CN102149817A - 在细胞培养物中产生感染性丙型肝炎病毒颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了在细胞培养系统中产生高水平的感染性HCV基因型1型病毒颗粒的新方法。可以在培养的细胞中经历完整的病毒周期的HCV基因型1型病毒(主要与世界上大多数地区肝病相关)的可用性对发现和研发用于治疗HCV的新疗法是有益的。
Description
本发明涉及在细胞培养中产生感染性HCV基因型1型病毒的新方法,以及在筛选、检测和评价多种HCV抑制剂方面的用途。
丙型肝炎病毒(HCV)是全世界主要的健康问题和慢性肝病的首要原因(Boyer,N.等J.Hepatol.2000 32:98-112)。感染HCV的患者具有发生肝的肝硬变以及随后的肝细胞癌的危险,因此HCV是肝移植的主要适应症。
根据世界卫生组织(World Health Organization),全世界存在2亿多感染的个体,每年至少有3百万至4百万的人受到感染。一旦受到感染,大约20%的人可以清除病毒,但是其余的人可能携带HCV终其一生。10%至20%的慢性感染个体最终发展为破坏肝的肝硬变或者癌症。病毒疾病通过已污染的血液或者血液制品、已污染的枕头肠胃外地传播或者通过性传播和垂直地从已感染的母亲或者带毒母亲传播给她们的后代。目前对于HCV感染的治疗局限于用仅重组干扰素α或者联合核苷类似物利巴韦林的免疫治疗,其具有有限的临床益处,特别是对于基因型1型。对可以有效抗慢性HCV感染的改良的治疗剂存在迫切的需要。
已经将HCV分类为病毒科黄病毒科(Flaviviridae)的成员,其包括黄病毒属(flaviviruses)、瘟病毒属(pestiviruses)和包括丙型肝炎病毒的肝病毒属(hepaciviruses)(Rice,C.M.,Flaviviridae:The viruses and theirreplication,in:Fields Virology,Fields,B.N.,Knipe,D.M.和Howley,P.M.编辑,Lippincott-Raven出版社,Philadelphia,Pa.,第30章,931-959,1996)。HCV是含有大约9.4kb的正义单链RNA基因组的有包膜病毒。病毒基因组由5’非翻译区(UTR)、编码大约3011个氨基酸的多蛋白前体的长可读框和短3’UTR组成。5’UTR是HCV基因组最高度保守的部分,并且对多蛋白翻译的起始和控制是重要的。
HCV的遗传分析已经鉴定了6种主要的基因型,显示出>30%的DNA序列差异。每一种基因型含有一系列更密切相关亚型,它们显示出20-25%的核苷酸序列差异(Simmonds,P.2004 J.Gen.Virol.85:3173-88)。已经区分了30多种亚型。在美国,大约70%的感染个体具有1a型和1b型感染。1b型在亚洲是最流行的亚型。(X.Forn和J.Bukh,Clinics in LiverDisease 1999 3:693-716;J.Bukh等,Semin.Liv.Dis.1995 15:41-63)。遗憾地是,1型感染对目前的疗法比2型或者3型基因型更不敏感(N.N.Zein,Clin.Microbiol.Rev.,2000 13:223-235)。
瘟病毒和肝病毒的ORF的非结构蛋白质部分的遗传组织和多蛋白加工非常相似。这些正链RNA病毒具有编码对病毒复制所必需的所有病毒蛋白质的单个大可读框(ORF)。这些蛋白质表达为多蛋白,其通过细胞和病毒编码的蛋白酶共翻译和翻译后加工以产生成熟病毒蛋白质。负责病毒基因组RNA复制的病毒蛋白质朝向羧基末端。三分之二的ORF称为非结构(NS)蛋白质。对于瘟病毒和肝病毒二者而言,成熟的非结构(NS)蛋白质,以从非结构蛋白质编码区的氨基末端到ORF的羧基末端的相继顺序,由p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B组成。
瘟病毒和肝病毒的NS蛋白质共有以特定的蛋白质功能为特征的序列结构域。例如,在两组中的病毒的NS3蛋白质拥有以丝氨酸蛋白酶和解旋酶为特征的氨基酸序列基序(Gorbalenya等,Nature 1988 333:22;Bazan和Fletterick Virology 1989 171:637-639;Gorbalenya等,Nucleic Acid Res.1989 17:3889-3897)。类似地,瘟病毒和肝病毒的NS5B蛋白质具有以RNA指导的RNA聚合酶为特征的基序(Koonin,E.V.和Dolja,V.V.Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.1993 28:375-430)。
在病毒的生活史中瘟病毒和肝病毒的NS蛋白质的实际作用和功能是直接类似的。在两种情况中,NS3丝氨酸蛋白酶负责ORF中在其位置下游的多蛋白前体的所有蛋白酶解加工(Wiskerchen和Collett Virology 1991184:341-350;Bartenschlager等J.Virol.1993 67:3835-3844;Eckart等Biochem.Biophys.Res.Comm.1993 192:399-406;Grakoui等J.Virol.199367:2832-2843;Grakoui等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993 90:10583-10587;Ilijikata等J.Virol.1993 67:4665-4675;Tome等J.Virol.1993 67:4017-4026)。在两种病毒中,NS4A蛋白质作为NS3丝氨酸蛋白酶的辅因子(Bartenschlage等J.Virol.1994 68:5045-5055;Failla等J.Virol.199468:3753-3760;Xu等J Virol.1997 71:5312-5322)。两种病毒的NS3蛋白质也起解旋酶的作用(Kim等Biochem.Biophys.Res.Comm.1995 215:160-166;Jin和Peterson Arch.Biochem.Bilphys.1995,323:47-53;Warrener和Collett J.Virol.1995 69:1720-1726)。最后,瘟病毒和肝病毒的NS5B蛋白质具有预测的RNA依赖的RNA聚合酶活性((Behrens等EMBO 1996 15:12-22;Lechmann等J.Virol.1997 71:8416-8428;Yuan等Biochem.Biophys.Res.Comm.1997 232:231-235;Hagedorn,PCT WO97/12033;Zhong等J.Virol.1998 72:9365-9369)。
目前,存在有限数量的经批准的现行可用的治疗HCV感染的疗法。已经回顾了治疗HCV和抑制HCV NS5B聚合酶的新的和已有的治疗方法:R.G.Gish,Sem.Liver.Dis.,1999 19:5;Di Besceglie,A.M.和Bacon,B.R.,Scientific American,10月:199980-85;G.Lake-Bakaar,Currentand Future Therapy for Chronic hepatitis C virus Liver Disease,Curr.Drug Targ.Infect Dis.2003 3(3):247-253;P.Hoffmann等,Recent patentson experimental therapy for hepatitis C virus infection(1999-2002),Exp.Opin.Ther.Patents 2003 13(11):1707-1723;F.F.Poordad等,Developments in Hepatitis C therapy during 2000-2002,Exp.Opin.Emerging Drugs 2003 8(1):9-25;M.P.Walke等,Promising Candidates forthe treatment of chronic hepatitis C,Exp.Opin.Investig.Drugs 2003 12(8):1269-1280;S.-L.Tan等,Hepatitis C Therapeutics:Current Status andEmerging Strategies,Nature Rev.Drug Discov.2002 1:867-881;R.DeFrancesc等,Approaching a new era for hepatitis C virus therapy:inhibitors of the NS3-4A serine protease and the NS5B RNA-dependentRNA polymerase,Antiviral Res.2003 58:1-16;Q.M.Wang等,hepatitisC virus encoded proteins:targets for antiviral therapy,Drugs of the Future2000 25(9):933-8-944;J.A.Wu和Z.Hong,Targeting NS5B-DependentRNA Polymerase for Anti-HCV Chemotherapy Cur.Drug Targ.-Inf.Dis.2003 3:207-219。
尽管在了解病毒的基因组组织和病毒蛋白质的功能中取得了进步,但是在HCV复制和致病机理的基本方面仍还未知。获得HCV复制的实验途径的主要困难是缺少允许产生感染性病毒颗粒的有效细胞培养系统。尽管已经报道了原代细胞培养和某些人类细胞系的感染,但是在那些系统中产生的病毒的量和HCV复制的水平太低以致于不能进行详细的分析。这对于基因型1a型HCV病毒颗粒尤其如此,尽管最近的报道详细说明了使用含有5种细胞培养-适应性突变组合的HCV RNA产生了低水平的感染性基因型1a型病毒(Yi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006 103(7):2310-2315)。
两个研究组已经报道了使用Huh-7人类肝癌细胞的高允许亚系(highpermissive sublines)产生基因型1a型复制系统。Blight等(J.Virol.2003 77:3181-3190)能够在高允许Huh-7亚系Huh-7.5中选择G418抗性菌落,其支持基因型1a型衍生的亚基因组复制子的复制,所述Huh-7.5是通过清除亚基因组Con1复制子RNA的已建立的G418抗性复制子细胞系产生的,所述亚基因组Con1复制子RNA已经通过用干扰素α处理来选择Huh-7.5(Blight等,J.Virol.2002 76:13001-13014)。在此类经选择的细胞系内的复制性HCV RNA的序列分析表明,最常见的关键突变定位于在NS3解旋酶的结构域II内的NS3的氨基酸位置470处(P1496L),以及NS5A突变(S2204I)。在另一种情况下,Grobler等(J.Biol.Chem.2003 278:16741-16746)使用系统性突变方法取得了类似的结论:P1496L和S2204I组合都对在以独立但是类似的方式选择的高允许Huh-7亚系中获得基因型1a型复制是必需的。然而,具有这两种增强突变的基因型1a型RNA在Huh-7细胞系中并不经历复制,表明该系统用途的局限性。
本发明基于使用人血清以在细胞培养系统中改进感染性HCV基因型1型病毒颗粒产生的令人惊奇的效果。可以在培养的细胞中经历完整的病毒周期的HCV基因型1型病毒的可用性对发现和研发用于治疗HCV的新疗法是有利的。
因此,本发明提供了用于在培养的细胞中增加HCV基因型1型病毒颗粒产生的方法,包括用包含适应性突变Q1067R、V1655I、K1691R、K2040R、S2204I的可复制型HCV基因型1型多核苷酸转染培养的细胞,在存在2-10%的人血清中温育已转染的培养细胞,并从含有感染性HCV基因型1型病毒颗粒的已转染培养细胞中收集培养基。本发明进一步提供了筛选HCV基因型1型抑制剂的方法,包括用包含适应性突变Q1067R、V1655I、K1691R、K2040R、S2204I的可复制型HCV基因型1型多核苷酸转染培养的细胞;在存在2-10%的人血清中温育已转染的培养细胞;从含有感染性HCV基因型1型病毒颗粒的已转染培养细胞中收集培养基;在存在或者不存在用于HCV抑制活性筛选的分子的情况下,用感染性HCV基因型1型病毒颗粒感染天然培养的细胞;以及测量在已感染的培养细胞中存在的HCV水平,其中HCV水平在存在所述分子的情况下比不存在所述分子的情况下相比降低表明分子是HCV基因型1型抑制剂。
考虑本发明的详细说明以及说明示例性实施方案的所附实施例,将会更容易理解本发明前述的和其他的优点和特点以及实现它们的方式。
图1.人血清不增强HCV复制。用体外转录的编码HCV毒株H77S或者复制缺陷突变体(GND)的RNA转染Rof-400c细胞。在转染后的指定时间纯化胞内RNA并然后用于测定HCV RNA的量。
图2.人血清不增强感染性HCV的产生。用体外转录的编码HCV毒株H77S或者复制缺陷突变体(GND)的RNA转染Rof-400c细胞。在转染后的指定时间收集培养基并用于感染幼稚细胞。3天后,纯化胞内RNA并然后用于测定HCV RNA的量。
图3.通过免疫荧光分析检测在感染的细胞中的HCV核心蛋白质。将收集自用编码HCV毒株H77S的体外转录的RNA转染的细胞的培养基用于感染幼稚细胞。4天后,通过免疫荧光分析HCV核心蛋白质的表达。
图4.通过免疫过氧化物酶分析检测感染的细胞中的HCV核心蛋白质。将收集自用编码HCV毒株H77S的体外转录的RNA转染的细胞的培养基用于感染幼稚细胞。4天后,在免疫过氧化物酶染色后分析HCV核心蛋白质的表达。
图5.H77S和H77S RO-51-5B的感染性病毒生产的动力学。用编码HCV毒株H77S或者嵌合毒株H77S RO-51-5B的体外转录的RNA转染Rof-0c细胞。在指定的时间点,收集培养基并用于感染幼稚细胞以测定感染性病毒滴度,其测量为导致50%的孔含有感染性细胞的终点稀释度(组织培养物感染剂量TCID50)。
图6.NS5B抑制剂和HCV进入抑制剂抗GT 1a感染性病毒的效力。用H77S或者嵌合H77S RO-51-5B感染Rof-0c细胞。在感染的时候,用NS5B抑制剂HCV-796或者HCV进入抑制剂JS81的连续稀释液处理细胞。3天后,纯化胞内RNA并用于测定HCV RNA的量。
如在本文中所用,术语“可复制型多核苷酸”指当在细胞中存在时复制的多核苷酸。例如,合成互补多核苷酸。如在本文中所用,术语“体外复制”指多核苷酸在生长在培养物中的细胞中复制。培养的细胞可以是已经选择的在培养物中生长的细胞,包括,例如,无限增殖化细胞或者转化细胞。备选地,培养的细胞可以是已经从动物中移植的细胞。“体内复制”指多核苷酸在动物例如灵长类(包括黑猩猩)或者人类的体内的细胞中复制。在本发明的一些方面中,在细胞中复制可以包括产生“感染性”病毒颗粒,即可以感染细胞并导致更多的感染性病毒颗粒产生的病毒颗粒。
可复制型多核苷酸包括至少一种适应性突变。如在本文中所用,“适应性突变”是多蛋白的氨基酸序列的改变,与不具有适应性突变的可复制型多核苷酸相比,其增加了可复制型多核苷酸复制的能力。
在本发明中所指的可复制型多核苷酸的一种适应性突变包括在大约氨基酸位置1067处的精氨酸,其是NS3的大约41位氨基酸。大多数临床HCV分离物和分子克隆实验室HCV毒株在该位置处包括谷氨酰胺,因此将这种突变称为Q1067R。第二种适应性突变是在大约氨基酸位置1655处的异亮氨酸,其是NS3的大约629位氨基酸。大多数临床HCV分离物和分子克隆实验室HCV毒株在该位置处为缬氨酸,因此将这种突变称为V1655I。第三种适应性突变是在大约氨基酸位置1691处的精氨酸,其是NS4A的大约34位氨基酸。大多数临床HCV分离物和分子克隆实验室HCV毒株在该位置处为赖氨酸,因此将这种突变称为K1691R。第四种适应性突变是在大约氨基酸位置2040处的精氨酸,其是NS5A的大约68位氨基酸。大多数临床HCV分离物和分子克隆实验室HCV毒株在该位置处为赖氨酸,因此将这种突变称为K2040R。在本发明中所称作的可复制型多核苷酸的第五种适应性突变是在大约氨基酸位置2204处的异亮氨酸,其是NS5A的大约232位氨基酸。大多数临床HCV分离物和分子克隆实验室HCV毒株在该位置处包括丝氨酸,并且这种突变在本领域称为S2204I。
如在本文中所用,术语“多核苷酸”指任意长度的核苷酸的聚合形式,或者核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸,并且包括双链和单链DNA和RNA。多核苷酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列,包括例如编码序列和非编码序列,例如调节序列和/或非翻译区。多核苷酸可以获自天然来源,或者可以借助重组的、酶学的或者化学的技术制备。多核苷酸可以是拓扑学上线性的或者环状的,并且可以例如是载体例如表达或者克隆载体的一部分或者片段。
术语“编码区”和“编码序列”可以互换地使用并且指编码多肽的多核苷酸区域,并且其当置于合适的调节序列的控制下时表达编码的多肽。编码区的边界一般通过在其5’末端的翻译起始密码子和在其3’末端的翻译终止密码子确定。编码区可以编码一种或者多种多肽。例如,编码区可以编码多肽,随后被加工成两种或者多种多肽。调节序列或者调节区是调节与其有效连接的编码区的表达的核苷酸序列。调节序列的非限制性例子包括启动子、转录起始位点、翻译起始位点、内部核糖体进入位点、翻译终止位点和终止子。“有效连接”指并列,其中所述的组分处于允许它们以其期望的方式发挥功能的关系中。调节序列当以此种方式结合时是与编码区“有效连接的”,所述方式使得编码区的表达在与调节序列相容的条件下实现。
如本文中所用“多肽”指氨基酸的多聚体,并且并非指特定长度的氨基酸多聚体。因此,例如,术语肽、寡肽、蛋白质、多蛋白、蛋白酶和酶都包括在多肽的定义内。该术语也包括多肽的表达后修饰,例如,糖基化、乙酰化、磷酸化等。“丙型肝炎病毒多蛋白”指翻译后剪切以产生多于一种多肽的多肽。
术语“5’非翻译RNA”、“5’非翻译区”、“5’不翻译区”和“5’非编码区”可以互换地使用并且是本领域的术语(参见Bukh等,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1992 89:4942-4946)。该术语指在可复制型多核苷酸的5’末端的核苷酸。
术语“3’非翻译RNA”、“3’非翻译区”和“3’不翻译区”可以互换地使用并且是本领域的术语。该术语指在可复制型多核苷酸的3’末端的核苷酸。
当将外源的或者异源的DNA或者RNA导入到细胞内时,细胞就已经被此类DNA或者RNA“转化”或者“转染”。转化或者转染DNA或者RNA可以或者可以不整合(共价连接)到染色体DNA中,组成细胞的基因组。例如,在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中,转化DNA可以保留在游离型元件例如质粒上。至于真核细胞,稳定转化的细胞是转化DNA已经整合到染色体中以至于可以经染色体复制遗传给子代细胞的细胞。这种稳定性通过真核细胞可以建立包含含有转化DNA的子代细胞群的细胞系或者克隆来阐明。
如在本文中所用,术语“受试者”指脊椎动物,特别是哺乳动物物种的成员并且包括但不限于啮齿类动物、兔、地鼠和灵长类,后者包括人类。
术语“样品”指分离自受试者的组织或者流体样品,包括但不限于,例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤的外表切片、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、奶、血细胞、肿瘤、器官,并且也指体外细胞培养组分的样品(包括但不限于来自生长的培养细胞、推定的病毒感染细胞、重组细胞的条件培养基和细胞组分)。
术语“HCV基因型1型抑制剂”指可以抑制HCV基因型1型的任一功能并可以在从开始附着和进入到释放的病毒生活史中的任一阶段起作用的分子,并且包括但不限于附着抑制剂、进入抑制剂、融合抑制剂、运输抑制剂、复制抑制剂、翻译抑制剂、蛋白质加工抑制剂或者释放抑制剂。分子可以来源广泛并可以包括但不限于有机分子、肽、多肽(例如,抗体)、多核苷酸(例如,反义寡核苷酸、siRNA、microRNA)或者它们的组合。
实施例
给出以下制备物和实施例能使本领域技术人员更清楚地理解和实施本发明。不应将它们视为限制本发明的范围,而是其仅仅作为本发明的说明和代表。
材料和方法
细胞培养
Rof-0是衍生自Huh-7细胞系的人类肝细胞癌细胞系。Rof-0细胞稳定保持HCV基因型(GT)1b型复制子。通过在400单位/ml的IFN-α2a(Hoffmann-LaRoche公司)以及G418((Invitrogen)存在的情况下维持Rof-0细胞以维持复制子的选择来产生对干扰素α具有减少的反应性的细胞系。得到的细胞系称为Rof-400。通过在2’-C-甲基腺苷存在的情况下培养细胞从Rof-0和Rof-400细胞清除HCV复制子,并得到细胞系Rof-0c和Rof-400c。将细胞系培养于补充了GlutamaxTM和100mg/ml丙酮酸钠(Invitrogen)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。将培养基进一步用10%(v/v)胎牛血清(FBS,Invitrogen)和1%(v/v)青霉素/链霉素补充。
质粒
编码具有5种细胞培养适应性突变的全长GT 1a株H77的质粒的构建如下。将编码GT 1a H77亚基因组复制子的TQ-1质粒和也编码H77亚基因组复制子并编码NS5B编码序列侧翼的AsiSI和RsrII限制酶切位点的TX-2质粒用限制酶AgeI和NsiI消化。纯化得自消化的6400个碱基对片段。用AgeI和NsiI消化质粒HCV 1a H77并纯化得到的5100个碱基对片段。来自TQ-1和TX-2消化的纯化片段用HCV 1a H77消化产物分别地连接,得到质粒pUC HCV1a H77,其含有3种适应性突变(K1691R、K2040R和S2204I)和pUC HCV 1a-H77.AsiSIRsrII,其含有相同的3种适应性突变外加用于NS5B序列中的盒的AsiSI和RsrII限制性酶切位点。根据厂商说明书使用Quick Change位点定向诱变试剂盒(Stratagene)将两种额外的适应性突变(Q1067R和V16551)引入到两个载体中。这得到了质粒pUCH77S(SEQ ID NO:1)和pUC H77S.AsiSIRsrII(SEQ ID NO:2)。通过使用Quick Change位点定向诱变试剂盒根据厂商说明书(Stratagene)在NS5B活性位点(D2738N)引入突变来产生复制缺陷型构建体,产生构建体pUC H77S GND。
编码来自临床分离物的NS5B序列的嵌合H77S病毒通过用AsiSI和RsrII消化pUC H77S.AsiSIRsrII和临床分离物RO-51NS5B序列的PCR产物产生。将片段连接在一起,得到了质粒pUC H77S RO-51-5B(SEQ IDNO:3)。
病毒产生
编码全长HCV基因组的质粒用限制酶SpeI线性化并然后用绿豆核酸酶处理。将线性化的模板使用T7 Ribomax Express试剂盒(Promega)根据厂商说明书在体外RNA转录反应中使用。对于RNA转染,将4百万个Rof-0c或者Rof-400c细胞用2-10μg体外转录的RNA电穿孔。电穿孔后,将细胞重悬浮于含有5%(v/v)FBS或者2%-10%(v/v)的人血清(HS,Bioreclamation)的DMEM中。在指定的时间点收集培养基,在3000RPM旋转并等分以用于测定感染性病毒的产生。
感染性病毒测定
将收集自转染的Rof-0c或者Rof-400c细胞的培养基通过与幼稚Rof-0c或者Rof-400c温育来测定感染性病毒。温育幼稚细胞72-96小时后,提取细胞RNA以定量HCV RNA或者将细胞固定以分析HCV蛋白质的表达。
在使用PerfectPure RNA 96 Cell试剂盒(5 Prime)根据厂商说明书纯化全细胞RNA后检查HCV RNA的存在。为了定量HCV RNA的量,使用Taqman Universal PCR混合物(Applied Biosystems)或者TaqMan EZRT-PCR试剂盒(Applied Biosystems)用一套与5’非翻译区(UTR)内的区域互补的引物和探针扩增cDNA。引物和探针序列为:(HCV20F)CGACACTCCACCATAGATCACT(SEQ ID NO:4);(HCV114R)GAGGCTGCACGACACTCATACT(SEQ ID NO:5);(HCV P43)FAM-CCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGA-TAMRA(SEQ IDNO:6)。
HCV蛋白质在感染的细胞中的表达通过免疫荧光测定或者免疫过氧化物酶测定来检查和定量。通过在2%的甲醛中室温温育1小时来固定细胞。固定后,细胞通过在含有0.2%TX-100和0.1%柠檬酸钠的PBS中温育5分钟来透化处理。对于荧光成像,将透化的细胞用3%正常山羊血清和0.5%牛血清白蛋白封闭30分钟并然后用对HCV核心特异的小鼠单克隆抗体(ab2740,Abcam)染色20分钟。洗涤后,将细胞用第二抗体(A11032,Invitrogen)温育20分钟。将细胞用1滴Permafluor(ThermoScientific)固定并成像。计数受感染的病灶的数目以便以病灶形成单位/ml测定感染滴度。
感染滴度也可以使用免疫过氧化物酶测定法来确定。将细胞如上所述进行固定和透化。然后将细胞用ImmPRESS抗小鼠Ig过氧化物酶试剂盒(MP-7402,Vector Labs)根据厂商说明书封闭。将细胞用对HCV核心特异的小鼠单克隆抗体(ab2740,Abcam)整批染色1小时。洗涤后,将细胞用ImmPRESS过氧化物酶:抗小鼠缀合物温育30分钟。染色的细胞在用ImmPACT DAB底物(SK-4105,Vector Labs)温育10分钟后然后通过DAB增强(H-2200,Vector Labs)进行显色。感染滴度确定为导致50%的孔含有感染细胞的终点稀释度(组织培养感染剂量TCID50)。
HCV感染性病毒EC
50
测定
感染性HCV对抗病毒剂的敏感性使用基因型1a型毒株H77S或者H77S RO-51-5B测定。通过将全长基因组转染到Rof-0c细胞中,在含有2-10%HS的DMEM中培养细胞并在转染后7天收集培养基来产生病毒原种。对于EC50测定,将Rof-0c细胞以10,000个细胞每孔接种到包被了聚D-赖氨酸的96孔板(BD Biosciences)中。接种后24小时,将培养基去除并将90μl的病毒原种加入到每孔中。然后加入以3倍连续稀释的抑制剂。感染后3天,如上所述定量HCV RNA。EC50值定义为通过定量RT-PCR测定的HCV RNA的水平的50%降低时所观察到的浓度。
结果
人血清不影响HCV RNA复制。研究感染性GT 1a毒株的体外复制目前受到产生的低病毒滴度的局限。为了改进感染性病毒产生,检查了人血清的作用。将经加工处理的Huh-7细胞系Rof-400c用全长GT 1a病毒毒株H77S转染并将细胞培养于含有10%FBS或者10%HS的培养基中。测定胞内HCV RNA的量超过5天。在测试的所有时间点,培养在HS或者FBS中的细胞含有相似量的HCV RNA(图1)。添加HS到转染的细胞中似乎并没有增加HCV RNA的复制。
人血清不增加感染性HCV的产生。在上述相同的实验中,检查了人血清对感染性HCV颗粒产生的作用。转染后每24个小时除去培养基,持续5天,并然后接种在幼稚细胞上以测量感染性病毒产生。在指定时间点收集的上清液存在的情况下温育72小时后,通过定量幼稚细胞内的胞内HCV RNA的量来测定感染性病毒的存在。在感染的幼稚细胞中检测到的胞内HCV RNA的量在用收集自转染了H77S或者复制缺陷突变体并培养在FBS中的细胞的上清液感染的细胞之间是相当的(图2)。这表明,从培养在FBS中的细胞释放的感染性HCV的量不能与转染剩余的残留HCVRNA相区分。然而,从用来自用HS培养的转染细胞的培养基接种的已感染的幼稚细胞中回收的胞内HCV RNA的量存在增加(图2)。培养在HS中的转染细胞释放了感染性HCV,并且其量在五天的测定中一直增加。这些实验表明HS并不增加HCV RNA的复制但是增加了感染性病毒的产生。
为了证实感染性颗粒释放自培养在HS中的感染细胞,将幼稚细胞用在多个时间点收集的上清液接种,并然后分析HCV核心蛋白质的表达。在细胞中染色进行免疫荧光和过氧化物酶分析来证实HCV核心蛋白质的存在(图3和图4)。这些结果表明,在用来自用HS培养的转染细胞的培养基感染的幼稚细胞中检测到的HCV RNA的增加(图2)是生产性HCV感染的结果。
感染性HCV的峰值产生。上述实验表明,培养在HS中的转染细胞在5天期间释放了感染性颗粒。为了测定病毒产生的峰值时间点,将转染细胞在HS中培养长达11天。收集来自转染细胞的培养基并用于接种幼稚细胞。感染性颗粒的存在通过测定TCID50/ml的终点稀释度测定来定量。用H77S转染Rof-0c细胞,并且在转染后第7天时,感染滴度达到大约6000TCID50/ml的峰值(图5)。获自培养在HS中的转染细胞的峰值HCV感染滴度比以前报道的培养在FBS中的细胞的峰值HCV感染滴度(Yi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2006 103(7):2310-2315)高60倍。
NS5B嵌合病毒的产生。使用便于克隆和分析任一NS5B序列的HCV复制子已经建立了NS5B盒系统(Le Pogam等,J.Antimicrob.Chemother.2008 61:1205-1216)。NS5B盒系统已经用于分析一组NS5B分离物对多种非核苷和核苷抑制剂的表型应答。将用于克隆NS5B序列的AsiSI和RsrII限制酶切位点克隆入全长H77S基因组中。将来自已知在H77盒复制子内复制的临床分离物的共有序列克隆入H77S NS5B盒中,得到了嵌合病毒H77S R0-51-5B。检查从H77S RO-51-5B转染的细胞的感染性病毒的产生。与H77S类似,感染性病毒产生的峰值时间点是第7天,尽管与H77S相比,H77S RO-51-5B的滴度减少了3倍(图5)。该数据表明,NS5B盒系统可以用于产生嵌合感染性病毒。
HCV抑制剂对GT 1a病毒的效力。通过在转染后第7天收集来自存在HS下培养的细胞的培养基产生病毒原种。分析HCV原种以测定它们是否足以测量HCV抑制剂的效力。将Rof-0c细胞接种在96孔板中,用H77S或者H77S RO-51-5B感染,并然后用已知的非核苷抑制剂(HCV-796)或者已知的进入抑制剂(JS81)处理。HCV-796针对感染性H77S的效力是32±4nM并且与报道的相似(图6)。JS81针对感染性H77S RO-51-5B的效力是139±23ng/ml并且也与已报道的数据相似(图6)。这些实验提供了证据证明在HS存在下生长的GT 1a感染性病毒可以用于测量HCV抑制剂的效力。
Claims (9)
1.用于在培养的细胞中增加感染性HCV基因型1型病毒颗粒产生的方法,所述方法包括:
用包含适应性突变Q1067R、V16551、K1691R、K2040R、S2204I的可复制型HCV基因型1型多核苷酸转染培养的细胞;
在2-10%的人血清存在下培育已转染的培养细胞;
从含有感染性HCV基因型1型病毒颗粒的已转染培养细胞收集培养基。
2.权利要求1的方法,其中所述已转染的培养细胞衍生自Huh-7细胞系。
3.权利要求1或者权利要求2的方法,其中将所述已转染的培养细胞在10%的人血清存在下培育。
4.用于在培养的细胞中增加感染性HCV基因型1型病毒颗粒产生的方法,所述方法包括:
用包含适应性突变Q1067R、V16551、K1691R、K2040R、S2204I和进一步含有来自HCV基因型1型感染的受试者中样品的NS5B多核苷酸序列的可复制型HCV基因型1型多核苷酸转染培养的细胞;
在2-10%的人血清存在下培育已转染的培养细胞;
从含有感染性HCV基因型1型病毒颗粒的已转染的培养细胞中收集培养基。
5.权利要求4的方法,其中所述已转染的培养细胞衍生自Huh-7细胞系。
6.权利要求4或者权利要求5的方法,其中将所述已转染的培养细胞在10%的人血清存在下培育。
7.筛选HCV基因型1型抑制剂的方法,所述方法包括:
用包含适应性突变Q1067R、V16551、K1691R、K2040R、S2204I的可复制型HCV基因型1型多核苷酸转染培养的细胞;
在2-10%的人血清存在下温育已转染的培养细胞;
从含有感染性HCV基因型1型病毒颗粒的已转染培养细胞收集培养基;
在存在或者不存在用于HCV抑制活性筛选的分子的情况下,用感染性HCV基因型1型病毒颗粒感染天然培养的细胞;并
测量已感染的培养细胞中存在的HCV水平,其中与不存在所述分子相比,在所述分子存在下HCV水平的降低表明该分子是HCV基因型1型抑制剂。
8.权利要求7的方法,其中所述可复制型HCV基因型1型多核苷酸还包含来自HCV基因型1型感染的受试者的样品的NS5B序列。
9.权利要求7或者权利要求8的方法,其中所述已转染的培养细胞和所述已感染的培养细胞衍生自Huh-7细胞系。
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