CN1594593A - 筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，特别是涉及在借助非感染性辅助痘病毒生产重组丙型肝炎病毒的细胞培养系统中，早期加入抗丙型肝炎病毒的候选药物，并通过分析所说的药物对病毒复制和组装的影响来筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法。

Description

筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法

发明的所属领域

本发明涉及筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，特别是涉及在借助非感染性辅助痘病毒生产重组丙型肝炎病毒的细胞培养系统中，早期加入抗丙型肝炎病毒的候选药物，并通过分析所说的药物对病毒复制和组装的影响来筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法。

发明的背景

丙型肝炎病毒(HCV)是含有RNA基因组的病毒。作为丙型肝炎的致病因子，人感染HCV后可导致很严重并且难以治愈的病理过程。目前，全世界有近1.7亿HCV感染者，约占全球人口的3％。而且，一旦发生HCV感染，病情极易慢性化。例如，大约有80％的HCV感染者将转为慢性，并且其中约有15％的慢性丙型肝炎发展成肝硬化甚至转为肝癌。

然而，由于被感染者的组织和血清中的HCV浓度较低，并且缺乏适用于HCV增殖的动物模型和宿主细胞系统，再加上人们对HCV的复制、转录和翻译及病毒颗粒的装配均缺乏足够的了解，在很大程度上限制了HCV疫苗和抗HCV药物的研究和开发。迄今尚没有找到有效的治疗药物和方法。

虽然已知从病人血清中得到的HCV能够感染人原代肝细胞、外周血单核细胞、人T细胞系(HPBMa10-2)、B细胞系(Daudi)以及肝细胞系，但HCV在这些细胞中的复制通常是瞬时的和低效的。因此，迄今尚未能建立一种在细胞培养物特别是哺乳动物细胞培养物中培养和增殖HCV病毒的方法。由于缺乏足够的靶病毒，无疑给抗HCV药物的筛选带来极大困难。这也是目前尚未找到一种有效的抗丙型肝炎病毒药物的重要原因之一。

为了实现HCV的体外大量培养，一种方法是筛选支持HCV复制的细胞系。

例如，Shimizu，Y.K等人(Shimizu，Y.K.et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：5477-5481)利用人T细胞系(HPBMa10-2)和Bertolini.L等人(Bertolini.L.et.al，Res.Virol.144：281-285)利用B细胞系(Daudi)作为HCV的宿主，培养一年后细胞内仍可检测到感染性病毒颗粒的存在，尽管其复制效率很低。另一种方法是在辅助病毒提供的某些DNA(_CDNA)复制和病毒装配元件的帮助下，用HCV基因组转染(例如使用脂质体介导的转染方法)适当的宿主细胞，或将HCV基因组或其部分序列与适当的质粒或病毒载体相连接，并用所得到的重组载体转染宿主细胞，以制备重组的HCV。例如，Yoo等人(Yoo，B.J.et.al.J.Virol.69：32-38)将HCV全长度RNA的_CDNA导入肝细胞系Huh7中，培养被转染的细胞后，从培养物上清中得到具有感染性的HCV颗粒。；另外，Selby等人(Selby，M.J.et.al.J.Gen.Virol.74：1103-1113)用克隆到T7启动子下游的丙型肝炎RNA的_CDNA转染Ost7-1细胞，然后再用携带T7噬菌体RNA聚合酶编码序列的重组痘苗病毒感染已被转染的细胞，HCV基因组即在宿主细胞中表达并加工成熟的蛋白质颗粒。但所说的细胞并没有产生有感染性的完整HCV颗粒。

0119744.7号中国专利申请公开了使用非感染性辅助痘病毒生产包括重组丙型肝炎病毒(HCV)在内的用作基因治疗载体的RNA病毒的方法。本发明人在这一现有技术的基础上，成功地制备了不依赖于其天然复制途径并避开任何细胞屏障限制，并以高滴度产生感染性HCV的细胞培养系统，为重组丙型肝炎病毒的大量生产提供了条件。利用我们的HCV生产和抗HCV药物筛选系统，并利用药物筛选领域已知的手段，本发明人成功地建立了一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，从而完成了本发明。

发明的目的

本发明的目的是提供本发明提供一种筛选抗HCV药物的方法，该方法包括以下步骤：

1)构建一个携带HCV基因组序列的质粒，所说的HCV基因组序列定位于噬菌体启动子和噬菌体转录终止子之间；

2)构建一个携带HCV前体蛋白编码序列的质粒，所说的编码序列定位于一个在真核细胞中有活性的痘苗病毒启动子的下游；

3)构建一个携带噬菌体RNA聚合酶编码序列的重组痘苗病毒；

4)用步骤1)和2)的重组质粒转染真核细胞适当时间后加入候选药物；

5)用步骤3)的重组痘苗病毒感染步骤4)中被转染的细胞，并在适当温度下保温适当时间；

6)检测候选药物对HCV增殖的影响并评价候选药物的抗病毒活性。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中步骤2)的丙型肝炎病毒前体蛋白的编码序列是缺失了5′非翻译区的序列。

根据本发明的再一个优选实施方案，其中步骤3)的噬菌体RNA聚合酶编码序列是与步骤1)的噬菌体启动子和噬菌体转录终止子相匹配的，并且所说的噬菌体RNA聚合酶编码序列被连接到痘苗病毒的启动子的下游。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中所说的真核细胞是哺乳动物细胞。

根据本发明的再一个优选实施方案，特征在于步骤4)中所说的候选药物可以是任何一种天然的、合成的或重组产生的药物。

根据本发明的再一个优选实施方案，其中重组质粒转染宿主细胞后的保温条件是35-37℃保温3-8小时，最好是于37℃保温4小时。重组痘苗病毒感染被转染细胞后的保温条件是28-32℃保温70-100小时，最好是30℃保温96小时。

根据本发明的再一个优选实施方案，本发明的方法还进一步包括去除辅助性痘苗病毒的步骤。

根据本发明的一个优选实施方案，步骤6)中所说的检测是使用荧光定量聚合酶链反应、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、逆转录偶联的聚合酶链式反应、免疫印迹分析、电镜及免疫电镜观察等方法检测被处理的宿主细胞的核苷酸和蛋白质合成、其复制能力、合成产物的免疫学性质及形态学特征。

根据本发明的再一个优选实施方案，其中步骤6)所说的影响包括候选药物对所产生的丙型肝炎病毒的病毒形态、核酸结构、复制能力和蛋白表达能力的影响。

根据本发明的一个优选实施方案，特征在于步骤6)中所说的丙型肝炎病毒是具有感染性的。

附图简要说明

图1图解显示包含有HCV基因组DNA拷贝的重组质粒pT7HCV。

图2图解显示包含有HCV多聚蛋白编码区的重组质粒pHCV。

图3是图解说明本发明的抗HCV药物筛选方法的流程。

图4图解显示以免疫印迹法检测被转染的细胞内HCV蛋白的表达。所用的第一抗体抗体为抗NS3和NS5a单克隆抗体，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗人的IgG，显色底物为DAB。泳道1为未加入α干扰素(IFN-α)的对照样品；泳道2为加入IFN-α(100U/ml)的样品；泳道3为加入IFN-α(1000U/ml)的样品。

图5A和5B是图解显示以间接免疫荧光法检测HCV蛋白在细胞中的表达。其中A和B分别显示使用抗NS3单克隆抗体或抗NS5a单克隆抗体作为第一抗体，并使用荧光标记的羊抗人IgG作为第二抗体的检测结果。

图6A和6B分别显示用于本发明的HCV颗粒的电镜观察。A是细胞的总体观，B是指示HCV颗粒在细胞内的定位。N代表细胞核；lu代表细胞腔隙；c代表细胞质，其中箭头指示HCV颗粒。

发明的详细描述

本发明的目的是提供本发明提供一种筛选抗HCV药物的方法，该方法包括以下步骤：

1)构建一个携带HCV基因组序列的质粒，所说的HCV基因组序列定位于噬菌体启动子和噬菌体转录终止子之间；

2)构建一个携带HCV前体蛋白编码序列的质粒，所说的编码序列定位于一个在真核细胞中有活性的痘苗病毒启动子的下游；

3)构建一个携带噬菌体RNA聚合酶编码序列的重组痘苗病毒；

4)用步骤1)和2)的重组质粒转染真核细胞适当时间后加入候选药物；

5)用步骤3)的重组痘苗病毒感染步骤4)中被转染的细胞，并在适当温度下保温适当时间；

6)采用适当的检测方法检测候选药物对HCV增殖的影响并评价候选药物的抗病毒活性。

根据本发明的一个优选实施方案，特征在于步骤1)中所说的噬菌体选自T3、T7和SP6噬菌体，并且优选的是T7噬菌体。所说的噬菌体启动子和噬菌体转录终止子是T7噬菌体启动子和与之匹配的T7噬菌体转录终止子。

根据本发明的一个优选实施方案，特征在于步骤2)中所说的HCV前体蛋白经酶解后，能够产生包装RNA基因组序列的衣壳蛋白；并且所说的前体蛋白编码序列被克隆到质粒中，从而使之可操作地连接到启动子上。

根据本发明的一个优选实施方案，特征在于将步骤2)HCV前体蛋白编码序列置于一个在动物细胞中有活性的痘苗病毒启动子的下游。

根据本发明的一个优选实施方案，特征在于步骤3)中所说的噬菌体RNA聚合酶编码序列是与噬菌体启动子可操作地配合的，并且其中所说的编码序列被克隆到辅助性重组痘病毒中，从而被可操作地连接到痘病毒启动子上。

根据本发明的一个优选实施方案，其中在允许所说的HCV前体蛋白编码序列被表达并组装包含有HCV基因组序列的衣壳的条件下，在真核细胞的胞质中共同表达步骤1)的RNA基因组序列、步骤2)的HCV前体蛋白编码序列及步骤3)的噬菌体聚合酶编码序列，从而在宿主细胞产生HCV病毒。

简单地说，为了实现本发明的筛选抗丙型肝炎病毒的方法，必须首先建立一个生物合成重组表达HCV病毒的细胞培养系统，其中在用携带HCV基因组序列的重组质粒和携带能够产生病毒衣壳的HCV前体蛋白编码序列的重组质粒共转染宿主真核细胞后，向被转染细胞的培养物中加入候选药物并保温适当时间。然后用携带噬菌体RNA聚合酶编码序列的重组痘苗病毒感染被转染的细胞并保温适当的时间。最后收获由所说的细胞产生的衣壳包裹的丙型肝炎病毒，检测病毒形态、核酸结构、复制能力和蛋白表达能力并借以判断所说的候选药物的抗病毒活性。

用于实现本发明的核酸，包括RNA、cDNA、基因组DNA、载体、相关的病毒或其杂合体，均可从各种来源中分离并经受遗传工程操作、扩增和/或重组表达得到。

另外，也可以使用已知的化学合成技术体外合成这些核酸(参见Carruters(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661)，然后合成互补链并使这些互补链在适当条件下退火结合成双链；或者可使用DNA聚合酶，将互补链与适当的引物序列相加合，以得到双链DNA片段。

核酸操作技术，例如造成序列突变、亚克隆、探针标记、测序、杂交等在科学文献和专利文献均已有充分描述(如参见Sambrook，ed.Molecular Cloning：ALaboratory Manul(3nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)；CurrentProtocols In Molrcular Biology，Ausubel，ed.John wiley & Sons，Inc.New York(1997))。

可借助电子显微镜和免疫电镜观察从形态学判定所产生的丙型肝炎病毒颗粒，并使用分光光度法、放射自显影法、高效液相层析法(HPLC)、薄层层析法(TLC)、免疫沉淀、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验、Southern分析、Northern分析、点印迹分析、凝胶电泳(SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、放射标记、闪烁计数及亲和层析等方法进行核酸、载体、衣壳、多肽等的分析和定量。

有关重组RNA病毒基因组序列和载体(包括HCV基因组和病毒颗粒)的生产与操作方法例如参见美国专利6,156,495和6,153,421。

与其它RNA病毒一样，HCV病毒只包含基因组RNA和结构蛋白。因此，用体外合成的HCV基因组RNA单独或者与编码病毒蛋白的mRNA一起转染细胞后，如果宿主细胞能够翻译mRNA并正确加工所得到的蛋白，这些蛋白又能够正确的装配并包裹HCV基因组RNA，就将会在宿主细胞内产生丙型肝炎病毒颗粒。

然而，由于RNA很容易降解并因此而给操作带来困难，所以通常使用由基因组RNA逆转录后得到的相应cDNA进行操作。在本发明中，首先分离抗HCV抗体阳性病人的血清，并采用逆转录偶联的聚合酶链式反应(RT-PCR)方法制备与HCV基因组RNA相对应的DNA序列。

经过适当的内切酶消化如上得到的HCV基因组DNA(_CDNA)后，将其连接到携带噬菌体启动子的适当载体例如携带噬菌体启动子和终止子的pOCUS-T7质粒中。HCV基因组DNA被克隆于噬菌体启动子和终止子之间。处于噬菌体启动子控制下的HCV基因组DNA如果遇到与之相匹配的噬菌体RNA聚合酶，HCV基因组DNA就会被转录生成相应的mRNA。由于相应噬菌体终止子的存在，使所说的DNA不至于过度转录。相反，如果没有噬菌体终止子，那么由噬菌体RNA聚合酶合成的转录子就可能是一个大的异质体，而导致其不能被包装到包膜蛋白形成的病毒衣壳中。噬菌体终止子使转录过程准确停止在HCV基因组末端，使所得到的RNA能够被包裹进衣壳内并最终形成衣壳包裹的HCV病毒颗粒。

虽然以前曾报道过将携带HCV基因组DNA的质粒导入细胞后可以产生HCV病毒，但是总地说来，这种方法产生病毒的效率是很低的，并且不能满足大量制备HCV病毒和筛选抗HCV药物的需要。

为了提高HCV的生产效率，一种有效的方法是构建一个携带HCV基因组cDNA中的HCV前体蛋白基因序列的质粒。将所说的前体蛋白编码序列置于一个在真核细胞中有活力的启动子例如痘苗病毒启动子的直接下游，并且删除了前体蛋白编码序列中的5’非翻译序列(5’-UTR)。用所得到的重组质粒转染适当的哺乳动物细胞后，启动子即启动前体蛋白的转录。由于前体蛋白的基因序列不含有5’非翻译序列(5’-UTR)，转录得到的mRNA即可以帽依赖方式被翻译，从而得到包括衣壳蛋白在内的HCV蛋白。因此，用携带HCV基因组序列的质粒和携带HCV前体蛋白编码序列的质粒共转染适当的宿主细胞，并且所说的基因和编码序列在细胞内被转录和翻译后，便可望得到HCV基因组RNA和包裹HCV基因组RNA的衣壳蛋白，经进一步的加工和组装后即可形成衣壳包裹的HCV病毒颗粒。

提高HCV生产效率的另一种方法是引入辅助性痘苗病毒。痘苗病毒具有能够感染多种细胞的广谱感染性，从而使得HCV的培养具有更广泛的宿主细胞范围。痘苗病毒感染细胞后，能在宿主细胞的胞质中以高效率完全复制。痘苗病毒利用其自身的酶系统复制如上得到的丙型肝炎病毒互补DNA并合成带有5’末端帽结构和3’末端polyA序列的mRNA。在由重组痘苗病毒提供的DNA聚合酶的帮助下，重组质粒中连接于痘苗病毒启动子下游的_CDNA便得以被转录，并借助痘苗病毒的戴帽酶和polyA聚合酶为转录产物提供5’帽序列和3’polyA接尾序列，从而使外源的HCV基因组序列能够在被转化细胞的胞质内以高拷贝数复制。由于5’末端帽结构和3’末端polyA接尾序列的存在，使所得到的mRNA序列能够利用宿主细胞的翻译系统被翻译成相应的蛋白质。

在后一个系统中，将噬菌体RNA聚合酶编码序列克隆到辅助性重组痘苗病毒中，并置于与之匹配的痘苗病毒启动子(例如痘苗病毒晚期启动子)的直接下游。噬菌体RNA聚合酶在被重组痘苗病毒感染的宿主细胞中合成后，将转录携带HCV基因组的质粒DNA。同时，痘苗病毒提供的RNA聚合酶亦将转录HCV前体蛋白的编码序列。所得到的HCV前体蛋白被进一步加工后，即可形成将包装基因组RNA并进而装配形成病毒颗粒的病毒衣壳蛋白。随后细胞即通过分泌的方式从细胞中释放出所产生的病毒颗粒。由于辅助性痘苗病毒的引入，使得完整HCV病毒颗粒的产生得以更顺畅地进行，从而提高HCV病毒颗粒的产率并满足其作为抗病毒药物筛选中的靶病毒的需要。

因此，为了由克隆的cDNA产生HCV，须使用两个质粒：一个质粒包含被克隆在噬菌体启动子(如T7，SP6或T3启动子)和噬菌体转录终止子之间的全长HCV基因组RNA的cDNA拷贝。这样每个转录单元的转录均借助识别启动子和终止子的噬菌体RNA聚合酶完成并产生有特定大小的RNA分子。另一个质粒则包含直接连接到上游痘苗病毒晚期启动子上的病毒多聚蛋白的编码序列。

使用这些质粒共转染对痘苗病毒敏感的适当的宿主细胞。然后再用含有处于痘苗病毒启动子(如痘苗病毒晚期启动子)控制下的噬菌体RNA聚合酶基因的辅助痘苗病毒重组体感染之(参见图3)。

用于生产HCV的辅助痘病毒可以是重组痘苗病毒。痘苗病毒具有一个插入在其基因组的胸腺嘧啶核苷酸激酶区的噬菌体RNA聚合酶基因。该RNA聚合酶的表达是由痘苗病毒启动子驱动的。Fuerst等人(Fuerst et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986 83：8122-26)描述了生产包含噬菌体RNA聚合酶基因的痘苗病毒重组体的方法。

用携带噬菌体RNA聚合酶编码序列的重组痘苗病毒感染上述质粒共转染的细胞之前，即当HCV基因组序列的转录和翻译过程开始进行之前，向细胞培养物内加入不同浓度梯度的候选药物(参见图3)。所说的药物可以是选自天然药物、化学合成药物，以及以DNA重组技术生产的任何一种或可望联合使用的两种或多种药物。药物将直接干预和影响继后进行的丙型肝炎病毒基因组的转录、转录产物的翻译、翻译产物的细胞内加工或完整病毒的装配等一系列过程，并最终影响完整病毒的产生。因此，可以根据所产生的病毒的拷贝数、pfu值和TCID₅₀值判定药物对病毒复制的抑制活性。如果候选药物影响HCV基因组的转录、翻译、翻译后蛋白质产物的加工以及病毒包装的任何一个环节，均可借助分子生物学检测手段检测并分析相应药物作用环节，从而判断药物的作用机理。除筛选有用的抗丙型肝炎病毒药物外，还可使用我们的系统监测和分析病毒复制全过程、了解丙型肝炎病毒的生物学特性以及病毒-宿主细胞的相互作用。

在本发明的实践中，重组质粒转染宿主细胞后的保温条件是35-37℃保温3-8小时，优选的是37℃保温4小时。重组痘苗病毒感染被转染细胞后的保温条件是28-32℃保温70-100小时，优选的是30℃保温96小时。培养被感染的细胞后，进一步使用超滤等方法去除辅助性痘苗病毒。可以使用荧光定量聚合酶链反应、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、逆转录偶联的聚合酶链式反应、免疫印迹分析、电镜及免疫电镜观察等方法检测宿主细胞内合成的HCV颗粒。

总之，本发明在不依赖于HCV的天然复制途径并避开任何细胞屏障限制，利用DNA重组技术生产HCV的现有技术的基础上，建立了用于筛选抗丙型肝炎病毒药物的系统和方法。本发明的方法可以在病毒复制的早期使候选药物介入病毒复制的全过程，并通过各种已知的分子生物学检测手段检测并分析药物的抗病毒活性及其强度，并有利于进一步判断药物的作用机理。本发明的方法相对简单、可靠并且易于掌握，因此可为抗丙型肝炎病毒药物的大规模筛选提供一种新的、可行的途径和手段。

实施例

实施例1：质粒pT7HCV和pVHCV的构建

(1)质粒pT7HC的构建

根据Aizaki(Hepatology，27：621-627，1998)报道的HCV基因组序列，利用逆转录偶联的聚合酶链反应(RT-PCR)，从HCV感染的病人血清中扩增得到HCV基因组的cDNA拷贝。其中所使用的引物是如下所示的T7启动子接尾引物和T7终止子接尾引物：

P1：5’-

TAATACGACTCACTATAGGGCCAGCCCCCTGATGGGGGCGACACTCC-3’

(SEQ ID NO：1)

P2：5’-

CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAG

ACATGATCTGCAGAGAGGCCAGTATCAG-3’(SEQ ID NO：2)

分离上述HCV基因组DNA的PCR扩增产物，然后在37℃水浴中用限制性内切酶EcoR1和Hind111酶切消化，得到长度约9.6kp的EcoR1/Hind111大片段，同时用同样双酶切含有噬菌体T7启动子和T7终止子的质粒pOCUS-T7(Novagen)。琼脂糖凝胶(0.8％)电泳分离并回收酶切的质粒和基因组片段，然后在T4 DNA连接酶存在下于16℃水浴中完成pOCUS-T7质粒载体和HCV基因组片段的连接。用连接产物转化通用的大肠杆菌菌株Top10(本室保存)后，提取质粒并用酶切和PCR方法鉴定与筛选阳性克隆。测定阳性克隆的DNA序列证实连接正确后，得到命名为pT7HCV的重组质粒(图1)。在所得到的重组质粒pT7HCV中，HCV基因组DNA的序列被定位于T7启动子和T7终止子之间并受二者的控制。

(2)质粒pT7HC的构建

使用下列引物P3和P4从如上构建的重组质粒pT7HCV中扩增得到不含有5’的非翻译序列的HCV前体蛋白基因片段：

P3：5’-GACGAATTCATGAGCACAAATCCA AAACCCCAAAGAAAA-3’

(SEQ ID NO：3)

P4：5’-GCCAGGCTTAAAAAAAAAAAGGGGAATGGCCTATTGGCC-3’

(SEQ ID NO：4)

分离扩增得到的前体蛋白基因片段，然后在37℃水浴中用限制性内切酶EcoR1和Stu1酶切消化，得到长度约9.2kp的EcoR1/Stu1大片段。同时用同样双酶切含有痘苗病毒晚期启动子的质粒PSC59(Novagen)。琼脂糖凝胶(0.8％)电泳分离酶切的质粒和基因组片段，并在T4 DNA连接酶存在下，于16℃水浴中连接回收的PSC59质粒载体和前体蛋白基因片段。用连接产物转化大肠杆菌菌株Top10后，提取质粒并用酶切和PCR方法鉴定与筛选阳性克隆。测定阳性克隆的DNA序列证实连接正确后，得到命名为pVHCV的重组质粒(图2)。在所得到的重组质粒pVHCV中，前体蛋白的基因序列位于痘苗病毒晚期启动子的下游并受其控制。

实施例2：重组痘苗病毒的增殖以及纯化

1)重组痘苗病毒的培养

在T-100培养瓶中，用3ml(1×10⁶pfu/ml)市售的携带噬菌体DNA聚合酶基因的重组痘苗病毒接种BHK₂₁细胞(约1×10⁷个细胞)，37℃ CO²培养箱保温2小时使病毒被吸收到细胞内，每30分钟摇动一次培养瓶以保证病毒和细胞的充分接触。然后向培养瓶内加入5ml含2.5％小牛血清的DMEM培养基，37℃和CO₂环境下保温4天。

2).重组痘苗病毒的纯化

收获BHK₂₁细胞，重悬于10mMTris-Cl PH9.0溶液，在密闭的玻璃匀浆器中匀浆细胞30次，以破碎细胞并释放痘苗病毒。将细胞转移到离心管中低速离心(500×g)离心5分钟，用10mM Tris-Cl PH9.0重新悬浮沉淀物，然后重复低速离心(500×g)3次，以尽可能多的收集含痘苗病毒的细胞裂解液。所得到的细胞裂解液(5ml)在含36％蔗糖溶液(17ml)的离心管中高速离心(32900×g离心)80分钟后，收集沉淀并将其重新悬浮在1mM Tris-HCl pH8.0(1ml)缓冲液中。然后使用浓度为24％-40％的连续蔗糖密度梯度(分别为40％、36％、32％、28％和24％，各6.8ml)对重悬的痘苗病毒颗粒进行梯度离心(26000g，5℃，50分钟)。然后收集离心管中的乳状带并重新悬浮于1mMTris-HCl pH9.0(1ml)中。再次离心(29000g、4℃，60分钟)，收集沉淀物并重新悬浮于1mM Tris-Cl PH9.0(1m)中。取10μl样品测病毒滴度为10¹²pfu/ml。这一病毒滴度完全符合在本发明的药物筛选方法中作为辅助病毒的要求。

实施例3：重组丙型肝炎病毒的产生和IFN-α抗丙肝病毒效果的检测

将BHK₂₁细胞接种到六孔培养板各孔内(5×10⁵个/孔)，在含10％小牛血清的DMEM培养基培养24小时。24小时后细胞生长至达到孔底的约80％面积。吸去培养基，用无血清DMEM培养基洗细胞2次，然后向各孔中加入0.5ml同样的无血清DMEM培养基。

分别将实施例1中制得的重组质粒pT7HCV和pHCV各30μg溶解在1.5ml无血清DMEM培养基中，同时将90μl脂质体溶解在1.5ml无血清DMEM培养基中，然后室温下保温5分钟。

将上述质粒与脂质体混合，混匀后室温静止20分钟。将混合物加到六孔培养板的各孔中(0.5ml/孔)并摇动混匀。在CO₂培养箱中37℃保温4小时。保温后向各孔中加入终浓度分别为100U/ml和1000U/ml的IFN-α，继续保温2小时。以同样处理但未加入IFN-α的培养孔作为对照。保温后，再向各孔中分别加入实施例2中得到的重组痘苗病毒(用含2.5％小牛血清的DMEM培养基稀释至10⁸pfu/ml)的悬液(100μl/孔)。补加25μl血清至培养基内血清终浓度达到2.5％(V/V)后，在CO₂培养箱中37℃保温2小时。保温后，吸去培养基并用新鲜无血清DMEM培养基洗培养孔3次。然后加入含10％小牛血清的DMEM培养基(2.5ml/孔)，并在CO₂培养箱中30℃培养4天。

培养后，收集培养物上清，4℃下离心(12000×g，5分钟)并将上清超滤(0.22μm滤膜)，同时将细胞收集，进行实施例4所述的分子生物学和病毒学检测。

实施例4：合成的丙型肝炎病毒的检测和IFN-α抗丙肝病毒效果分析

(1)荧光定量PCR方法检测合成的HCV RNA的拷贝数

简单地说，提取HCV病毒RNA并逆转录成_CDNA后，在ABI Prism7000型PCR检测系统中进行PCR反应(93℃2分钟；93℃45秒，55℃45秒，10个循环；93℃30秒，55℃45秒，72℃ 1分钟，30个循环)。反应后，用Prism SDS计算机软件分析结果，得出如下列表1所示的基因组RNA拷贝数。

表1：荧光定量PCR检测HCV基因组RNA拷贝数结果

IFN-α处理	RNA拷贝数	阴性对照
			0U/ml	7.46±0.16×106	0
100U/ml	5.12±0.24×106	0
			1000U/ml	4.25±0.14×106	0

从荧光定量PCR检测的结果可以看出，加入IFN-α以后，HCV基因组RNA的拷贝数以剂量依赖性方式降低。RNA拷贝数最多减少达30％。说明IFN-α可以影响HCV在哺乳动物细胞中的复制过程。

(2)Western印迹法检测HCV蛋白的表达

用裂解液裂解产生HCV病毒颗粒的细胞后，对细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳(12％聚丙烯酰胺凝胶)分离，然后转印到PVDF膜上，用10％脱脂奶封闭后，加入第一抗体(抗NS3、NS5a的单克隆抗体)并保温1小时。保温后，再第二抗体(辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG)并保温1小时。然后用发色染料(DAB)显色并观察结果(图4)。

由图4所示的Western印迹分析结果可以看出，随着IFN-α加入量的增加，所得到的免疫印迹条带的染色逐渐变淡。该结果表明，IFN-α可在一定程度上降低HCV蛋白的表达水平。

(3)间接免疫荧光检测法检测HCV病毒颗粒生成细胞中HCV蛋白的表达

将盖玻片放于培养板的小孔中并在盖玻片上接种按照实施例3中描述的步骤得到的重组痘苗病毒感染的细胞。细胞固定后，加第一抗体(抗NS3、NS5a的单克隆抗体)。保温1小时后再加入第二抗体(荧光素标记的羊抗人IgG)。反应完成后，在荧光显微镜下观察细胞的荧光染色结果。

图5中所示的发出绿色荧光的细胞即为可与特异性抗NS3或NS5a单克隆抗体结合的，含有重组丙肝病毒的细胞。图5显示的免疫荧光实验结果表明，哺乳动物细胞被分别携带HCV基因组序列和HCV前体蛋白基因片段(已缺失了5’-UTR部分)的重组载体共转染，并进一步感染携带噬菌体DNA聚合酶基因序列的复制缺陷型重组痘苗病毒后，即获得了产生衣壳包裹的丙型肝炎病毒的能力。

(4)逆转录偶联的聚合酶链式反应分析

收集按实施例1-3所述方法在真核宿主细胞中产生的HCV颗粒，用DNA酶和RNA酶消化后，提取HCV基因组RNA。然后使用逆转录偶联的聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增重组HCV病毒颗粒的基因组序列。PCR扩增的条件为94℃，10min预变性；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，共30次循环。其中所使用的引物是根据野生型HCV的基因序列设计的。

逆转录引物：

P5：5’-AGCCCTGGCAGCGCCCCCTAGGGGGGCGCC-3’(SEQ ID NO：5)

P6：5’-GGGGGATGGCCTATTGGCCTGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO：6)PCR引物：

P7：5’-GCACAATCCAAAACCCCAAAGAAAAA-3’(核苷酸346-372)(SEQID NO：7)

P8：5′-CGCTCATCGGTTGGGGAGCAGGTAGATG-3’(核苷酸9378-9351)

(SEQ ID NO：8)

琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物后，可以得到约9kb大小的DNA片段(电泳图未示出)。PCR结果显示，所得到的重组HCV病毒含有与天然病毒相同的基因序列，证明我们使用本发明的系统生产的HCV病毒具有与天然病毒相同的核苷酸序列。

(5)电子显微镜观察

实施例(3)中所得到的重组HCV病毒用磷钨酸负染后，在电子显微镜下观察病毒形态。电子显微镜下可以看到宿主细胞的细胞质中存在有直径约50nm的、较深染色的颗粒(参见图6)。

以上的实验结果充分的证明，利用我们提供的丙型肝炎病毒生产系统可以生产出高滴度的、与天然HCV病毒有相同基因组序列的、并且形态完整的重组HCV颗粒。利用这一系统不但可以生产高滴度丙型肝炎病毒、进行抗HCV病毒药物的筛选，而且有利于进一步地研究这些药物的抗HCV病毒机理。这一系统的建立为筛选抗丙型肝炎病毒药物提供了一个有力的工具。

                                      序列表

<110>热带病研究所

<120>筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法

<141>

<160>8

<210>1

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

TAATACGACT CACTATAAGGG CCAGCCCCCT GATGGGGGCG ACACTCC

<210>2

<211>76

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

CAAAAAACCC CTCAAGACCC GTTTAGAGGC CCCAAGGGGT TATGCTAGAC

ATGATCTGCA GAGAGGCCAG TATCAG

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>3

GACGAAITCA TGAGCACAAA TCCAAAACCC CAAAGAAAA

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>4

GCCAGGCTTA AAAAAAAAAA GGGGAATGGC CTATTGGCC

GCCAGGCTTA AAAAAAAAAA GGGGAATGGC CTATTGGCC

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>5

AGCCCTGGCA GCGCCCCCTA GGGGGGCGCC

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>6

GGGGGATGGC CTATTGGCCT GGAGTTGT

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>7

GCACAATCCA AAACCCCAAA GAAAAA

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>8

CGCTCATCGG TTGGGGAGCA GGTAGATG

Claims (9)

1、一种筛选抗HCV药物的方法，该方法包括以下步骤：

1)构建一个携带HCV基因组序列的质粒，所说的HCV基因组序列定位于噬菌体启动子和噬菌体转录终止子之间；

2)构建一个携带HCV前体蛋白编码序列的质粒，所说的编码序列定位于一个在真核细胞中有活性的复制缺陷型痘苗病毒启动子的下游；

3)构建一个携带噬菌体RNA聚合酶编码序列的重组痘苗病毒；

4)用步骤1)和2)的重组质粒转染真核细胞适当时间后加入候选药物；

5)用步骤3)的重组痘苗病毒感染步骤4)中被转染的细胞，并在适当温度下保温适当时间；

6)检测候选药物对HCV增殖的影响并评价候选药物的抗病毒活性。

2、根据权利要求1的方法，其中步骤2)的丙型肝炎病毒前体蛋白的编码序列是缺失了5′非翻译区的序列。

3、根据权利要求1的方法，其中步骤3)的噬菌体RNA聚合酶编码序列是与步骤1)的噬菌体启动子和噬菌体转录终止子相匹配的，并且所说的噬菌体RNA聚合酶编码序列被连接到复制缺陷型痘苗病毒的启动子的下游。

4、根据权利要求1的方法，其中所说的真核细胞是哺乳动物细胞。

5、根据权利要求1的方法，特征在于步骤4)中所说的候选药物可以是任何一种天然的、合成的或重组产生的药物。

6、根据权利要求1的方法，特征在于重组痘苗病毒感染被转染细胞后的保温条件是28-32℃保温70-100小时。

7、根据权利要求1的方法，特征在于所说的方法进一步包括去除辅助性痘苗病毒的步骤。

8、根据权利要求1的方法，其中步骤6)所说的影响包括候选药物对所产生的丙型肝炎病毒的病毒形态、核酸结构、复制能力和蛋白表达能力的影响。

9、根据权利要求1的方法，特征在于步骤6)中所说的丙型肝炎病毒是具有感染性的。

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