ES2415106T3 - Virus de la hepatitis C capaz de replicación y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Un polinucle6tido capaz de replicaciOn que comprende: una regi6n 5' no traducida (NTR), una 3' NTR, y una secuencia codificante presente entre las 5' NTR y3' NTR y codificando una poliproteina del virus de la hepatitis C, donde la poliproterna comprende unaisoleucina en lugar de la serina correspondiente a la serina 2204 de la SEC ID N 0: 2, y una arginina enlugar de la glutamine correspondiente a glutamine 1067 de la SEC ID N 0: 2, en la que la 5' NTR, la 3'NTR y la secuencia de nucleetidos que codifica la poliproteIna son genotipos la, en la que elpolinucle6tido capaz de replicaci6n se replica en celulas Huh7, y en la que la poliproteina comprendeuna secuencia de aminoacidos que tiene al menos 90% de identidad con la SEC ID N °: 2.

Description

ANTECEDENTES [0001] El virus de la hepatitis C es la causa más común de hepatitis vírica crónica en los Estados Unidos, que aproximadamente infecta a 4 millones de estadounidenses y es el responsable de la muerte de 8.000-10.000 personas al año debido a fibrosis hepática progresiva que conduce a cirrosis y/o desarrollo de carcinoma hepatocelular. El virus de hepatitis C es un virus ARN de sentido positivo de cadena sencilla, con una longitud de genoma de unos 9,6 kb. Se clasifica actualmente en un género separado de la familia de los flavivirus, el género Hepacivirus. El genoma del virus de hepatitis C contiene un único y gran marco de lectura abierta (ORF) que sigue a un ARN 5' No traducido de unas 342 bases conteniendo un segmento de entrada interna de ribosoma (IRES) que dirige la iniciación de la traducción vírica independiente de cap. El gran ORF codifica una poliproteína que sufre escisión post-traduccional, bajo el control de proteinasas celulares y víricas. Esto produce una serie de proteínas estructurales que incluyen un núcleo o proteína de la nucleocápside, dos glicoproteínas de envoltura, E1 y E2, Y por lo menos seis proteínas no estructurales de replicación. Estas incluyen NS2 (que con la secuencia adyacente NS3 demuestra actividad de metaloproteinasa cis-activa en el sitio de escisión NS2/NS3), NS3 (una serina proteinasa / NTPasa / ARN helicasa), NS4A (factor accesorio de serina proteinasa), NS4B, NS5A y NS5B (ARN polimerasa dependiente de ARN). [0002] Con la excepción del ARN 5' no traducido, existe una heterogeneidad genética sustancial entre diferentes cepas del virus de la hepatitis C. Los análisis filogenéticos han dado lugar a la clasificación de las cepas de virus de la hepatitis C en una serie de "genotipos" genéticamente distintos, cada uno de los cuales contiene un grupo de virus genéticamente relacionados. La distancia genética entre algunos de estos genotipos es suficientemente grande como para sugerir que puede haber diferencias serotípicas biológicamente significativas también. Hay poco conocimiento de la medida en la que la infección con un virus de cualquier genotipo puede conferir protección contra virus de un genotipo diferente. [0003] La terapia actualmente disponible de interferón en combinación con ribavirina tiene una pobre velocidad de respuesta frente a las cepas más frecuentes de VHC, genotipo 1 a y 1 b. El establecimiento de sistemas de replicón subgenómicos seleccionables ha avanzado el estudio de la replicación del ARN VHC. Sin embargo, sólo replicones de cepas de genotipo 1 b están fácilmente disponibles, y la extensión de los sistemas de replicón a otros genotipos ha sido bastante infructuosa. Teniendo en cuenta la naturaleza de la alta variabilidad genética del VHC, serán muy útiles sistemas de replicación del VHC derivados de otros genotipos en el esfuerzo de descubrimiento de fármacos. De acuerdo con esta noción, replicones quiméricos que contienen una polimerasa de genotipo 1 a en el antecedente de un replicón con genotipo 1 b eran más resistentes al tratamiento con interferón in vitro que el replicón derivado de un genotipo 1 b del VHC. La extensión del sistema de replicón a otros genotipos también es necesaria para entender el mecanismo de la replicación del

ARN del VHC y la contribución de las secuencias variables en ese proceso. [0004] Recientemente, dos grupos informaron de la generación del sistema de replicación del genotipo 1a usando sublineas altamente permisivas de células Huh-7. Blight y col. (J. Virol 77, 3.181-3.190 (2003)) fueron capaces de seleccionar colonias resistentes de G418 soportando la replicación de un genotipo derivado de replicones subgenómicos 1a de una sublinea Huh7 hiper-permisiva, Huh-7.5, que fue generada curando una linea celular establecida de replicón resistente a G418 del ARN replicón subgenómico Con1 que se habla utilizado para seleccionarlo mediante tratamiento con interferón-alfa (Tizón et al., J. Virol., 76, 13001-13014 (2002)). El análisis de secuencia de ARNs de VHC replicantes en el interior de dichas lineas celulares seleccionadas mostró que las mutaciones críticas más comunes se encuentran en la posición de aminoácido

470 de NS3 (P1496L) dentro del dominio II de la helicasa NS3, y la mutación NS5A (S22041). En otro caso,

Grobler y col. (J. Biol.. Chem .. , 278,16741-16746 (febrero de 2003)), utilizaron un enfoque sistemático mutacional para llegar a una conclusión similar de que la combinación de ambos P1496L y S22041 era necesaria para conseguir la replicación del genotipo 1a en una sublfnea Huh-7altamente permisiva que se seleccionó de forma independiente pero similar. Sin embargo, ARNs de genotipo 1a con estas dos mutaciones

5 mejoradas no sufren replicación en la linea celular Huh-7 indicando una utilidad limitada de este sistema.

RESUMEN

[0005] La presente invención proporciona polinucleótidos capaces de replicación de acuerdo con la reivindicación 1. Los polinucleótidos capaces de replicación incluyen una región no traducida 5' (NTR), una NTR 3', Y una primera secuencia codificante presente entre la NTR 5' Y la NTR 3' Y que codifica una 10 poliprotelna del virus de la hepatitis C. La NTR 5', la NTR 3', Y la secuencia de nucleótido que codifican la poliprotelna son genotipo 1 a. La poliprotelna incluye una isoleucina aproximadamente en el aminoácido 2204, e incluye además una mutación adaptativa en la que la mutación adaptativa es una arginina en aproximadamente el aminoácido 1067. La poliprotelna puede ser una poliprotelna subgenómica. La poliprotelna puede incluir el núcleo de productos de escisión, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y

15 NS5B. Los polinucleótidos capaces de replicación pueden incluir además una segunda secuencia de codificación. La segunda secuencia de codificación puede codificar, por ejemplo, un marcador o un transactivador. Los polinucleótidos capaces de replicación pueden incluir además una secuencia de nucleótidos que tiene actividad de ribozima que actúa en cis, en la que la secuencia de nucleótidos se localiza 3'de la NTR 3'.

20 [0006] También se proporcionan por la presente invención métodos para fabricar un polinucleótido capaz de replicación según la reivindicación 11, Y el polinucleotido capaz de replicación resultante. Los métodos incluyen proporcionar un polinucleótido que tiene una NTR 5', NTR 3', una primera secuencia codificante presente entre la NTR 5' Y NTR 3' Y que codifica una poliproteina del virus de la hepatitis C. La NTR 5', la poliprotelna y NTR 3' son de genotipo 1 a. La poliprotelna incluye una serina en aproximadamente el

25 aminoácido 2204 y una glutamina en aproximadamente el aminoácido 1067, Y el método incluye alterar la secuencia de codificación de forma que la poliprotelna codificada por ello incluye una isoleucina en el aminoácido 2204, y una glutamina en el aminoácido 1067. La poliprotelna puede ser una poliprotelna subgenómica. La poliprotelna puede incluir el núcleo de productos de escisión, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B.

30 [0007] La presente invención proporciona además métodos para identificar un compuesto que inhibe la replicación de un polinucleótido capaz de replicación tal como se define en la reivindicación 1. El método incluye poner en contacto una célula que contiene un polinucleótido capaz de replicación con un compuesto, incubar la célula bajo condiciones en las que el polinucleótido capaz de replicación se replica en ausencia del compuesto, y detectar el polinucleótido capaz de replicación, en el que una disminución del polinucleótido VHC capaz de replicación en la célula puesta en contacto con el compuesto comparado con el polinucleótido capaz de replicación en una célula no puesta en contacto con el compuesto indica que el compuesto inhibe la replicación del polinucleótido capaz de replicación. La detección del polinucleótldo capaz de replicación puede incluir, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico o identificar un marcador codificado por el polinucleótido capaz de replicación o por la célula que contiene el polinucleótido capaz de replicación.

40 [0008] También se proporcionan por la presente invención métodos para seleccionar un polinucleótido capaz de replicación. El método incluye incubar una célula que contiene un polinucleótido que incluye una NTR 5', una NTR 3', Y una primera secuencia de codificación presente entre la NTR 5' Y la NTR 3 Y que codifica una poliprotelna de virus de la hepatitis C como se define en la reivindicación 1, Y una segunda secuencia de

codificación. La poliprotefna incluye una isoleucina en aproximadamente el aminoácido 2204, e incluye además una glutamina en aproximadamente el aminoácido 1067. La segunda secuencia de codificación codifica un marcador seleccionable que confiere resistencia a un agente de selección que inhibe la replicación de una célula que no expresa el marcador seleccionable. El método también incluye la detección de una célula que se replica en presencia del agente de selección, en el que la presencia de dicha célula indica que el polinucleótido es capaz de replicación. El método puede incluir además obtener una partícula de virus producido por la célula, exponer una segunda célula a la partícula del virus aislada e incubar la segunda célula en presencia del agente de selección, y detectar una segunda célula que se replica en presencia del agente de selección, en el que la presencia de dicha célula indica que el polinucleótido capaz de replicación en la primera célula produce una partícula de virus infeccioso. [0009] La presente invención también proporciona métodos para detectar un polinucleótido capaz de replicación, incluyendo incubar una célula que contiene un polinucleótido capaz de replicación. El polinucleótido capaz de replicación incluye una NTR 5', una NTR 3', Y una primera secuencia codificante presente entre la NTR 5' Y NTR 3' Y que codifica una poliproteina del virus de la hepatitis C como se define en la reivindicación 1, Y una segunda secuencia codificante que codifica un transactivador. La célula incluye un región codificante transactivada y una secuencia operadora unida operativamente a la región codificante transactivada, y la región codificante transactivada codifica un marcador detectable, en el que el transactivador altera la transcripción de la región codificante transactivada. El método incluye además detectar un marcador detectable, en donde la presencia del marcador detectable indica que la celda incluye un polinucleótido capaz de replicación.

Definiciones

[0010] Como se usa aquí, el término "polinucleótido capaz de replicación" se refiere a un polinucle6tido que se replica cuando está presente en una célula. Por ejemplo, se sintetiza un polinucleótido complementario. Como se usa aquf, el término "replica in vitro" indica que el polinucleótido se replica en una célula que está creciendo en cultivo. La célula cultivada puede ser una que ha sido seleccionada para crecer en cultivo, incluyendo, por

ejemplo, una célula inmortalizada o una célula transformada. Alternativamente, la célula de cultivo puede ser una que ha sido extirpada de un animal. "Replica in vivo" indica que el polinucleótido se replica en una célula dentro del cuerpo de un animal, por ejemplo un primate (incluyendo un chimpancé) o un humano. En algunos aspectos de la presente invención, la replicación en una célula puede incluir la producción de partículas víricas infecciosas, es decir, las partfculas vfricas que pueden infectar una célula y dar lugar a la producción de más partículas víricas infecciosas. [0011] Como se usa aqUí, el término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos, e incluye tanto ADN como ARN de cadena doble y sencilla. Un polinucle6tido puede incluir secuencias de nucle6tidos que tienen diferentes funciones, incluyendo, por ejemplo, las secuencias codificantes y secuencias no codifican tes tales como secuencias reguladoras y/o regiónes no traducidas. Un polinucleótido puede ser obtenido directamente a partir de una fuente natural, o se puede preparar con ayuda de técnicas recombinantes, enzimáticas, o químicas. Un polinucleótido puede ser de topología lineal o circular y puede ser, por ejemplo, una porción de un vector, tal como un vector de expresión o clonado, o un fragmento. [0012] Los términos "región codificante" y "secuencia codificante" se utilizan indistintamente y se refieren a una región de polinucleótido que codifica un polipéptido y, cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas, expresa el polipéptido codificado. Los límites de una región codificante están generalmente determinados por un codón de inicio de traducción en su extremo 5' y un codón de parada de

traducción en su extremo 3'. Una región codificante puede codificar uno o más polipéptidos. Por ejemplo, una región codificante puede codificar un polipéptido que se procesa posteriormente en dos o más polipéptidos. Una secuencia reguladora o región reguladora es una secuencia de nucleótidos que regula la expresión de una región codificante a la que está operativamente vinculada. Ejemplos no limitantes de secuencias reguladoras incluyen promotores, sitios de inicio de transcripción, sitios de inicio de traducción, sitios internos de entrada de ribosomas, sitios de parada de traducción, y terminadores. "Unido operativa mente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes asi descritos están en una relación que les permite funcionar en sus modos previstos. Una secuencia reguladora está "unida operativamente" a una región codificante cuando se une de tal manera que la expresión de la región codificante se consigue en condiciones compatibles con la secuencia reguladora. [0013] "Polipéptido", como se usa aquí, se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica de un poli mero de aminoácidos. Así, por ejemplo, los términos péptido, oligopéptido, proteina, poliproteina, proteinasa, y enzima se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Este término también incluye modificaciones post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Una "poliproteina del virus de la hepatitis C" se refiere a un polipéptido que se escinde después de la traducción para producir más de un polipéptido. [0014] Los términos " ARN 5' no traducido", "región 5' no traducida", '''región 5' no traducida", "región 5' no codificante" se utilizan indistintamente, y son términos de la técnica (ver Bukh et al., Proc. Na!.. Acad. Sci.. EE.UU., 89, 4.942-4.946 (1992)). El término se refiere a los nucleótidos que se encuentran en el extremo 5' de un polinucleótido capaz de replicación. [0015] Los términos '" ARN 3' no traducido", "región 3' no traducida", y "región 3' no traducida" se usan indistintamente, y son términos de la técnica. El término se refiere a los nucleótidos que se encuentran en el extremo 3' de un polinucleótido capaz de replicación. [0016] A menos que se especifique lo contrario, "un", "una", "el" y "al menos uno" se utilizan indistintamente y significan uno o más de uno.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

[0017]

Figura. 1. Organización de los replicones de VHC subgenómico dicistrónico seleccionables, Bpp-Ntat2ANeo/SI (idéntico a Ntat2Aneo/SI en Yi et al., Virol., 302, 197-210 (2002)), Htat2ANeo/SI, y Bpp-Htat2ANeo/SI, en el que la mayoría de las regiónes no estructurales de codificación de proteina y la NTR 3' se derivan de la secuencia de genotipo l' de H77c VHC. Los dos ORF grandes se muestran como rectángulos, con segmentos de ARN no traducidos mostrados como lineas. El segmento del ORF 3'ORF etiquetado 'pp' ('proteasa proximal') codifica el extremo amino terminal de la proteina NS3 (residuos 1 a 75). 'Bpp' indica que esta región se deriva de la secuencia Con1 VHC. Ambos replicones contienen la mutación S22041 en NS5A (S --+ 1). '!:J.' Indica la secuencia de ribozima de hepatitis delta introducida aguas abajo del extremo 3' de la secuencia de VHC que produce un extremo exacto 3'. Figura. 2. Ensayo transitorio de replicación de ARN VHC. Se muestra la expresión de SEAP por células EN5-3 después de transfección con el replicón 1 a quimérico Bpp-Htat2ANeo/SI y Bpp-Htat2ANeo/KRlSI, que lleva

una mutación adicional K1691R en NS3 que fue identificada tras la selección de células resistentes a G418 después de transfección con Bpp-Htat2ANeo/SI. Como controles, la expresión de SEAP se muestra después de la transfección de células con el replicon 1b de replicación altamente competente, Bpp-Ntat2ANeo/SI, y un mutante relacionado !:J.GDD de replicación defectuosa; también mostrado en la expresión de SEAP por células normales EN5-3. Los resultados mostrados representan los valores medios obtenidos de cultivos triplicados transfectados con cada ARN. SI, mutación adaptativa S2204; mutación adaptativa KR, K1691 R . Figura. 3 (A) Esquema que representa la organización del extremo 5' del segundo ORF en replicones quiméricos subgenómicos que contiene la mayorla (Bpp-H34A-Ntat2ANeo/SI) o toda (Hpp-H34ANtat2ANeo/SI) la secuencia codificante del genotipo 1a H77 NS34A en el fondo del genotipo 1 b Bpp

Ntat2ANeo/SI. La secuencia del Genotipo 1a (H77) se muestra como una caja abierta, la secuencia del genotipo lb (Con 1 o VHC-N) como una caja sombreada. 'Bpp' indica la presencia de la secuencia del genotipo 1 b de la cepa Con de VHC en la secuencia de codificación proximal 5' de la proteasa, mientras que 'Hpp' indica que esta secuencia se deriva de la secuencia de genotipo I H77. Ubicaciones aproximadas se muestran para las mutaciones adaptativas 01 067R (O -+ R) Y G1188R (G -+ R), identificadas en clones celulares resistentes a G418 seleccionadas tras la transfección de Hpp-H34A-Ntat2ANeo/SI. La actividad (B) SEAP presente en fluidos de cultivo sobrenadantes recogidos a intervalos de 24 h después de la transfección de células EN5-3 con varios replicones 1a-1b quiméricos incluyendo Bpp-H34A-Ntat2ANeo/SI, HPP-H34ANtat2ANeo/SI, Hpp-H34A-Ntat2ANeo/ORISI, y Hpp-H34A-Ntat2ANeo/GRISI. Las células de control se transfectaron con Bpp-Ntat2ANeo/SI y el mutante Ll.GDD de replicación defectuosa. Véase la leyenda de la figura 2 para más detalles. SI, mutación adaptativa S2204, OR, mutación adaptativa 01067R, y GR, mutación adaptativa G1188R. Figura 4. Impacto de las mutaciones adaptativas en competencia para la replicación del genotipo 1a subgenómico, Htat2ANeo/SI. (A) Localización de diversas mutaciones adaptativas en el segundo ORF (derivado enteramente de la secuencia del genotip01a H77): 01067R, P1496L (NS3); K1691R (NS4A); Y F2080V Y S22041 (NS5A). (B) Ensayo de replicación transitoria de ARN de VHC. La actividad SEAP en sobrenadantes de cultivo recogidos a intervalos de 12 a 24 h después de electroporación de células EN5-3 con el replicón 1a Htat2ANeo que realiza las combinaciones indicadas de las mutaciones adaptativas mostrados en el panel A. Las células también fueron transfectadas con ARN replicón del genotipo 1 b Bpp-Ntat2ANeo/SI como referencia. (C) Resumen de los fenotipos de replicación de ARNs de replicón Htat2ANeo de genotipo 1 a que contienen diversas combinaciones de las mutaciones adaptativas: (-) sin replicación detectable, (+) modesto aumento en la expresión de SEAP por encima del fondo días 3-5, y (+ + +» aumento de 10 veces en la expresión de SEAP por encima del fondo 7 días después de la transfección en el ensayo de replicación transitoria (véase panel B). SI, mutación adaptativa S2204; OR, mutación adaptativa 01067R; PL, mutación adaptativa P1496L; KR, K1691R adaptativa K1691R, y FV, mutación adaptativa F2080V. Figura. 5. Las mutaciones adaptativas dentro de la poliproteína no influyen en la eficacia de la traducción de la poliproteina bajo el control de la EMCV IRES. Se muestra un gel SDS-PAGE cargado con productos de reacciones de traducción in vitro programadas con ARNs derivados de BPP-Ntat2ANeo (via 1), BPPHtat2ANeo (vi as 2 y 3), Htat2ANeo (vias 4 a 8), o Bpp-Ntat2ANeo/AGDD (via 9) los ARN llevan varias combinaciones de mutaciones adaptativas (01067R, K1691R,F2080V o S22041) como se indica. El esquema en la parte superior de la figura indica la localización de estas mutaciones dentro de la poliproteína. 'pp' indica el segmento de ARN que codifica los 75 residuos amino terminales de NS3, mientras que 'NS' indica el resto del segmento de ARN que codifica las proteínas no estructurales. H = secuencias de genotipo 1a H77, B = secuencias de genotipo 1 b con1, y N = secuencias de VHC-N de genotipo 1 b . La ubicación de NS3 y producto Neo se indica en el lado del gel. Figura 6. Impacto de mutaciones adaptativas adicionales sobre capacidad del replicón subgenómico del genotipo 1a, Htat2ANeo/ORlKRlSI (ver fig. 4). (A) Localización de diversas mutaciones adaptativas en el segundo ORF (derivado por completo de la secuencia H77 del genotipo 1a): 01067R, V16551 (NS3); K1691R

(NS4A); K2040R y (KR5A), F2080V y S22041 (NS5A). (B) Ensayo de replicación transitoria de ARN del VHC. La actividad SEAP en sobrenadantes de cultivos recogidos a intervalos de 12 a 24 h después de electroporación de células EN5-3 con el replicón Htat2ANeo llevando las combinaciones indicadas de las mutaciones de adaptación mostrados en el panel A Las células también fueron transfectadas con ARN replicón Bpp-Ntat2ANeo/SI del genotipo 1b como referencia. QR, mutación adaptativa Q1067R, VI, mutación adaptativa V16551, KR, Mutación adaptativa K1691R; KR5A, mutación adaptativa K2040, FV, mutación adaptativa F2080V, y SI, mutación adaptativa S22041. Figura 7. El análisis Northern de la abundancia de ARN VHC 4 días después de la transfección de las células normales Huh7 o EN5-3 con ARN de VHC con longitud indicada de genoma subgenómico dicistrónico y monocistrónico: (via 1), células normales; (vía 2), el replicón subgenómico, Htat2ANeo/SI; (vias 2-5), ARNs replicones de Htat2ANeo/SI que llevan las combinaciones indicadas de mutaciones; (via 6), Htat2ANeo/QRlVIIKR 11 KR5A1SIIAAG no replicantes; (via 7) ARN H77c de longitud de genoma; (Vias 8-10), ARN H77c de longitud de genoma que contienen las combinaciones indicadas de mutaciones; (via 11), ARN

H77 de longitud de genoma que contiene la mutación letal NS5B; (Vias 12 y 13) transcriptos de subcontrol de ARN genómico y sintético de longitud de genoma. Los blols se sondaron con una sonda de genotipo 1a derivada de la secuencia de codificación de NS5B para la detección de la secuencia específica de VHC (paneles superiores); los blots se sondaron también para el mensaje de b-actina para evaluar la carga de ARN (paneles inferiores). En la parte superior de la figura se muestra las actividad SEAP en el liquido de cultivo sobrenadante de células EN5-3 inducida mediante la replicación de los ARN subgenómicos en el momento de la recogida de células. SI, mutación adaptativa S2204; QR, mutación adaptativa Q1067R; KR, mutación adaptativa K1691R , Y FV, mutación adaptativa F2080V.

Figura 8. Estructura de la enzima compleja NS3/4 de serina proteasa/helicasa derivada de la cepa de VHC de genotipo 1b BK (PDP 1CU1), con las ubicaciones resaltadas de las mutaciones adaptativas. (A) Diagrama de la estructura mostrando el dominio de helicasa NS3 (H) y el dominio de la proteasa (P). El polipéptido cofactor NS4A (NS4A) se muestra en la vista del espacio completo, con los residuos de proteasa NS3 de sitio activo (Sitio Activo) que se muestran en la vista de espacio completo. Las mutaciones adaptativas identificadas en este estudio (Q1067, G1188, V1655 y K1691) se agrupan cerca del sitio activo de la proteasa o en sitios involucrados en el reconocimiento del sustrato, incluyendo las mutaciones en el dominio de la proteasa NS3 a Gln-1067, Gly-1 188 y cerca del terminal carboxilo de NS3 en el dominio de la helicasa en Val-1655. La mutación adaptativa NS4A en Lys-1691 está justo más allá de la superficie de la proteasa, en el lugar de salida de la hebra NS4A Las mutaciones adaptativas dentro del dominio de la helicasa NS3 que fueron identificados en otros estudios, S1222, A1226, y P1496 se muestran en la vista de espacio completo, y no están cerca del sitio activo de la proteasa. (B) Vista de espacio completo de la estructura que se muestra en el panel A, en la que las mutaciones adaptativas y el sitio activo tienen sombreado similar. Las mutaciones adaptativas NS3/4A identificadas en este estudio (Q1067R, G1188R, V16551 y K1691 R) ocurrirán en residuos de disolvente accesible en este lado de la molécula. (C) Vista basculante de la estructura que se muestra en el panel B, girada unos 180 grados. Las mutaciones adaptativas de la helicasa identificadas en estudios anteriores se encuentran en la superficie de la helicasa, distante del sitio activo de la proteasa. Hay que mencionar que en la secuencia de la cepa de VHC del genotip01 b BK, Pro-1496 es Arg (denominado P1496

(R) en la figura, y Lys-1691 es Ser (denominado K1691 (S) en la figura). Figura 9. Secuencia de nucleótidos de HIVSEAP (SEC ID N°: 7). La repetición del terminal largo del VIH (LTR) se representa en nucleótidos 1-719, y la fosfatasa secretora alcalina se codifica por los nucleótidos 748 a 2239.

La Figura 10. 10A, Secuencia de nucleótidos de un NTR 3" (SEC ID N°: 8); 10B, secuencia de nucleótidos de un NTR 5' (SEC ID N 0: 9). Figura 11. 11A, secuencia de nucleótidos de un us de la hepatitis C de longitud genómica (longitud completa), genotipo 1a (SEC ID N 0: 11); 11B, secuencia de aminoácidos de la poliprotelna del VHC (SEC ID N°: 12) codificada por la región codificante presente en la SEC ID N 0: 11. Figura 12. 12A, Secuencia de nucleótidos de Htat2ANeo (SEC ID N 0: 13), donde los nucleótidos 1-341 son las NTR 5' , los nucle6tidos 342-1454 son los tat2ANeo (codón de terminación en 1455-1457), los nucle6tidos 1458 -2076 son el EMCV IRES, los nucleótidos 2080-8034 codifican la poliprotelna de HCY (codón de iniciación en los nucleótidos 2077 a 2079 y codón de terminación en los nucleótidos 8035-8037), los nucleótidos 8038-8259 son los NTR 3', Y los nucleótidos 8.260-8.345 son el ribozima delta HDV (las secuencias de vector de plásmido se muestran en los nucleótidos desde 8.346 -11.240); 12B, la secuencia de aminoácidos de la pOliprotelna del VHC (SEC ID N°: 14) codificada por la región codificante presente en SEC ID N": 13. Figura 13. Nucle6tidos (SEC ID N°: 1) de la cepa H77 del virus de la hepatitis C y secuencia de aminoácidos (SEC ID W: 2) codificada por los nucleótidos 342-9377. Figura 14. Nucleótidos (SEC ID N°: 3) de la cepa H del virus de la hepatitis C y secuencia de aminoácidos (SEC ID W: 4) codificada por los nucleótidos 342-9377.

Descripción detallada de realizaciones preferidas de la invención [0018] La presente invención proporciona polinucleótidos capaces de replicación según la reivindicación 1. Los polinucleótidos incluyen una región no traducida (NTR) 5' una NTR 3', Y una secuencia codificante presente entre la NTR 5' Y NTR 3'. Los polinucleótidos capaces de replicación de la presente invención se basan en los virus de la hepatitis C (VHC), un virus de cadena positiva. Mientras que la capacidad de un polinucleótido para replicar normalmente requiere la presencia del polinucleotido ARN de cadena positiva en una célula, se entiende que el término "polinucleótido capaz de replicación" también incluye el complemento del mismo (es decir, el ARN de sentido negativo), y las correspondientes secuencias de ADN de las secuencias de ARN de sentido positivo y sentido negativo. Opcionalmente, un polinucleótido capaz de replicación puede ser aislado. "Aislado" designa un material biológico, por ejemplo, un polinucleótido, polipéptido o partícula de virus, que se ha retirado de su entorno natural. Por ejemplo, un virus que ha sido retirado de un animal o de células cultivadas en las que el virus fue propagado es un virus aislado. Un polipéptido o polinucleótido aislado significa un polipéptido o polinucleótido que ha sido bien retirado de su entorno natural, producido con técnicas recombinantes o de slntesis qulmica o enzimática. Un material biológico "purificado" es uno que es al menos 60% libre, preferiblemente 75% libre, y lo más preferible 90% libre de otros componentes con los que está naturalmente asociado. [0019] La secuencia de codificación codifica una poliproteína del virus de la hepatitis C. En algunos aspectos de la invención, la poliproteina VHC puede producir los siguientes polipéptidos; núcleo (también conocido como C o nucleocápside), E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B. Opcionalmente, una poliprotelna VHC de longitud completa también produce proteína F (ver Xu et al., EMBO J., 20, 3.840-3.848

(2.001). En algunos aspectos de la presente invención, una poliproteína VHC se acorta y da un subconjunto de polipéptidos, y por lo general no incluye polipéptidos codificados por el extremo tenminal amino de la poliproteina VHC de longitud completa. Por lo tanto, una poliprotelna del virus de la hepatitis C puede codificar los polipéptidos E 1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, Y NS5B; E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B; P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B; NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B, o NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B. El virus de la hepatitis C que codifica tal poliprotelna VHC acortada puede ser denominado como un virus de la hepatitis C subgenómico, y la poliproteina VHC acortada puede ser denominada como una poliproteína VHC subgenómica. En otros aspectos de la invención, un polinucleótido capazde replicación codifica una poli proteína VHC que no incluye polipéptidos presentes en una porción interna de una poliproteina de virus de la hepatitis C. Por lo tanto, una poli proteína de virus subgenómico de

5 hepatitis C puede codificar, por ejemplo, los polipéptidos NS3, NS4A, NS4B, Y NS5B [0020] En aquellos aspectos de la invención en donde el polinucleótido capaz de replicación incluye una región codificante que codifica menos de una poli proteína VHC de longitud completa, el extremo 5' de la región codificante que codifica la poli proteína del VHC puede incluir, además, unos 33 a unos 51 nucleótidos, o unos 36 a unos 48 nucleótidos, que codifican los primeros unos 11 a unos 17, o unos 12 a unos 16, aminoácidos del

10 polipéptido del núcleo. El resultado es un polipéptido de fusión formado por aminoácidos amino terminales del polipéptido de núcleo y el primer polipéptido codificado por el primer producto de escisión de la poliprotelna, por ejemplo, E1, o E2, o P7, o NS2, etc [0021] Un poliprotelna que puede producir el núcleo, polipéptidos E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B (una poliprotelna de longitud completa) es normalmnte de entre unos 3000 y 3033 aminoácidos de

15 longitud, preferiblemente unos 3011 aminoácidos ácidos de longitud. La relación entre dicha poli proteína y los correspondientes residuos de los polipéptidos individuales resultantes después del procesamiento posttraduccional se muestra en la Tabla 1. Este sistema de numeración se usa aquí cuando se refiere a una poliproteína de longitud completa, y cuando se hace referencia a una poliproteína que contiene una porción de la poliprotelna de longitud completa. Por ejemplo, en aquellos aspectos de la invención en donde el

20 polinucleótido capaz de replicación incluye una secuencia de codificación que codifica una poliproteína del VHC que produce los productos de escisión NS3, NS4A, NS4B, NS5A Y NS5B y no hay polipéptido de fusión compuesto de amino ácidos de terminal amino del polipéptido del núcleo y el producto de escisión NS3, el primer aminoácido del polipéptido NS3 se considera que es aproximadamente el residuo numero 1027. Una persona de experiencia ordinaria en la técnica reconoce que este sistema de numeración puede variar entre

25 elementos de diferentes genotipos, y entre elementos del mismo genotipo, por tanto los números que se muestran en la Tabla 1 son aproximados y pueden variar en 1, 2, 3, 4, o unos 5. Tabla 1. Correspondencia entre aminoácidos de poliprotelna y polipéptidos individuales después del procesamiento [0022] Un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención incluye las mutaciones adaptativas como se definen en la Reivindicación 1. Como aqui se usa, una mutación adaptativa es un cambio en la secuencia de aminoácidos de la poliprotelna que aumenta la capacidad de un polinucleótido capaz de replicación para replicar en comparación con un polinucleótido capaz de replicación que no tiene la mutación adaptativa. Una mutación adaptativa que incluye un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención es una isoleucina en aproximadamente el aminoácido 2204, que es aproximadamente el aminoácido 232 de NS5A. La mayoría de aislados clfnicos de VHC y cepas de laboratorio de VHC molecularmente

Aminoácidos de Poliproteinaa VHC

Polipéptido correspondiente tras el procesamiento

1-191

Núcleo

192-383

E1

384-746

E2

747-809

P7

810-1 026

NS2

1027-1657

NS3

1658-1711

NS4A

1712-1 972

NS4B

1973-2420

NS5A

2421-301 1

NS5B

aSe refiere al número aproximado de aminoácidos antes de la escisión de la poliproteína en donde el primer aminoácido es el primer aminoácido de la poliprotelna expresada por el VHC

clonadas incluyen una serina en esta posición, y esta mutación ha sido referida en la técnica como S22041. En la mayoría de los polinucleótidos capaces de replicación, la ubicación de esta mutación adaptativa puede también determinars localizando el principio de la secuencia de aminoácidos SSSA en aproximadamente el aminoácido 2200 en la poliproteina VHC, donde el aminoácido inmediatamente siguiente de la secuencia de SSSA es isoleucina. [0023] Un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención también incluye una arginina en aproximadamente el aminoácido 1067, que es aproximadamente el aminoácido 41 de NS3. La mayoría de los VHC aislados clfnicamente y cepas de laboratorio del VHC clonadas molecularmente incluyen una glutamina en esta posición, por tanto esta mutación puede ser referida como Q1067R. En la mayorla de los

polinucleotidos capaces de replicación, la ubicación de esta mutación adaptativa también puede determinarse localizando el principio de la secuencia de aminoácidos STAT en aproximadamente el aminoácido 1063 de la poliprotelna del VHC, donde el aminoácido inmediatamente después de la secuencia STAT es arginina. Una mutación adaptativa opcional es una arginina en aproximadamente el aminoácido 1691, que está cerca del aminoácido 34 de NS4A. La mayorla de los aislados clinicos de VHC y cepas de VHC de laboratorio molecularmente clonadas incluyen una lisina en esta posición, por tanto esta mutación puede ser referida como K1691R. En la mayorla de los polinucleótidos capaces de replicación, la ubicación de este mutación adaptativa también se puede determinar mediante la localización del principio de la secuencia de aminoácidos VLSG en aproximadamente el aminoácido 1687 en la poliprotelna del VHC, en donde el aminoácido inmediatamente después de la secuencia de VLSG es arginina. Un mutación adaptativa opcional es una valina en aproximadamente el aminoácido 2080, que está cerca del aminoácido 108 de la NS5A. La mayoría de los aislados clinicos de VHC y cepas de VHC de laboratorio molecularmente clonadas incluyen una fenilalanina en esta posición, por lo que esta mutación puede ser referida como F2080V. En la mayorla de los polinucleótidos capaces de replicación, la ubicación de esta mutación adaptativa también puede determinarse localizando el principio de la secuencia de aminoácidos ALWR aproximadamente en el aminoácido 2081 en la poliprotelna del VHC, donde el aminoácido inmediatamente anterior a la secuencia de ALWR es valina. Una mutación adaptativa opcional es una isoleucina en aproximadamente el aminoácido 1655, que está cerca del aminoácido 629 de NS3. La mayorla de los VHC aislados clinicamente y las cepas VHC de laboratorio clonadas moleculamente incluyen una valina en esta posición, por tanto esta mutación puede ser referida como V16551. En la mayoría de los polinucleótidos capaces de replicación, la ubicación de esta mutación adaptativa también se puede determinar localizando el principio de la secuencia de aminoácidos ADLE en aproximadamente el aminoácido 2051 de la poliproteína VHC, en donde el aminoácido inmediatamente después la secuencia ADLE es isoleucina. Una mutación adaptativa opcional es una arginina en aproximadamente el aminoácido 2040, que está cerca del aminoácido 68 de NS5A. La mayoría de los VHC aislados clínicamente y cepas de laboratorio del VHC molecularmente clonadas incluyen una lisina en esta posición, por lo que esta mutación puede ser referida como K2040R. En la mayorla de los polinucleótidos

capaces de replicación, la ubicación de esta mutación adaptativa también puede ser determinada localizando el inicio de la secuencia de aminoácidos GHVXN en aproximadamente el amino ácido 2037 en la poliproteína VHC, donde la X en el aminoácido es arginina. Una mutación adaptativa opcional es una arginina en aproximadamente el aminoácido 1188, que es aproximadamente el aminoácido 162 de la NS3. La mayoría de 5 los aislados clinicos de VHC y cepas de laboratorio de VHC molecularmente clonadas incluyen una glicina en esta posición, por lo tanto esta mutación puede ser referida como G1188R. En la mayoría de los polinucleótidos capaces de replicación, la ubicación de esta mutación adaptativa también se puede determinar localizando el inicio de la secuencia de aminoácidos VCTR en aproximadamente el aminoácido 1184 de la poliproteína VHC. En algunos aspectos, el polinucleótido capaz de replicación de la presente invención incluye

10 las mutaciones adpatativas Q1067R y K1691R, así como la mutación adaptativa S22041. Estas mutaciones adaptativas se resumen en la Tabla 2. Una persona de habilidad ordinaria en la técnica reconoce que la ubicación precisa de estas mutaciones adaptativas de cultivo de células pueden variar entre elementos de diferentes genotipos, y entre elementos del mismo genotipo, por lo tanto los números que se muestran en la Tabla 2 son aproximados, y pueden variar en 1,2,3,4, o alrededor de 5.

Tabla 2. Mutaciones adaptativas 2

Símbolo' Proteina / Residu0 Mutación3

QR NS3/41 Q1067R GR NS3/142 G1188R VI NS3/629 V16551 KR NS4A134 K1691R

KR5A

NS5A168 K2040R FV NS5A1108 F2080V SI NS5A1238 S22041

1 Simbolo usado para designar la presencia en transcritos ARN.

20 2 Residuo se refiere a la posición en la proteína después de escisión posterior a la traducción de la poliproteína H77c (número de acceso GenBank AF011751). 3Número se refiere a la posición de la mutación en la poliproteína H77c antes de la escisión post-traduccional (número de acceso GenBank AF011751).

[0024] Hay muchas otras mutaciones adaptativas conocidas en la técnica, y los polinucleótidos capaces de replicación de la presente invención pueden incluir una o más de las mutaciones adaptativas. Ejemplos de mutaciones adaptativas conocidas pueden encontrarse en, por ejemplo, Bartenschlager (patente US 6.630.343), Blight Y col. (Science, 290, 1972-1975 (2000)), Lohmann et al., (Abstract P038, 7" Reunión Internacional sobre el virus de la hepatitis C y virus relacionados (Virología Molecular y Patogénesis), 30 Diciembre 03 al 07 (2000)), Guo et al. (Abstract P045, 7" Reunión Internacional sobre el virus de la hepatitis C y virus relacionados (Virología Molecular y Patogénesis), diciembre 3-7 (2000)), Tizón et al., (J. Virol 77, 3181 a 3190 (2003)), Gu et al., (. J. Virol 77, 5352 a 5359 (2003), Y Grobler y col., (J. Biol.. Chem .. , 278, 16.741

16.746 (Feb, 2003). [0025] Se espera que los polinucleótidos que codifican una poliproteína VHC puedan obtenerse de diferentes

35 fuentes, incluyendo cepas de laboratorio molecularmente clonadas, por ejemplo, clones cADN de VHC, y aislados clinicos. Ejemplos de cepas de laboratorio molecularmente clonadas incluyen el VHC que está codificado por PCV-H77C (Yanagi et al., Proc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU., 94, 8.738 hasta 8.743 (1997), número de acceso Genbank AF01 1751, SEC ID N 0: 1), y pVHC-H (Inchauspe et al., Proc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU., 88,10292-10296 (1991 ), número de acceso Genbank M67463, SEQ ID NO: 3). Los aislados clínicos pueden proceder de una fuente de VHC infecciosa, incluyendo muestras de tejido, por ejemplo a partir de sangre, plasma, suero, biopsia de hígado o leucocitos, a partir de un animal infectado, incluyendo un humano

o un primate. También se espera que el polinucleótido que codifica la poli proteína VHC presente en un polinucleótido capaz de replicación se pueda preparar mediante procedimíentos recombínantes, enzímáticos, o químicos. La secuencia de nucleótídos de cepas de laboratorio molecularmente clonadas y aislados clínicos puede ser modificada para codificar una poliproteina del VHC que incluya la mutación adaptativa S22041, la mutación adaptativa Q1067R y, opcionalmente, una o más de las mutaciones adaptativas aquí descritas. Tales métodos son rutinarios y conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, mutagénesis PCR. [0026] La presente invención incluye además polinucleótidos capaces de replicación que codifican una poliproteina VHC con al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 4 (en el caso de una poli proteína de longitud completa), o una porción de la misma (en el caso de una poliproteina VHC que codifique, por ejemplo, NS3, NS4A, NS4B, NS5A,y NS5B, y no codificando núcleo, E1, E2, P7, Y NS2). La similitud se conoce como similitud estructural y se determina generalmente alineando los residuos de las dos secuencias de aminoácidos (es decir, una secuencia de aminoácidos candidata y la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 2, SEC ID N° 4, o una porción de la misma) para optimizar el número de aminoácidos idénticos a lo largo de las longitudes de sus secuencias; huecos en cualquiera o ambas secuencias están permitidos al hacer la alineación para optimizar el número de aminoácidos idénticos, aunque los aminoácidos en cada secuencia, sin embargo, deben permanecer en el orden correcto. Una secuencia de aminoácidos candidata es la secuencia de aminoácidos que se compara con una secuencia de aminoácidos presente en la SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 4, o una porción de la misma. Una secuencia de aminoácidos canddata puede aislarse de una célula infectada con un virus de la hepatitis C, o puede producirse usando técnicas recombinantes, o sintetizada química o enzimáticamente. Preferiblemente, se comparan dos secuencias de aminoácidos utilizando el programa BLASTP del algoritmo de búsqueda BLAST 2, como se describe por Tatusova, et al. (FEMS Microbiol Lett 1999, 174:247-250), y está disponible en http://www.ncbLnlm.nih.gov/gorf/b12.html. Preferentemente, se utilizan los valores por defecto para todos los parámetros de búsqueda BLAST 2, incluyendo la matriz=BLOSUM62; penalización por hueco abierto= 11, penalización por extensión de hueco=1, hueco x caida=50, espera=10, tamaño=3, y opcionalmente, filtrado. En la comparación de dos secuencias de aminoácidos utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST, las similitudes estructurales se conocen como "identidades". Una poliproteina VHC tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud estructural con SEC ID N° 2, SEC ID N° 4, o una porción de la misma, de al menos aproximadamente 90%, por ejemplo identidad del 91 %, 92%, 93% Y así hasta 100% de identidad. Un polinucleótido capaz de replicación que tiene un NTR 5' de SEC ID N° 9, un 3' NTR de la SEC ID N°: 8, y poli proteína del VHC con similitud estructural con SEC ID N° 2, SEC ID N° 4, o una porción de la misma, es capaz de replicación en una célula derivada de un hepatoma humano tal como Huh-7 y Huh-7.5. Una poliproteína de VHC con una similitud estructural con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 2, SEC ID N° 4, o una porción de la misma, incluye la mutación adaptativa S22041, la mutación adaptativa Q1067R y, opcionalmente, una o más de las mutaciones adaptativas aquí descritas. Tal poliproteina de VHC puede incluir opcionalmente otras mutaciones adaptativas. [0027] Un polinucleótido que codifica una poliprotelna VHC presente en un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención es genotipo 1a (como se definió por Simmonds, Hepatología 21, 570-583 (1995)). En

otros aspectos, la poliprotelna VHC es genotipo 1 a. Los métodos para determinar el genotipo de un virus de hepatitis C son rutinarios y conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, serotipar e la partícula de virus utilizando anticuerpo, y/o evaluar la secuencia de nucleótidos mediante, por ejemplo, ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (véase Simmonds, J. Hepatol., 31 (Supl. 1) ,54-60 (1999)). [0028] La presente invención incluye polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos que tiene similitud con la poliproyeina VHC. La similitud se conoce como similitud estructural y se determina alineando los residuos de dos polinucleótidos (por ejemplo, la secuencia de nucle6tidos de la región codificante candidata y los nucleótidos 342 a 9377 de la SEC ID N° 2: o los nucleótidos 342 -9377 de la SEC ID N° 3) para optimizar el número de nucleótidos idénticos a lo largo de las longitudes de sus secuencias; huecos en cualquiera o ambas secuencias están permitidos al hacer la alineación para optimizar el número de nucleótidos compartidos, aunque los nucleótidos en cada secuencia, sin embargo, deben permanecer en el orden correcto. Una región codificante candidata es la región codificante comparada a una región codificante

presente en SEC ID N" 1 (por ejemplo, nucleótidos 342 -9377 de la SEC ID N° 1). Una secuencia de nucleótidos candidata puede aislarse a partir de una célula, o puede ser producida por técnicas recombinantes, o sintetizada quimica o enzimáticamente. Preferiblemente, dos secuencias de nucleótidos se comparan utilizando el Programa Blastn del algoritmo de búsqueda BLAST 2, como se describe por Tatusova, et al. (FEMS Microbiol Lett 1999, 174:247-250), y está disponible en http://www.ncbl.nlm.nih.gov/gorf/bI2.html.

Preferiblemente, se usan los valores por defecto para todas los parámetros de búsqueda BLAST 2, incluyendo recompensa por coincidencia = 1, penalización por falta de coincidencia = -2, penalización por hueco abierto= 5, penalización por extensión de hueco = 2, hueco x caida = 50, espera = 10, tamaño= 11, Y opcionalmente, filtro. En la comparación de dos secuencias de nucle6tidos utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST, semejanza estructural se conoce como "identidades". [0029] La presente invención también incluye polinucleótidos que codifican las poliproteínas VHC aqui descritas, incluyendo, por ejemplo, las poliproteínas que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC

ID N° 2 Y SEC ID N" 4. Un ejemplo de la clase de las secuencias de nucleótidos codificantes de cada una de estas poliproteinas son los nucleótidos 342 -9377 de la SEC ID N 0: y los nucleótidos 342 -9377 de la SEC ID N° 3, respectivamente. Estas clases de secuencias de nucleótidos son grandes pero finitas, y la secuencia de nucleótidos de cada miembro de la clase puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica por

referencia al código genético estándar. [0030] Un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención incluye una región 5' no traducida (NTR) (véase Smith et al., J. Gen. Vi rol. , 76, 1749-1761 (1995)). Una 5' NTR es típicamente de unos 341

nucleótidos de longitud. Un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención también incluye una NTR 3'. Una 3' NTR incluye trpicamente, de 5' a 3', nucleótidos de longitud variable y una secuencia (referida como la región variable), un tracto poli-pirimidina (la región poli U-UC), y una secuencia altamente conservada de unos 100 nucleótidos (la región conservada) (ver, por ejemplO, Lemon et al., EE.UU. Aplicación Publicada EE.UU. 2003 0125541 Y Yi Y Lemon, J. Vi rol. , 77, 3557-3568 (2003)). La región variable comienza aproximadamente en el primer nucleótido después del codón de parada de la poliproteina VHC, y generalmente termina inmediatamente antes de los nucleótidos de la región poli U-UC. La región poli T-UC es

un tramo de residuos predominantemente U, residuos CU, o repeticiones C(U)n. Cuando se compara la secuencia de nucleótidos de una región variable entre elementos del mismo genotipo, en general hay una gran cantidad de similitudes, sin embargo, en general hay muy poca similitud en la secuencia de nucleótidos de las regiónes variables entre elementos de diferentes genotipos (ver, por ejemplo, Yamada et al., Virología,223, 255-261 (1996)).

[0031] Se espera que un 5' NTR Y un 3' NTR puedan ser obtenidos de diferentes fuentes, incluyendo cepas de laboratorio molecularmente clonadas, por ejemplo, clones de ADNc de VHC, y aislados clínicos. Ejemplos de cepas de laboratorio molecularmente clonadas incluyen la VHC que está codificada por pCV-H77C (Yanagi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. EE.UU., 94, 8.738 a 8.743 (1997), número de acceso GenBank AF011751, SEC ID N° 1, en donde los nucleótidos 1-341 son la 5' NTR Y nucleótidos 9378-9599 son la NTR 3'), Y pVHC-H (Inchauspe et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. EE.UU., 88, 10292-10.296 (1991), número de acceso GenBank M67463, SEC ID N° 3, en donde los nucle6tidos 1-341 son la 5' NTR Y los nucleótidos 9.378 a 9.416 son las 3' NTR). Los aislados clfnicos pueden ser de una fuente de VHC infecciosa, incluyendo muestras de tejido, por ejemplo de sangre, plasma, suero, biopsia de hlgado, o leucocitos, de un animal infectado, incluyendo un humano o un primate. También se espera que el polinucleótido que codifica la poliprotelna VHC presente en un polinucleótido capaz de replicación se pueda preparar mediante técnicas recombinantes, enzimáticas, o químicas. [0032] La 5' NTR Y 3' NTR presente en un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención es genotipo 1a (tal como se define por Simmons, Hepatology, 21, 570-583 (1995)). La poliproteina VHC es del genotipo 1 a. Los métodos para determinar el genotipo de una 5' NTR Y 3' NTR son rutinarios y conocidos en la técnica e incluyen la evaluación de la secuencia de nucleótidos para nucleótidos especificos que son caracterlsticos de un genotipo especifico. [0033] En algunos aspectos de la invención, un polinucleótido capaz de replicación incluye una región codificante secundaria. La secuencia codificante secundaria puede estar presente en la 3' NTR, por ejemplo, en la región variable de la 3' NTR. En algunos aspectos de la invención, la región secundaria de codificación está presente en la región variable de tal manera que la región variable no es eliminada. Alternativamente, la región secundaria de codificación sustituye a la región variable en su totalidad o en parte. Las regiónes secundarias de codificación pueden ser insertadas en la región variable entre los nucleótidos 5 y 6 de la secuencia 5' CUCUUAAGC 3', donde la secuencia mostrada corresponde a la cadena positiva. [0034] En algunos aspectos de la invención, la segunda región codificante está presente en un polinucleótido capaz de replicación aguas abajo de la NTR 5', y aguas arriba de la primera región codificante, es decir, la región codificante que codifica una poliproteina VHC. Por ejemplo, el primer nucleótido de la segunda región codificante puede ser inmediatamente posterior y adyacente al último nucleótidos de la 5' NTR. Alternativamente, el primer nucleótido de la segunda región codificante puede estar más aguas abajo del último nucleótido de la 5' NTR, por ejemplo, unos 2 a unos 51 nucleótidos, aproximadamente 33 a unos 51 nucleótidos, o alrededor de 36 a alrededor de 48 nucleótidos posteriores al último nucleótido de la 5' NTR. Típicamente, cuando el primer nucleótido de la segunda región codificante no es inmediatamente posterior al último nucleótido de la NTR 5', los nucleótidos entre el 5' NTR Y la segunda región codificante codifican los aminoácidos amino-terminales del núcleo del polipéptido VHC. Por ejemplo, el extremo 5' de la segunda región codificante puede incluir, además, unos 33 a unos 51 nucleótidos, o unos 36 a unos 48 nucleótidos, que codifican los primeros cerca de 11 a unos 17, o unos 12 a unos 16, aminoácidos del polipéptido del núcleo. El resultado es un polipéptido de fusión compuesto de amino ácidos amino-terminales del polipéptido de núcleo y los polipéptidos codificados por la segunda región codificante (ver, por ejemplo, Yi et al., viral., 304, 197-210 (2002), Y Solicitud publicada US 2003 0125541). Sin pretender ser limitativos, se cree que la presencia de los nucleotiodos de la secuencia de codificación de núcleo actuan para potenciar la traducción del polipéptido codificado por la segunda región codificante [0035] En aquellos aspectos de la invención donde la segunda región codificante presente en un polinucleótido capaz de replicación está presente aguas abajo de la NTR 5' y aguas arriba de la región codificante que

codifica la poliprotelna del VHC, el polinucleótido capaz de replicacion normalmente incluye una región reguladora unida operativamente a la región codificante posterior, por ejemplo, la región codificante que codifica la poliproteína del VHC. Preferiblemente, la región reguladora proporciona la traducción de la región codificante aguas abajo. El tamaño de la región reguladora puede ser de unos 400 nucleótidos a unos 800 nucleótidos, más preferiblemente, de unos 600 nucleótidos a unos 700 nucleótidos. Tfpicamente, la región

reguladora es un IRES. Se describen en este documento ejemplos de elementos IRES.

[0036] La segunda región codificante puede codificar un polipéptido que incluye, por ejemplo, un marcador, incluyendo un marcador detectables y/o un marcador seleccionable. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen moléculas que tienen una actividad enzimática detectable, por ejemplo, secreción de fosfatasa alcalina, moléculas que tienen una fluorescencia detectable, por ejemplo, proteinas fluorescentes verde o rojas

o azules, y moléculas que pueden ser detectadas por anticuerpo. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen moléculas que confieren resistencia a antibióticos capaces de inhibir la replicación de células eucariotas, incluyendo los antibióticos kanamicina, ampicilina, cloramfeinicol, tetraciclina, blasticidina, neomicina, y formulaciones de fleomicina D1 incluyendo, por ejemplo, la formulación disponible bajo el nombre comercial ZEOCIN (Invitrogen, Carlsbad, California). Las secuencias codificantes que codifican tales marcadores se conocen en la técnica. Otros ejemplos de polipéptidos que pueden ser codificados por la segunda región codificante incluyen un transactivador, y/o un polipéptido de fusión. Preferiblemente, cuando el polipéptido es un polipéptido de fusión, la segunda región codificante incluye nucleótidos que codifican un marcador, más preferiblemente, nucleótidos que codifican una fusión entre un transactivador y un marcador. Los transactivadores se describen aquí a continuación. Opcionalmente, la región codificante puede codificar un polipéptido inmunogénico. Un polinucleótido capaz de replicación que contiene una segunda región codificante es normalmente dicistrónico, es decir, la región codificante que codifica la poliprotefna VHC y la segunda región codificante están separadas. [0037] Un "polipéptido inmunogénico" se refiere a un polipéptido que provoca una respuesta inmunológica en un animal. Una respuesta inmunológica a un polipéptido es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpo al polipéptido. Por lo general, una respuesta inmunológica incluye, pero no se limita a uno o más de los los siguientes efectos: producción de anticuerpos, células B, células T cooperadoras, células T supresoras, y/o células T citotóxicas, dirigidos específicamente a un epftopo o epftopos del fragmento de polipéptido. [0038] Un transactivador es un polipéptido que afecta en trans la expresión de una región codificante, preferiblemente una región codificante integrada en el ADN genómico de una célula. Tales regiónes codificantes se denominan aquf "región es codificantes transactivadas". Las células que contienen regiónes codificantes transactivadas se describen aquf en detalle a continuación. Los transactivadores útiles en la presente invención incluyen los que pueden interactuar con una región reguladora, preferiblemente una secuencia operadora, que está unida operativamente a una región codificante transactivada. Como aquí se usa, el término "transactivado' incluye polipéptidos que interactúan con una secuencia operadora y, o evitan que se inicie la transcripción en, o activan el inicio de la transcripción de, o estabilizan una transcripción de, una región codificante transactivada unida operativamente a la secuencia operadora. Ejemplos de transactivadores útiles incluyen el polipéptido tat VIH (véase, por ejemplo, los polipéptidos MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRK KRRQRRRAHQNSQTHQASLSKQPTSQPRGDPTGPKE (SEC ID N° 5) que está codificada por los nucleótidos 5377-5591 y desde 7925 hasta 7970 del número de acceso Genbank AF033819), y MEPVDPRLEPWKHPGSQPKT ACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRK

KRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE (SEC ID N° 10). El polipéptido tat HIV interactúa con la repetición terminal larga del VIH (L TR). Otros transactivadores útiles incluyen polipéptidos tax del virus de leucemia de células T humanas (que se une al elemento de respuesta tax de la secuencia operadora, Fujisawa et al., J. Virol., 65, 4525 hasta 4528 (1991)), Y los polipéptidos transactivados codificados por espumavirus en la región entre env y la L TR, tales como el polipéptido bel-1 en el caso de virus espumoso humano (que se une al dominio U3 de estos virus, Rethwilm et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. USA, 88, 941-945 (1991)). Alternativamente, se puede utilizar un transactivador post-transcripcional, tal como rev VIH. El rev VIH se une a una secuencia de ARN de 234 nucleótidos en el gen env (el elemento de respuesta rev, o RRE) de VIH

(Hadzopolou-Cladaras y col., J. Virol., 63, 1265-1274 (1989».

[0039] Otros transactivadores que se pueden utilizar son los que tienen similitud con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° 5 o SEC ID N° 10. La similitud se determina generalmente como se describe aqul anteriormente. Una secuencia de aminoácido candidata que está siendo comparado con una secuencia de aminoácidos presente en la SEC ID N° 5 o SEC ID N" 10 puede aislarse a partir de un virus, o puede ser producida con técnicas recombinantes o sintetizada qu!mica o enzimáticamente. Preferiblemente, dos secuencias de aminoácidos se comparan usando el programa BLASTP del algoritmo de búsqueda BLAST 2, como se ha descrito aqui anteriormente. Preferiblemente, un transactivador incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud estructural con SEC ID N° 5 o SEC ID N° 10, de al menos aproximadamente 90%, al menos un 94%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, o al menos un 99% de identidad. Tipicamente, una secuencia de aminoácidos que tiene una similitud estructural con SEC ID N° 5 o SEC ID N° 10 tiene actividad tal. Si tal polipéptido tiene actividad se puede evaluar determinando si la secuencia de aminoácidos puede interactuar con un L TR VIH, preferentemente alterar la transcripción de una secuencia codificante operativamente ligada a un L TR HIV. L TR VIH útiles se describen en este

documento. [0040] Análogos activos o fragmentos activos de un transactivador se pueden usar en la invención. Un

análogo activo o fragmento activo de un transactivador es uno que es capaz de interactuar con una secuencia

operadora y, o bien evitar que se inicie la transcripción en, activar inicio de transcripción de, o estabilizar un transcripto de, una región codificante transcativada operativamente ligada a la secuencia operadora.

[0041] Análogos activos de un transactivador incluyen polipéptidos que tienen sustituciones de aminoácidos conservadoras que no eliminan la capacidad de interactuar con un operador y alterar la transcripción. Los sustitutos de un aminoácido pueden ser seleccionados de otros elementos de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y tirosina. Aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cistelna, tirosina, aspartato, y glutamato. Los aminoácidos de carga positiva (básica) incluyen arginina, lisina e histidina. Los animoácidos de carga negativa (ácida) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Los ejemplos de sustituciones conservadoras preferidas incluyen Lys por Arg y viceversa para mantener una carga positiva;

Glu por Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser por Thr de manera que se mantiene un-OH libre; y Gln para Asn mantener un NH2 libre.

[0042] Los fragmentos activos de un transactivador incluyen una porción del transactivador que contiene deleciones o adiciones de aproximadamente 1, unos 2, unos 3, unos 4, o al menos unos 5 aminoácidos contiguos o no contiguos de manera que el transactivador resultante alterarala expresión de una región codificante transactivada unida operativamente. Un ejemplo preferido de un fragmento activo del polipéptido tat

HIV incluye aminoácidos 1-48 de la SEC ID N° 5, o aminoácidos 1-48 de SEC ID N° 10.

[0043] En aquellos aspectos de la invención en los que la segunda región codificante codifica un polipéptido de fusión, el polipéptido de fusión puede incluir además aminoácidos que corresponden a una proteinasa cisactiva. Cuando el polipéptido de fusión es una fusión entre un transactivador y un marcador, preferiblemente el polipéptido de fusión también incluye aminoácidos correspondientes a una proteinasa cis-activa. Preferiblemente, los aminoácidos que corresponden a una proteinasa cis-activa están presentes entre los aminoácidos que corresponden al transactivador y el marcador. Una proteinasa cis-activa en esta posición permite que el aminocido correspondiente al transactivador y el marcador estén fisicamente separados entre si en la célula dentro de la que está presente el polinucleótido capaz de replicación. Ejemplos de proteinasas cisactivas que son útiles en la presente invención incluyen la proteinasa 2A cis-activa del virus de la fiebre aftosa (VFA) (véase, por ejemplo, patente US 5.846.767 (Halpin et aL) y patente US 5.912.167 (palmenberg et aL)), ubiquitina (véase, por ejemplo, Tauz et al.,virologia, 197, 74-85 (1993)), Y el sitio de reconocimiento de NS3 GADTEDWCCSMSY (SEC ID N° 6) (véase, por ejemplo, Lai et al., J. Virol., 74, 6339 -6347 (2000)).

[0044] Análogos activos y fragmentos activos de proteinasas cis-activas también se pueden utilizar. Análogos activos de una proteinasa cis-activa incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de aminoácidos que no eliminan la capacidad de la proteinasa para catalizar la escisión. Los fragmentos activos de una proteinasa cis-activa incluyen una porción de la proteinasa cis-activa que contiene supresiones o adiciones de uno o más aminoácidos contiguos o no contiguos de manera que la proteinasa cis-activa resultante catalizará la escisión de la proteinasa. [0045] En algunos aspectos de la invención, la segunda región codificante puede incluir además una región reguladora ligada operativamente. Preferiblemente, una región reguladora situada 5' de la región codificante unida operativamente proporciona la traducción de la región codificante.

[0046] Una región reguladora preferida situada en 5' de una segunda región codificante unida operativamente es un sitio de entrada interno de ribosoma (IRES). Un IRES permite un acceso de ribosoma a ARNm sin un requisito para el reconocimiento principal y la posterior exploración al iniciador AUG (Pelletier, et al., Naturaleza, 334, 320-325 (1988)). Un IRES se localiza aguas arriba del codón de iniciación de traducción, por ejemplo, ATG o AUG, de la secuencia codificante a la que el IRES está unido operativamente. La distancia entre los el IRES y el codón de iniciación depende del tipo de IRES utilizado, y se conoce en la técnica. Por ejemplo, el IRES del virus de la polio inicia un proceso de translocación/escaneado del ribosoma a un codón AUG aguas abajo. Para otros elementos IRES, el codón iniciador se encuentra generalmente en el extremo 3' de la secuencia IRES. Ejemplos de un IRES que se puede utilizar en la invención incluyen un IRES viricos, preferiblemente un IRES picornavirico o un IRES flavivlrico. Ejemplos de elementos IRES de poliovirus incluyen, por ejemplo, IRES del virus de la polio, IRUS del virus de la encefalomiocarditis, o IRES del virus de la hepatitis A. Ejemplos de IRES flavivíricos preferidos incluyen IRES del virus de la hepatitis C, IRES del virus

B GB, o IRES pestivirus, incluyendo pero no limitado de IRES del virus de la diarrea viral bovina e IRES del virus de la fiebre porcina clásica. Otros elementos IRES con similar estructura secundaria y terciaria y actividad de iniciación de traducción o bien pueden ser generados por mutación de estas secuencias víricas, por clonación de secuencias análogas de otros virus (incluyendo picornavirus), o preparados por técnicas de síntesis enzimática.

[0047] El tamaño de la segunda región de codificación no es crítico para la invención. Se espera que no haya límite inferior en el tamaño de la segunda región codificante, y que existe un limite superior en el tamaño de la segunda región codificante. Este límite superior puede ser determinado fácilmente por una persona experta en la técnica, ya que una segunda región codificante que es mayor que este límite superior limitado afecta adversamente a la replicación de un polinucleótido capaz de replicación. La segunda región de codificación es

tlpicamente de, al menos, unos 10 nucleótidos, de al menos unos 20 nucleótidos, de al menos unos 30

nucleótidos, o de al menos unos 40 nucleótidos. [0048] Un polinucleótido capaz de replicación también puede incluir una secuencia de nucleótidos que tiene una acción de ribozima cis-activa. Tal ribozima está típicamente presente en el terminal 3 "de 3' NTR de un polinucleótido capaz de replicación, y genera un terminal 3" preciso del polinucleótido capaz de replicación cuando es una molécula de ARN mediante escisión de la unión entre el polinucleótido capaz de replicación y la ribozima. Esto puede ser ventajoso cuando el polinucleótido capaz de replicación debe usarse para una transfección transitoria. Dado que la ribozima cataliza su propia eliminación de la molécula de ARN, este tipo de ribozima está presente sólo cuando un polinucleótido capaz de replicación es una molécula de ADN. [0049] El polinucleótido capaz de replicación de la invención puede estar presente en un vector. Cuando un

polinucleótido capaz de replicación está presente en un vector el polinucleótido es ADN, incluyendo el ARN 5' no traducido y el ARN 3' no traducido, y, si está presente, la segunda secuencia de codificación. Los métodos para la clonación y/o inserción de secuencias de virus de hepatitis C en un vector son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Yanagi et al, Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 94, 8738-8743 (1997); y Rice et al., (patente US

6.127.116)). Tales constructos son referidos a menudo como cepas de laboratorio molecularmente clonadas, y un VHC que se inserta en un vector se conoce a menudo como un clon de ADNc del VHC. Si el ARN codificado por el VHC es capaz de replicarse in vivo, el VHC presente en el vector se conoce como un clon infeccioso de ADNc. Un vector es un polinucleótido replicante, tal como un plásmido, fago, cósmido, o cromosoma artificial al que otro polinucleótido puede estar unido a fin de llevar a cabo la replicación del polinucleótido adjunto. Un vector puede proveer clonación adicional (amplificación del pOlinucleótido), es decir, un vector de clonación, o expresión del polipéptido codificado por la región codificante, es decir, un vector de expresión. El término vector incluye, pero no se limita a, vectores plasmidicos, vectores vlricos, vectores cósmidos, o vectores de cromosomas artificiales. Preferiblemente, el vector es un plásmido. Preferiblemente, el vector es capaz de replicarse en una célula huésped procariota, por ejemplo Escherichia eoli. Preferiblemente, el vector se puede integrar en el ADN genómico de una célula eucariota. [0050] Un vector de expresión incluye, opcionalmente, secuencias reguladoras unidas operativamente al polinucleótido capaz de replicación de tal manera que se transcribe para producir moléculas de ARN. Estas moléculas de ARN se pueden utilizar, por ejemplo, para la introducción de un polinucleótido capaz de replicación en una célula que se encuentra en un animal o en crecimiento en cultivo. Los términos "Introducir" e "introducción" se refieren a proveer un polinucleótido capaz de replicación a una célula en condiciones en que el polinucleótido es captado por la célula de tal manera que a continuación se puede replicar. El polinucleótido capaz de replicación puede estar presente en una particula de virus, o puede ser una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, ARN. La invención no está limitada por el uso de promotor particular alguno, y se conoce una amplia variedad. Los promotores actúan como señales reguladoras que ligan la polimerasa del ARN en una célula para iniciar la transcripción de un VHC aguas abajo (dirección 3'). El promotor usado en la invención puede ser un promotor constitutivo o inducible. Un promotor preferido para la producción del polinucleótido capaz de replicación como una molécula de ARN es un promotor T7. [0051] La presente invención incluye métodos para identificar un polinucleótido capaz de replicación, incluyendo detectar y/o seleccionar las células que contienen un polinucleótido capaz de replicación. Típicamente, las células usadas en este aspecto de la invención son células de primate o humano que crecen en cultivo. Las células cultivadas útiles apoyarán la replicación de los polinucleótidos de la presente invención, e incluyen hepatocitos principales humanos o de chimpancés, células mononucleares periféricas, líneas de células linfoides humanas cultivadas (por ejemplo, lineas que expresan marcadores de células B y células T,

tales como BJAB y Molt-4), y lineas celulares continuas derivadas de tales células, incluyendo HPBMa1 0-2 y

Daudi (Shimizu et al., J. Gen. Virol.,79, 1383-1386 (1998), Y MT-2 (Kato et al., Biochem. Biophys. Res..

Commun., 206, 863-869 (1995)). Otros células útiles incluyen las derivadas de células de hepatoma humano,

por ejemplo, Huh-7 (ver, por ejemplo, Lohmann y col. (Ciencia, 285, 110-1 13 (1 999)), Huh-7.5 (véase, por

5

ejemplo, Blight y un., J. Virol., 76, 13001-13014 (2002), Y Blight Y col., J. Virol., 77, 31 83-3190 (2003)), HepG2

y IMY-N9 (Fecha et al., J. Biol.. Chem. 279, desde 22.371 a 22.376., (2004)), Y PH5CH8 (Ikeda et Virus Res.

Col. 56, 157-167 (1998)). En general, las células útiles incluyen las que soportan la replicación del ARN del

VHC, incluyendo, por ejemplo, la replicación del VHC codificada por PCV-H77C, la replicación del VHC

codificada por pVHC-N según modificada por Beard et al. (Hepatol., 30, 316-324 (1 999)), o la replicación de tal

10

VHC modificado para contener una o más mutaciones adaptativas.

[0052] En algunos aspectos de la invención, la célula cultivada incluye un polinucleótido que incluye una

región de codificación, cuya expresión es controlada por un transactivador. Tal región de codificación se

denomina en este documento región codificada transactivada. Una región codificada transactivada codifica un

marcador, tal como un marcador detectable, por ejemplO, fosfatasa alcalina secretora (SEAP), un ejemplo de

15

la cual se codifica por los nucleótidos 748-2239 de la SEC ID N o 7 (véase la figura 9). Típicamente, una célula

cultivada que incluye un polinucleótido con una región de codificación transactivada se utiliza en conjunción

con un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención que incluye una región codificante que

codifica un transactivador.

[0053] El polinucleótido que comprende la región de codificación transactivada puede estar presente integrado

20

en el ADN genómico de la célula, o presente como parte de un vector que no está integrado. Los métodos

para modificar una célula para contener un ADN integrado se conocen en la técnica (véase, por ejemplo,

Lemon y col., Solicitud Publicadas US 2003 0.1 25.541, Y Yi et al., Virol., 302, 197-210 (2002)).

[0054] Ligado operativamente a la región de codificación transactivada está una secuencia operadora. La

interacción de un transactivador con una secuencia operadora puede alterar la transcripción de la región

25

codificante transactivada unida operativamente. En aquellos aspectos de la invención en los que un

transactivador aumenta la transcripción, hay tlpicamente baja transcripción, o, esencialmente no transcripción,

de la región de codificación transactivada en ausencia de un transactivador. Una secuencia operadora puede

estar presente aguas arriba (5') o aguas abajo (3') de una región de codificación transactivada. Una secuencia

operadora puede ser un promotor, o puede ser una secuencia de nucleótidos que está presente además de un

3 O

promotor.

[0055] En algunos aspectos de la invención, la secuencia operadora que está unida operativamente a una

secuencia codificante transactivada es una repetición de terminal largo (L TR)del VIH. Un ejemplo de un L TR

de VIH se representa en los nucleótidos 1-719 de la SEC ID N° 7. También se incluyen en la presente

invención las secuencias operadoras que tienen similitud a los nucleótidos 1-719 de la SEC ID N° 7. La

35

similitud entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar alineando los residuos de los dos

polinucleótidos (es decir, la secuencia de nucleótidos de la secuencia operadora candidata y la secuencia de

nucleótidos de los nucleótidos 1-719 de la SEC ID N ° 7) para optimizar el número de nucleótidos idénticos a lo

largo de las longitudes de sus secuencias; huecos en una o ambas secuencias están permitidos al hacer la

alineación para optimizar el número de nucleótidos compartidos, a pesar de que los nucleótidos en cada

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secuencia, sin embargo, deben permanecer en el orden correcto. Una secuencia operadora candidata puede

ser aislada de una célula, o puede ser producida usando técnicas recombinantes o de slntesis química o

enzimática. Preferiblemente, dos secuencias de nucleótidos se comparan utilizando el programa BLASTN del

algoritmo de búsqueda BLAST 2, como fue descrito por Tatusova, et al. (FEMS Microbiol Lett 1999, 174:247

250), Y disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bI2.html. Preferentemente, se utilizan los valores por defecto para todos los parámetros de búsqueda BLAST 2, incluyendo recompensa por coincidencia=1 , sancion por falta de coincidencia= -2, penalización de hueco abierto=5, penalización de extensión de hueco=2, hueco x caida=50, espera=10, tamano=11, y filtro. En la comparación de dos secuencias de nucleótidos utilizando el algoritmo de búsqueda BLAST, la similitud estructural se conoce como "identidades". Preferiblemente, una secuencia operadora incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una similitud estructural con los nucleótidos 1-719 de la SEC ID N° 7 de al menos aproximadamente el 90%, al menos un 95%, o al menos un 99% de identidad. Tlpicamente, una secuencia operadora que tiene similitud estructural con los nucleótidos 1719 de la SEC ID N° 7 tiene actividad transcripcional. Si tal secuencia operadora tiene actividad transcripcional puede determinarse evaluando la capacidad de la secuencia operadora para alterar la transcripción de una secuencia codificante unida operativamente en respuesta a la presencia de un polipéptido que tiene actividad tat, preferiblemente, un polipéptido que incluye los aminoácidos de la SEC ID N° 5 o SEC ID N° 10. [0056] Puede usarse un agente de selección para inhibir la replicación de células cultivadas que soportan la

replicación de polinucleótidos de la presente invención. Ejemplos de agentes de selección incluyen antibióticos, incluyendo kanamicina, ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, neomicina, y formulaciones de fleomicina 01. Un agente de selección puede actuar para evitar la replicación de una célula, o matar una célula, mientras el agente está presente y la célula no expresa una molécula que proporciona resistencia al agente de selección. Típicamente, la molécula que proporciona resistencia a un agente de selección se expresa en la célula por un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención. Alternativamente, la molécula que proporciona resistencia a un agente de selección se expresa por la célula, pero la expresión de

la molécula se controla por un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención que está presente en la célula. La concentración del agente de selección se elige normalmente de manera que una célula no Se replica si no contiene una molécula que proporcione resistencia a un agente de selección. La concentración apropiada de un agente de selección varía dependiendo del agente de selección particular, y puede determinarse fácilmente por un experto normal en la técnica usando técnicas conocidas [0057] Cuando un polinucleótido se introduce en una célula que está creciendo en cultivo, el polinucleótido se puede introducir usando técnicas conocidas en la materia. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, transfección mediada por liposomas y no-liposomas. Métodos de transfección mediada por no-liposomas incluyen, por ejemplo, electroporación. [0058] En algunos aspectos de la invención, cuando un polinucleótido de replicación competente se identifica utilizando células cultivadas, su capacidad para replicar puede ser verificada mediante la introducción del polinucleótido capaz de replicación en una célula presente en una animal, preferiblemente un chimpancé. Cuando la célula está presente en el cuerpo de un animal, el polinucleótido capaz de replicación puede ser introducido por, por ejemplo, administración percutánea subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o intrahepática percutánea, preferiblemente por administración intrahepática. Los métodos para determinar si un polinucleótido capaz de replicación es capaz de replicarse en un chimpancé son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Yanagi et al., Proc. Natl. Acad. Ciencia. EE.UU., 94, 8.738 hasta 8.743 (1997)). En general, la demostración de la infectividad se basa en la aparición del virus en la circulación del chimpancé a lo largo de los días y semanas tras la inyección intrahepática del polinucleótido capaz de replicación. La presencia del virus se puede confirmar mediante por detección del ARN viral por reacción en cadena de la polimerasa-transcripción inversa (RT -PCR), mediante inoculación de un segundo chimpancé con transferencia de la infección del virus de hepatitis C como se indica por la aparición de la enfermedad hepática y la seroconversión al virus de la hepatitis C en ensayos ELlSA, o, posiblemente, por detección inmunológica de

los componentes del virus de hepatitis C (por ejemplo, la proteina de núcleo) en la circulación del animal inoculado. Cabe señalar que la seroconversión en si misma no es generalmente un indicador útil de la infección en un animal inyectado con un ARN vlrico producido usando una cepa de laboratorio molecularmente clonada, ya que este ARN puede tener propiedades inmunizantes y ser capaz de inducir anticuerpos especlficos del VHC a las protelnas traducidas a partir de una entrada ARN que es no replicante. Del mismo modo, la ausencia de seroconversión no excluye la posibilidad de replicación vlrica y la infección de un chimpancé con VHC. [0059] Si un polinucleótido es capaz de replicación se puede determinar usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos que utilizan amplificación del ácido nucleico para detectar el resultado de niveles aumentados de replicación. Por ejemplo, la transfección transitoria de una célula con un polinucleótido capaz de replicación permite la medición de la producción de polinucleótidos adicionales. Los métodos para la transfección transitoria de una célula con un polinucleótido capaz de replicación y para el ensayo de la posterior replicación son conocidos en la técnica. En algunos aspectos de la invención, otro método para la detección de un polinucle6tido capaz de replicación incluye medición de la producción de partlculas vlricas por una célula. La medición de partlculas vlricas se puede lograr mediante el paso de sobrenadante de medios que contienen un cultivo celular que puede contener un polinucleótido capaz de replicación, y utilizando el sobrenadante para infectar una segunda célula. La detección del polinucleótido o partlculas vi ricas en la segunda célula indica que la célula inicial contiene un polinucleótido capaz de replicación. La producción de partlculas de virus infecciosos por una célula también se puede medir utilizando un anticuerpo que se une especlficamente a una partlcula vlrica VHC. Como aqul se usa, un anticuerpo que puede "unirse especlficamente" a una partlcula vlrica VHC es un anticuerpo que interactúa sólo con el epltopo del antlgeno (por ejemplo, la partlcula vlrica o un polipéptido que constituye la partlcula) que induce la slntesis del anticuerpo, o interactúa con un epltopo estructuralmente relacionado. "Epltopo" se refiere al sitio en un antlgeno al que responden Células B y/o células T especificas por lo que el anticuerpo se produce. Un epltopo podrla incluir alrededor de 3 aminoácidos en una conformación espacial que es única para el epltopo. Generalmente, un epltopo incluye al menos aproximadamente 5 de tales aminoácidos, y más usualmente, se compone de por lo menos unos 8-10 de tales aminoácidos. Los anticuerpos para partlculas vlricas VHC se pueden producir como aqul se describe. [0060] En otro aspecto, identificar un polinucleótido capaz de replicación incluye incubar una célula cultivada que incluye un polinucleótido de la presente invención. En aquellos aspectos de la invención donde el polinucleótido capaz de replicación incluye una segunda región codificante que codifica un marcador detectable, las células que contienen el polinucleótido capaz de replicación pueden ser identificadas observando células individuales que contienen el marcador detectable. Alternativamente, si el marcador detectable es secretado por la célula, la presencia del marcador en el medio en el que se incuba la célula puede detectarse. Se conocen métodos en la técnica para observar la presencia o ausencia de un marcador detectable en una célula o en medios IIquidos. [0061] Otro aspecto de la invención proporciona la selección positiva de células que incluyen un polinucleótido capaz de replicación. En este aspecto de la invención, un polinucleótido capaz de replicación incluye tlpicamente una segunda secuencia de codificación que codifica un marcador seleccionable, y la célula que incluye el polinucleótido capaz de replicación se incuba en presencia de un agente selectivo. Aquellas células que pueden replicarse en presencia del agente de selección contienen un polinucleótido que es capaz de replicación. Las células que pueden replicarse se detectan permitiendo que crezcan células resistentes en

presencia del agente de selección, y observando, por ejemplo, la presencia de colonias y/o la expresión de un marcador, tal como SEAP. [0062] En algunos aspectos, el método puede incluir además aislamr partlculas de virus de las células que contienen un polinucleótido capaz de replicación y exponer una segunda célula a la partrcula del virus aislado

5 en condiciones tales que la particula del virus se introduce en la célula. Después de proporcionar tiempo para la expresión del marcador seleccionable, la segunda célula es luego incubada con el agente de selección. La presencia de una célula que replica indica que el polinucleótido capaz de replicación produce partículas víricas infecciosas. [0063] En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar un polinucleótido capaz de

10 replicación. El método incluye incubar una célula que contiene un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención. El polinucleótido puede incluir una segunda región codificante que codifica un marcador seleccionable o detectable. Opcionalmente, el polinucleótido puede incluir un transactivador que interactúa con la secuencia operadora presente en la célula. En este aspecto, la célula puede incluir una región de codificación transactivada y una secuencia operadora unida operativamente a la región codificadante

15 transactivada. El método incluye además detectar la presencia de mayores cantidades del polinucleótido capaz de replicación, o la presencia o ausencia del marcador codificado por la segunda secuencia de codificación o la región codificante transactivada presente en la célula. La presencia de cantidades aumentadas del polinucleótido capaz de la replicación o el marcador indica que la celula incluye un polinucleótido capaz de replicación.

20 [0064] Los métodos descritos anteriormente para identificar un polinucleótido capaz de replicación también se pueden utilizar para identificar una variante del polinucle6tido capaz de replicación, es decir, un polinucleótido capaz de replicación que se deriva a partir de un polinucleótido capaz de replicación de la presente invención. Una variante del polinucleótido capaz de replicación puede tener una tasa de replicación más rápida que el progenitor o el polinucleótido de entrada. El método aprovecha la inherentemente alta tasa de mutación de la

25 replicación del ARN. Se espera que durante el cultivo continuado de un polinucleótido capaz de replicación en células cultivadas, el polinucleótido de la presente invención pueda mutar, y algunas mutaciones darán lugar a polinucleótidos con mayores tasas de replicación. El método incluye identificar una célula que tiene una mayor expresión de un polipéptido codificado por un polinucleótido capaz de replicación. Un polinucleótido de la presente invención que se replica a una velocidad mayor dará por resultado más del polinucleótido en la

30 célula, o dará lugar a más polipéptido (s) que está codificado por el segunda región codificante presente en el polinucleótido. Por ejemplo, cuando un polinucleótido capaz de replicación codifica un marcador seleccionable, una célula que contiene un polinucleótido variante con una mayor tasa de replicación será resistente a mayores niveles de un agente de selección apropiado. Cuando un polinucleótido codifica un transactivador, una célula que contiene un polinucleótido variante que tiene una mayor tasa de replicación que el

35 polinucleótido progenitor o de entrada, expresará cantidades más altas de la región de codificación transactivada que está presente en la célula. [0065] Una molécula de ADNc de una variante de polinucleótido capaz de replicación puede clonarse usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Yanagi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 94, 8.738

8.743 (1997)). La secuencia de nucleótidos de ADNc clonado se puede determinar usando métodos conocidos

40 en la técnica, y se compara con la de los ARN de entrada. Esto permite identificar las mutaciones que han ocurrido en asociación con el paso del polinucleótido capaz de replicación en el cultivo celular. Por ejemplo, usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo RT -PCR de gran alcance, se pueden obtener extensas porciones de una variante del genoma del polinucleótido capaz de replicación

Múltiples clones podrían obtenerse de cada segmento del genoma, y determinarse la secuencia dominante presente en el cultivo. Las mutaciones identificadas por este enfoque, pueden luego reintroducirse en el fondo del ADNc que codifica el polinucleótido progenitor o de entrada. [0066] La presente invención también proporciona métodos para identificar un compuesto que inhibe la replicación de un polinucleótido capaz de replicación. El método incluye poner en contacto una célula que contiene un polinucleótido capaz de replicación con un compuesto e incubar la célula bajo condiciones que permiten la replicación del polinucleótido capaz de replicación en ausencia del compuesto. Tras un período de tiempo suficiente para permitir la replicación del polinucleótido, se detecta el polinucleótido capaz de

replicación. Una disminución en la presencia del polinucleótido capaz de replicación en la célula en contacto con el compuesto respecto a la presencia del polinucleótido capaz de replicación en una célula no contactada por el compuesto indica que el compuesto inhibe la replicación del polinucleótido. Un compuesto que inhibe la replicación de dicho polinucleótido incluye compuestos que impiden por completo la replicación, así como compuestos que disminuyen la replicación. Preferiblemente, un compuesto inhibe la replicación de un polinucleótido capaz de replicación en al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 75%, más preferiblemente al menos un 95%. [0067] Los compuestos añadidos a una célula pueden ser una amplia gama de moléculas y no es un aspecto limitante de la invención. Los compuestos incluyen, por ejemplo, un policétido, un péptido no ribosómico, un polipéptido, un polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido o ribozima), u otras moléculas orgánicas, o una combinación de los mismos. Las fuentes para los compuestos a supervisar pueden incluir, por ejemplo, bibliotecas de compuestos quimicos, medios de fermentación de estreptomicetos, otras bacterias y hongos, y extractos de células eucariotas o procariotas. Cuándo el compuesto se añade a la célula no es tampoco un aspecto limitante de la invención. Por ejemplo, el compuesto se puede añadir a una célula que contiene un polinucleotido capaz de replicación. Alternativamente, el compuesto se puede añadir a una célula antes o al mismo tiempo que el polinucleótido capaz de replicación es introducido en la célula .. [0068] Normalmente, la capacidad de un compuesto de inhibir la replicación de un polinucleótido capaz de

replicación se mide usando los métodos aquí descritos. Por ejemplo, pueden usarse métodos que utilizan amplificación del ácido nucleico para detectar la cantidad de un polinucleótido capaz de replicación en una célula. Alternativamente, pueden usarse métodos que detectan o seleccionan un marcador codificado por un polinucleótido capaz de replicación o codificado por una célula que contiene un polinucleótido capaz de replicación . [0069] En algunos aspectos de la invención, el polinucleótido capaz de replicación de la invención se puede utilizar para producir partículas víricas. Preferiblemente, las partículas víricas son infecciosas. Por ejemplo, una célula que incluye un polinucleótido capaz de replicación puede incubars en condiciones que permiten que el polinucleótido replique, y las particulas viricas que se producen se pueden aislar utilizando métodos rutinarios y conocidos en la técnica. Las partículas víricas pueden usarse como fuente de partículas víricas para diversos ensayos, incluyendo la evaluación de métodos para inactivar particulas, excluyendo particulas de suero, identificar un compuesto neutralizador, y como un antrgeno para su uso en la detección de anticuerpos antiVHC en un animal. Un ejemplo del uso de una partícula vírica como antrgeno incluye el uso como control positivo en ensayos de prueba para la presencia de anticuerpos anti-VHC. [0070] Por ejemplo, la actividad de compuestos que neutralizan o inactivan las partículas puede ser evaluada midiendo la capacidad de la molécula para evitar que las partículas invecten celulas creciendo en cultivo o en células en un animal. Compuestos desactivadores incluyen detergentes y disolventes que solubilizan la envolvente de una particula virica. Los compuestos desactivadores se usan a menudo en la producción de productos de sangre y productos de sangre sin células. Ejemplos de compuestos que pueden ser neutralizantes incluyen un policétido, un péptido no ribosómico, un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo), un polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido o ribozima), u otras moléculas orgánicas. Un compuesto neutralizante es preferiblemente un anticuerpo, incluyendo anticuerpos policlonales y

5 monoclonales, así como variaciones de los mismos, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos Fab. [0071] Las partlculas víricas producidas por el polinucleótido capaz de replicación de la invención se pueden usar para producir anticuerpos. Los métodos de laboratorio para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow E. y col. Anticuerpos: Un manual de

10 laboratorio de Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988) y Ausubel, R. M., ed. Current Protocols in Molecular Biology (1994)), e incluyen, por ejemplo, inmunizar un animal con una partícula de virus. Pueden usarse anticuerpos producidos usando las partlculas víricas de la invención para detectar la presencia de partículas de virus en muestras biológicas. Por ejemplo, la presencia de partlculas víricas en los productos de sangre y productos de sangre sin células puede determinarse utilizando los anticuerpos.

15 [0072] La divulgación incluye procedimientos de tratar un animal, incluyendo administrar anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos se pueden usar para evitar la infección (profilácticamente) o para tratar la infección (terapéuticamente) y, opcionalmente, pueden usarse en conjunción con otras moléculas usadas para evitar o tratar la infección. Los anticuerpos neutralizantes se pueden mezclar con excipientes o vehlculos farmacéuticamente aceptables. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, solución

20 salina, dextrosa, glicerol, etanol, o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, los anticuerpos neutralizantes y excipientes o vehículos farmacéutica mente aceptables pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o agentes emulsionantes, agentes tamponantes del pH, y / o adyuvantes que mejoran la eficacia de los anticuerpos neutralizantes. Pueden usarse tales formulaciones y modos de administración adicionales como se conocen en la técnica.

25 [0073] Las partlculas de virus producidas por el polinucleótido capaz de replicación de la invención se pueden utilizar como una fuente de antlgeno vlrico para medir la presencia y cantidad de un anticuerpo presente en un animal. Están disponibles ensayos que miden la presencia en un animal del anticuerpo dirigido a VHC, e incluyen, por ejemplo, ensayos ELlSA y ensayos recombinantes de inmunotransferencia. Estos tipos de ensayos se pueden usar para detectar si un animal ha estado expuesto a VHC, y/o si el animal puede tener

30 una infección activa de VHC. Sin embargo, en estos ensayos no se usan partlculas de virus, sino más bien polipéptidos vlricos individuales o múltiples expresados a partir de ADNc recombinante que no están en forma de partlculas de virus. Por lo tanto son generalmente incapaces de detectar anticuerpos potencialmente importantes dirigidos contra los epltopos de superficie de los polipéptidos de cubierta, y tampoco son normalmente medidas de anticuerpos neutralizantes vlricos funcionalmente importantes. Tales anticuerpos generalmente se detectan con el uso de partlculas de virus infecciosas, tales como las que se producen en este sistema. El uso de partículas víricas infecciosas como antlgeno en ensayos que detectan la presencia de anticuerpos específicos en virtud de su capacidad para bloquear la infección de las células con partículas víricas del VHC, o que posiblemente se unen a partículas de virus enteros en un ensayo ELlSA o radioinmunoensayo, permitirán la detección de anticuerpos neutralizantes víricos funcionalmente importantes.

40 [0074] La presente invención también proporciona un kit para identificar un compuesto que inhibe la replicación de un polinucleótido capaz de replicación. El kit incluye un polinucleótido capaz de replicación tal como aquí se describe, y una célula que contiene un polinucle6tido que incluye una secuencia de codificación transactivada que codifica un marcador detectable y una secuencia operativa unida operativamente a la secuencia de codificación transactivada en un material de envasado adecuado. Opcionalmente, también se incluyen otros reactivos tales como tampones y soluciones necesarias para la práctica de la invención. Las instrucciones de uso de los materiales envasados también están normalmente incluidas. [0075] Como aqur se usa, la frase "material de envasado" se refiere a una o más estructuras físicas utilizadas para albergar el contenido del kit. El material de envasado se construye por métodos bien conocidos, preferiblemente para proporcionar un ambiente estéril, libre de contaminantes. El material de envasado puede incluir una etiqueta que indica que el polinucleótido capaz de replicación se puede utilizar para identificar un compuesto que inhibe la replicación de dicho polinucleótido. Además, el material de envasado puede contener instrucciones que indican cómo se emplean los materiales dentro del kit. Como aqur se usa, el término "envase" se refiere a una matriz o material sólido como vidrio, plástico y similares, capaz de contener dentro con límites fijos el virus capaz de replicación y la célula de vertebrado. [0076] La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos. Ha de entenderse que los particulares ejemplos, materiales, cantidades y procedimientos han de interpretarse en sentido amplio, de acuerdo con el alcance y esprritu de la invención como se indica en este documento.

EJEMPLOS

[0077] Los ejemplos que no se relacionan con el polinucleótido de la reivindicación 1 están presentes con fines ilustrativos Materiales y Métodos [0078] Células. Las células Huh7 se cultivaron en un medio Eagle modificado de Dulbecco (Gibco BRL, Carlsbad, CA), complementado con suero fetal de ternero 10%, penicilina y estreptomicina. EN5-3 es una línea celular clonal derivada de células Huh7 por transformación estable con el plásmido pLTR-SEAP (Yi et al., Virology, 304,197-210 (2002)). Estas células se cultivaron en un medio Eagle modificado de Dulbecco (Gibco BRL) suplementado con suero fetal de ternero 10%, 2 mg/ml de blasticidina (Invitrogen), penicilina y estreptomicina. Las líneas celulares se pasaron una o dos veces/semana. Se usó G418 a una concentración de 250 mg/ml para elegir colonias de células transfectadas EN5-3 con ARN replicado que contienen secuencias 1 a. [0079] P/ásmidos. El plásmido PBPP-Htat2ANeo se construyó reemplazando el fragmento BsrGI-Xbal de pBpp-Ntat2ANeo/Si (idéntico a Ntat2ANeo/SI como se describe por Yi et al. (Yi et al., Virology, 304, 197-210 (2002)) con el segmento análogo de pH77c (GenBank AF011751) (Yanagi et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 94, 8738-43 (1997)) disenado para contener un sitio BsrGI en la ubicación correspondiente por mutagénesis Quick-Change (Stratagene, La Jolla, CA). Este intercambio de fragmento da lugar a que la secuencia NS3NS5B en PBPP-Htat2ANeo es idéntica a la de pH77c, con la excepción de que el ARN codifica los 75 residuos aminoácidos N-terminales de NS3 que conserva la secuencia Con1 genotipo 1 b. Dado que Bpp-Ntat2ANeo/SI fue disenado originalmente para contener una secuencia del genotipo 1a 5' no traducida del ARN (5" NTR) (Yi et al., Virology, 304,197-210 (2002)), el constructo pBpp--Htat2ANeo resultante posee tanto un genotipo 1a NTR 5' como una secuencia 3' NTR 1 a. Se usó superposición de PCR para fusionar una secuencia del ribozima anti-genómico de la hepatitis delta directamente para el extremo 3' del genotipo 1 a 3' NTR, con el fin de generar una secuencia de auto-escisión 3' con el nucleótido exacta del 3 'terminal de de VHC (Perrolta y Been, Nucleic Acids Res, 24, 1314-1321 (1996)). Se crearon derivados de pBpp-Htat2ANeo con las mutaciones adaptativas K1691 Ro S22041 por mutagénesis Quick-Change (Stratagene). [0080] Para construir pBpp-H34A-Ntat2ANeo/SI, se creó un sitio de restricción EcoRI en pBpp-Ntat2ANeo/SI cerca del extremo 3 'de la región codificante NS4A por mutagénesis Quick-Change. Después de la digestión del plásmido resultante con BsrGI y EcoRI, el segmento de VHC extirpado se reemplazó con la secuencia

equivalente de pH77c que había sido amplificada por PCR utilizando pares de cebadores que contienen terminal de BsrGI y EcoRI, respectivamente. Para construir el plásmido HPP-H34ANtat2ANeo, se fusionaron fragmentos de ADN que representan la secuencia del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) y la secuencia de codificación de protelnas genotipo 1a H77c NS3 mediante solapamiento de PCR. El fragmento resultante se digirió con Kpnl en un sitio ubicado dentro de la IRES EMCV y BsrGl en el sitio creado dentro de la región modificada NS3 pH77c (véase más arriba), luego se insertó en lugar del fragmento correspondiente en pBpp-H34A-Ntat2ANeo/SI. La mutaciones adaptativas, 01 067R o G1188R, se introdujeron en pHpp-H34A-Ntat2ANeo/SI de una manera similar, utilizando fragmentos de ADNc preparados por RT-PCR de plantillas ARN aisladas a partir de lineas celulares independientes de replicón resistentes a G418 seleccionadas después de la transfección de células EN5-3 con HPP-H34A

Ntat2ANeo RNA. Se construyó pHtat2ANeo/SI sustituyendo el fragmento BsrGI-Xbal de pHpp-H34ANtat2ANeo/SI con el de pBpp-Htat2ANeo/SI. Una estrategia similar se utilizó para construir pHtat2ANeo/OR/SI, pHtat2ANeo/KRlSI, y pHtat2ANeo/ORlKRlSI. Se usó mutagénesis Ouick-Change (Stratagene) para introducir las mutaciones P1496L, F2080V y K2040R en constructos de replicación derivados de pHtat2ANeo/SI. [0081] Se crearon plásmidos pH77c modificados con mutaciones adaptativas sustituyendo el fragmento XbalBsrGI con el fragmento correspondiente del derivado del plásmido pHtat2ANeo que contiene la mutación indicada, a excepción de la mutación 01067R que fue introducida por mutagénesis Ouick-Change

(Stratagene). Cada mutación se confirmó por análisis de secuencia. Para su uso como controles, se crearon constructos genotipo 1a (Htat2ANeo/ORNI/KR/KR5A1SI/AAG y H77/0RNI/KR/KR5A1SI/AAG) incapaces de replicación subgenómicos y de longitud de genoma sustituyendo los residuos 2737-2739 de NS5B ('GDD') con 'AAG' utilizando una estrategia similar. Cada mutación se confirmó mediante análisis de secuencia. [0082] Transcripción y la transfeccion del ARN. El ARN se sintetizó con reactivos T7 MegaScript (Ambion, Austin, TX), después de linealizar los plásmidos con Xbal. Después del tratamiento con DNasa libre de RNasa para eliminar la plantilla de ADN y la precipitación del ARN con cloruro de litio, el ARN se transfectó en células Huh7 o células EN5-3 por electroporación. En pocas palabras, 5 g de ARN se mezclaron con 2 x 10 · células suspendidas en 500 I de solución salina tamponada con fosfato, en una cubeta con una anchura de intersticio de 0,2 cm (Bio-Rad). La electroporación fue con dos pulsos de corriente suministrada por el dispositivo de electroporación Gene Pulser II (Bio-Rad), fijado en 1,5 kV, 25 F Y máxima resistencia. Para los ensayos de replicación transitoria, no se añadió G418 al medio. Las células transfectadas se transfirieron a dos pocillos de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos, y el medio de cultivo se eliminó completamente cada 24 horas y se guardó a 4°C para el ensayo de SEAP posterior. Las células se lavaron dos veces con PBS antes de realimentación con medio de cultivo fresco. Dado que el medio de cultivo se reemplazó cada 24 horas en estos ensayos transitorios, la actividad SEAP medida en estos fluidos reflejaba la producción diaria de SEAP por las células. Las células se dividieron 5 dlas después de la transfección. Muestras de los medios se almacenaron a 4'C hasta ser ensayadas para actividad SEAP a la conclusión del experimento. [0083] Ensayo de fosfatasa alcalina. Se midió actividad SEAP en alícuotas de 1 O I de fluidos de cultivo sobrenadantes de células transfectadas utilizando el ensayo de indicador quimioluminiscente Phospha-Light (Applied BiosystemslTropix, Foster City, CA) con el protocolo sugerido por el fabricante a escala reducida. La señal luminosa se leyó usando un luminómetro TD-20/20 (Turner Designs, Inc., Sunnyvale, CA). [0084] Análisis de secuencias de ADNc a partir de ARN del VHC rplicante. ARN del VHC fue extraído de células, convertido a ADNc y amplificado por PCR como se ha descrito previamente (Yi et al., J. Virol, 77, 5768 (2003)). La sin tesis de ADNc de primera cadena se llevó a cabo con transcriptasa inversa Superscript 11 (Gibco-BRL); la polimerasa de ADN pfu Turbo (Stratagene) fue utilizada para la amplificación por PCR del ADN. Los ADNs amplificados se sometieron a secuenciación directa usando un secuenciador de ADN automático ABI 9600. [0085] Traducción in vitro. Se usó ARN transcrito in vitro, preparado como se describió anteriormente, para

programar reacciones de traducción in Vitro en lisado de reticulocitos de conejo (Promega, Madison, WI). Aproximadamente 1 g de ARN, 2 I de [35S]-metionina (1000 Cilmmol en 10 mCilml), y 1 I de una mezcla de aminoácidos que carece de metionina se incluyeron en cada 50 I de mezcla de reacción. La traducción se llevó a cabo a 30°C durante 90 minutos. Los productos de traducción fueron separados por SDS-PAGE seguido de autorradiografla o análisis Phosphorlmager (Molecular Dynamics). [0086] Inmunofluorescencia indirecta. Se cultivaron células en portaobjetos de cámara hasta confluencia de 70-80%, se lavaron 3 veces con PBS, y se fijaron en metanol / acetona (1:1 V / V) durante 10 min a temperatura ambiente. Una dilución 1 :20 de un anticuerpo monoclonal murino principal de núcleo o NS5A (Maine Biotechnology Services, Portland, ME) se preparó en PBS conteniendo albúmina de suero bovino 3%, y se incubó con las células fijadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavados adicionales con PBS, se detectó unión especifica del anticuerpo con un anticuerpo secundario IgG FITC-conjugado de cabra anti-ratón (Sigma, SI. Louis, Missouri) diluido 1:70. Las células se lavaron con PBS, se contraMeron con

DAPI, y se montaron en un medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) antes de examen por microscopio de fluorescencia Zeiss AxioPlan2.

[0087] Análisis Northern de ARN de VHC. Se sembraron células soportes de replicón en placas de 10 cm con una densidad de 5x105 células/placa, y se cosechó el ARN 4 días más tarde. El total de ARN celular se extrajo con el reactivo Trizol (Gibco-BRL) y se cuantificó por espectrofotometrla a 260 nm. 30 g del ARN total extraído de cada pocillo fue cargado en un gel desnaturalizan te de agarosa-formaldehído, sometido a electroforesis y transferido a membranas de nylon Hybond-N + cargadas positivamente (Amersham-Pharmacia Biotec) utilizando reactivos suministrados con el Kit NorthernMax (Ambion). Los ARNs se inmovilizaron sobre las membranas por reticulación UV. La membrana se hibridó con una mezcla de ribosonda antisentido [32p]_ etiquetada complementaria al extremo 3' de la secuencia NS5B de VHC (nucleótidos 8990-9275) derivada de

pH77C o pVHC-N, y la sonda hibridada fue detectada por exposición a película de rayos-X.

Resultados

[0088] Replicación transitoria de replicón 1a que contiene la secuencia quimérico codificante de NS3. En contraste con VHC genotipo 1 b, varios informes anteriores sugieren que es dificil generar replicones subgenómicos de genotipo 1a que sean capaces de replicación eficaz en células Huh7 (Blight y col., Science,

290:1 972-4 (2000), Gua et al., J. Virol, 75, 8516-23 (2001), Ikeda et al., J. Viral, 76, 2997-3006 (2002), Lanford et al., J. Viral, 77,1092-104 (2003)). Resultados similares se encontraron con un replicón Indicador de SEAP dicistrónico construido a partir del clan molecular infeccioso H77c (Yanagi et al., Proc Natl Acad Sci. EE.UU., 94, 8738-43 (1997)) que codificaba tanto la proteína HIV tat y la fosfotranferasa de neomicina en el cislrón aguas arriba. La organización de este último replicón, Htat2ANeo/SI (Fig. 1), era similar a la del replicón del genotipo 1 b Bpp-Ntat2ANeo/SI (Fig. 1) de replicación eficiente, referido anteriormente simplemente como "Ntat2ANeo/SI" (Yi et al., Virología,304,197-210 (2002)). La mayor parte de la secuencia de codificación de poliproteína del VHC en Bpp-Ntat2ANeo/SI se derivó de la cepa de VHC de genotipo1 b del VHC-N (Barba et al., Hepatol, 30, 316-24 (1999)), pero el prefijo "Bpp" usado aquí y en toda esta comunicación se refiere a la presencia de 225 nucleótidos (nts) de secuencia que se derivan de la cepa Con 1 de VHC en el extremo 5' de la región codificante de poliprotefna ("pp" indica la región 5' proximal codificante de la protesasa, figura.1 ). En contraste, toda la secuencia de VHC en Htat2ANeo/SI (fig. 1) se deriva del virus H77c de genotipo 1a, incluyendo tanto las secuencias NTR 5' como NTR 3'. A diferencia de ARN Bpp-Ntat2ANeo/SI, ARN Htat2ANeo/SI no transdujo la selección de colonias resistentes a G418, ni indujo la secreción de SEAP por encima de la observada con un mutante de supresión de NS5B incapaz de replicación (llGDD) cuando transfectado en células EN5-3 (células Huh7transformadas establemente que expresan SEAP bajo control del promotor de repetición de terminal larga de VIH) (Yi et al., Virology, 304,197-210 (2002)). en un ensayo de replicación transitoria. Este fue el caso a pesar de que el replicón fue disenado para contener la mutación adaptativa del genotipo 1 b, S22041, dentro de NS5A (fig. 1). La ausencia de replicación aparente de ARN Htat2ANeo/SI fue sorprendente dado el hecho de que se derivaba de un clon molecular infeccioso bien documentado de la cepa H77c de VHC (Yanagi et al., Proc Natl Acad Sci. EE.UU., 94, 8738-43 (1997)). [0089] Informes recientes sugieren que la traslación conducida por EMCV IRES del segundo cistrón en ARN subgenónmico dicistrónico, tal como las mostradas en la figura 1 pueden reducirse cuando la secuencia de ARN traducida se deriva del virus de genotipo 1a, en lugar de genotipo 1b (Gu et al., J. Virol, 77, 5352-9 (2003), Guo et al., J. Virol, 75, 8516-23 (2001), Lanford et al., J. Virol, 77,1092-104 (2003)). Sin embargo, incluso cuando la traducción del segundo cistrón se hace más eficiente reemplazando el 5' 225 nts de la secuencia NS3 de genotipo 1 a con la secuencia relacionada del virus de genotipo 1 b Con1, normalmente la replicación no se ha observado cuando el resto de la secuencia del replicón se deriva de un virus de genotipo

1a (Guo et al., J. Virol, 75, 8516-23 (2001), Lanford et al., J. Virol, 77,1092-104 (2003)). Sin embargo, Gu et al. (Gu et al., J Virol, 77, 5352-9 (2003)) describieron recientemente la selección exitosa de un replicón quimérico capaz de replicación en que el 5' 225 nts de la secuencia de codificación NS3 se derivaba de virus de genotipo 1 b, Y el resto del segundo cistrón de genotipo 1a del VHC (la construcción de replicones quiméricos simplificándose por un único sitio de BsrG1 dentro de la sceuncia del virus del genotipo 1 b Con 1, 225 nts aguas abajo del extremo 5' de la región NS3). Este replicón también contenia secuencia de NTR 5' derivada del virus de genotipo 1b, y tenia un único cambio de base dentro de la secuencia 3' NTR genotipo 1a. Los resultados de Gu et al. (Gu et al., J. Virol, 77, 5352-9 (2003)) sugieren que la inclusión de la secuencia Con1 en el extremo 5' final de la región NS3 puede de alguna manera facilitar la replicación del ARN 1a. Esta hipótesis está reforzada por observaciones hechas con replicones de genotipo 1 b derivados de N-VHC. Los descritos anteriormente, incluyendo Bpp-Ntat2ANeo/SI ARN, fueron construidos mediante ligación de la secuencia del VHC-N a un replicón Con1 en el sitio BsrG1 (Guo et al., J. Virol, 75, 8516-23 (2001), Ikeda et al.,

J. Virol, 76, 2.997-3.006 (2002), Yi et al., Virology, 304,197-210 (2002)), Y por lo tanto contienen secuencia de NS3 proximal 5" (secuencia de proteasa proximal o 'pp', fig. 1) derivada del virus Con1. Aunque este ARN Con1/HCV-N quimérico se replica significativamente más eficientemente que los replicones Con 1descritos originalmente, la sustitución de la secuencia de NS3 5' proximal en Bpp-Ntat2ANeo/SI con la secuencia de VHC-N (dando lugar a NPP-Ntat2ANeo/SI) prácticamente extirpó su fenotipo de replicación en ensayos de transfección transitoria, a pesar de que seguia siendo posible para seleccionar colonias resistentes a G418 a una baja frecuencia después de la transfección. [0090] Para evaluar formalmente la capacidad de la secuencia de NS3 proximal 5' de genotipo 1b para mejorar la replicación de ARN de genotipo 1a, la region codificante NS3 de 5' 225 nts en Htat2ANeo/SI fue reemplazada con la secuencia Con 1, generando Bpp-Htat2ANeo/SI (fig. 1). El constructo también se modificó sustituyendo el sitio de restricción Xba1 en el extremo 3' de la secuencia de VCH con la secuencia de la ribozima del virus de la hepatitis delta (Perrolla y Been, Nucleic Acids Res, 24,1314-21 (1996)). Hemos mostrado anteriormente que la presencia de los 4 nts extranos en el extremo 3' del replicón de ARN que resulta de la transcripción final de ADN del plásmido digerido con Xbal, reduce la capacidad de replicación de ARNs del genotipo 1 b en 2-3 veces (Yi y Lemon, RNA, 9, 331-45 (2003)). La inclusión de la ribozima dio lugar a transcriptos de ARN auto-escindibles capaces de generar de manera exacta la secuencia 3' terminal del ARN del VHC. Sin embargo, este ARN Bpp-Htat2ANeo/SI modificado aún seguia siendo incapaz de inducir la expresión de SEAP en células transfectadas EN5-3 más allá de la observada después de la transfección del ARN LlGDD. La transfección dio como resultado sólo un estallido inicial en la expresión SEAP debido a traducción del ARN replicón de entrada, sin la expresión de SEAP sostenida que es indicativa de la replicación del ARN (Fig. 2). Sin embargo, el ARN Bpp-Htat2ANeo/S1 era capaz de transducir la selección de colonias de células resistentes a G418 que soportan la replicación de los ARN durante un período de 3-4 semanas después de la transfección de las células. [0091] Se analizó la secuencia de ARN replicón extraída de dos clones independientes de células resistentes a G418 seleccionados tras la transfección de células En5-3 con ARN BPP-Htat2ANeo. Se determinó la

presencia de una única mutación Lys a Arg situada dentro de la región NS4A, en el residuo 1691 (K1691R) de la poliprotefna en ambos clones celulares. Este residuo se encuentra justo más allá de los límites 3' de la secuencia del péptido cofactor de NS4A que participa en la formación de un complejo no covalente con NS3 y mejora la actividad de la proteasa (Wright-Minogue et al., J Hepatol, 32, 497-504 (2000), Yao et al., Estructura

Fold Des, 7, 1353-1363 (1999» . Para determinar si la mutación K1691R facilitó la replicación del ARN

quimérico genotipo 1 b/1 a en células En5-3, esta mutación fue introducida en el constructo progenitor BppNtat2ANeo/SI, creando así Bpp-tat2ANeo/KRISI (ver Tabla 2 para obtener una lista de todas las mutaciones adaptativas identificadas en estos estudios, así como los símbolos utilizados para indicar su presencia en constructos). Como se muestra en la figura 2, esta única mutación mejora de forma significativa la capacidad de replicación del ARN, lo que permite detectar la replicación por un aumento sostenido en la expresión de SEAP después de la transfección transitoria de células EN5-3 en ausencia de G41 8 (fig. 2). Puesto que el nivel de producción de SEAP se ha demostrado que se correlaciona estrechamente con la abundancia intracelular del ARN replicón en este sistema indicador (Yi et al., Virology, 304,197-210 (2002), Yi et al., J. Virol, 77, 57-68 (2003)) conclufmos que K1691 R es una mutación adaptativa. Curiosamente, se ha mostrada previamente que esta mutación confiere un fenotipo de replicación mejorada a replicones Con 1 (Lohmann et al., J. Virol, 77,

3007-19 (2003» , mientras que la secuencia del VHC-N es naturalmente Arg en esta posición (Barba et al., Hepatol., 30, 316-24 (1999» . Nuestros resultados están en contraste con los reportados por Gu et al. (Gu et al., J. Virol, 77, 5352-9 (2003» , que identificaron varias mutaciones en las secuencias NS3, NS5A y NS5B de ARNs quiméricos de genotipo 1 b-1 a. Ninguna de estas mutaciones pareció mejorar la capacidad de los ARN quiméricos para replicar o translucir la selección de colonias.

[0092] Los 5 '225 nts de la secuencia NS3 de genotipo 1a modulan a la baja la amplificación de replicón. Los resultados antes descritos, asf como los de Gu et al. (Gu et al., J Virol, 77, 5352-9 (2003)) sugieren que los primeros 225 nts de la secuencia NS3 del genotipo 1 a tienen un impacto negativo en la replicación de replicones VHC subgenómicos. Esto podría ocurrir por modulación a la baja de la traducción dirigida por IRESEMCV de las proteínas no estructurales (Guo et al., J. Virol, 75, 8516-23 (2001)), o influyendo directamente en la propia replicación, posiblemente influyendo una función NS3-relacionada. Para abordar esta cuestión, se buscó identificar mutaciones adaptativas adicionales capaces de compensar la presencia de la secuencia de proteasa proximal 5' de genotipo 1 a. Se construyeron así replicones quiméricos adicionales conteniendo la secuencia NS3/4A completa del genotipo 1a dentro del fondo de Bpp-Ntat2ANeo/SI (Hpp-H34A-Ntat2ANeo/SI, fig. 3A). También se construyó una variante de este constructo en la que los primeros 225 nts de la secuencia de NS3/4A fueron reemplazados con la secuencia Con1 (BPP-H34A-Ntat2ANeo/SI, figura 3A). En ambos ARNs quiméricos, la secuencia que se extiende desde NS4B a la 3' NTR se derivó por completo de la cepa VHC-N genotipo 1 b. Mientras que el replicón que contiene toda la secuencia de NS3/4a genotipo 1 a (HppH34A-NtatNeo/SI) no mostró evidencia de replicación en un ensayo de transfección transitoria, la variante que contiene los primeros 225 nts de la secuencia Con1 (Bpp-H34A-NtatNeo/SI) replicó así como el replicón referencia Bpp-Ntat2ANeo/SI (Fig. 3B). Este resultado confirma que los 225 nucleótidos 5' de la secuencia NS3 de genotipo 1a tienen un efecto negativo sobre la replicación de ARN en células EN5-3, y también indica que la secuencia aguas abajo NS3/4a de genotipo 1a funciona bien en este contexto. [0093] Curiosamente, a pesar de la falta de replicación detectable de ARN en el ensayo transitorio, era posible la selección de clones celulares estables de células resistentes a G418 después de la transfección de ARN Hpp-H34A-Ntat2ANeo/SI. La secuenciación de ARNs replicones derivada de dos clones celulares independientes sólo reveló una única mutación potencialmente adaptativa en cada uno: Q1067R y G1188R, ambas localizadas dentro de ARN que codifica la proteasa NS3 (Fig. 3A). La mutación Q1067R tiene un interés particular, puesto que está dentro de los 225 nucleótidos 5' de la región NS3. Cuando se introduce en

HPP-H34ANtat2ANeo I SI, la mutación Q1067R y (en menor medida) la G1188R amplían la replicación del ARN a un nivel que fue detectable en el ensayo transitorio (figura 3B), lo que indica que ambas son mutaciones adaptativas y capaces de compensar, en parte, la presencia de la secuencia de proteasa de genotipo 1 a. Sin embargo, ninguna de estas mutaciones, cuando introducidas en un replicón con sólo secuencia de genotipo 1 a (Htat2ANeo/SI), fue capaz de mejorar la replicación hasta el punto en que era evidente en el ensayo transitorio (Htat2ANeo/QRISI,. Fig. 4). [0094] Replicación transitoria de replicón de un genotipo 1a en células normales Huh7. Para determinar si las mutaciones K1691R y Q1067R pueden trabajar cooperativamente para conferir un fenotipo de replicación transitorio del ARN replicón de genotipo 1 a, ambas se introdujeron en Htat2ANeo y se evaluó la capacidad del ARN modificado para replicar en células transfectadas EN5-3. Sorprendentemente, la combinación de las mutaciones K1691R y Q1067R (además de la mutación S22041 en NS5A) confirió un fenotipo de replicación

relativamente robusto al ARN genotipo 1 a, de modo que la replicación fue fácilmente detectable en el ensayo de transfección transitoria utilizando el sistema indicador SEAP (Htat2ANeo/QR/KRISI, la fig. 4B). Usando un enfoque similar al adoptado en los experimentos anteriores, una mutación adaptativa adicional (F2080V) dentro de la región codificando NS5A (F2080V) se identificó después, cuando las células transfectadas con ARN Htat2ANeo/QR/KRISI fueron sometidas a la presión de selección con G418. Esta mutación dio lugar a una ligeramente mayor eficiencia de replicación cuando se introduce en el replicón genotipo 1a que contiene K1691R y Q1067R además de S22041 (Htat2ANeo/QR/KR/FV/SI, fig. 4B). Sin embargo, F2080V tuvo

relativamente poco efecto cuando se añade a replicones que contienen sólo K1691 R o Q 1 067R (además de S22041) (Fig. 4B). Se observó secreción de SEAP minimamnete incrementada sobre el fondo GDD durante los primeros 5 días tras la transfección con Htat2ANeo/KR/FV/SI, pero esto ya no era evidente tras 6 días. El fenotipo de replicación de Htat2ANeo/QR/FV/SI era indistinguible del de GDD mutante incapaz de replicación en este ensayo (Fig. 4B). Estos resultados se resumen en la figura 4C. [0095] Para facilitar la comparación de estos resultados con los reportados previamente por Blight y col. (Blight et al., J Virol, 77, 3181-90 (2003», la mutación adaptativa P1496L identificada por este grupo en el dominio de la helicasa de NS3 tras la transfección de un replicón de genotipo 1 a se introdujo en la sublínea Huh7 altamente permisiva, Huh-7.5. De acuerdo con el informe anterior, un replicón 1a que soporta esta mutación

P1496L demostró sólo una evidencia mínima de replicación en el ensayo transitorio (que utiliza células EN5-3 que son comparables a células normales Huh7 en términos de su permisividad para replicación de ARN de VHC) (Htat2ANeo/PL/SI, fig. 4B). La adición de la mutación de NS5A, F2080V, no pudo mejorar notablemente la capacidad de replicación de este ARN (Htat2ANeo/PLlFV/SI, la fig. 4B). La expresión SEAP inducida por replicones de genotipo 1a que contienen ambas Q1067R y K1691R fue de unas 10 veces la inducida por replicones que contienen P1496L. Dado que la producción de SEAP desde células EN5-3 se correlaciona estrechamente con la abundancia intracelular del ARN replicón (Yi et al. ,Virología, 304,197-210 (2002)), estos resultados sugieren que las mutaciones del dominio de proteasa tienen una mayor contribución a la capacidad de replicación del replicón de genotipo la.

[0096] Las mutaciones adaptativas en NS3 no afectan a la traducción conducida por EMCV IRES del segundo cistron. Como se ha mencionado anteriormente, informes anteriores indican que la traducción conducida por EMCV del segundo cistrón se reduce en replicones de genotipo 1 a en comparación con replicones que contienen la secuencia Con1 de genotipo 1 b (Gu et al., J. Virol, 77, 5352-9 (2003), Guo et al., J. Virol, 75, 8516-23 (2001), Lanford et al., J. Virol, 77,1092-104 (2003)). Aunque el mecanismo es incierto, el efecto parece ser debido a que la secuencia de genotipo 1 a codifica el extremo amino terminal de NS3. Dado que la mutación adaptativa 01067R se encuentra dentro de esta región, nos preguntamos si ella u otras mutaciones que mejoran la amplificación del replicón 1a lo hacen mediante la mejora de la traducción conducida por EMCV IRES de las protelnas no estructurales de VHC. Para probar esta hipótesis, se programaron reacciones de traducción in vitro con ARN replicones de genotipo 1b y 1a conteniendo diversas mutaciones adaptativas, y se compararon las producciones de proteínas codificadas por el segundo cistrón con neomicina fosfotransferasa producida del primer cistrón. Como se muestra en la figura. 5, la síntesis de NS3 se redujo ligeramente con replicones con secuencia H77c de genotipo 1a en la región 5' proximal de la proteasa (comparar la abundancia de NS3 en las vías 4-8 con la que hay en otras vías). Sin embargo, no se incrementó por ninguna de las mutaciones adaptativas, incluyendo 01067R. Este resultado indica que la dificultad de establecer replicones 1 a capaces de replicación es más probablemente debida a la propiedad intrínseca de la secuencia 1 a que a una incompatibilidad de las secuencias de VCH y EMCV en esta región que conduce a una actividad reducida de la EMCV IRES. No obstante, el reducido nivel de traducción de las proteinas no estructurales de genotipo la que es evidente en la figura 5 puede contribuir al pobre fenotitpo de replicación de estos ARNs. [0097] Una mutación adaptativa NS5A adicional aumenta la capacidad de replicación. Aunque la mutación F2080V en NS5A proporcionó sólo una ligera ventaja adicional de replicación a ARNs subgenómicos de genotipo 1a que contienen las mutaciones 01067R, K1691R Y S22041 (Fig. 4), se identificaron simultáneamente posteriormente mutaciones adicionales cerca del término C de NS3 (V 16551) Y dentro de NS5A (K2040R) en ARNs replicantes dentro de una línea celular resistente a G418 seleccionada tras la transfección con el replicón subgenómico Htat2ANeo/OR/KRISI. Como se muestra en la figura. 6, ambas de estas mutaciones mejoran la capacidad de replicación del ARN de genotipo 1 a. La adición de la mutación 16551 V resultó en una mejora modesta de la replicación de Htat2ANeo/OR/KRISI, que condujo a un fenotipo de replicación ligeramente mejor que el observado con la adición de la mutación F2080V. En contraste, la adición de la mutación K2040R en NS5A dio lugar a un aumento importante de capacidad de replicación, haciendo al fenotipo de replicación del ARN genotipo 1a equivalente al del replicón estándar VHC-N de genotipo 1b usado en estos estudios, Bpp-Ntat2ANeo/SI (Fig. 6B). Un replicón de genotipo 1a que contiene ambas de estas mutaciones adaptativas, además de las replicadas identificados anteriormente con una eficiencia ligeramente mayor que este ARN de referencia de genotipo 1 b en el ensayo transitorio (Fig. 6B, Htat2ANeo/ORNI/KRlKR5A1SI). Estos resultados fueron confirmados en experimentos independientes.

[0098] Replicación robusta del ARN de genotipo 1 a de longitud de genoma con mutaciones adaptativas.

Alentados por 105 anteriores resultados, evaluamos la capacidad de replicaciuón invitro de ARN H77c genotipo 1a de longitud de genoma manipulado para contener las mutaciones adaptativas antes descritas. Al igual que con 105 ARNs subgenómicos dicistrónicos, colocamos la secuencia de ribozima de la hepatitis delta en el extremo 3' de la secuencia de ADNc infeccioso clonado en pH77c a fin de generar transcritos de ARN que

contienen un terminal 3' exacto de VHC. Como estos ARNs genómicos no codificaban ningún marcador seleccionado o producto de proteina indicador, su replicación se evaluó en células Huh7 y EN5-3 transfectadas por análisis northern blot en comparación con ARNs subgenómicos relacionados. ARNs mutantes H77 subgenómicos y de longitud genómica incapaces de replicación, en los que el motif GDD habla sido sustituido con AAG, sirvieron como controles negativos para este experimento. Para las células EN5-3 transfectadas con los ARNs subgenómicos, también determinamos los niveles de expresión de SEAP. [0099] Como se esperaba, el ARN H77c no modificado no mostró evidencia de replicación, a pesar de que se ha demostrado previamente que es infeccioso en chimpancés cuando se inocula en el higado (Fig. 7, comparar linea 7 con ARN genómico 1a de replicación defectuosa en linea 11). La introducción de la mutación Q1067R (NS3), sola o en combinación con S22041 (NS5A), fue insuficiente para conferir un nivel detectable de la replicación a células Huh7. Sin embargo, cuando se introdujeron las tres mutaciones (Q1067R, K1691 R Y S22041), el ARN H77c adquirió un fenotipo de replicación relativamente eficiente con amplificación fácilmente detectable de ARN en northern blots de lisados celulares preparados 4 dlas después de la transfección de células Huh7 o EN5-3 (Figura 7, linea 8). La replicación de ARN de longitud genómica aumentó ligeramente por la adición ulterior de la mutación F2080V (NS5A) (fig. 7, linea 9). Sin embargo, coherentemente con los datos presentados en la figura. 6, la inclusión de tanto la mutación V16551 en NS3 como la mutación K2040R confirieron un fenotipo de replicación sustancialmente más robusto en el H77c de longitud genómica, cuando están presentes en combinación con otras mutaciones adaptativas en NS3, NS4A y NS5A (H77c/QRNI/KR/KR5A1SI, la fig. 7, comparar lineas 10 y 11). Este experimento confirmó asi los efectos de adaptación de estas mutaciones. El Northern blot indicó que la capacidad de replicación del ARN genotipo 1a de longitud de genoma que contiene mutaciones adaptativas fue significativamente mayor que los replicones de genotipo 1 a comparables subgenómicos, dicislrónicos, por lo que la senal de ARN 4 días después de la transfección era baja y cerca de los límites de detección en northern blots (Fig. 7, comparar vlas 3 a 6 con las vías 8 a 11). Estos hallazgos son coherentes con los reportados previamente por Blight y col. (J. Vi ro 1. , 77, 3181-3190 (2003)), e indican que la inclusión de secuencias heterólogas en los replicones dicistrónicos perjudica la capacidad de replicación del ARN. Replicones subgenómicos de ARN se detectaron de forma inequivoca sólo en células transfectadas con Htat2ANeo/QRNI/KR/KR5A1SI, los ARN que generaron el más alto nivel de la expresión de SEAP (Fig. 7, comparar linea 5 y 6). [0100] Como una medida adicional de la capacidad de replicación de estos ARNs H77c modificados de longitud genómica, examinamos también células EN5-3 transfecladas para detectar la presencia proteínas de núcleo o NS5A usando un método de inmunofluorescencia indirecta. La introducción de ambas mutaciones K1691 R (NS4A) Y S22041 dio lugar a expresión detectable de antigeno 4 dlas después de la transfección, aunque sólo en un porcentaje muy bajo de células (menos de 0,01%). Sin embargo, se observó fuerte expresión en proteínas de núcleo y NS5A en aproximadamente el 30% de las células En5-3 4 días tras la transfección de ARN con las cuatro mutaciones adaptativas. El aumento de la eficacia de replicación de ARN de genotipo 1a se correlacionaba con una mayor proporción de células soportando la replicación de ARN del VHC, evidenciada por la presencia de antlgeno vlrico.

Discusión

[0101] Replicones de ARN del VHC subgenómicos, dicistrónicos, seleccionables derivados de virus de genotipo 1b se replican eficientemente en células cultivadas (Blight y otros, Science, 290:1 972-1974 (2000), Guo et al., J. Virol., 75:8516-8523 (2001), Ikeda et al., J. Virol., 76:2997-3006 (2002), Krieger et al., J. Virol.,

75:4614-4624 (2001), Lohmann et al., J. Virol., 75:1437-1449 (2001), y Lohmann et al., Science 285: 11 0-113 (1999)). Estos nuevos ARNs han facilitado el estudio de la replicación del ARN del VHC y aceleraron

considerablemente los esfuerzos de descubrimiento de fármacos antivirales. La linea celular Huh7, derivada de un hepatoma humano, parece ser únicamente permisiva y de apoyo de la replicación de estos ARN del VHC, aunque estudios recientes sugieren que otros tipos de células también pueden ser permisivas para la replicación del ARN del VHC (Zhu et al., J. Virol., 77:9204-9210 (2003)). Sin embargo, a pesar del éxito de replicones de genotipo 1 b, ha sido dificil generar ARN que se replique de manera eficiente en cualquier tipo de célula de otros genotipos de VHC, incluyendo genotipo 1a, (Blight y otros, Science, 290:1 972-1974 (2000), Guo ... et al, J. Virol, 75:8516-8523 (2001), Ikeda et al, J. Virol, 76:2997-3006 (2002), y Lanford y otros, J. Virol, 77, 1092-104 (2003)). Esta sorprendente observación indica que existen diferencias biológicas significativas entre virus de genotipo 1a y lb, a pesar del hecho de que las secuencias de nucleótidos de los virus de genotipo 1 a están relativamente muy relacionados con las de genotipo 1 b (90 -93% de identidad). Esta diferencia biológica plantea la posibilidad de que agentes antivirales que se consideren activos contra el virus de genotipo 1 b pueden tener significativamente menor actividad contra virus de genotipo 1a. En vista de estas observaciones y la relativamente alta variabilidad genética que existe entre los diferentes genotipos del VHC, el desarrollo de sistemas de cultivo celular que soportan la replicación de ARNs viricos de otros genotipos será importante para validar la eficacia in vitro de agentes antivirales candidatos en una gama de genotipos del VHC genéticamente distintos, asi como para desarrollar una mejor comprensión general de estos virus.

[0102] Los virus de genotipo 1a son los tipos más frecuentes de VHC en los Estados Unidos, y al igual que el virus genotipo 1 b son relativamente refractarios al tratamiento con interferón (Fried et al., N Engl J Med., 347, 975-82 (2002), Y McHutchison Fried, Clin Liver Dis, 7, 149-61 (2003)). Hasta el momento, se ha reportado un nivel detectable de replicación de ARN de genotipo 1a sólo en sublineas celulares humanas Huh7 de hematoma altamente permisivas especialmente aisladas (por ejemplo, células Huh-7.5) generadas eliminando la reproducción de replicones de ARN de genotipo 1 b de replicones establecidos en lineas celulares de replicones utilizando interferón-a in vitro (Blight y col., J Virol, 77, 3181-90 (2003), Grobler y col., J. Biol. Chem., 278,1 6741-6 (2003)). Estos ARNs de genotipo 1a antes descritos poseen mutaciones adaptativa de cultivo celular que mejoran su replicación en estas células especiales, incluyendo las seleccionadas durante el aislamiento de lineas celulares resistentes a antibióticos que contienen estos replicones 1a (Blight y col., J Virol, 77, 3181-90 (2003), Grobler y col., J. Biol. Chem., 278,16741-6 (2003)). Sin embargo, los informes

publicados sugieren que estos ARN de genotipo 1a descritos anteriormente no se replican a un nivel detectable en células Huh7 estándar, y que su capacidad para replicación en células cultivadas está por lo tanto limitada. Por el contrario, se informa aquí que los ARN del VHC de genotipo 1a replican de una manera altamente eficiente en las células Huh7normales.

[0103] Nuestros resultados sugieren que la replicación altamente eficiente de los ARN de genotipo 1a requiere al menos tres mutaciones adaptativas situadas dentro de las protelnas NS3, NS4A y NS5A. Es evidente que estas mutaciones se refuerzan mutuamente en su capacidad para mejorar la replicación de los ARN de genotipo 1a, a pesar de que se identificaron individualmente bajo diferentes circunstancias. Se encontró que la introducción de la mutación S22041 en NS5A, que es conocida por promover la replicación de ARNs de virus de genotipo 1b en células Huh7 (Blight y col., Science, 290:1 972-4 (2000)), no era suficiente para que replicones subgenómicos compuestos en su totalidad de la secuencia de genotipo 1 a iniciaran la replicación en células Huh7. Sin embargo, hizo posible la selección de colonias de células resistentes a G418 después de la transfección de un ARN replicón quimérico, en el que la secuencia del clon molecular infeccioso del virus H77c de genotipo 1 a codificaba todas las protelnas no estructurales distintas de los 75 residuos de aminoácidos N-terminales de NS3 que se derivan de la secuencia Con I de genotipo 1 b (Fig.1, BppHtat2ANeo/SI). Los ARN de HCV que replican en estas células contenían una sola mutación dentro de la región de codificación de NS4A (K1691 R) que mejoró la capacidad de replicación del ARN replicón quimérico original, (Fig. 2). Estos resultados sugieren que una restricción a la replicación del virus de genotipo 1 a en células Huh7 puede residir dentro del dominio de la proteasa de serina de NS3, ya que la sustitución del dominio N-terminal de la proteasa genotipo 1 a con la del virus Con1 de genotipo 1 b permitió la iniciación de la replicación y la selección de células resistentes a G418. Una conclusión similar puede extraerse a partir de los resultados reportados por Gu el. al. (Gu et al., J Virol, 77, 5352-9 (2003)). Por lo tanto, es interesante que la

mutación adaptativa K1691 R resida dentro de NS4A muy cerca de la superficie del complejo proteasa NS3/4A que ayuda a formar (Fig. 8). [0104] En un esfuerzo por comprender mejor esta restricción, se construyó un segundo replicón quimérico que contiene la secuencia completa NS34A del genotipo 1a dentro del fondo de un replicón de genotipo 1b. Este ARN (HPP-H34ANtat2ANeo / SI) no sufrió replicación detectable en el sistema de transfección transitoria utilizado en estos estudios (fig. 3). Sin embargo, fue capaz de transducir la selección de colonias de células resistentes a G418 después de la transfección y selección antibiótica. El análisis de la secuencia de los ARN de HCV replicando dentro de estas células identificó una segunda mutación adaptativa de cultivo celular dentro de la región N-terminal de la proteasa NS3 (Q1 067R), proporcionando evidencia adicional de que una restricción principal a la replicación del virus de genotipo 1a reside dentro de este dominio. Otra evidencia adicional de esto viene del fenotipo de replicación del replicón Bpp-H34A-Ntat2ANeo/SI, que también contiene toda la secuencia NS3/4A del genotipo 1 a, excepto por los 75 residuos aminoácidos del extremo N-terminal, y que demostró un fenotipo de replicación robusto en el ensayo de transfección transitoria. Por lo tanto parece que hay ninguna restricción a la replicación que se derive de la inclusión del dominio de la helicasa NS3 de genotipo 1 a, ni de hecho cualquier parte del dominio de la proteasa a excepción de su extremo N-terminal.

[0105] Trabajos posteriores demostraron que las mutaciones K1691R y Q1067R trabajaron cooperativamente: ninguna por si misma era capaz de conferir la capacidad para replicación eficiente en un replicón compuesto en su totalidad de la secuencia de genotipo 1 a, pero una combinación de las dos (además de la mutación adaptativa S22041 de genotipo lb) dio lugar a replicación del ARN que podia ser fácilmente detectada en el ensayo de transfección transitoria (Fig. 4). Que estas mutaciones actuaran cooperativamente en sus efectos sobre la replicación, como se indica por los datos mostrados en la figura. 4, es coherente con su ubicación en la poli proteína, ya que el dominio del cofactor de proteasa NS4A interactúa principalmente con residuos dentro

del dominio N-terminal de la proteasa NS3 (Wright-Minogue et al., J Hepatol, 32, 497-504 (2000), Yao et al., Estructura Fold Des, 7, 1353-1363 (1999)). [0106] Se identificaron y verificaron mutaciones adaptativas adicionales en serie iterativas de experimentos que implican transfeccion del ARN, aislamiento de células resistentes a G418, y análisis de secuencia de replicación eficiente del ARN de genotipo 1 b. También se demostró que la mutación S22041 facilita la replicación de ARN de genotipo 1a, ya que su eliminación de los ARNs subgenómicos de eficiente replicación reducía sustancialmente su capacidad de replicación en el ensayo de transfección transitoria. Las mutaciones adaptativas de genotipos 1 a identificadas aqui se resumen en la Tabla 2. Pueden ser agrupadas funcionalmente en dos grupos: K2040R, F2080V, y S22041, que se encuentran dentro de NS5A (un sitio común de las mutaciones adaptativas de gentipo 1b) y Q1067R, G1188R, V 16551 Y K1691R, que están ubicadas en o asociadas de otro modo con el dominio de la proteasa de NS3. Mientras se exponen en alguna medida a disolventes, tanto G1188R como Q1067R están cerca del sitio activo de la proteasa (Fig. 8), Y añadirián ambos una diferencia significativa de carga a la cara activa de la proteína. V16551 es particularmente interesante. Se encuentra cerca del extremo terminal C de la proteína NS3, aguas abajo del dominio helicasa, y cerca del sitio activo de la proteasa en la estructura cristalina del complejo NS3/4A (Yao et al., Estructura Fold Des, 7, 1353-1363 (1999»

. En la posición P3 del sitio de escisión NS3/4A, V1655 juega ciertamenter un

papel en el reconocimiento de sustrato durante la escisión activa en cis de la poliproteina en la unión NS3/4A y se mantiene dentro de el bolsillo de unión al sustrato en la estructura cristalina. El impacto potencial de la mutación K1691 R, dentro de NS4A, en la conformación del sitio activo de la proteasa es mucho menos cierto, pero está en estrecha proximidad con el dominio del cofactor NS4A, como antes se mencionó, y es bien conocido que la intercalación de este dominio en la proteasa NS3 modula la actividad de la proteasa. [0107] Significativamente, todos estas mutaciones de NS3 y NS4A se encuentran a cierta distancia de otras mutaciones adaptativas de genotipo 1 a en NS3 que se han descrito en la literatura (véase la fig. 8). Estas mutaciones, localizadas en S1222, A 1226 Y P1496, están todas dentro del dominio helicasa NS3 (Blight et al., J Viro 1, 77, 3181-90 (2003), Grobler et al., J Biol. Chem., 278,16741-6 (2003)). Aunque en la superficie de la proteina, se encuentran en el lado opuesto las superficies expuestas al disolvente que contienen los residuos G1188, V1655, Q1067 (Fig. 8). Por lo tanto, es posible que faciliten la replicación del ARN de genotipo 1a por un mecanismo diferente al de las mutaciones que se agrupan cerca del sitio activo de la proteasa. Por lo menos la mutación P1496L identificada por Blight y col. (Tizón et al., J Virol, 77, 3181-90 (2003)) Y Grobler y

col. (Grobler y col., J. Biol. Chem., 278,16741-6 (2003» parece ser sustancialmente menos activa en conferir

capacidad de replicación en el ARN H77c de genotipo 1a. Esto se demostró por la falta de replicación detectable de replicones de ARN que contienen esta mutación (Htat2ANeo/PUSI y Htat2ANeo/PUFVlSI) en el experimento de transfección transitoria resumido en la figura. 4. [0108] ¿Qué papel jugarían las mutaciones cerca del sitio activo de la proteasa NS3 en la promoción de la replicación del ARN del VHC genotipo 1a en células Huh7? Es poco probable que estas mutaciones trabajen

mejorando la traducción de las proteinas no estructurales bajo el control del EMCV IRES en el contexto del replicón subgenómico, ya que no observamos ninguna diferencia en la traducción de estas proteinas in vitro en lisados de reticulocitos programados con estos ARNs (Fig. 5). Más importante aún, mejoran la replicación del ARN H77c genómico que carece de cualquier secuencia heteróloga en células Huh7 (véase la fig. 7). Estas

mutaciones no parecen promover la replicación por influencia favorable en la capacidad de la proteasa para procesar la poliproteína virica, ya que el segmento de poli proteína expresado en los derivados de Htat2ANeo se deriva enteramente del mismo genoma de H77c, y éste se replica de manera muy eficiente en el higado de un chimpancé. Sin embargo, esto sigue siendo una posibilidad formal que debe ser excluida en estudios futuros. Es posible, en cambio, que estas mutaciones promuevan interacciones del complejo NS3/4A con proteínas celulares especificas que desempenan un papel en el ensamblaje del complejo de replicasa vírica, o influyen de otro modo en la replicación por desactivación de las defensas innatas antiviricas celulares. [0109] Foy et al. (Foy et al., Science, 300, 1145-8 (2003)) ha demostrado recientemente que la expresión de la proteasa NS3/4A bloqueaba eficazmente la activación del factor 3 regulador de interferón (IRF3) en células Huh7 infectadas con virus de Sendai, evitando por ello la inducción de síntesis de interferón-¡3 y otras citoquinas antivirales. Esta acción inmuno-evasiva de NS3 fue revertida por un inhibidor específico de cetoamida de la proteasa NS3/4A, y era dependiente de la actividad proteasa de NS3/4A, lo que indica que es probable que NS3/4A escinda una proteína celular implicada en la senalización de IRF3 tras infección vírica. Mientras Foy et al. (Foy et al., Science, 300, 1145-8 (2003)) demostraron que ambas proteasas de genotipo 1 a y de genotipo 1 b son capaces de bloquear la activación de IRF3, es intrigante considerar que las mutaciones adaptativas dentro de NS3/4a pueden promover su capacidad para dirigir tal escisión, mejorando por ello la replicación del virus mediante la disminución de defensas antiviricas celulares. [0110] El segundo grupo de mutaciones de adaptación identificadas en NS5A, K2040R, F2080V Y S22041 (Tabla 2), es probable que funcione de una manera similar a las mutaciones adaptativas NS5A identificadas en

replicones de genotipo 1 b, que incluyen S22041. Aunque no se conoce su mecanismo específico de acción, pueden promover ya sea la capacidad de NS5A de montar un complejo funcional replicasa en las células Huh7, o tal vez aumentar las acciones inmunomoduladoras que se han propuestopara esta protefna vfrica a través de sus interacciones con proteina quinasa R estimulada por ARN de doble cadena (PKR) (Gale et al., Clin Diagn Virol, 10, 157-62 (1998)). La contribución de estas mutaciones adaptativas a la replicación del ARN de genotipo 1a en estos estudios parece ser adicional a la de las mutaciones NS3/4A (Figs. 3 y 6), no sinérgica como se muestra para la combinación de 01067R y K1691R (fig. 3). Texto libre de Listado de Secuencias [01 11] SEC ID N°: 1 Secuencia de nucleótidos de la cepa de virus de hepatitis C H77 SEC ID N°: 2 Secuencia de aminoácidos de la poliprotefna de VHC codificada por los nucleótidos 342 a 9377 de la SEC ID N°: 1. SEC ID N": 3 Secuencia de nucleótidos de la cepa H del virus de la hepatitis C SEC ID N°: 4 Secuencia de aminoácidos de la poliproteína del VHC codificada por los nucleótidos 342 a 9377 de la SEC ID N": 3. SEC ID N°: 5 Polipéptido tat VIH SEC ID N°: 6 Sitio de reconocimiento de NS3 SEC ID N°:7 Secuencia de nucleótidos de VIH SEAP, la repetición terminal larga del VIH (LTR) se representa en los nucleótidos 1-719, y fosfatasa alcalina secretora está codificada por los nucleótidos 748 a 2239. SEC ID N°: 8 Secuencia de nucleótidos de una NTR 3'. SEC ID N°: 9 Secuencia de nucleótidos de una NTR 5' SEC ID N°: 10 Poilpéptido tat VIH SEC ID N°: 11 Virus de la hepatitis C de longitud genómica, genotipo la SEC ID N°: 12 Poliproteína VHC codificada por la región codificante presente en SEC ID N": 11. SEO ID N°: 13 secuencia de nucleótidos de Htat2ANeo SEC ID N°: 14 Poliproteína VHC codificada por la región codificante presente en SEC ID N°: 13

Claims (23)

1. Reivindicaciones

   1. Un polinucleótido capaz de replicación que comprende: una región 5' no traducida (NTR), una 3' NTR, Y una secuencia codificante presente entre las 5' NTR Y 3' NTR Y codificando una poli proteína del virus de la hepatitis C, donde la poli proteína comprende una

   5 isoleucina en lugar de la serina correspondiente a la serina 2204 de la SEC ID N 0: 2, y una arginina en lugar de la glutamina correspondiente a glutamina 1067 de la SEC ID N 0: 2, en la que la 5' NTR, la 3' NTR Y la secuencia de nucleótidos que codifica la poliproteína son genotipos 1a, en la que el polinucleótido capaz de replicación se replica en células Huh7, yen la que la poli proteína comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la SEC ID N 0: 2.

   10 2. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1 que comprende además una secuencia de codificación adicional.
2. 3. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 2 en el que la secuencia adicional de codificación codifica un marcador.

3. 4.

   El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 2 en el que la secuencia adicional de codificación 15 codifica un transactivador.

4. 5. El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1 que comprende además una secuencia de nucleótidos que tiene una actividad de ribozima en cis, en el que la secuencia de nucleótidos se encuentra en 3' de la 3' NTR.

5. 6.

   El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1 en el que la ubicación de un aminoácido dado 20 varía en 1 ó 2 ó 3 ó 4 ó 5 residuos en comparación con la ubicación en la SEC ID N 0: 2.

6. 7. Un polinucleótido capaz de replicación según la reivindicación 1 en el que la poliproteina codificada del virus de la hepatitis C comprende, además, una combinación de mutaciones adaptativas seleccionadas del grupo que consiste de una arginina en lugar de la lisina correspondiente a la lisina 1691 de la SEC ID N 0: 2, una valina en lugar de la fenilalanina correspondiente a fenilalanina 2080 de la SEC ID W: 2, una isoleucina en

   25 lugar de la valina correspondiente a valina 1655 de la SEC ID N°: 2, una arginina en lugar de la lisina correspondiente a lisina 2040 de la SEC ID N 0: 2, una arginina en lugar de la glicina correspondiente a glicina 1188 de la SEC ID N 0: 2.
7. 8. Un método para producir partículas víricas, que comprende incubar una célula que comprende el polinucleótido capaz de replicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en condiciones que

   30 permitan al polinucleótido replicar, en el que el polinucleótido capaz de replicación está presente en las partículas del virus.

8. 9.

   El método de la reivindicación 8 que comprende además aislar las partículas víricas.

9. 10.

   Partlculas viricas que contienen el polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1.

10. 11.

    Un método para hacer un polinucleótido capaz de replicación que comprende: proporcionar un polinucleótido que comprende una 5' NTR, 3' NTR, una secuencia codificante presente entre las 5 'NTR Y 3' NTR Y codificando una poliproteina del virus de la hepatitis C, en el que la poli proteína comprende una serina correspondiente a serina 2204 de la SEC ID N°: 2, una glutamina correspondiente a glutamina 1067 de la SEC ID N°: 2, una lisina correspondiente a lisina 1691 de la SEC ID W: 2, una fenilalanina correspondiente a fenilalanina 2080 de la SEC ID N°: 2, una valina

    40 correspondiente a valina 1655 de la SEC ID N 0: 2, una lisina correspondiente a lisina 2040 de la SEC ID N°: 2, o una glicina correspondiente a glicina 1188 de la SEC ID N°: 2 y en el que la 5 'NTR, la poliproteína, y 3' NTR son de genotipo 1a; y alterar la secuencia codificante de tal manera que la poliprotefna codificada por ello comprende una isoleucina en lugar de la serina correspondiente a serina 2204 de la SEC ID N°: 2, y una arginina en lugar de la glutamina correspondiente a glutamina 1067 de la SEC ID N°: 2, en el que el polinucleótido capaz de replicación se replica en células Huh7, y en el que la poliprotefna comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad con la SEC ID N°: 2.

11. 12.

    Un método de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además alterar la secuencia de codificación de forma que la poliproteina codificada por ello comprende una combinación de mutaciones adaptativas seleccionados del grupo que consiste de una arginina en lugar de la lisina correspondiente a lisina 1691 de la SEC ID N°: 2, una valina en lugar de la fenilalanina correspondiente a fenilalanina 2080 de la SEC ID N°: 2, una isoleucina en lugar de valina correspondiente a valina 1655 de la SEC ID N 0: 2, una arginina en lugar de la lisina correspondiente a lisina 2040 de la SEC ID N°: 2, una arginina en lugar de la glicina correspondiente a glicina 1188 de la SEC ID N°: 2.

12. 13.

    Un método para identificar un compuesto que inhibe la replicación de un polinucleótido capaz de

    replicación, el método comprendiendo: poner en contacto una célula que comprende un polinucleótido capaz de replicación según la reivindicación 1 con un compuesto,

    incubar la célula en condiciones en las que el polinucleótido capaz de replicación replica en ausencia del compuesto; y detectar el polinucleótido capaz de replicación, en el que una disminución del polinucleótido del VHC capaz de replicación en la célula puesta en contacto con el compuesto comparado con el polinucleótido capaz de replicación en una células no contactada con el compuesto indica que el compuesto inhibe la replicación del polinucleótido capaz de replicación.

13. 14.

    El método de la reivindicación 13 en el que detectar el polinucleótido capaz de replicación comprende amplificación de ácido nucleico.

14. 15.

    El método de la reivindicación 13 en el que el polinucleótido capaz de replicación comprende además una secuencia de codificación que codifica un marcador, y en el que detectar el polinucleótido capaz de replicación comprende identificar el marcador.

15. 16.

    El método de la reivindicación 13 en el que el polinucleótido capaz de replicación comprende además una secuencia de codificación que codifica un transactivador, en el que la célula comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación transactivada que codifica un marcador detectable y una secuencia operadora unida operativa mente a la secuencia de codificación transactivada, en el que el transactivador interactúa con la secuencia operadora y altera la expresión de la secuencia de codificación transactivada, y en el que detectar el polinucleótido capaz de replicación en la célula comprende detectar el marcador detectable codificado por la secuencia de codificación transactivada.

16. 17.

    Un método para seleccionar un polinucleótido capaz de replicación, el método comprendiendo:

    incubar una célula en presencia de un agente de selección, en donde: la célula comprende un polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia adicional de codificación; la secuencia adicional de codificación codifica un marcador seleccionable que confiere resistencia al agente de selección; y el agente de selección inhibe la replicación de una célula que no expresa el marcador seleccionable; y detectar una célula que replica en presencia del agente de selección, en donde la presencia de dicha célula indica que el polinucleótido es capaz de replicación

17. 18.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 17 en donde la célula es una célula de hepatoma humano.

18. 19.

    El método de la reivindicación 17 en el que el agente de selección es un antibiótico.

19. 20.

    El método de la reivindicación 17 en el que la célula es una primera célula, el método comprendiendo

    además: obtener una partícula de virus producida por la primera célula; exponer una segunda célula a la partícula de virus aislada e incubar la segunda célula en presencia

    del agente de selección, y detectar una segunda célula que se replica en presencia del agente de selección, en donde la presencia de tal celula indica que el polinucleótido capaz de replicación en la primera célula produce una partícula de virus infeccioso.
20. 21. Un método para detectar un polinucleótido capaz de replicación, el método comprendiendo:

    incubar una célula que comprende un polinucleótido capaz de replicación, en el que: el polinucleótido capaz de replicación es un polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende además entre la NTR 5 'y 3' NTR de una secuencia de codificación adicional que codifica un transactivador; la célula comprende una región de codificación transactivada y una secuencia operadora unida operativamente a la región de codificación transactivada ; y la región de codificación transactivada codifica un marcador detectable, en donde el transactivador altera la transcripción de la región de codificación transactivada; y

    detectar el marcador detectable, en el que la presencia del marcador detectable indica que la célula comprende un polinucleótido capaz de replicación.

21. 22.

    Un kit que comprende: un polinucleótido capaz de replicación según la reivindicación 1 que comprende además entre las 5 'NTR Y 3' NTR, una secuencia codificante adicional que codifica un transcativador; y una célula que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación transactivada que codifica un marcador detectable y una secuencia operadora unida operativamente a la secuencia de codificación transactivada, en donde el transactivador interacciona con la secuencia operadora y altera la expresión de la secuencia codificante transactivada.

22. 23.

    El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1, el método de cualquiera de las reivindicaciones 11, 13, 17 o 21 o el kit de la reivindicación 22 en los que la poliproteina del virus de la hepatitis e es una poliproteina subgenómica del virus de la hepatitis C.

23. 24.

    El polinucleótido capaz de replicación de la reivindicación 1, el método de cualquiera de las reivindicaciones 11, 13, 17 o 21 o el kit de la Reivindicación 22 en los que la poli proteína del virus de la hepatitis e comprende los productos de escisión de núcleo, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A,NS4B, NS5A Y NS5B.