图(n>4)。
图6A-6E是示出用HCV菌株JFH-1(“JFH”)感染细胞的结果的一组图，其中细胞是在FBS或HS中培养。图6A：在用产自人血清或胎牛血清中培养的细胞的JFH病毒感染之后，FBS中培养的细胞的病毒滴度(JFH-HS，圆形；JFH-FBS，正方形)。图6B：用相同病毒(JFH-HS)感染的在不同条件(FBS，空心圆圈；HS，闭合圆圈)下生长的细胞的病毒滴度。图6C示出FBS培养的细胞中的JFH-FBS相比HS培养的细胞中的JFH-HS的产生之间的病毒滴度中的1000倍差异。图6D：在将细胞从含FBS的培养基中转移至含HS的培养基时感染(空心圆圈)或在从含FBS的培养基中转移至含HS的培养基之后14天感染(闭合圆圈)下的人血清中生长的细胞中的高病毒滴度的长期产生。图6E：示出在具有2％HS的原代肝细胞培养基(PHM，2％HS)或具有2％HS的DMEM(DMEM，2％HS)中生长的细胞的病毒滴度。
图7是示出用HCV感染的患者血清(圆形)、通过电穿孔HuH7.5细胞随后在含HS的培养基中培养而产生的JFH病毒(JFH-HS，正方形)或组织培养的病毒HCVcc(三角形)感染嵌合SCID/Alb-uPA小鼠模型的结果的图，
图8是示出含人血清培养物对HCV的影响的一组图。图A：如通过蔗糖梯度离心测定的产自于FBS(圆形)或人血清(正方形)中培养的细胞的病毒的病毒密度；图B：产自于FBS或人血清(HS)中培养的细胞的病毒的病毒密度分布的定量；以及图C：不同病毒变体的载脂蛋白B缔合。JFH FBS：产自于FBS中培养的细胞的JFH-1；JFH HS：产自于HS中培养的细胞的JFH-1；患者血清。
图9是示出向分化细胞添加含ApoB脂蛋白的影响的一组图。左图：向分化细胞添加人VLDL对病毒产生的影响；右图：向分化细胞添加人LDL对病毒产生的影响。
图10是示出用来自2位不同患者(患者1：圆形；患者2：正方形，两者都是基因型1A)的HCV阳性血清感染保持在人血清中的细胞的图。
图11：图A和B是示出人血液(A)和来自于人血清(HS)中培养不同时间长度的Huh7.5细胞的培养基(B)的基于三酰基甘油的脂蛋白概况的图。使用尺寸排阻快速蛋白质液相色谱法(FPLC)来进行脂蛋白分离。
图12是示出取自于人血清(HS)中培养不同时间长度的Huh7.5细胞的培养基的基于胆固醇的脂蛋白概况的图。使用尺寸排阻快速蛋白质液相色谱法(FPLC)来进行脂蛋白分离。
图13是示出在感染于人血清(HS)中培养的Huh7.5细胞之后的HBV产生的图。
图14是在FBS或人血清中培养不同时间段的Huh7.5细胞中NTCP表达的图。
图15是示出比较在不同培养基(FBS、HS和肝素处理的FBS和HS(HepHS和HepFBS))中HCV病毒产生的一组图。图A：HS(正方形)或FBS(圆形)中培养的细胞中的病毒滴度。图B：HepFBS或HepHS中培养的细胞中的病毒滴度。图C：图B的前8天的放大图。
图16是示出使用肝素柱纯化HCV的图。通过定量每个级分中的HCV核心蛋白来检测HCV。
图17是示出使用利用肝素柱纯化的病毒感染FBS或HepHS中培养的细胞2天的图像。
图18提供示出用小鼠传代的HCV基因型1a(图A)或用来自图A中星号(*)所指示的时间点的细胞的上清液(图B)感染HS培养的Huh7.5细胞的图。图B中的细胞在HS中分化，放置于HepHS中2天，并且然后感染。
图19和20示出HS培养的Huh7.5细胞中阶段I代谢基因的基因表达分析。
图21和22示出HS培养的Huh7.5细胞中阶段II代谢基因的基因表达分析。
实施方案详述
在进一步描述本发明之前，应当理解本发明不仅限于所述的特定实施方案，因而，当然也可有所变化。还应理解本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且无意具有限制性，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
当提供值的范围时，应理解除非上下文另有明确规定，否则该范围的上下限和该明示范围的任何其它明示或居中值之间的直到下限单位十分之一的每个居中值都涵盖于本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在本发明内，服从该规定范围内任何明确排除在外的界限。当所明示范围包括所述限值中的一个或两个时，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包含于本发明中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在实践或测试本发明时也可以使用与本文中描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物以引用的方式并入本文，以结合出版物所引用的内容来公开和描述方法和/或材料。
应注意，除非上下文另有明确规定，否则本文中和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括复数个这类细胞并且提及“所述病毒”包括提及一种或多种病毒及其为本领域技术人员所知的等效物等。
本文论述的出版物仅因其公开内容在本申请的优先权日之前而提供。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权通过以在先发明的方式从而先于这些出版物。此外，所提供的公布日期可不同于可能需要独立确认的实际公布日期。
提出实施例是为了向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和描述，不意欲限制本发明人看待其发明的范围，也不意欲表示以下试验是进行的全部或仅有的试验。已经努力确保使用的数值(例如用量、温度等)的准确性，但也应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。
应理解，出于清晰目的而在分开的实施方案的上下文中所描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，出于简洁目的而在单个实施方案的上下文中所描述的本发明的各种特征也可以分开地或以任何适合的子组合来提供。与本发明有关的实施方案的所有组合明确地由本发明包含并且就犹如每个和每一组合被单独地并明确地公开一样而在本文中公开，程度为这类组合包含为例如为稳定化合物(即，可被制备、分离、表征且测试生物活性的化合物)的化合物的主题。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合(例如，在描述这类变量的实施方案中所列举的化学基团的要素)也明确地由本发明包含，并且就犹如每个和每一这样的子组合被单独地并明确地公开在本文中一样而在本文中公开。
定义
当细胞、或细胞的实质部分和细胞群体中细胞的子代显示出未分化亲代细胞的形态学特征，使得它们与具有不同于未分化亲代细胞的所需表型，例如本文所述的原代肝细胞的表型的分化细胞区分开来时，细胞或细胞培养物被描述为“未分化的”。应注意，群体内未分化的细胞集落通常将被分化的相邻细胞包围。
“生长环境”是所关注细胞将在其中体外增殖、分化和/或成熟的环境。环境的特征包括培养细胞的培养基、可能存在的任何生长因素或诱导分化的因素以及支撑结构(诸如在固体表面上的基底)(如果存在)。
“表型标志物”是指细胞的可观察特征，其为细胞类型的指示器。表型标志物包括生物标志物、形态学特征和细胞的生理学功能。
如本文所用的“生物标志物”通常是指差异性地存在于具有不同表型状态的细胞(例如，未分化的hHCC细胞相较于原代肝细胞)或在第一细胞中与具有已知表型状态的第二细胞(例如，分化的hHCC细胞相较于原代肝细胞)中的类似的有机生物分子(例如，多肽)。如果在第一表型状态相对于第二表型状态中生物标志物的平均或中值水平经计算表现出统计上的显著差异，则生物标志物在不同表型状态之间差异性地存在。用于统计显著性的通用检验除其它之外包括t检验、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和比值比。生物标志物单独或组合地提供细胞属于所关注表型状态的相对可能性的量度。
在评估单独细胞或细胞群体上的表型生物标志物时，如果细胞表现出显著高于背景或阴性对照水平的可检测水平的生物标志物，则细胞被称为对于生物标志物呈“阳性的”，除非另外说明。如果生物标志物的表达并未显著高于背景或对照水平，则细胞被称为对于生物标志物呈“阴性的”，除非另外说明。
当多核苷酸已通过任何合适的人工操纵手段被转移到细胞中，或当细胞为已继承所述多核苷酸的初始遗传改变的细胞的子代时，细胞被称为“遗传改变的”或“遗传修饰的”。如果改变的细胞的子代具有相同的改变，则遗传改变被称为“可继承的”。
“组织培养适应的病毒”是指先前已经在体外细胞培养物中培养以便被选择实现相对于培养之前的亲代病毒而言改进的体外细胞系中的复制、体外细胞系的感染性或两者的病毒。
如本文所用，在适应病毒的背景中“适应性突变”是指相较于不具有所述适应性突变的有复制能力的病毒而言增加了病毒复制、感染或复制和感染靶细胞两者的能力的遗传改变。
“遗传修饰的病毒”是指相对于天然存在的病毒而言由遗传修饰的病毒基因组产生的病毒。
“假型病毒”是指具有至少一种来自于不同于病毒所包含的病毒基因组的来源(例如，不同的病毒)的病毒蛋白(例如，外壳蛋白)的病毒。
“原代细胞培养物”是指直接从组织(例如，从肝)获得并且未被永生化(例如，不是来自癌组织或未通过培养而转化为永生化的)的体外细胞培养物。
在本文互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的聚合形式的氨基酸，其可以包括生化修饰或衍生化的氨基酸。所述术语包括：融合蛋白，其包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白、具有异源和同源前导序列的融合体，具有或不具有N末端甲硫氨酸残基；免疫标记蛋白；等。“NH2”是指存在于多肽的氨基末端的游离氨基，并且“COOH”是指存在于多肽的羧基末端的游离羧基。
“保守性氨基酸取代”是指一种氨基酸残基对氨基酸侧链的共有化学和物理性质(例如，电荷、大小、疏水性/亲水性)的另一种氨基酸残基的取代。“保守性取代”旨在包括在以下氨基酸残基组内的取代：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；和phe、tyr。对于这类取代的指导可获自对多肽的氨基酸序列的比对。
如本文所用的术语“多核苷酸”是指任何长度的聚合物形式的核苷酸，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。此术语包括双链和单链DNA和RNA。此术语还包括已知类型的修饰，例如天然存在的修饰诸如甲基化。当多核苷酸为非天然存在时，多核苷酸可包括用类似物取代一种或多种天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，例如像，具有不带电荷的键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、含有悬垂部分(例如像，蛋白质(包括例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等))的那些、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷化剂(alkylator)的那些、具有修饰的键联(例如，α异头核酸等)的那些、以及未修饰形式的多核苷酸。
“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”以及指示作为单细胞实体培养的微生物或高等真核细胞系的其它这类术语是指可为、或已被用作重组载体或其它转移DNA的受体的细胞，并且包括已被转染的原始细胞的子代。应理解，由于天然、意外或故意突变，单个亲代细胞的子代并不一定与原始亲代在形态或基因组或全DNA补体方面完全相同。
“复制子”是指任何遗传元件，例如，质粒、染色体、病毒、粘粒等，其表现为细胞内自主多核苷酸复制单元，即，能够在其自身控制下复制。
“载体”是指选定的多核苷酸可被插入其中以便实现所选定的多核苷酸的复制和/或表达的复制子。
“可操作地连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预定的方式起作用的关系的并置。“可操作地连接“至编码序列的控制序列诸如启动子是以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接。
如本文所用的“转化”是指将外源性多核苷酸引入到宿主细胞中，与用于插入的方法，例如转导、转染或电穿孔无关。外源性多核苷酸可被保持为未整合载体，例如质粒，或者可被整合到宿主基因组中。
“分离的”是指所关注实体处于与化合物可以天然出现的环境不同的环境中。“分离的”意欲包括处于大体上富含所关注化合物和/或其中所关注化合物得以部分或大体上纯化的样品内的化合物。
“纯化的”是指所关注化合物(例如，多肽)已经与实际上伴随它的组分分离。“纯化的”也可用于指代所关注化合物与可在制造期间(例如，在化学合成中)伴随它的组分分离。在一些实施方案中，当至少50重量％至60重量％不含与其天然相关联或与其在制造期间相关联的有机分子时，化合物为大体上纯的。在一些实施方案中，制剂为至少75重量％、至少90重量％、至少95重量％或至少99重量％的所关注化合物。大体上纯的化合物可例如通过从天然来源(例如，细菌)提取、通过化学合成化合物、或通过纯化和化学修饰的组合来获得。大体上纯的化合物还可通过例如富集包含所述化合物的样品来获得。大体上纯的化合物还可通过重组或化学合成生产来获得。可以通过任何适当的方法，例如色谱法、质谱法、高效液相色谱法分析等来测量纯度。
如本文所使用，术语“确定”、“评估”、“测定”、“测量”、和“检测”是指定量、半定量和定性确定，并且因此术语“确定”与“测定”、“测量”等在本文中可互换使用。当预期定量确定时，使用短语“确定分析物的量”等。当预期定量和半定量确定时，使用短语“确定分析物的水平”或“检测”分析物。
体外肝细胞培养方法和组合物
本公开提供在足以使人肝细胞癌(hHCC)细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞的条件下培养hHCC细胞系的方法。以下更详细地描述细胞、培养基和培养方法的实施例。
用于培养方法的细胞
适合使用本公开的方法来产生具有原代人肝细胞表型的细胞的细胞包括人肝细胞癌(hHCC)细胞系。“hHCC细胞系”(也称为人肝癌细胞系)是指永生化细胞系及其子代，其中永生化细胞系来源于人肝细胞(例如，通过培养天然存在的癌性人肝细胞，例如肝细胞癌或肝母细胞癌的细胞系)。hHCC细胞系包括但不一定限于：HuH-7细胞(JCRB0403)、源于HuH-7的细胞系(“HuH-7来源的细胞”，例如Huh7.5；ATCC PTA-8561；US 7,455,969)、HuH-6(JCRB0401)HepG2(ATCC No.HB-8065)；HepG2-来源的细胞(例如，C3A(ATCC No.CRL-10741)；以及HepaRGTM细胞(可获得自Life Technologes,GrandIsland,NY,USA)。“来源的细胞”是指为所提及的亲代细胞的亚群(或“亚系”)的细胞，其已经通过选择所需表型(例如，相对于亲代细胞对病毒(例如组织培养适应的病毒(例如HCV)的病毒复制的支持增强)来分离。在一个实例中，hHCC细胞为HuH-7细胞或HuH-7来源的细胞(例如，Huh7.5)。
适合用于本公开的方法的细胞可在不需要重组遗传修饰(例如用构建体进行转染)的情况下使用，例如以便促进病毒滴度产生增加，或促进至原代人肝细胞表型的分化。
培养基
用于hHCC细胞(包括病毒感染的hHCC细胞)的维护和繁殖的培养基可以是任何合适的含有非人血清(例如，胎牛血清(FBS)，也称为小牛血清(FCS)、或合成血清(例如)的培养基。通常，可选择用于hHCC细胞系的维护和繁殖的培养基以便与细胞系相容。
可以选择在本公开的方法中用于诱导hHCC细胞分化以具有原代人肝细胞表型的培养基以便与所使用的起始细胞系最相容，不过用人血清(HS)取代非人血清(例如，替代胎牛血清(FBS))。
通常，培养基包含碳源、氮源、无机盐、微量营养物、缓冲液和任选的抗生素。碳源可以是各种糖醇、多元醇、羟醛糖或酮糖，包括但不限于阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、葡萄糖、甘油、肌醇、乳糖、麦芽糖、甘露糖醇、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、山梨糖醇、山梨糖、蔗糖、海藻糖、丙酮酸盐、琥珀酸盐或甲胺或可以由本领域技术人员确定的其它基底。
培养基可含有多元醇或羟醛糖。在更具体的实施方案中，培养基包含浓度为约0.1hHCC至约20.0重量％的甘露糖醇、肌醇、山梨糖、甘油、山梨糖醇、乳糖和阿拉伯糖作为碳源。所有的碳源都可在培养开始之前添加到培养基中，或它可在培养期间被逐步地或连续地添加。培养基还可以包含氮源、合适的无机盐以及，适当的话，各种微量营养素、生长因子等。
合适的补充碳源的实例包括但不限于：其它碳水化合物，诸如葡萄糖、果糖、甘露糖醇、淀粉或淀粉水解物、纤维素水解物和糖蜜；有机酸，诸如乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸和富马酸；以及醇，诸如甘油、肌醇、甘露糖醇和山梨糖醇。
合适的氮源的实例包括但不限于：氨，包括氨气和氨水；无机酸或有机酸的铵盐，诸如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和乙酸铵；尿素；硝酸盐或亚硝酸盐的盐；以及其它含氮材料，包括呈纯或粗制品的氨基酸、肉提取物、蛋白胨、鱼粉、鱼水解物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼水解物、酵母提取物、干酵母、乙醇酵母馏分、大豆粉、棉籽粉等。
合适的无机盐的实例包括但不限于：钾、钙、钠、镁、锰、铁、钴、锌、铜、钼、钨以及其它微量元素和磷酸的盐。
适当的微量营养物、生长因子等的实例包括但不限于：辅酶A、泛酸、盐酸吡哆醇、生物素、硫胺素、核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、DL-6,8-硫辛酸、叶酸、维生素Bi2、其它维生素、氨基酸诸如半胱氨酸和羟脯氨酸、碱例如腺嘌呤、尿嘧啶、尿苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶、硫代硫酸钠、对氨基苯甲酸或r-氨基苯甲酸、烟酰胺、次氮基乙酸盐等，它们作为纯或部分纯化的化学化合物或存在于天然材料中。在一些实施方案中，培养基包含浓度各自小于50μM-200μM的尿苷和/或胞苷。
细胞培养物中所使用的抗生素的实例包括但不限于青霉素、新霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素以及它们的混合物。
合适的培养基的实例包括但不限于DMEM、DMEM/F-12、Leibovitz L-15培养基、RPMI 1640和原代肝细胞培养基(本文称为PHM)。可容易地评估另外的培养基的适合性，并且本发明的方法不限于在培养物中使用的特定类型的细胞培养基，只要培养基适于支持hHCC细胞系的生长且适于添加人血清即可。可提供培养基以使其不含有添加的非人血清(例如，不含有添加的胎牛血清)。
通常，用于本公开的方法和组合物的人血清是通过常规方法自人受试者获得的。“人血清”涵盖来自一位个体的血清以及来自多位个体的混合血清的使用。“人血清”涵盖完整的人血清以及其亚级分。在待使用分化的hHCC来产生高水平的病毒颗粒的情况下，人血清亚级分包含人低密度脂蛋白(LDL)或它补充有人LDL。人血清可新鲜使用或在储存(例如在-20摄氏度下)后使用。人血清可在使用之前热灭活。
人血清可以获得自健康的人受试者，例如未患有可检测的病原体(例如，将在细胞中培养的病原体)感染的人受试者和/或关于病原体是天然的人受试者(例如，在人血清中不存在抗病原体抗体)。获自健康受试者的人血清的使用在具有原代人肝细胞表型的分化的hHCC细胞的培养物将用于涉及细胞感染病原体和/或病原体在细胞中繁殖(例如感染HCV)的方法的情况下是特别受关注的。
人血清可以适于培养hHCC细胞系且适于其分化以具有原代人肝细胞表型的任何浓度存在于培养基中。例如，人血清可以至少1％(v/v)、至少2％(v/v)、至少5％(v/v)、至少8％(v/v)、至少10％(v/v)或更大的浓度存在，并且可以具有约1％(v/v)至20％(v/v)或约2％(v/v)至10％(v/v)的浓度。
促进hHCC细胞分化的培养方法
通常，本公开的培养方法涉及将hHCC细胞系在包含人血清的培养基中于足以诱导hHCC分化成具有原代人肝细胞表型的细胞的条件下培养。图1提供本公开的培养方法的实施例。
如上所指出，在于HS中培养之前，hHCC细胞可在任何合适的培养基(通常含有非人血清或非人血清代替物(例如，)中培养。如果需要，可每3-4天对含FBS的培养基中的hHCC细胞培养物进行传代培养(例如，通过胰蛋白酶化)。无论是保持在含FBS的培养基中或是在于含HS的培养基中培养期间，细胞通常在适于hHCC细胞系的孵育条件(例如，37℃，5％CO2)下培养。
可通过解离FBS培养的hHCC单层且将hHCC细胞再悬浮并涂铺在含HS的培养基中来实现FBS培养的hHCC细胞到含HS的培养基的转移。可使用任何合适的方法(例如通过用胰蛋白酶处理)来解离FBS培养的hHCC细胞单层的培养物。在使用酶诸如胰蛋白酶来促进单层解离的情况下，可将酶灭活(例如，使用含血清例如FBS或HS的培养基)。然后离心解离的细胞并且将细胞沉淀再悬浮于含HS的培养基中。然后以合适的密度(例如约30％至50％)将细胞涂铺到组织培养板上。这可以例如通过将3-5ml的106个细胞/ml的悬浮液涂铺到75cm2板上来实现。
在开始在含HS的培养基中培养之后，对细胞培养物的剩余生命无需进行传代培养细胞。通常每3至4天，或每2至4天更换细胞培养基。
任选地，在涂铺在含HS的培养基中后约2至7天、约2至6天、约2至5天、约2至4天或约2至3天内(例如，当含HS的培养基中所培养的细胞处于或接近汇合时)，可例如使用单层解离的标准技术(例如通过用胰蛋白酶处理，接着进行胰蛋白酶灭活)对细胞培养物进行传代培养(“分裂”)、离心、再悬浮于含HS的培养基中并且涂铺到组织培养皿上。通常，在此阶段，如果在再次铺板前细胞以不多于约1:2稀释(即，不多于约50％稀释)，则此任选的传代培养实现最佳结果。虽然本公开的方法假设在转移到含HS的培养基中之后，HS培养的细胞可以此方式分裂持续最多约1周(同样，如果细胞分裂不多于1:2，则实现最佳结果)，在于人血清中培养约10天后进行胰蛋白酶化和再次铺板并未提供最佳结果并且与细胞培养物死亡相关联。在约10天后进行胰蛋白酶化的不利影响可通过将细胞涂铺在胶原涂覆的板上得以减轻。
不受理论的限制，在于含HS的培养基中培养约7天时，细胞似乎进入生长停滞，在此时与在含FBS的培养基中的生长相比，细胞分裂减缓并且通常停止。(图1)因此，培养方法可将此观察考虑在内，并且避免在于含HS的培养基中培养期间生长停滞开始后对细胞进行传代培养，例如在于含HS的培养基中培养约7天、约8天、约9天或约10天后不进行传代培养。
如在图1中本公开的方法的实施例所陈述，并且不受理论限制，在于含HS的培养基中培养的约7天时出现明显的生长停滞后，hHCC细胞开始显示出朝原代人肝细胞表型分化的迹象。在于含HS的培养基中培养的约14天、15天、16天、17天或18天或更长时间内，培养物包含完全分化成原代人肝细胞表型的细胞。通常，这类分化的细胞培养物含有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更多的分化细胞。
适合诱导hHCC中的原代人肝细胞表型的培养条件通常包括在含有人血清(HS)(例如，至少2％体积/体积HS)的合适培养基中将hHCC培养至少7天，通常超过11天，通常至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天或至少21天或者更长的时间。
通常，在含HS的培养基中培养hHCC细胞可在未对细胞进行超过一次的传代培养或未在于含HS的培养基中培养的前7天内或前10天内进行传代培养的情况下进行。“传代培养”是指分开(“分裂”)培养的细胞群体以便减少培养物中的细胞密度。
分化成原代人肝细胞表型的hHCC细胞可以在培养物中持续至少1个月或至少2个月或更久。这类长期培养可在未进行传代培养的情况下保持。
图1示意性地描述本公开的方法的一个实施例。例如，hHCC细胞可保持在含FBS的培养基中，其中每3-4天进行传代培养(例如，通过胰蛋白酶化)。对hHCC细胞进行传代培养并将其转移到含HS的培养基中。在转移到含HS的培养基中后2-4天，任选地对细胞进行传代培养，其中稀释不多于1:2。在转移到含HS的培养基中后第7天，hHCC细胞开始显示生长停滞的迹象，例如细胞分裂停滞(即，群体中的细胞数目未显著增加)，细胞未聚集(例如，细胞未彼此上下积聚)，可长期保持而无需传代培养)。在此时未对细胞进行传代培养，并且每3-4天将培养基更换成新鲜的含HS的培养基。在转移至含HS的培养基后约14-18天，hHCC细胞似乎完全分化成具有原代人肝细胞表型的细胞。将这些细胞保持在培养物中持续至少1个月、2个月或更久，并将培养基更换成新鲜的含HS的培养基。
包含分化的hHCC细胞的组合物
本公开提供包含具有原代人肝细胞表型的分化的hHCC细胞的细胞群体。简洁起见，由hHCC细胞分化且具有人原代肝细胞表型的细胞在本文中也可被称为“分化的hHCC细胞”。“原代人肝细胞表型”是指根据其是否表达原代人肝细胞所特有的表型标志物(例如，生物标志物、细胞的生理学功能以及形态学特征)而表征的细胞。表型标志物的外观和数目(例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多或全部的诸如以下所述的生物标志物和/或形态学特征和/或生理学特征)取决于hHCC细胞朝具有原代人肝细胞表型的完全分化的hHCC分化的阶段。
如以下提供的原代人肝细胞表型的表型标志物通常在于含HS的培养基中培养至少7天后在hHCC中开始出现。在于含HS的培养基中继续培养hHCC(例如，持续至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12、至少13天或至少14天或更久)的情况下，随着hHCC继续进展变为完全分化的hHCC，另外的表型标志物以及表型标志物的增加的表达水平出现。
原代人肝细胞所特有的表型生物标志物包括表达2种、3种、4种或所有生物标志物白蛋白、α1-抗胰蛋白酶和LxRα/NR1H3、以及表达密蛋白-1和紧蛋白，这与紧密连接的形成相关联。对于表达至少白蛋白和α1-抗胰蛋白酶而言，其中这些生物标志物各自以高于阴性对照水平的水平表达指示原代人肝细胞的表型(例如，高于在缺乏人血清、含有或不含DMSO下培养hHCC时的白蛋白和α1-抗胰蛋白酶的表达水平，如下文所讨论)，原代人肝细胞表型可被定义为阳性的。原代人肝细胞所特有的另外的表型生物标志物包括LxRα/NR1H3、密蛋白-1和紧蛋白。对于至少1种、2种或所有3种LxRα/NR1H3、密蛋白-1和紧蛋白的表达高于阴性对照水平(例如，高于在缺乏人血清、含有或不含DMSO下培养的hHCC的表达水平，如下文所讨论)而言，分化的hHCC可被描述为阳性的。
具有原代人肝细胞特征的分化的hHCC可被描述为相对于阴性对照例如在缺乏人血清时(例如，在非人血清诸如FBS或成牛血清(ABS)存在下，这种培养可含有或不含DMSO)培养的hHCC所表达的，差异性表达一种或多种表型生物标志物。因此，例如，对于以原代人肝细胞所特有的水平表达原代人肝细胞的表型标志物白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、LxRα/NR1H3、紧蛋白和密蛋白1而言，在非人血清(例如，FBS或ABS，含有或不含DMSO)中培养的hHCC细胞中的表型生物标志物的表达水平可被视为阴性的。
具有原代人肝细胞的表型特征的分化的hHCC细胞可被描述为表现出差异性表达1、2、3、4种或更多种白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、LxRα/NR1H3、密蛋白-1和紧蛋白，其中在分化的hHCC中的生物标志物的表达水平显著大于在缺乏人血清时培养的hHCC的生物标志物的表达水平，并且相比在缺乏人血清时培养的hHCC在分化的hHCC中可为至少1.5倍、2倍、2.5倍或更大。
原代人肝细胞的表型的表型标志物包括形态学特征。原代人肝细胞的形态学特征包括粒状外观、多边形(例如，立方形)细胞形状、紧密连接的形成以及铺石状细胞群体组织，并且多核化也经常是原代人肝细胞的典型特征。
原代人肝细胞的表型的表型标志物包括细胞生理学特征，例如与原代人肝细胞相关联的细胞活动。原代人肝细胞的表型的生理学特征包括白蛋白的分泌以及低密度脂蛋白(LDL)的脂质的摄取和利用。
具有原代人肝细胞表型的完全分化的hHCC可通过本文所述的表型标志物的任何合适的组合来描述，其中所述组合足以将原代人肝细胞与非原代人肝细胞区分开来。通常，具有原代肝细胞表型的完全分化的hHCC对于α1-抗胰蛋白酶和白蛋白的表达以及多边形(例如，立方形)细胞形状可被鉴定为阳性的。在完全分化的hHCC中，白蛋白和α1-抗胰蛋白酶各自的表达水平并不显著低于在相同条件下培养的原代人肝细胞中的白蛋白和α1-抗胰蛋白酶的表达水平、并且可能与其大致相同或高于其。
具有原代人肝细胞表型的完全分化的hHCC也可任选地通过表达紧密连接蛋白密蛋白-1和紧蛋白中的一种或两种来表征。例如，具有原代人肝细胞表型的完全分化的hHCC可以表达密蛋白-1和紧蛋白各个的水平并不显著低于在相同条件下培养的原代人肝细胞的表达水平、并且可能与其大致相同或高于其。具有原代人肝细胞表型的完全分化的hHCC还可通过存在紧密连接的形态学特征和/或通过能够摄取和利用LDL的脂质的形态学特征来表征。
原代人肝细胞表型的标志物可使用任何合适的方法来检测。例如，标志物可使用任何合适的免疫学技术，诸如用于细胞表面标志物的流式免疫细胞化学、或用于胞内或细胞表面标志物的免疫组织化学(例如，固定的细胞或组织切片的免疫组织化学)来检测。例如，可通过在标准免疫细胞化学或流式细胞术测定中，任选地在固定细胞之后且任选地使用标记的第二抗体或其它偶联物来扩增标记而使特异性抗体结合抗原，从而检测细胞表面抗原的表达。
基因产物标志物的表达也可以在mRNA水平上通过RNA印迹分析、斑点印迹杂交分析，或通过逆转录酶引发的聚合酶链式反应(RT-PCR)，使用序列特异性引物以标准扩增方法来检测。特定标志物的序列数据可从公共数据库诸如GenBank获得。
本公开可提供包含未分化的和分化的hHCC细胞两者以使得群体中部分细胞具有原代人肝细胞特征的培养细胞群体。例如，这类细胞培养物可以包括其中群体中至少约20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少98％或更多的细胞为分化的hHCC细胞的那些，例如这些细胞对如上所述的原代人肝细胞所特有的一个、二个、三个或更多个任何表型标志物和/或形态学标志物呈阳性。还可能希望将细胞群体中未分化的hHCC细胞的比例最小化。在某些实施方案中，分化的hHCC细胞群体具有小于15％、小于10％或小于5％的未分化的hHCC细胞。
本公开的方法可提供具有原代人肝细胞表型的大的hHCC分化的细胞群体。可以产生至少108、1010或1012个具有原代人肝细胞表型的细胞的群体。
本公开的组合物包含具有人原代肝细胞表型的细胞的培养细胞群体，其中所述细胞是hHCC细胞系的分化子代；以及包含人血清的培养基。在一些实施方案中，细胞培养物已被连续地保持至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少有18天、至少19天、至少20天、或至少21天或更久。在一些实施方案中，所述培养基包含约1％至20％的人血清，任选地约2％至10％的人血清。在一些实施方案中，所述hHCC细胞系为HuH-7或HuH-7来源的细胞系。在一些实施方案中，培养细胞被粘附到固体载体(例如，培养板的孔、珠子等)上，其中固体载体任选地包含一种或多种胞外基质组分，例如胶原(例如，I型胶原)以便促进培养细胞至固体载体的粘附。
本公开的组合物包含已经保持培养至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或更久的含有分化的hHCC细胞的培养细胞群体。
自hHCC细胞系分化的细胞表现出原代人肝细胞的表型，但是因为它们源于hHCC细胞系，所以它们也可被表征为是原始细胞或细胞系的分化子代。因此，分化的hHCC将具有与它们来源的细胞相同的基因组。这意味着无论是任何核型改变，染色体DNA将在原始亲代hHCC细胞系与得自其且具有原代人肝细胞的表型的分化的hHCC细胞之间超过90％同一性。已经历通常与以常规培养方法培养亲代hHCC细胞系相关联的遗传改变或已通过重组方法处理而引入转基因或敲除内源性基因的分化的hHCC细胞仍然被视为具有与其来源细胞系相同的基因组，因为所有非重组操纵的遗传元件都得以保留。分化的hHCC细胞及其亲代hHCC细胞可通过标准遗传指纹法技术来鉴定为具有相同的基因组。
这种特征可以是本公开的分化hHCC细胞的有价值的特征。例如，使用相同的hHCC细胞系来生成分化的hHCC细胞可减少在不同时间生成的分化hHCC细胞群体之间的变化。
本公开的组合物的某些实施方案包括原始细胞(诸如未分化的hHCC细胞系或中间群体)与具有原代人肝细胞的特征的分化细胞的组合。这两种群体可以处于相同容器(例如，在共培养物中)、处于相同设施的分开容器中，或处于两个不同的位置。未分化的和分化的细胞可同时或在不同时间存在，诸如当未分化细胞的培养物的实体被致使分化成分化的hHCC时。
使用含有耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清的培养基的方法和组合物
本公开还提供用于使培养细胞感染嗜肝微生物(例如，嗜肝病毒、嗜肝寄生虫(例如疟疾)等)的方法和组合物。通常，所述方法包括在含有耗尽LDL-受体结合脂蛋白(包括LDL和VLDL)的血清的培养基存在的条件下将培养细胞暴露于嗜肝微生物，以便促进培养细胞感染嗜肝微生物诸如肝炎病毒，例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型或戊型肝炎病毒(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV)等、巨细胞病毒(CMV)。当嗜肝微生物为肝炎病毒时，病毒可以是任何基因型(例如，HCV基因型1(例如，基因型1a、1b、1c)、2、3、4、5、6和7)并且可以是天然存在的病毒(例如，得自感染的灵长类动物的病毒，例如得自感染的人的临床分离株)、组织培养适应的病毒、遗传修饰的病毒、嵌合病毒或假型病毒。
用于利用耗尽LDL-受体结合脂蛋白的血清的方法的细胞可以是任何适合的肝细胞，诸如原代肝细胞、永生化肝细胞系(例如，hHCC细胞)以及根据本文所公开的方法分化以表现出原代人肝细胞表型的hHCC细胞)。本发明方法可特别用于实现培养的肝细胞(例如原代肝细胞、或永生化肝细胞系，包括分化以表现出原代人肝细胞表型的hHCC细胞)感染肝炎病毒的临床分离株，例如HCV的临床分离株。
在本公开的这些方法中在培养基中使用的耗尽LDL-受体结合脂蛋白的血清可通过本领域可用的任何合适的方法来制备。用于所述方法的血清可以是人、牛(例如胎牛)或任何其它合适的来源。在一个实例中，耗尽LDL-受体结合脂蛋白的血清通过如下方法制备：使血清与用于结合LDL受体(例如，人LDL受体)的脂蛋白的结合剂(例如，抗LDL受体结合脂蛋白抗体(例如，多克隆或单克隆抗体、抗VLDL抗体、抗LDL抗体、抗载脂蛋白B抗体)或肝素)接触一段足够长的时间以提供与结合剂的结合，然后回收未结合结合剂的血清组分以供在培养基中使用。“耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清”是指相对于处理之前的血清(“未处理血清”)耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清，并且涵盖相对于耗尽之前的血清耗尽了至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的LDL受体结合脂蛋白的血清。在一个实施方案中，耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清相对于处理之前的血清未实质上耗尽HDL(其未显著结合LDL受体)。
在一个实施方案中，耗尽LDL-受体结合脂蛋白的血清是通过以下方式制备的：使血清与作为结合剂的肝素接触，其中接触足够的时间以实现血清中的肝素结合组分(例如，LDL、VDL)与肝素的结合，随后回收肝素未结合的血清组分以用于培养基。
用于本发明方法的血清包括与耗尽之前的血清相比耗尽了至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的脂蛋白的血清，与耗尽之前的血清相比耗尽了至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的肝素结合脂蛋白的血清，和/或与耗尽之前的血清相比耗尽了至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的ApoB的血清。
本公开的使用脂蛋白耗尽的血清(例如，肝素处理的血清)的方法涉及用嗜肝微生物感染细胞(例如，hHCC细胞、原代人肝细胞或易于被嗜肝微生物感染的其它细胞)，其中细胞在含有脂蛋白耗尽的血清的培养基中培养。感染之后，可将细胞转移到任何合适的培养基(例如，用于hHCC细胞的含HS的培养基，其中分化或分化的hHCC细胞的保持是需要的)。
用途
本公开的方法和组合物可用于各种方法，诸如但不限于病毒颗粒产生(例如，如在病毒疫苗生产中)、肝细胞功能的研究以及筛选方法。在下文将更详细地描述用途的实施例。
病毒颗粒产生
本公开的方法和组合物可用于病毒颗粒的产生，特别是嗜肝病毒诸如肝炎病毒，例如，甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV)等、巨细胞病毒(CMV)的病毒颗粒的产生。病毒可以是任何基因型(例如，HCV基因型1(例如，基因型1a、1b、1c)、2、3、4、5、6和7)并且可以是天然存在的病毒(例如，得自感染的灵长类动物例如感染的人的病毒，通常称为“临床分离株”)、组织培养适应的病毒、遗传修饰的病毒或假型病毒。
本公开的产生病毒颗粒的分化的hHCC细胞可以使用任何合适的方法来实现。例如，可通过感染、电穿孔、转染等将病毒基因组引入细胞中。在一些实施方案中，未通过重组技术对hHCC细胞和/或分化的hHCC细胞进行修饰，以便提供基因组完整的病毒基因组。在一些实施方案中，未对hHCC细胞和/或分化的hHCC细胞进行遗传修饰以将可操作地连接非天然于病毒基因组的启动子的基因组完整的病毒基因组包括在内。
病毒基因组可在以下时间引入hHCC细胞中：在于含HS的培养基中分化之前，在从含FBS的培养基转移到含HS的培养基时，在于含HS的培养基中培养引起分化期间(例如，在转移至含HS的培养基后第1、2、3、4、5或6天)，或在生长停滞和/或分化成原代人肝细胞表型后(例如，在转移至含HS的培养基后第7、8、9、10、11、12、13、14天或更久)。
当通过感染引入病毒基因组时，可在含有如上所述的脂蛋白耗尽的(例如，肝素处理的)血清(例如，人血清、胎牛血清)的培养基中进行感染。任选地，在感染后可将细胞转移至含HS的培养基中例如以提供hHCC细胞的分化和/或促进细胞活力。在一个实施方案中，未分化的或分化的hHCC细胞在含有脂蛋白耗尽的血清的培养基中培养一段时间以允许添加至细胞的病毒颗粒的感染。在感染时期之后，将培养基更换为含HS的培养基并且将细胞培养一段时间以实现hHCC细胞的分化、hHCC细胞的继续分化和/或实现分化的hHCC细胞的保持且实现病毒颗粒的产生。
本公开提供包含至少105、至少106、至少107、至少108或至少109或更多个病毒颗粒/毫升培养基的分化的hHCC细胞培养物。本公开进一步提供可保持至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或更久的这种产病毒颗粒培养物。
产自于HS中培养的hHCC细胞的病毒颗粒表现出与在非人血清(例如在FBS)中培养的hHCC细胞中产生的病毒颗粒的结构特征不同的结构特征。例如，当在HS中所培养的分化的hHCC细胞中产生时，病毒颗粒具有比当产自FBS中所培养的hHCC细胞时低的平均密度。例如，当HCV颗粒在FBS培养的hHCC细胞中产生时，约75％的病毒颗粒具有大于约1.16g/ml的密度。相比之下，当HCV颗粒在HS培养的hHCC细胞中产生时，HCV颗粒具有较低的平均密度，其中群体中仅约25％的HCV颗粒具有大于1.16g/ml的密度。另外，产自HS培养的hHCC细胞的HCV颗粒与ApoB缔合，其中产生的病毒颗粒群体中通常至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％或更多的HCV颗粒是ApoB缔合的。
产自分化的hHCC细胞的病毒颗粒可以各种方式使用。例如，产自分化的hHCC细胞的病毒颗粒可自细胞培养基中分离，并被配制以便适于作为疫苗施用。病毒颗粒可用于研究设置，例如用于动物模型，诸如人嵌合小鼠模型的感染。分化的hHCC细胞群体还提供一种用于研究病毒特别是嗜肝病毒的研究工具。
测定
本公开的分化的hHCC可用于多种测定。例如，分化的hHCC可用作人肝细胞的模型，并且因此可用作肝功能和疾病(例如，癌变、脂肪变性(脂肪肝疾病))的模型。其它用途包括脂蛋白代谢和分泌的研究以及生物中间体与生物异源化合物的代谢研究(例如，细胞色素P450所引起的氧化)。
使用本公开的分化的hHCC的测定可以包括，例如评估试剂对具有原代人肝细胞表型的细胞的影响，例如，以评估试剂对人肝细胞功能的影响(例如，以评估试剂的肝脏毒性)；以评估人肝细胞的试剂的代谢；研究肝细胞功能所涉及的机理等等。分化的hHCC细胞可用于筛选影响具有人原代肝细胞表型的细胞的特征的试剂(诸如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸)和/或环境条件(诸如培养条件或操作)。
试剂(例如候选试剂)活性的评估通常包括使分化的hHCC细胞与试剂(单独地或与其它试剂(例如，具有已知活性的药物)组合)接触。在孵育足够长的时间之后，进行适当的测定以检测候选试剂对分化的hHCC细胞的影响(如果有的话)(例如，通过评估细胞形态、细胞功能的改变、人原代肝细胞表型的标志物的改变)。例如，通过与对照比较(例如，通过与不存在试剂情况下的表型比较和/或通过与存在具有对肝细胞的已知影响的试剂情况下的表型比较)来检测和分析试剂对表型的影响的存在与否。
例如，当测定是要评估候选试剂对脂蛋白代谢的影响时，测定可包括相较于不存在候选试剂时在存在候选试剂时，检测表型标志物的改变，例如形态改变(例如，分化的hHCC细胞中脂质组织改变的存在与否(例如，如通过脂质小滴的存在与否和/或这类脂质小滴的型式改变所指示的)或生物标志物的改变，诸如脂蛋白或脂质的改变(例如，脂蛋白或脂质的水平的改变)。相较于不存在候选试剂，在存在候选试剂时表型标志物的改变指示候选试剂对脂蛋白代谢具有影响。
在一方面，本文提供一种用于评估候选试剂对本文提供的任何分化的hHCC细胞的脂蛋白分泌的影响的方法。如以下实施例所论述的，在包含人血清的培养基中培养至少3-5天或更久的人肝细胞癌(hHCC)细胞系分泌脂蛋白(例如，VLDL、LDL、HDL)。在于包含人血清的培养基中培养14天或更久时，hHCC细胞分泌脂蛋白的水平很类似培养的原代人肝细胞的分泌水平，并且很类似在人血清中发现的脂蛋白水平。因此，在人血清中培养的hHCC细胞的分泌的脂蛋白概况类似于原代人肝细胞所分泌的脂蛋白的概况且类似于在人血清中发现的脂蛋白概况。这样，相较于不存在候选试剂，在存在候选试剂时脂蛋白分泌水平的改变指示候选试剂对脂蛋白分泌具有影响。
在某些实施方案中，所述方法包括将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在含HS的培养基中孵育超过14天的步骤。hHCC细胞系可在本文所述的任何含HS的培养基中培养3天或更久。在某些实施方案中，人肝细胞癌(hHCC)细胞系在与候选试剂接触之前于含HS的培养基中培养3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天或更久。
在将hHCC细胞系培养选定时段(例如，以实现所需的分泌脂蛋白概况)后，然后将细胞系与候选试剂接触。候选试剂包括但不限于：合成的、天然存在的或重组产生的分子(例如，小分子；药物；多核苷酸；多肽；肽；抗体；存在于真核细胞或原核细胞中的内源性因素(例如，多肽、植物提取物等))；等)。候选试剂包括众多化学类别的试剂，不过它们通常为有机分子，优选为分子量大于50并小于约2500道尔顿的小的有机化合物。候选试剂包括生物分子，诸如但不限于：抗体、肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物、核酸抑制剂或其组合。
所述方法可包括施用变化量的候选试剂(从无试剂至接近可在培养细胞的毒性限制内被递送的量的上限的量的试剂)，并且可包括在不同制剂中递送试剂。试剂可单独地施用或可与两种或更多种的组合结合施用，例如在待评估候选组合药物疗法的作用时。
在与候选试剂一起孵育足够的时间量之后，进行适当的测定以检测(如果有的话)候选试剂对分化的hHCC细胞分泌脂蛋白的影响。在某些实施方案中，所述方法包括评估含HS的培养基中脂蛋白(例如，VLDL、LDL和/或HDL)的水平的步骤。hHCC细胞所分泌的脂蛋白的水平可通过任何合适的方法来评估。例如，所分泌的脂蛋白的水平可通过测定从培养的hHCC细胞收集的培养基来评估以获得脂蛋白概况(HDL、LDL和/或VLDL胆固醇和甘油三酯水平的量度)。脂蛋白概况可例如使用超速离心或通过液相色谱法技术来获得。参见，例如，Brousseau等(1993)Clinical Chemistry 39(6):960-964。在某些实施方案中，脂蛋白概况通过分离用于培养hHCC细胞的培养基且使用尺寸排阻快速蛋白质液相色谱法从培养基中分离脂蛋白来获得。脂质含量(例如，胆固醇或三酰基甘油)可随后通过任何合适的脂质检测方法，包括荧光基脂质检测方法来测量。参见，例如，Yang等(2012)ChemPhys Lipids 165(2):133-41。
通过与对照样品(例如，获自未与试剂接触的hHCC细胞的培养基的对照脂蛋白概况)比较来确定候选试剂对脂蛋白分泌的影响的存在与否。在这类实施方案中，相较于对照样品在存在候选试剂的情况下脂蛋白水平的差异指示候选试剂对脂蛋白分泌具有影响。任何合适的样品都可用作用于与获自与候选试剂接触的hHCC细胞系的脂蛋白的水平进行比较的对照样品。在具体实施方案中，对照样品是获自在与所测试的样品相同的条件下且在不存在候选试剂的情况下在含HS的培养基中培养的人肝细胞癌(hHCC)细胞系的脂蛋白概况。在其它实施方案中，与得自与对肝细胞脂蛋白分泌具有已知影响的试剂接触的样品的脂蛋白概况进行比较。
这种方法可用于，例如，筛选用于治疗脂蛋白介导的疾病和病状的治疗剂，所述疾病和病状包括但不限于血脂异常、低脂血症、高脂血症、低脂蛋白血症、高脂蛋白血症、丹吉尔病(tangiers disease)、高α脂蛋白血症、低α脂蛋白血症、冠心病(CHD)、脑血管疾病(CVD)、动脉粥样硬化、血栓形成和中风。在具体实施方案中，所述方法是用于预防或治疗动脉粥样硬化。在这类实施方案中，相比于对照样品在培养基中VLDL或LDL的降低或HDL的增加指示候选试剂可以用于预防或治疗动脉粥样硬化。
当测定是评估药物代谢时，所述方法通常包括使具有人原代肝细胞表型的分化的hHCC细胞的培养物与药物接触足够的时间用于产生药物代谢物(如果有的话)，以及评估药物代谢物(例如，培养上清液中的)。药物代谢物可以使用本领域可获得的方法来检测。代谢物可进行进一步的分析，例如以便鉴定代谢物的结构。
当测定是评估试剂对人肝细胞的毒性时，所述方法通常包括使具有人原代肝细胞表型的分化的hHCC细胞的培养物与试剂接触，以及检测表型标志物的改变(例如，形态改变和/或指示毒性的生物标志物的改变，例如转氨酶水平的改变)。相比于不存在试剂的情况，在存在试剂下的改变(例如，在试剂存在下细胞培养基中转氨酶的增加和/或细胞死亡的表型标志物(例如，凋亡细胞死亡、坏死细胞死亡的表型标志物(例如，TUNEL、半胱天冬酶)的增加是试剂对分化的hHCC细胞具有毒性的指标)的检测。
当分化的hHCC用嗜肝微生物(例如，嗜肝病毒诸如HCV、HBV)来培养时，测定可以包括进入研究、复制以及在病毒的背景中病毒颗粒产生。测定还可以提供对抗嗜肝病原体试剂，例如抗病毒试剂的筛选。
例如，当测定是要筛选抗病毒试剂时，测定可通常包括在病毒基因组存在下将分化的hHCC细胞与至少一种测试候选试剂一起孵育，以及检测对病毒的影响存在与否。这可通过例如测定病毒复制来实现。测定病毒复制可通过例如评估病毒颗粒水平(例如，病毒滴度)、检测病毒核酸等来实现。例如，当用HCV感染分化的hHCC细胞时，HCV水平可通过测量病毒滴度、定量测量HCV RNA、测量HCV病毒颗粒(例如，通过检测核心蛋白，例如通过免疫测定)、通过显微术等来评估。病毒产生病毒复制的抑制可以源于例如在核酸水平上对病毒复制的抑制、病毒颗粒产生的抑制和/或病毒进入细胞的抑制。相较于不存在候选试剂，在存在候选试剂时病毒复制的降低指示候选试剂具有抗病毒活性。
筛选抗病毒试剂的方法可被变更来筛选抗体的抗病毒活性，例如以便测定通过例如抑制分化的hHCC的病毒感染性来中和病毒的抗体。这类抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在一个实施方案中，待筛选的抗体存在于获自暴露于病毒(例如，HCV)的受试者或已经施用疫苗(例如，候选疫苗)的受试者的生物样品中。生物样品可以例如是例如疑似含有抗病毒抗体的血液或其级分。在一个实施方案中，分化的hHCC细胞感染有临床病毒分离株。测定可以包括比较在抗体或疑似含有所述抗体的样品存在下的病毒复制，其中在抗体或样品存在下病毒复制的减少指示抗病毒活性。当生物样品来自免疫后受试者时，免疫后样品的抗病毒活性可以与免疫前生物样品(例如，来自同一受试者)的抗病毒活性相比较。
可以筛选多种候选试剂中的任一种。“候选试剂”是指包括合成的、天然存在的或重组产生的分子(例如，小分子；药物；多核苷酸；多肽；肽；抗体；存在于真核细胞或原核细胞中的内源性因素(例如，多肽、植物提取物等))；等)。候选试剂涵盖众多化学类别，不过它们通常为有机分子，优选为分子量大于50并小于约2,500道尔顿的小的有机化合物。候选试剂还可以包括生物分子，诸如但不限于：抗体、肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。
候选试剂可从多种来源获得，包括合成化合物文库或天然化合物文库。例如，众多方法可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括表达随机寡核苷酸和寡肽。呈细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可用的或容易产生的。抗体文库可以通过本领域可用的方法来产生。另外，天然或合成产生的文库和化合物易于通过常规化学、物理和生物化学手段来修饰，并且可以用于产生组合文库。已知的药理学药剂可进行定向或随机的化学修饰(如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等)以产生结构类似物。
所述测定方法可包括施用变化量的候选试剂(从无试剂至接近可在培养细胞的毒性限制内被递送的量的上限的量的试剂)，并且可包括在不同制剂中递送试剂。试剂可单独地施用或可与两种或更多种的组合结合施用，例如在待评估候选组合药物疗法的影响时。
应理解测定可以以多种方式进行，并且使分化的hHCC细胞与病毒和候选试剂接触的顺序可以改变。例如，分化的hHCC细胞可在与候选试剂接触之前感染病毒；或者，分化的hHCC细胞可在暴露于感染性病毒颗粒之前与候选试剂接触。
试剂(例如，候选试剂、药物和/或微生物(例如病毒))可在将hHCC细胞转移至含HS的培养基时、在hHCC细胞分化期间或在hHCC细胞分化成人原代肝细胞表型之后添加到培养基中。
试剂盒
本公开的试剂盒可以包括hHCC细胞、具有人原代肝细胞表型的分化的hHCC细胞或两者。试剂盒可任选地包括培养基组分，例如培养基(例如，不含血清或含有人血清)、用于培养的人血清等)。例如，试剂盒可以包括含有或不含有人血清的原代肝细胞培养基(诸如以下实施例中所详述的)。根据需要，试剂盒的各种组分可存在于单独容器或某些相容组分可预组合于单一容器中。
试剂盒可包括使用试剂盒的组分来实践本公开的方法的说明书。说明书通常记录在合适的记录介质上，诸如纸、塑料、电子存储器、媒介等。例如，说明书可作为包装说明书存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器的标签或其部件(例如，与包装相关联的)中等。在其它实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质(例如压缩式光盘只读存储器(CD-ROM)、数字通用光盘(DVD)、磁盘等)上。在其它实施例中，所提供的说明书不包含许多或全部测定细节，而是仅提供例如经由互联网获得详细说明书的作为远程数据源的指导。
实施例
提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和说明，并不意欲限制本发明人看待其发明的范围，也不意欲表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保使用的数值(例如用量、温度等)的准确性，但也应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。
材料和方法
在以下实施例中使用以下方法和材料。
标准培养条件(用于在人血清中培养之前的细胞增殖)。HuH-7(JCRB403)细胞可获自日本研究资源收藏中心(Japanese Collection ofResearch Resources)-细胞库(JCRB细胞库)。Huh7.5细胞是C.Rice博士的友好馈赠。两种细胞系都根据所描述的方案来保持(在于人血清中培养之前)。简言之，将Huh7.5或HuH-7细胞保持在含DMEM/10％胎牛血清(FBS)/青霉素/链霉素的培养基中，且每3至4天进行胰蛋白酶化和分裂。在大约20-30代后，丢弃细胞并且解冻新的小瓶。
由于人血清的使用引起细胞的生长停滞，所以通常将细胞培养物保持在含FBS的培养基(DMEM/10％的FBS/青霉素/链霉素，如上所述)中。
用JFH-1病毒进行的细胞感染。JFH-1病毒(JFH)是获自T.Wakita博士。在感染前两天，将细胞以30％的密度重新铺板。在感染4小时后，将细胞洗涤并酌情在含FBS或HS的培养基中培养。
嵌合小鼠的感染。将移植人肝细胞的嵌合SCID/uPA小鼠(参见，例如WO 01/67854)如先前所述进行感染(Steenbergen等(2010)Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol 299:G844-854；Mercer等(2001年8月)Nat.Med.7(8):927-33)。使用100μl来自JFH感染的细胞的组织培养上清液或来自HCV感染的患者的血清来实现感染。通过定量PCR和ELISA分别测定小鼠模型嵌合小鼠血清中的HCV滴度和人白蛋白(hAlb)。
通过免疫荧光对脂质小滴进行的可视化和定量。使细胞在盖玻片上生长并且在FBS或HS中培养。根据供应商的说明用Bodipy 493/503(Invitrogen)染色细胞，以便可视化脂质小滴。使用荧光显微镜对中性脂质染色的量进行可视化。使用相同的显微镜和曝光设置取不同细胞培养条件下Bodipy 493/503染色的图像。使用ImageJ软件(NationalInstitutes of Health)对荧光的量进行定量。在3个独立的实验中收集收据，每种条件测量4-8个显微视野。忽略背景和自动荧光。
在相同显微术设置下，但在对每个单独条件最佳的曝光下在单独染色的样品中检查脂质小滴的分布和形状。
蔗糖梯度/密度离心。如先前所述进行蔗糖密度梯度超速离心分析(Zhong等(2005)Proc Natl Acad Sci U S A 102:9294-9299)。将HCV感染的细胞的上清液在300g下离心5min以便在含蛋白酶抑制剂(RocheApplied Science,Indianapolis)的1ml TNE缓冲液(50mM TrisHCl，pH 8；100mM NaCl；1mM EDTA)中去除细胞碎片，加载到20-60％蔗糖梯度上(12.5ml总体积)，并且在4℃下于SW41Ti转子(Beckman)中在120,000g下离心16h。从梯度上层收集各0.5ml级分，并且如下所述通过定量RT-PCR测定各级分的滴度。通过测定已知体积的重量来测定各级分的密度。
含ApoB颗粒的免疫沉淀。基本上如先前所述进行免疫沉淀实验(Steenbergen等(2010)Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 299:G844-854)。将具有至少105个RNA拷贝/ml滴度的血清或细胞培养物上清液样品(50μl)与7.5μl抗ApoB抗体(Chemicon AB742，山羊抗人载脂蛋白B；与人、小鼠和牛ApoB的交叉反应)在4℃孵育过夜同时旋转。将蛋白G浆液(20μl，GE healthcare，Protein Sepharose 4 fastflow)添加到每个样品中并且在旋转器上孵育最少1小时。将蛋白G复合物在微离心管中于14000g下沉淀。将沉淀用PBS洗涤一次，将病毒RNA从沉淀中直接分离(QiaAmp Viral RNA试剂盒，Qiagen)且通过定量RT-PCR进行分析。在免疫沉淀之前，将含大量免疫球蛋白的样品(如患者血清)用蛋白G珠预清理，以便确保对ApoB复合物的定量免疫沉淀。为了确保蛋白G珠未直接结合HCV或HCV复合物，我们将含有小鼠血清的HCV与蛋白G琼脂糖珠在不存在抗ApoB抗体下一起孵育。在这些样品的沉淀物中的HCV滴度可忽略不计。
肝细胞标志物的定量RT-PCR。根据制造商的说明，使用Trizol从细胞分离RNA。使用Quantitect Reverse Transcription试剂盒(Qiagen)由RNA产生cRNA。基因特异性引物探针设置由Applied Biosystems设计。使用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系统用于基因产物的定量。根据Pfaffl(Pfaffl MW.Nucleic Acids Res 29:e45,2001)，相对于HPRT计算基因表达。
原代肝细胞培养物：冷冻的人原代肝细胞购自Invitrogen，或如先前所述自身分离(Mercer等，2001 Nat Med.7927-933)。将分离的细胞用HypoThermosol HTS-Purge(BioLife Solutions)进行预处理，再悬浮于Cryostor CS10(BioLife Solutions)中并且在受控速率冷冻机中以1℃/min的速率冷却直到-40℃。然后将细胞储存在液氮中。将细胞解冻，再悬浮于预加温的原代肝细胞介质(DMEM，1.2μg/ml胰岛素，11μM氢化可的松半琥珀酸酯，15mM Hepes，青霉素/链霉素，200mmol葡萄糖，2％人血清)中并且以1百万个细胞/孔的密度涂铺在I型胶原涂覆的板(Millicoat 6孔板，Millipore)上。12-18小时后，更新组织培养基以去除未附着的细胞。在铺板后3天内使用细胞。
分泌的脂蛋白的FPLC分析：使用尺寸排阻快速蛋白质液相色谱法(FPLC)来将培养的Huh7.5细胞所分泌的脂蛋白颗粒分离到培养基中。在此系统中，最大的颗粒被首先从柱洗脱(VLDL)，随后是LDL和HDL大小的颗粒。分离后，在线测定三酰基甘油(TG，也称为甘油三酯)或胆固醇含量。
为了制备样品，将细胞用无血清OptiMEM(Gibco/Invitrogen)深度洗涤以便去除存在于含血清的培养基中的脂蛋白。收集最后一次洗液并且充当基线测量。然后将细胞置于无血清OptiMEM中过夜。第二天，收集培养基且通过离心去除细胞碎片(300g，10分钟)。使用离心过滤器装置(Amicon Ultra-100，Millipore)浓缩培养基。将浓缩的培养基(65μl)注入装备有Superose 610/300FPLC柱的Agilent 1200HPLC仪器中。使用柱后反应，在37℃下对总胆固醇和TG(InfinityCholesterol and Triglyceride reagents，Thermo Scientific)进行在线测定。在500nm实时监测反应产物并且使用Agilent Chemstation软件进行分析。所有脂蛋白都包含TG和胆固醇两者。然而，VLDL富含TG并具有很少的胆固醇，而HDL富含胆固醇并具有很少的TG。因此，胆固醇概况更加适合检测所分泌的HDL水平中的差异，而TG概况更适合分析VLDL水平。
实施例1：人血清中所培养的HUH7.5细胞的生长和外观
图1提供示出用于在人血清(HS)中培养细胞以提供分化细胞的步骤的实施例的流程图。使先前保持在含FBS的培养基中的Huh7.5细胞胰蛋白酶化以促进单层的解离。将胰蛋白酶用DMEM/10％FBS灭活。然后将细胞在300g离心，将细胞沉淀再悬浮于DMEM/2％HS/青霉素/链霉素中并且以30％-50％的密度铺板。在汇合时(通常在孵育后2天)，再一次对细胞进行胰蛋白酶化，并且然后以50％的密度铺板。从现在开始，不经进一步分裂来培养细胞，并且允许细胞形成未分裂细胞的汇合层。任选地，人血清中培养的细胞可分裂持续多达约1周，条件是它们未分裂多于1:2。然而，在于人血清中培养10天后的重复胰蛋白酶化导致细胞培养物的活力缺失，其中80％-90％或更多的细胞死亡。
在补充有人血清(HS)而非胎牛血清(FBS)的培养基中生长的Huh7.5细胞经受一系列的形态改变，并且保持为汇合层超过两个月，而无需分裂。HS培养的细胞变得有组织的呈铺石状结构，形成非常牢固地附着至组织培养基底的紧密堆集的单层。在大约一周后，含HS的培养基中所培养的细胞中的细胞分裂减缓，并且最终经受接触抑制且生长停滞。相比于FBS培养的细胞(图2A，左图)，与所培养的原代肝细胞(右图)类似，HS培养的细胞是单核或双核的，并且具有粒状外观(图2A，中图)。在大约14-18天后，HS中细胞大小显著增大。
为了检查在HS中培养的表观生长停滞效应，在初始铺板于HS培养的细胞和FBS培养的细胞之后三周的时间跨度内对细胞数目进行计数。如图2B所示，相比含FBS的培养基中的生长，含HS的培养基中培养的细胞的生长显著减缓。
随着定期培养基改变，含HS的培养基中培养的细胞可在无分裂情况下保持并且再次铺板持续至少2个月。
实施例2：在HS中培养HUH7.5细胞促进至原代肝细胞样表型的分化
为了进一步评价在含HS的培养基中培养细胞的效应以及为了评估这些细胞是否经受至原代肝细胞样细胞的分化，在将Huh7.5细胞转移到HS补充的培养基中后第7天和21天测定肝细胞分化标志物的表达水平。在7天后，仅观察到肝细胞标志物的微小改变。(图3A)然而，在21天后，相比FBS，在人血清中生长的细胞中的肝分化标志物白蛋白和α1-抗胰蛋白酶的表达增加了大约4倍。这些蛋白质的表达水平类似于培养的人原代肝细胞的表达水平。在原代肝细胞培养基(PHM)中培养Huh7.5细胞并未对白蛋白或α1-抗胰蛋白酶的表达造成显著的额外影响。在HS中生长的细胞的LDL受体(LDL-R)改变并不显著，然而，当Huh7.5细胞在原代肝细胞培养基(PHM)中生长时，LDL-R表达增加。
在人血清中生长21天后的细胞中的紧密连接组分密蛋白-1和紧蛋白的表达也增加，并且与培养的人原代肝细胞中的表达相当(图3A)。在肝组织中存在高水平的紧密连接。另外，通过固定细胞，这些蛋白质也称为有效的肿瘤抑制子，并且指示致瘤状态到更加分化的细胞状态的转换。密蛋白-1和紧蛋白还充当HCV的进入受体。
相比FBS中生长的细胞，在HS中生长的细胞中关键脂质代谢调节剂的表达增加(图3B)。LXRα(肝X受体α)在肝中高度表达，并且控制脂质内稳态和炎症中所涉及的转录程序。过氧化物酶体增殖物活化的受体(PPAR)是分化和代谢的关键调节剂。PPARα是肝中脂质代谢的主要调节剂。PPARα活化通过上调脂肪酸运输和脂肪酸氧化所涉及的基因而促进脂肪酸的摄取和利用。PPARγ调节脂肪酸摄取和储存以及葡萄糖代谢。在人血清中培养的细胞中，细胞骨架蛋白波形蛋白和e-钙粘蛋白也增加。波形蛋白对维持形状和保持细胞器在位是重要的，它还控制细胞内部低密度脂蛋白的运输。E-钙粘蛋白在细胞至细胞粘附中起到重要作用，并且因此，与紧密连接蛋白类似，指示细胞的非增殖性/非致瘤状态。
实施例3：其它培养条件的检查
为了比较HuH-7或HuH-7来源的细胞在人血清中培养的作用，检查其它培养条件。
已经报告，DMSO(二甲基亚砜)诱导HuH-7或HuH-7来源的细胞和其它肝癌细胞中的生长停滞。(Sainz等(2006)J Virol 80:10253-10257)。为了评估DMSO的作用，检查在含1％或2％DMSO的DMEM(DMEM，10％FBS，1％或2％DMSO，青霉素/链霉素)存在下生长3周的Huh7.5细胞中肝细胞特异性基因的表达水平。另外，将Huh7.5细胞在含2-10％成牛血清(ABS,Invitrogen)(代替胎牛血清)的DMEM(DMEM，2％ABS，青霉素/链霉素)中培养。
两种培养条件都在大约7天内导致生长停滞。在含DMSO或ABS的培养基中培养的细胞确实经受一些形态改变，但决达不到在人血清中培养的细胞的程度。在任一种培养基中，通常未观察到细胞质中指示原代人肝细胞表型的点状图案(数据未示出)。
通过如上所述评估相同肝细胞分化标志物的表达水平，检查在ABS或DMSO中培养的细胞的分化状态(图4)。在2％DMSO中培养导致白蛋白表达略微增加，并且ABS导致紧密连接蛋白密蛋白-1和紧蛋白表达小幅增加，然而没有任何蛋白质的表达水平与培养的原代人肝细胞的表达水平相当或与在人血清中培养的Huh7.5细胞的表达水平相当。所测试的其它生物标志物的表达水平相对于在含FBS的培养基中的培养未显著增加。
实施例4：培养基对细胞脂质小滴外观的影响
检查在FBS相对HS中培养Huh7.5细胞后细胞脂质小滴的外观。如图5A和5B所示，相比FBS，在HS中所培养的细胞中指示脂质的Bodipy荧光要强烈得多。当使用ImageJ软件定量时，在HS中的细胞培养物的Bodipy荧光强度比在FBS中的细胞培养物高大约4倍(图5B)。
另外，脂质小滴的分布受不同培养条件的影响。在FBS培养基中，在细胞中脂质小滴大小是不均匀的。在HS培养基中，细胞中的脂质小滴通常小于FBS培养的细胞中的脂质小滴，并且在大小上均匀得多。
实施例5：JFH-1病毒滴度的产生
将JFH-1电穿孔到FBS培养的细胞中。然后将电穿孔的细胞保持在FBS中或者在电穿孔后立即根据实施例1转移到含HS的培养基中。在电穿孔后4-6天，通过收集培养物上清液收获病毒。
通过对保持在FBS培养基中的细胞进行电穿孔而产生的病毒被称为“JFH-FBS”；通过对在电穿孔后立即转移并保持在HS培养基中的细胞进行电穿孔而产生的病毒被称为“JFH-HS”。
图6A示出利用两种不同的病毒对在FBS中培养的细胞进行的感染。当FBS保持的细胞用在电穿孔之后4天分离的JFH-FBS(类似JFH-HS)感染时，在这些细胞中未检测到感染，因为这些病毒母液的RNA滴度过低。相比之下，JFH-HS立即在FBS生长的细胞中产生高病毒滴度。病毒滴度快速达到平稳水平。为了比较，使用在电穿孔之后15天分离的JFH-FBS(称为JFH-FBS(15)。)。与JFH-HS相比，JFH-FBS(15)的病毒滴度在整个感染过程保持较低。
图6B示出在不同条件(FBS和HS)下生长，但用相同病毒(JFH-HS)感染的细胞的病毒滴度。显著地，在于HS中培养的前10至11天期间，使用HS用于病毒产生的益处并不明显。然而，在约11天后，病毒滴度开始增加，使得在将细胞转移至HS培养基后约第14天，HS保持的细胞中病毒产生快速增加。在FBS培养的细胞中未观察到这种病毒产生的增加。该时间对应于HS培养的细胞表现出朝向类似原代人肝细胞表型的表型分化的表型的适当时间。在HuH-7细胞中进行类似感染。在HuH-7细胞中观察到的趋势与在Huh7.5细胞中观察到趋势类似(成倍增加是类似的)。
图6C示出，当HS中生长的细胞用JFH-HS感染时，与使用JFH-FBS在FBS培养的细胞中的标准组织培养条件相比，病毒产生(HCV RNA拷贝/ml)增加了约1000倍。在每3-4天更换新鲜的含HS的培养基的情况下，在含HS的培养基中培养细胞允许接近108个RNA拷贝/ml或更多的连续病毒滴度产生持续至少45天(图6D)。当细胞首先分化至原代肝细胞样表型(通过在含HS的培养基中培养约14天)，然后用JFH-HS感染，实现类似的病毒滴度(图6C)。
图6E示出使用原代肝细胞培养基对病毒滴度的影响。将被感染且使用HS首先分化的细胞转移至原代肝细胞培养基(DMEM，1.2μg/ml胰岛素，11μM氢化可的松半琥珀酸酯，15mM Hepes，青霉素/链霉素，200mmol葡萄糖，2％人血清)并且评估对病毒产生的影响。在转移后3天内，视为在HS中培养的结果的形态改变变得更加明显(未示出)。另外，相比于保持在DMEM/2％HS/青霉素/链霉素中的相同细胞，病毒滴度增加大约5倍。
实施例6：用JFH-HS和JFH-FBS感染小鼠
在嵌合SCID/Alb-uPA小鼠模型中测试JFH-HS和JFH-FBS两者的体内感染性。电穿孔后收集的JFH-HS母液用于感染新细胞，并且来自这些受感染细胞的上清液用于感染小鼠。不可能与在FBS中产生的相同病毒进行直接比较，因为病毒滴度太低以致于不能期望可检测的感染。因此，仅为了比较的目的，以类似的滴度使用组织培养适应的JFH变体(HCVcc)。
HCVcc、JFH病毒母液是通过电穿孔FBS中的细胞培养物而产生的。从第15天开始到感染后第30天，每5天分离汇集的病毒。使用此汇集的病毒来感染FBS中生长的细胞。随后，使用受感染细胞的上清液来感染新鲜细胞。重复此程序用于几轮感染。所得病毒因此是组织培养适应的。来自HCV感染的患者的血清充当阳性对照。
图7示出小鼠血清中多至感染后25天的病毒滴度。JFHHS引起嵌合小鼠快速感染。JFHHS滴度在感染后4天以高滴度可检测到，并且在接下来的3周仅少量进一步增加。相比之下，组织培养适应的JFHFBS的病毒滴度在前2周内缓慢增加并且然后似乎达到相同平稳水平。与JFHHS类似，高度感染性患者血清HCV的病毒滴度在4天内也可检测到。
实施例7：HS培养的细胞对HCV颗粒的影响：病毒密度、脂蛋白缔合。
为了评估病毒的生物物理特性是否受在HS相对FBS中培养的影响，评估病毒的病毒密度和ApoB缔合。
如图8所示，图A：HS中培养的病毒的密度朝较低密度移动。在使用FBS的标准组织培养条件下，JFH的中值密度为1.16g/ml，这与先前的报告非常符合。在于HS中培养细胞时，病毒颗粒的总体密度朝较低密度移动，其中中值密度为1.09g/ml，并且另外出现非常低密度的峰。在由HuH-7和Huh7.5细胞产生的病毒中测定病毒密度，并且这两种细胞类型的结果类似。
替代性表示示出于图8，图B中。当产生于FBS培养的细胞时，约75％的病毒具有高于1.16g/ml的密度，而当产生于HS培养的细胞时，仅约25％的病毒具有>1.16g/ml的密度。
先前已报告，组织培养物产生的病毒未与ApoB缔合，但与ApoE缔合。在人血清中，并且在HCV感染小鼠模型中，大部分HCV与ApoB缔合(约60％)。因此，检查改变的组织培养条件对HCV与ApoB的缔合的影响。
在使用FBS的标准组织培养条件下，仅大约5％的JFH与ApoB缔合。当细胞在人血清中培养时，大约90％的病毒与ApoB缔合(图8，图C)。为了比较，在患者血清中已经观察到约30-80％的HCV与ApoB缔合，而在嵌合小鼠血清中已经观察到约40-70％的HCV与ApoB缔合。在由HuH-7和Huh7.5细胞产生的病毒中测定ApoB缔合，并且结果类似。
实施例8：人低密度脂蛋白(HLDL)对HS培养的细胞中病毒产生的影响
为了检查脂蛋白对病毒产生的影响，制备缺乏含载脂蛋白B的脂蛋白(VLDL和LDL)的人血清。根据制造商提供的说明书通过在肝素柱(HiTRAP Heparin HP,GE Healthcare)上运行血清来制备低(LDL)脂蛋白耗尽的HS和超低密度(VLDL)脂蛋白耗尽的HS。肝素以高亲和力结合含ApoB的脂蛋白，VLDL和LDL，而HDL不结合肝素。所得血清因此仅耗尽VLDL和LDL。简言之，在与结合缓冲液平衡之后，将血清应用于柱，允许含ApoB的脂蛋白结合。将ApoB耗尽的级分收集并无菌过滤且在-20℃下储存。
当在脂蛋白耗尽的HS中培养细胞时，人血清对高病毒滴度产生的大部分有益影响损失，但Huh7.5细胞仍然分化至原代肝细胞样表型。添加回人VLDL并不能挽救病毒产生。然而，添加人LDL确实使病毒产生增加1000倍。人LDL的这种作用是剂量相关的，并且仅可在(部分)分化的细胞中实现(图9)。
实施例9：用来自HCV感染的患者的血清感染细胞
测试人血清中培养的Huh7.5细胞被来自感染HCV基因型1a的HCV患者的血清感染的易感性。在高达约105个RNA拷贝/ml的病毒滴度下实现成功的感染。(图10)相比之下，在含FBS的培养基中培养且用相同血清感染的Huh7.5细胞未产生可检测的病毒，如通过RT-PCR所测定。
以上实施例示出在人血清中培养的hHCC细胞诸如HuH-7来源的细胞引起原代肝细胞表型的分化。在含人血清(而非根据常规组织培养方案的FBS)的培养基中培养的HuH-7或Huh7.5细胞变为接触抑制的并且显示出若干肝细胞分化标志物(包括密蛋白-1和紧蛋白，即已被认为是HCV的进入受体的两种因子)的表达的增加。另外，HS培养的细胞显示出细胞脂质小滴(即已被认为是HCV复制和/或组装的位点的细胞器)的增加。
与使用补充FBS的DMEM的标准组织培养方法相比，用HCV感染HS培养的hHCC细胞在病毒产生方面显示出1000倍的增加。在用含HS的培养基替换hHCC细胞培养物的含FBS的培养基之后不久，观察到病毒滴度增加约10-100倍。在HS培养的hHCC细胞分化成原代肝细胞表型左右的时间(约第14天)，与保持在含FBS的培养基中的hHCC细胞相比，病毒复制增加约1000倍。结果示于图9中。
人LDL在病毒滴度增加中起到重要作用。从血清中去除VLDL和LDL防止与HS培养条件相关联的病毒滴度的增加。选择性添加人LDL而非人VLDL，挽救HS培养条件的病毒产生水平。hHCC细胞的分化状态在LDL对病毒滴度的有益影响中起作用。
产自HS培养的hHCC细胞的HCV颗粒在结构上与产自FBS培养的hHCC细胞的HCV不同。产自HS培养的hHCC细胞的HCV颗粒具有较低的密度并且是ApoB缔合的。HCV级分的较低的密度与较高的感染性有关。在嵌合小鼠模型中的确观察到较高的感染性。产自HS培养的细胞的病毒表现出与来自高度感染性患者血清的HCV类似的感染时间过程，这指示与产自FBS培养的hHCC细胞的病毒相比具有较高的感染性。HS培养的hHCC细胞中产生的较低密度和ApoB缔合的HCV更类似在患者血流中循环的病毒。
相比在FBS培养的细胞中产生的相同病毒，HS培养的细胞可用于产生较高的病毒滴度。如上所示，在无需对病毒进行遗传修饰和/或先前进行组织培养适应以选择适应性突变的情况下，产自HS培养的细胞的JFH-1的滴度远高于FBS培养的细胞。转染JFH-1且培养13天的HS培养的细胞产生对HS培养的细胞具感染性的病毒颗粒，并且这些细胞产生的病毒在嵌合小鼠中具有高度感染性。
实施例10：HS培养的细胞中的脂蛋白分泌
肝细胞特异性功能诸如VLDL分泌在于FBS补充的血清中生长的hHCC中不存在。VLDL分泌发生在人血清中所培养的hHCC中，如实施例1所述将FBS补充的血清中所培养的Huh7.5细胞转换到人血清(HS)补充的培养基中，并且使用尺寸排阻快速蛋白质液相色谱法在不同时间点从培养细胞的培养基中获得基于三酰基甘油(图11)和胆固醇(图12)的脂蛋白概况。
与之前的观察(Ling等(2013)Biochim Biophys Acta 1831(2):387-97；和Meex等(2011)J Lipid Res 52:152-158)符合，在于FBS补充的血清中生长的Huh7.5细胞中不存在VLDL分泌(图11，图B和图12)，并且仅观察到小的LDL大小的峰。在于人血清中培养5天之后，在VLDL分泌中存在小的增长，并且在胆固醇概况上观察到LDL和HDL大小的级分的较小改变(图12)。
然而，在细胞分化时(从14天开始)在人血清中培养的细胞中存在VLDL分泌，如在脂蛋白概况中所示的突出VLDL峰所指示的(图11，图B和图12)。另外，在细胞分化时，LDL峰的大小(曲线下的面积较大)增大并且存在更大的LDL颗粒(LDL峰向左移动(更大的颗粒首先洗脱))。在于HS中培养的第30天，来自HS培养的细胞的培养基的脂蛋白概况很类似由培养的原代人肝细胞分泌的脂蛋白(Ling等(2013)Biochim Biophys Acta 1831(2):387-97)和人血清的脂蛋白概况(图11图A，Steenbergen等(2010)299:G844-854)。在基于胆固醇的脂蛋白概况中也观察到HDL峰的增加(图12)。总之，此数据显示脂蛋白分泌可以在HS培养的细胞分泌脂蛋白中恢复，并且表现出与在人血清中发现的和由原代人肝细胞产生的类似的分泌脂蛋白概况。
实施例11：用HBV感染细胞
检查hHCC细胞感染乙型肝炎病毒(HBV)的易感性。还监测推定HBV进入受体，即牛磺胆酸钠协同运输多肽(NTCP，SLC10A1)的表达水平。
如上所述将Huh7.5细胞在含人血清(HS)的培养基中培养21天以产生分化的细胞。在此时期后，将细胞用HBV感染24小时或48小时。通过以下方式实现感染：将来自感染患者的50-100μl HBV阳性血清以15-30个病毒/细胞(或更高)的感染复数(MOI)添加到细胞培养物中，或添加10μl来自培养HepAD38细胞的细胞上清液的50X浓缩样品，所述HepAD38细胞是被遗传修饰以表达HBV颗粒的细胞系。对于HepAD38细胞，使用大约1000个病毒/细胞的MOI。
在感染后深度洗涤细胞以去除未结合的病毒。通过使用定量PCR在感染后的不同天数测定培养基中病毒基因组的量来监测到培养基中的病毒分泌。
如图13所示，HS培养的细胞成功感染有两种不同的HBV临床分离株(空心圆圈和闭合圆圈)，以及感染有由HepAD38细胞产生的病毒(空心三角形)。在感染后大约4天，检测到病毒滴度超过在洗液(其中洗液是在感染后第1天或第2天(第0天))中的病毒滴度。病毒滴度在大约5-14天达到最大值。在感染后15天后，病毒滴度降低，这与降低的进入受体水平一致。
实施例12：HS培养的细胞中的HBV进入受体的表达
已经报告，牛磺胆酸钠协同运输多肽(NTCP)是人细胞中用于HBV的进入受体(Yan等(2012)eLife 1:e00049)。评估如上所述在HS中培养持续不同的时间长度(0-35天)的Huh7.5细胞中的mRNA水平上的NTCP表达。将在FBS中培养且以相同传代数分离的Huh7.5细胞用作对照。在每个培养周期结束时，根据制造商的说明书在(Invitrogen)中制备细胞裂解物。使用定量PCR，相较于HPRT测定NTCP的相对mRNA水平。
如图14所示，HS培养的细胞在转移至含人血清的培养基后不久表现出增加的NTCP水平。在转移至HS后25天观察到NTCP的最高表达水平，显示相比FBS增加了60倍。在约28天，NTCP水平开始下降。
因为NTCP具有作为胆汁交换器的功能，所以这些数据指示胆汁分泌(肝特异性功能)在HS培养的细胞中增加或恢复。另外，鉴于NTCP的表达水平，这些数据指示含HS的培养基中hHCC的较短分化时间(例如，10-14天)足以提供HBV感染。
实施例13：在组织培养基中使用肝素处理的血清增强感染并增加病毒滴度。
通过在Heparin柱(根据制造商的说明书；HiTrap Heparin柱，GEHealthcare)上洗脱血清而将脂蛋白从血清中去除。肝素以高亲和力结合载脂蛋白B(ApoB)。将血清(FBS或HS)应用于柱并且收集流过液。流过级分基本上不含包含ApoB的脂蛋白诸如LDL和VLDL。
将初始在FBS中培养的Huh7.5细胞用相同量的病毒(HS产生的病毒，因此是ApoB缔合的病毒)感染并且然后进一步保持在FBS、HS、肝素处理的FBS(HepFBS)或肝素处理的HS(HepHS)中多至28天。细胞活力不受在HepFBS或HepHS中培养的影响。在28天期间监测病毒滴度。
图15，图A示出在HS或FBS中培养的细胞中的病毒滴度。如所预期的，HS中的病毒滴度(正方形)远超过FBS中的病毒滴度(圆形)。图15，图B示出在HepFBS或HepHS中培养的细胞中的病毒滴度。在前10-15天，HepHS和HepFBS中的病毒滴度超过在FBS中的滴度，然而随着时间流逝，HepHS、HepFBS和FBS产生类似的滴度。图15，图C是图B的前8天的放大图，并且它示出HS、HepFBS和HepHS培养产生在此时期相对于FBS中培养的细胞得到类似增强的滴度。
这些数据指示，相对于使用未处理的FBS实现的病毒滴度，增强的病毒滴度可通过在耗尽脂蛋白(例如，通过肝素处理)的血清中由培养细胞在病毒感染时实现。令人惊讶地，使用肝素处理的人血清或肝素处理的胎牛血清可实现增强的病毒滴度。
实施例14：纯化的脂蛋白缔合的病毒(HS产生的病毒)的增加的感染速率
人血清中产生的病毒与人载脂蛋白B(ApoB)缔合。这种特性被用来使用ApoB对肝素的高亲和力而将病毒从来自HCV感染的患者的血清中纯化出。使用300kDa过滤器在Centrimate 500S切向流设备中将HS培养的细胞中产生的病毒浓缩至60ml。将其加载到HiTrap肝素柱(流过级分1-10[无HCV存在，如通过病毒核心蛋白ELISA所检测的])上。用120ml洗涤缓冲液(0.1M NaCl，20mM NaPO4缓冲液，ph7.4，通过标准技术制成)洗涤柱(级分11-17)。然后将柱用0.2MNaCl，20mM NaPO4缓冲液ph7.4洗脱(级分18-27)、用0.4M NaCl，20mM NaPO4缓冲液ph7.4洗脱(级分28-34)且最终用1M NaCl，20mM NaPO4缓冲液ph7.4洗脱(级分35-38)。使用ELISA在每个级分中定量HCV核心蛋白。如图16所示，存在两个峰(汇集级分28-30和35-37)。
将来自每个级分的纯化病毒稀释100次，并且通过感染FBS或肝素耗尽的HS(HepHS)中所培养的细胞4小时来测试病毒的感染性。对于两种条件使用相同量的纯化病毒。通过如先前所述在感染后2天对于HCV NS5a染色来测定感染速率(Lindenbach等,2005Science第309卷第623-626页)受感染细胞将变为黑棕色(灰度级中的暗灰色)。
级分35-37是相对感染性较差的(感染性与FBS中未纯化病毒的感染性类似)并且感染速率不受脂蛋白去除的影响(未示出)。来自级分28-30的病毒成功地感染病毒。如图17所提供的实施例中所示，在肝素结合脂蛋白耗尽的血清中可以实现高得多的感染速率。
实施例15：用HCV的临床分离株(基因型1A)感染HUH7.5细胞
测试HS培养的Huh7.5细胞被HCV的临床分离株感染的易感性。研究感染方案以促进脂蛋白缔合的HCV的进入，使用分泌脂蛋白的细胞可实现HCV的临床分离株的成功感染。
为了避免从患者直接获得血清中存在的人抗体，使HCV临床分离株首先在移植人肝细胞的SCID/Alb-uPA小鼠(“嵌合小鼠”)中传代(US 6,509,514；Mercer等(2001)Nat.Med.7:927-33)。虽然人可生成中和抗体，但嵌合小鼠不能。因此，来自HCV感染的嵌合小鼠的HCV阳性血清不含HCV中和抗体。
嵌合小鼠感染有HCV基因型1a临床分离株。在不同时间点收集血液样品，并且通过定量RT PCR评估血清中病毒的量。使用具有107个RNA拷贝/ml的病毒滴度的HCV阳性小鼠血清样品(小鼠A578)来感染培养细胞。
将细胞在含人血清的培养基中培养多达10-21天以分化细胞。在感染前2天，如上所述将细胞放置在HepHS中。然后以1至3个病毒基因组/细胞用HCV阳性小鼠血清感染细胞。同时用相同量的病毒感染含正常血清(HS)的培养基中培养的细胞。将细胞感染24小时；之后将培养基换成含正常人血清(HS)的血清。使用定量RT PCR监测病毒滴度。然后使用相同细胞感染方案，使用具有最高病毒滴度的样品来直接接种新鲜细胞。
如图18所示，在正常人血清中培养的细胞不能可检测地感染HCV阳性小鼠血清A578(闭合圆圈，A578)。然而，当在感染阶段于脂蛋白耗尽的血清中培养细胞时，获得高达105个RNA拷贝/ml的病毒滴度(A578HepHS；空心圆圈)。然后使用相同的感染方案，使用来自A578HepHS的第15天样品(标记星号)来感染新细胞。7天后，病毒滴度大约为104个RNA拷贝/ml，而在14天后，病毒滴度接近107个RNA拷贝/ml。
实施例16：药物代谢中所涉及的基因表达的分析
如上所说明，在含人血清(HS)的培养基而非标准含胎牛血清(FBS)的培养基中培养人肝细胞癌(hHCC)细胞(例如，HuH-7或Huh7.5细胞)诱导这些细胞分化。如上进一步所示，在人血清中培养hHCC细胞恢复白蛋白和VLDL分泌，这指示这些细胞变得更类似肝细胞。在此测试分化细胞以评估这些细胞在药物代谢方面是否可充当原代人肝细胞模型。
进行对在含HS的培养基中培养不同时间的细胞和在含FBS的培养基中生长的细胞进行比较的全基因组微阵列研究。如之前将细胞在含HS的培养基中培养8、15或23天，并且使用Trizol(Invitrogen)收集复孔。在汇合时收集FBS培养基中的细胞。根据制造商的说明书提取RNA，并且使用随机引物和MMLV逆转录酶来合成cDNA。然后执行Affymetrix Human PrimeView阵列，并且使用RobustMulti-Array Analysis方法(RMA)分析数据。
药物代谢分为三个阶段。在阶段I，酶诸如细胞色素P450氧化酶将反应性或极性基团引入异型生物质(诸如小分子药物)中。然后，这些修饰的化合物在P中偶联至极性化合物，这通过转移酶诸如谷胱甘肽S-转移酶催化。在阶段III，偶联的异型生物质可经进一步处理，随后被外排性转运蛋白识别且从细胞中泵送出。本分析集中于阶段I和阶段II代谢基因，以及先前研究中预测牵涉药物代谢的转运蛋白。(Jennen等(2010)Drug Discovery Today 15:851-858)。一般的基因家族是细胞色素(16种基因)、醇脱氢酶(8种基因)、醛脱氢酶(18种基因)、甲基转移酶(8种基因)、谷胱甘肽转移酶(13种基因)、磺基转移酶(11种基因)、UDP葡萄糖苷酰转移酶(11种基因)和ABC转运蛋白(26种基因)。结果在图19-22中示出。
引人注目地，多种阶段I基因被上调，包括多种细胞色素和黄素单氧酶以及醛酮还原酶(图19-20)。另外，葡萄糖苷酰转移酶和一些其它阶段II基因被上调(图20-21)。在不同家族中的多数其它基因未被上调，这预期是因为未向细胞添加药物。
药物代谢中涉及的雌激素偏爱磺基转移酶SULTE1被上调23倍，并且胆汁酸酰基转移酶阶段II酶BAAT被上调13倍。在这些研究中上调的许多mRNA似乎编码胆汁酸代谢中涉及的酶，这与分化的肝细胞和增加的解毒功能相一致，这指示HS培养的细胞更好地反映原代肝细胞。这类分化的细胞可提供比原代肝细胞更一致的模型，因为原代肝细胞通常是从标准以下的组织分离的(因为，最好的肝脏通常注定用于移植)。
尽管本发明已经参考其特定实施方案加以描述，但本领域技术人员应了解的是可在不脱离本发明的真实精神和范围下进行各种变化且可用等效物进行替代。此外，可进行许多修改以使特定情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤适于本发明的目标、精神和范围。所有这类修改都意图在随附于此的权利要求的范围内。

Claims (40)

1.一种产生包含具有原代人肝细胞表型的细胞的细胞培养物的方法，所述方法包括：
将人肝细胞癌(hHCC)细胞系在包含人血清的培养基中培养超过11天
其中所述培养诱导所述hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含约1％至20％的人血清。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含约2％至10％的人血清。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述hHCC细胞系为HuH-7或HuH-7来源的细胞系。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述培养并未在于所述包含人血清的培养基中培养10天后进行传代培养。
6.一种细胞培养物，其包含通过权利要求1-5中任一项所述的方法产生的细胞。
7.一种细胞培养物，其包含：
具有人原代肝细胞表型的细胞，其中所述细胞为hHCC细胞系的分化子代；以及
包含人血清的培养基。
8.一种评估候选试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的影响的方法，所述方法包括：
使如权利要求7所述的细胞培养物与候选试剂接触；以及
测定所述候选试剂对所述具有人原代肝细胞表型的细胞的表型的影响存在与否。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述测定是针对所述候选试剂对所述具有原代人肝细胞表型的细胞的脂质代谢的影响。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述测定是针对所述候选试剂对所述具有原代人肝细胞表型的细胞的极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和/或高密度脂蛋白(HDL)分泌的影响。
11.一种评估具有人原代肝细胞表型的细胞的试剂代谢的方法，所述方法包括：
使如权利要求7所述的细胞培养物与试剂接触；以及
测定所述试剂和/或所述试剂的代谢物的存在与否。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述试剂为药物。
13.一种评估试剂对具有人原代肝细胞表型的细胞的毒性的方法，所述方法包括：
使如权利要求7所述的细胞培养物与试剂接触；以及
测定指示所述试剂对所述细胞的毒性的细胞表型改变的存在与否。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述表型为培养基中转氨酶的增加。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述表型为细胞死亡标志物的增加。
16.一种产生病毒颗粒的方法，所述方法包括：
将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育超过11天
其中所述孵育诱导所述hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；
将嗜肝病毒的基因组引入所述hHCC细胞系或所述具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；以及
将所述细胞培养物保持在适合产生病毒颗粒的条件下。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述引入是通过向所述培养基添加感染性病毒颗粒。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述感染性病毒颗粒是在所述培养的第1天添加的。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到所述hHCC细胞系中。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述引入是通过嗜肝病毒的感染并且所述细胞培养物包含脂蛋白耗尽的血清。
21.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中所述方法包括将病毒颗粒从所述培养基中分离。
22.一种病毒感染的细胞培养物，其包含通过以下方法产生的细胞，所述方法包括：
将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育超过11天，其中所述培养诱导所述hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；以及
将嗜肝病毒的基因组引入所述hHCC细胞系或所述具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中。
23.一种用于针对抗病毒活性筛选候选试剂的方法，所述方法包括：
将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育超过11天，其中所述孵育诱导所述hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；
将嗜肝病毒的基因组引入所述hHCC细胞系或所述具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；
使所述细胞培养物与候选抗病毒试剂接触；
将所述细胞培养物保持在适合病毒复制的条件下；以及
检测所述候选试剂对病毒复制的影响存在与否；
其中相较于不存在所述候选试剂时在存在所述候选试剂时病毒颗粒产生的降低表明所述候选试剂具有抗病毒活性。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述引入是通过向所述培养基添加感染性病毒颗粒。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述感染性病毒颗粒是在所述培养的第1天添加的。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到所述hHCC细胞系中。
27.一种用于针对抗病毒活性筛选疑似含有抗体的样品的方法，所述方法包括：
将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育超过11天，其中所述孵育诱导所述hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；
将嗜肝病毒的基因组引入所述hHCC细胞系或所述具有原代人肝细胞表型的细胞中的至少一种中；
使所述细胞培养物与疑似含有抗体的样品接触；
将所述细胞培养物保持在适合病毒复制的条件下；以及
检测所述样品对病毒复制的影响存在与否；
其中相较于不存在所述样品时在存在所述样品时病毒颗粒产生的降低表明所述样品含有具有抗病毒活性的抗体。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述引入是通过向所述培养基添加感染性病毒颗粒。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述感染性病毒颗粒是在所述培养的第1天添加的。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述病毒基因组在所述孵育之前被引入到所述hHCC细胞系中。
31.一种用于针对脂蛋白介导的疾病的治疗筛选候选试剂的方法，所述方法包括：
将包含人肝细胞癌(hHCC)细胞系的细胞培养物在包含人血清的培养基中孵育至少3天，其中所述孵育诱导所述hHCC细胞系分化成具有原代人肝细胞表型的细胞；
使所述细胞培养物与所述候选试剂接触；以及
针对所述候选试剂相较于对照样品对所述分化的hHCC细胞系所分泌的脂蛋白的水平的影响的存在与否测定所述细胞培养物；
其中所述候选试剂对所述分化的hHCC细胞系所分泌的脂蛋白的水平的影响表明所述候选试剂可用于治疗所述脂蛋白介导的疾病。
32.如权利要求31所述的方法，其中针对所述候选试剂相较于对照样品对所述培养基中极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和/或高密度脂蛋白(HDL)的水平的影响的存在与否测定所述细胞培养物。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述方法是用于针对动脉粥样硬化的治疗筛选候选试剂，并且其中VLDL或LDL的降低或HDL的增加表明所述候选试剂可用于治疗动脉粥样硬化。
34.一种用嗜肝微生物感染培养肝细胞的方法，所述方法包括：
使培养肝细胞与感染性嗜肝微生物在包含耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清的培养基中接触；
其中所述接触持续足以使所述培养肝细胞感染所述嗜肝微生物的时间。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述培养细胞为原代肝细胞或永生化肝细胞细胞系。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述培养细胞为分化的hHCC细胞。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述耗尽LDL受体结合脂蛋白的血清为耗尽LDL受体结合脂蛋白的人血清或耗尽LDL受体结合脂蛋白的胎牛血清。
38.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述感染性嗜肝微生物为嗜肝病毒。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述嗜肝病毒为丙型肝炎病毒或乙型肝炎病毒。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述嗜肝病毒为临床分离株。
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