CN104313038A - 衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及通过使用该核酸各自制备的表达载体、转化细胞和丙型肝炎病毒颗粒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包括丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区、NS3蛋白质编码区、NS4A蛋白质编码区、NS4B蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区、NS5B蛋白质编码区和3'非翻译区的核酸,其中所述核酸在NS3蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区或NS5B蛋白质编码区中具有引起选自下述的一个或多个氨基酸置换的核苷酸置换:M(1205)K、F(1548)L、C(1615)W、T(1652)N、A(2196)T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S,如使用作为参考序列的在序列表中的SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列定义的。
Description
本申请是国际申请日为2009年12月25日、国际申请号为PCT/JP2009/071644、进入国家阶段的申请号为200980157561.X、发明名称为“衍生自丙型肝炎病毒的核酸以及通过使用该核酸各自制备的表达载体、转化细胞和丙型肝炎病毒颗粒”的PCT申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及丙型肝炎病毒衍生的核酸以及使用该核酸制备的表达载体、转化细胞和丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。
背景技术
使得有效病毒扩增成为可能的实验系统是病毒研究以及抗病毒药物研究和开发所必需的。此外,如果存在使用培养细胞用于扩增病毒的系统或使用培养细胞用于评估病毒生长的系统,那么病毒研究以及关于抗病毒药物的研究和开发将得到极大进步。
丙型肝炎病毒(在下文中,称为HCV)属于黄病毒(Flaviviridae)科,包括单链(+)有义RNA作为其基因组,并且已知其引起丙型肝炎。近期研究已揭示丙型肝炎病毒依赖于基因型或血清型分类为许多类型。根据使用HCV毒株核苷酸序列的Simmonds等人的系统发育分析法,HCV分类为6个基因型,并且基因型进一步分类为几个亚型(Simmonds,P.等人,Hepatology,1994,10:1321-1324)。多种HCV基因型的全长基因组的核苷酸序列目前已得到确定(Choo等人,Science,1989,244:359-362;Kato等人,J. Med. Virol.,2001,64:334-339;Okamoto,H等人,J. Gen Virol.,1992,73:673-679;和Yoshioka等人,Hepatology,1992,16:293-299)。
直到最近,用HCV感染培养细胞或HCV基因组在培养细胞中的复制仍是不可能的。因此,深入HCV复制机制或HCV感染机制之内的研究需要使用黑猩猩作为实验动物的使用体内系统的实验。然而,由基因型1b的HCV的Con1毒株、N毒株和O毒株以及基因型1a的HCV的H77毒株制备亚基因组复制子RNA已使得能够在使用培养细胞的体外系统中进行关于深入HCV复制机制之内的研究的实验(日本专利公开(Kokai)号2001-17187 A;Lomann等人,Science,1999,285:110-113;Blight等人,Science,2000,290:1972-1974;Friebe等人,2001,75:12047-12057;和Ikeda等人,J. Virol.,2002,76:2997-3006)。此处,术语“HCV亚基因组复制子RNA”指包括HCV基因组的一部分的RNA,其不能产生感染性HCV颗粒但能够自我复制引入细胞内的HCV基因组衍生的RNA。
此外,连同亚基因组复制子RNA,通过其经由体外引入Huh7细胞内产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA已由基因型2a的HCV的JFH-1毒株制备。这已使得能够使用培养细胞用体外系统进行实验,也用于深入HCV感染机制之内的研究(Kato,T等人,Gastroenterology,2003,125:1808-1817;和Wakita,T等人,Nat Med.,2005,11:791-796)。此处,术语“HCV全基因组复制子RNA”指包括全长HCV基因组的RNA,其能够自我复制引入细胞内的HCV基因组衍生的RNA并且能够产生感染性HCV颗粒。
同时,丙型肝炎目前主要通过用干扰素-α或干扰素-β的单药剂疗法以及用干扰素-α和病毒唑的组合疗法进行治疗,所述病毒唑是嘌呤核苷衍生物。然而,已知即使当执行这些疗法时,对于所有治疗患者中的仅约60%观察到疗效。还已知如果疗法中断,那么疾病在有效治疗患者中的一半或更多中再次突然爆发。另外,干扰素的疗效与HCV基因型相关,并且从而已知疗效对于基因型1b低但对于基因型2a高(Mori,S.,等人,Biochem. Biophis. Res. Commun.,1992,183:334-342)。
为什么干扰素疗效取决于HCV基因型而不同的原因仍未得到阐明。认为原因之一是HCV复制机制或HCV复制效率中存在差异。
然而,HCV亚基因组复制子RNA的存在局限于来自基因型1a、1b和2a的HCV毒株的几个类型。此外,全基因组复制子RNA的存在局限于来自基因型2a的HCV的JFH-1毒株的一个类型。因此,阐明HCV基因型和HCV复制机制或HCV复制效率之间的关系是困难的。此外,可以人工制备且用于HCV疫苗的原料的病毒颗粒类型也局限于由全基因组复制子RNA生成的那些。因此,具有特征性复制机制或复制效率的HCV的其他亚基因组复制子RNAs或全基因组复制子RNA的发现是期望的。
不存在来自相同基因型的HCV或来自就复制机制或复制效率而言具有不同特征的相同HCV毒株的亚基因组复制子RNAs或全基因组复制子RNAs。因此,HCV复制机制或HCV复制效率中的差异无法使用具有相同遗传背景的样品进行比较。此外,无法鉴定通过新抗HCV治疗剂靶向的HCV复制所需的因子,并且无法筛选能够不依赖于复制机制或复制效率发挥有利效应的抗HCV治疗剂。
发明内容
本发明待解决的问题
本发明的目的是提供具有高自我复制能力的新HCV亚基因组复制子RNA和全基因组复制子RNA。
用于解决问题的手段
本发明人已将由HCV基因组制备的亚基因组复制子RNA引入培养细胞内,所述HCV基因组从暴发性丙型肝炎患者中分离,并且随后深入研究在已自我复制的亚基因组复制子RNA中生成的突变。因此,他们已揭示了显著增加自我复制能力(自主复制能力)的突变。此外,通过使编码HCV基因组的结构蛋白质的区域等与具有显著增加自我复制能力的突变的HCV亚基因组复制子RNA连接,他们已成功制备了能够产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA。因此,他们已完成了本发明。
具体地,本发明提供了包括丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区、NS3蛋白质编码区、NS4A蛋白质编码区、NS4B蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区、NS5B蛋白质编码区和3'非翻译区的核酸,其中所述核酸在NS3蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区或NS5B蛋白质编码区中具有引起选自下述的一个或多个氨基酸置换的核苷酸置换:M(1205)K、F(1548)L、C(1615)W、T(1652)N、A(2196)T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S,如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的。
核酸优选具有至少引起NS5A蛋白质编码区中的氨基酸置换A(2218)S的核苷酸置换。
核酸优选进一步包括丙型肝炎病毒基因组的核心蛋白质编码区、E1蛋白质编码区、E2蛋白质编码区、p7蛋白质编码区和NS2蛋白质编码区。
在一个优选实施方案中,核酸编码在序列表中的SEQ ID NO:5或6中所示的氨基酸序列中具有选自下述的一个或多个氨基酸置换的氨基酸序列:M(1205)K、F(1548)L、C(1615)W、T(1652)N、A(2196)T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S,如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的。
在另一个优选实施方案中,核酸由序列表中的SEQ ID NO:12或13中所示的核苷酸序列组成。
核酸可以进一步包括标记基因和/或IRES序列。
核酸可以是亚基因组复制子RNA。
可替代地,核酸可以是全基因组复制子RNA。
包括HCV亚基因组序列的核酸用作用于合成HCV亚基因组复制子RNA的模板或直接用作HCV亚基因组复制子RNA。将HCV亚基因组复制子RNA引入培养细胞内,从而展示出高于迄今获得的HCV亚基因组复制子RNA的自我复制能力。因此,包括HCV亚基因组序列的核酸可以用于筛选抑制HCV复制的抗HCV药物或用于阐明HCV复制机制的研究。
包括HCV全基因组序列的核酸用作用于合成HCV全基因组复制子RNA的模板或直接用作HCV全基因组复制子RNA。将HCV全基因组复制子RNA引入培养细胞内,从而展示出高于迄今获得的HCV全基因组复制子RNA的自我复制能力,并且可以有效产生感染性HCV颗粒。
本发明进一步提供了包括在启动子下游可操作地连接的核酸的表达载体。
本发明可以进一步提供包括核酸的表达载体,所述核酸在启动子下游可操作地连接,并且编码全基因组复制子RNA。
本发明还提供了通过引入全基因组复制子RNA或表达载体获得的转化细胞,所述表达载体包括编码全基因组复制子RNA的核酸。在此类转化细胞中,优选地,全基因组复制子RNA是自我复制的。此类转化细胞可以适当地用于产生丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。根据本发明进一步提供了通过培养转化细胞获得的丙型肝炎病毒(HCV)颗粒。本发明还提供了针对此类丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的抗体。
本说明书包括日本专利申请号2008-335016的说明书和附图的公开内容,本申请要求所述专利的优先权。
发明效果
根据本发明,可以提供具有高自我复制能力的HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子RNA。此类复制子RNA可以用于筛选抑制HCV复制的抗HCV药物或用于阐明HCV复制机制的研究。此外,本发明的HCV全基因组复制子RNA具有高于迄今获得的HCV全基因组复制子RNA的HCV颗粒生产能力。因此,可以在体外大量制备感染性HCV颗粒。因而获得的HCV颗粒可以用作HCV疫苗或抗原用于制备抗HCV抗体。
附图说明
图1A显示了HCV JFH-2.1毒株和JFH-2.3毒株的全长基因组结构。图1B和1C显示了用于合成来自JFH-2.1和JFH-2.3毒株的HCV亚基因组复制子RNA的载体pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3的结构。图1D显示了来自JFH-2.1和JFH-2.3毒株的HCV亚基因组复制子RNA的结构。
图2显示了显示通过来自JFH-2.1和JFH-2.3毒株的HCV亚基因组复制子RNA引入其内的细胞的集落形成的照片。
图3显示了在突变型复制子中发现的氨基酸突变,这在JFH-2.3亚基因组复制子RNA已引入其内的细胞中发生。
图4显示了在JFH-2.3亚基因组复制子中发现的氨基酸置换引入其内的突变型JFH-2.1 HCV亚基因组复制子RNA(图4A),和显示通过用其各自转化的细胞的集落形成的照片(图4B)。
图5显示了J6/JFH-2.1和J6/JFH-2.1 A2217S嵌合HCV全基因组复制子RNAs的结构。
图6显示了J6/JFH-2.1和J6/JFH-2.1 A2217S嵌合HCV全基因组复制子RNAs引入其内的Huh7细胞中的核心蛋白质水平随着时间过去的变化。
图7显示了得自J6/JFH-2.1 A2217S嵌合HCV全基因组复制子RNA引入其内的Huh7细胞传代培养物的培养上清液中的核心蛋白质水平随着时间过去的变化。
图8显示了评估J6/JFH-2.1 A2217S HCV颗粒的感染性的结果。
图9显示了JFH-2.1基因组RNA(HCV全基因组复制子RNA)和JFH-2.1 A2218S HCV全基因组复制子RNA的结构。
图10显示了得自JFH-2.1 A2218S HCV全基因组复制子RNA引入其内的Huh7细胞传代培养物的培养上清液中的核心蛋白质水平随着时间过去的变化。
图11显示了评估JFH-2.1 A2218S HCV颗粒的感染性的结果。
图12显示了得自用J6/JFH-2.1 A2217S 衍生的突变型HCV RNA转染的Huh7细胞(Huh7.5.1细胞)传代培养物的培养上清液中的核心蛋白质水平随着时间过去的变化。在图12中,J6/JFH2-AS、CS、LP、TI、CS/LP、CS/TI、TI/LP、CS/TI/LP、AT/CS/TI/LP、引入所有4A突变的病毒和引入所有4B突变的病毒分别指示J6/JFH-2.1 A2217S、J6/JFH-2.1 A2217S(CS)、J6/JFH-2.1 A2217S(LP)、J6/JFH-2.1 A2217S(TI)、J6/JFH-2.1 A2217S(CS/LP)、J6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI)、J6/JFH-2.1 A2217S(TI/LP)、J6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI/LP)、J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)、J6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)和J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)。关于J6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)的结果用空心圆圈显示,并且关于J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)的结果用实心圆圈显示。
具体实施方案
(1)根据本发明的突变型HCV复制子RNA和编码该RNA的核酸
丙型肝炎病毒(HCV)基因组是包括约9,600个核苷酸的单链(+)RNA。这种基因组RNA包括5'非翻译区(也称为“5’UTR”或“5’NTR”)、由结构区和非结构区组成的翻译区、和3'非翻译区(也称为“3’UTR”或“3’NTR”)。在结构区中,编码HCV结构蛋白质,并且在非结构区中,编码非结构蛋白质。
HCV结构蛋白质和非结构蛋白质首先由翻译区作为连续前体蛋白质(多聚蛋白质)转录且翻译。使HCV结构蛋白质接受通过宿主细胞中的蛋白酶的有限降解,并且使非结构蛋白质部分接受通过2类自动催化作用的HCV蛋白酶活性的有限降解,并且随后这些蛋白质作为成熟蛋白质分开释放。
HCV结构蛋白质是组成HCV病毒颗粒部分的核心、E1、E2和p7。核心是核心蛋白质,E1和E2是包膜蛋白质,并且p7是形成在宿主细胞的膜上起作用的离子通道的蛋白质。
HCV非结构蛋白质是NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B,它们是具有涉及病毒基因组复制或HCV蛋白质加工的活性的酶蛋白质。各种HCV基因型是已知的,并且各种基因型的HCV基因组已知具有相似的基因结构。
HCV 5'非翻译区(5’UTR或5’NTR)提供了用于蛋白质翻译的内部核糖体进入位点(IRES)和复制所需的元件,包括来自全长HCV基因组的N末端的约340个核苷酸。
HCV 3'非翻译区(3’UTR或3’NTR)具有帮助HCV复制的功能,且除多聚U区外还包括约100个核苷酸的另外区域。
应用HCV基因组,本发明提供了可以高效率自我复制的RNA或编码该RNA的DNA,包括突变已引入其内以增加自我复制能力的HCV亚基因组序列或HCV全基因组序列。
术语“复制子RNA”在本发明中指在细胞中可自我复制(可自主复制)的RNA。引入细胞内的复制子RNA自我复制,并且所得到的RNA拷贝在细胞分裂后分配给子代细胞,从而使得使用复制子RNA稳定引入细胞内是可能的。在本发明中,在HCV背景中的术语“基因型”指根据由Simmonds等人开发的国际分类法(International Classification)分类的基因型。
在一个优选实施方案中,本发明提供了包括丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区、NS3蛋白质编码区、NS4A蛋白质编码区、NS4B蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区、NS5B蛋白质编码区和3'非翻译区的核酸,其中所述核酸在NS3蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区或NS5B蛋白质编码区中具有引起选自下述的一个或多个氨基酸置换的核苷酸置换:M(1205)K、F(1548)L、C(1615)W、T(1652)N、A(2196)T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S,如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的。此类核酸一般是突变型HCV复制子RNA或编码该突变型RNA的DNA。
根据本发明的核酸是包括丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区、NS3蛋白质编码区、NS4A蛋白质编码区、NS4B蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区、NS5B蛋白质编码区和3'非翻译区的核酸,并且编码包括至少NS3蛋白质、NS5A蛋白质或NS5B蛋白质的氨基酸序列,其中一个或多个氨基酸置换选自M(1205)K、F(1548)L、C(1615)W、T(1652)N、A(2196)T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S,如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的。
如本文使用的,除RNA和DNA外,术语“核酸”还指经由其结合形成的杂交核酸。另外,此处,术语“蛋白质编码区”指编码给定蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列,其可以包括或可以不包括起始密码子和终止密码子。
在说明书中,表达“如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:“X”中所示的氨基酸序列定义的氨基酸置换“a(Z)b””,意指当氨基酸序列Y(优选地,与SEQ ID NO:“X”同源)与作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:“X”中所示的序列比对时,待与位于SEQ ID NO:“X”中所示的氨基酸序列中在位置“Z”上的氨基酸“a”比对的在给定氨基酸序列Y中的氨基酸(这优选地是但不限于与SEQ ID NO:“X”中相同的氨基酸“a”,或类似于氨基酸“a”的氨基酸)由氨基酸“b”置换。此处,“a”和“b”代表给定氨基酸,其各自基于生物学领域中一般用于氨基酸的单字母符号进行描述。
因此,例如,表达“如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的氨基酸置换A(2218)S”,意指当HCV前体蛋白质的氨基酸序列“Y”与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列(HCV JFH-2.3毒株的前体蛋白质的氨基酸序列)比对时,待与SEQ ID NO:6的位置2218上的氨基酸A(丙氨酸)比对的在给定氨基酸序列Y中的氨基酸的S(丝氨酸)置换。因此,例如当整个HCV前体蛋白质的氨基酸序列中的第2217位丙氨酸(在位置2217上的丙氨酸)与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列中在位置2218上的丙氨酸比对时,在目的氨基酸序列中在位置2217上的丙氨酸由丝氨酸的置换对应于“如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的氨基酸置换A(2218)S”。
此外,短语“如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:“X”中所示的氨基酸序列定义的在位置“Z”上的氨基酸”,指当SEQ ID NO:“X”中所示的序列与序列Y(优选地,与SEQ ID NO:“X”同源)比对时,待与SEQ ID NO:“X”中所示的氨基酸序列中在位置“Z”上的氨基酸比对的在给定氨基酸序列Y中的氨基酸。表达“如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:“X”中所示的核苷酸序列定义的在位置“Z”上的核苷酸”也将类似地理解。
在说明书中,如果核酸是RNA,并且RNA的核苷酸序列或核苷酸通过参考序列表中的SEQ ID NO(S)指定,那么相关SEQ ID NO中所示的核苷酸序列中的“T(胸腺嘧啶)”应读作“U(尿嘧啶)”。
给定序列Y与SEQ ID NO:“X”中所示的序列的比对可以手工执行,或通过例如Clustal W多重比对程序(Thompson,J. D. 等人,(1994)Nucleic Acids Res. 22,第4673-4680页)使用缺省设置执行。
在说明书中,每个HCV区域还可以用在每个区域的5'末端和3'末端上的核苷酸位置进行鉴定,如使用作为参考序列的SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列(JFH-2.3毒株的全长基因组序列)定义的。在SEQ ID NO:4中所示的核苷酸序列中,5’UTR范围从核苷酸位置1到340,核心编码区(核心区)范围从核苷酸位置341到913,E1编码区(E1区)范围从核苷酸位置914到1492,E2编码区(E2区)范围从核苷酸位置1493到2593,p7编码区(p7区)范围从核苷酸位置2594到2782,NS2编码区(NS2区)范围从核苷酸位置2783到3433,NS3编码区(NS3区)范围从核苷酸位置3434到5326,NS4A编码区(NS4A区)范围从核苷酸位置5327到5488,NS4B编码区(NS4B区)范围从核苷酸位置5489到6271,NS5A编码区(NS5A区)范围从核苷酸位置6272到7669,NS5B编码区(NS5B区)范围从核苷酸位置7670到9445,并且3’UTR范围从核苷酸位置9446到9686。
在说明书中,HCV前体蛋白质中的氨基酸可以用氨基酸编号进行指定,所述氨基酸编号通过用前体蛋白质的翻译起始甲硫氨酸(M)编号为“第一个”氨基酸而给定。例如,JFH-2.1毒株的前体蛋白质从翻译起始甲硫氨酸开始,并且随后以第3034位精氨酸(R)结束。此外,JFH-2.1毒株的第2218位氨基酸是NS5A区中包括的丙氨酸(A)。
在说明书中,氨基酸置换通过例如A(2218)S或在位置2218上的A→S指示。具体地,作为原则,它们都意指在位置2218上的A(丙氨酸)由S(丝氨酸)置换。在说明书中,氨基酸或氨基酸残基由生物学领域中一般用于氨基酸的单字母代码或三字母代码描述(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版,1989)。如上所述的氨基酸也包括接受翻译后修饰例如羟基化、糖基化或硫酸化的氨基酸。
在本发明中,如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的,将选自M(1205)K、F(1548)L、C(1615)W、T(1652)N、A(2196)T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S的一个或多个氨基酸置换引入HCV前体蛋白质中的NS3蛋白质、NS5A蛋白质和NS5B蛋白质内,从而可以增加编码HCV前体蛋白质的复制子RNA的自我复制能力。一个或多个氨基酸置换的此类引入可以通过使用本领域技术人员已知的基因工程技术引入核苷酸置换执行,所述核苷酸置换引起编码HCV复制子RNA的DNA内的相关氨基酸置换。
根据生物学领域中众所周知的遗传密码表,通过比较置换后的氨基酸密码子与置换前的氨基酸密码子,可以容易地指定引起一个或多个上述氨基酸置换的一个或多个核苷酸置换。
根据本发明的核酸例如突变型HCV复制子RNA或编码该RNA的DNA并无限制,但优选具有引起来自上述氨基酸置换中的至少氨基酸置换A(2218)S的核苷酸置换。这是因为该氨基酸置换对于增强自我复制是特别有效的。例如,引起氨基酸置换A(2218)S的核苷酸置换优选是这样的核苷酸置换,其将编码在氨基酸位置2218上的丙氨酸的密码子(一般而言,GCT、GCC、GCA或GCG)转换为编码丝氨酸的密码子例如TCA、TCC、TCG、TCT、AGT或AGC。
除5'非翻译区、NS3蛋白质编码区、NS4A蛋白质编码区、NS4B蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区、NS5B蛋白质编码区和3'非翻译区外,根据本发明的核酸例如突变型HCV复制子RNA或编码该RNA的DNA可以进一步包括丙型肝炎病毒基因组的核心蛋白质编码区、E1蛋白质编码区、E2蛋白质编码区和p7蛋白质编码区。根据本发明的突变型HCV复制子RNA或编码该RNA的核酸可以进一步包括丙型肝炎病毒基因组的NS2蛋白质编码区。根据本发明的突变型HCV复制子RNA或编码该RNA的核酸进一步优选包括核心蛋白质编码区、E1蛋白质编码区、E2蛋白质编码区、p7蛋白质编码区和NS2蛋白质编码区,并且更优选以这一次序包括它们。
根据本发明的核酸的优选例子是编码在序列表中的SEQ ID NO:5或6中所示的氨基酸序列中具有选自下述的一个或多个氨基酸置换的氨基酸序列的核酸:M(1205)K、F(1548)L、C(1615)W、T(1652)N、A(2196)T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S,如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的。核酸编码从暴发性肝炎患者中分离的JFH-2.1毒株(SEQ ID NO:5)或JFH-2.3毒株(SEQ ID NO:6)的前体蛋白质的突变型。
根据本发明的上述核酸的另一个优选例子是包括序列表中的SEQ ID NO:12或13中所示的核苷酸序列的核酸。
根据本发明的核酸例如突变型HCV复制子RNA或编码该RNA的DNA优选进一步包括外源基因例如标记基因和/或IRES序列。此类标记基因的例子包括可以对细胞赋予选择性通过其仅选择表达相关基因的细胞的选择标记基因,和编码充当基因表达指示的基因产物的报道基因。在本发明中,此类选择标记基因的优选例子包括但不限于新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰转移酶基因、Zeocin抗性基因和嘌呤霉素抗性基因。在本发明中,报道基因的优选例子包括但不限于转座子Tn9衍生的氯霉素乙酰转移酶基因、大肠杆菌(Escherichia coli)衍生的β葡糖醛酸酶或β半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、水母衍生的水母发光蛋白基因和分泌的胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因。
在本发明中的术语“IRES序列”指能够引起核糖体与RNA内部结合以便起始翻译的内部核糖体进入位点。在本发明中此类IRES序列的优选例子包括但不限于EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)、FMDV IRES和HCV IRES。
根据本发明的核酸例如突变型HCV复制子RNA或编码该RNA的DNA可以是包括HCV亚基因组复制子序列的核酸,这仅包括丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区、NS3蛋白质编码区、NS4A蛋白质编码区、NS4B蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区、NS5B蛋白质编码区和3'非翻译区作为HCV衍生的序列。在本发明中,术语“HCV亚基因组”指HCV全长基因组的部分序列。HCV亚基因组复制子RNA是包括HCV亚基因组的复制子RNA,但不包括范围从HCV全长基因组的5’UTR到3’UTR的全部区域。
包括HCV亚基因组复制子序列的核酸的例子是RNA,其中在5’到3’方向,5’UTR、包括来自核心编码区5'末端的36个核苷酸的序列、萤光素酶基因(标记基因)、脑心肌炎病毒IRES序列、NS3区、NS4A区、NS4B区、NS5A区、NS5B区和3’UTR例如以此次序连接。
根据本发明的核酸例如突变型HCV复制子RNA或编码该RNA的DNA还可以是HCV全基因组复制子RNA。术语“HCV全基因组复制子RNA”指包括范围从HCV全长基因组的5’UTR到3’UTR的全部区域的复制子RNA,具体地,5’UTR、核心蛋白质编码区(核心区)、E1蛋白质编码区(E1区)、E2蛋白质编码区(E2区)、p7蛋白质编码区(p7区)、NS2蛋白质编码区(NS2区)、NS3蛋白质编码区(NS3区)、NS4A蛋白质编码区(NS4A区)、NS4B蛋白质编码区(NS4B区)、NS5A蛋白质编码区(NS5A区)、NS5B蛋白质编码区(NS5B区)和3’UTR。HCV全基因组复制子RNA可以由HCV全长基因组序列组成或可以进一步包括另外序列。在本发明中,术语“HCV全长基因组”或“全长HCV基因组”指包括HCV基因组的全长序列(范围从5’UTR到3’UTR)的RNA或编码该RNA的DNA。
(2)根据本发明的复制子RNA的制备
使用编码突变型HCV复制子RNA的DNA并且随后将其用作模板,通过经由本领域技术人员已知的任何基因工程技术制备复制子RNA表达载体,可以制备根据本发明的突变型HCV复制子RNA,具体地突变型HCV亚基因组复制子RNA或突变型HCV全基因组复制子RNA。本发明还提供了包括核酸(优选地,编码突变型HCV复制子RNA的DNA)的载体,特别是表达载体,所述核酸例如突变型HCV复制子RNA、编码该RNA的DNA等,其在启动子下游可操作地连接。表达载体可以用于在体外有效合成突变型HCV复制子RNA。用于构建根据本发明的复制子RNA表达载体的基础技术如Lohmann等人的文献(Science,285:110-113,1999)和Kato等人的文献(Gastroenterology,125:1808-1817,2003)中所述。
作为可以用于制备根据本发明的核酸的HCV毒株,可以使用从HCV患者中分离的任何毒株或其衍生毒株。更优选使用从暴发性丙型肝炎患者中分离的HCV毒株。用于从患者中分离HCV基因组的方法如Kato等人的文献(Gastroenterology,125:1808-1817,2003)中所述。在本发明中,在HCV背景中的术语“衍生毒株”指衍生自目的病毒株的毒株。
任何丙型肝炎病毒毒株的基因组都可以用于制备根据本发明的核酸。优选使用基因型2a的丙型肝炎病毒的至少一个基因组。编码NS3蛋白质、NS4A蛋白质、NS4B蛋白质、NS5A蛋白质和NS5B蛋白质的区域可以衍生自任何丙型肝炎病毒基因组。更优选地,使用来自基因型2a的丙型肝炎病毒的基因组的此类区域。进一步优选地,使用一个或多个上述氨基酸置换引入其内的来自HCV JFH-2.1或HCV JFH-2.3毒株、毒株的衍生毒株、或HCV JFH-1毒株的基因组的序列。
根据本发明的核酸可以是来自一个、两个或更多个类型的任意丙型肝炎病毒的基因组的嵌合体。根据本发明的核酸可以是但不限于其中使用基因型2a的丙型肝炎病毒的至少一个基因组的嵌合体。对于根据本发明的核酸的制备,例如可以使用HCV JFH-1毒株、J6CF毒株、HCV JFH-2.1毒株、HCV JFH-2.3毒株或这些毒株的衍生毒株的基因组。
根据本发明的突变型HCV复制子RNA可以例如通过下述方法进行制备,但所述方法并不限于下述方法。首先,通过常规方法使编码上述突变型HCV复制子RNA的DNA连接在载体中的RNA启动子下游,从而制备DNA克隆。RNA启动子的例子包括但不限于,T7启动子、SP6启动子和T3启动子。T7启动子是特别优选的。作为载体,可以使用pUC19(TaKaRa)、pBR322(TaKaRa)、pGEM-3Z(Promega)、pSP72(Promega)、pCRII(Invitrogen)、pT7Blue(Novagen)等,但例子并不限于这些。
来自包括编码突变型HCV复制子RNA的DNA的表达载体的突变型HCV复制子RNA的制备(合成)可以使用例如MEGA script T7试剂盒(Ambion)等执行。此外,当载体引入细胞内用于表达时,优选使用包括RNA聚合酶I启动子和终止子的载体(在WO2007-037428(HCV#9)中描述)。
如此制备的突变型HCV复制子RNA可以通过本领域技术人员已知的RNA提取法、纯化法等进行提取且纯化。
(3)包括自我复制的突变型HCV复制子RNA的转化细胞的制备
将上述制备的复制子RNA例如突变型HCV复制子RNA引入宿主细胞内,从而可以获得包括自我复制的复制子RNA的转化细胞。本发明还提供了经由突变型HCV复制子RNA引入细胞内获得的转化细胞,复制子RNA在所述转化细胞中自我复制。
复制子RNA引入其内的细胞可以是使得HCV复制子能够复制的任何细胞。此类细胞更优选是人肝衍生的细胞、人子宫颈衍生的细胞或人胚肾衍生的细胞。此类细胞的例子包括Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞和293细胞。此类细胞的进一步合适例子包括Huh7细胞的衍生株,例如Huh7.5细胞和Huh7.5.1细胞。此外,CD81基因和/或Claudin 1基因在其中表达的细胞,例如Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞也是此类细胞的例子。在这些细胞中,优选使用Huh7细胞或Huh7细胞的衍生细胞。
复制子RNA可以使用本领域技术人员已知的任何技术引入细胞内。此类技术的例子包括磷酸钙共沉淀、DEAE葡聚糖法、脂转染、显微注射和电穿孔。优选地,执行脂转染和电穿孔。更优选地,特别优选执行基于电穿孔的方法。
关于复制子RNA,可以引入单独的靶复制子RNA,或还可以引入与另一种核酸混合的靶复制子RNA。为了改变复制子RNA的量同时使待引入的RNA量维持在恒定水平,使靶复制子RNA与从待用于引入的细胞中提取的总细胞RNA混合,并且随后将混合物引入细胞内。待引入细胞内的复制子RNA的量可以依赖于待采用的引入方法决定。在本文中待使用的复制子RNA的量范围优选地为1皮克到100微克,并且更优选10皮克到10微克。
当使用包括标记基因的复制子RNA时,复制子RNA已引入其内且自我复制的细胞可以使用标记基因的表达进行选择。
通过常规方法可以由引入细胞内且培养细胞后形成的集落克隆活细胞。以此类方式,可以建立包括自我复制的复制子RNA的细胞克隆。
如此建立的细胞克隆优选实际上通过下述证实复制子RNA的自我复制:例如,检测细胞中来自所引入复制子RNA的复制子RNA的复制,证实复制子RNA中标记基因的表达,或证实HCV蛋白质(例如核心)的表达。通过使针对待由引入的复制子RNA表达的HCV蛋白质的抗体与从细胞克隆中提取的蛋白质反应,可以证实HCV蛋白质的表达。这种方法可以通过本领域技术人员已知的任何蛋白质检测方法执行。具体地,例如,该方法可以通过下述执行:将从细胞克隆中提取的蛋白质样品点在硝酸纤维素膜上,使抗HCV蛋白质抗体(例如抗核心特异性抗体或从丙型肝炎患者中收集的抗血清)与膜反应,并且随后检测抗HCV蛋白质抗体。如果从细胞克隆中提取的蛋白质中检测到HCV蛋白质,那么可以得出结论HCV衍生的复制子RNA自我复制,并且HCV蛋白质在细胞克隆中表达。如此建立且优选证实的细胞克隆是通过引入根据本发明的复制子RNA获得的转化细胞。
作为用于评估复制子RNA在转化细胞中的复制能力的方法,可以测量连接到HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA内的外源基因的功能。当外源基因是药物抗性基因时,评估可以通过测定在包含药物的选择培养基中生长的细胞数目或细胞集落数目来进行。此外,当外源基因是酶基因时,复制能力可以通过测量酶活性进行评估。作为另一种方法,复制能力可以通过经由定量PCR定量测定复制的RNA量进行评估。
已证实HCV基因组的有效复制需要在HCV基因组的核苷酸序列中突变的出现(Lohmann,V.等人,J. Virol.,75:1437-1449,2001)。改善复制的突变被称为适应性突变。根据本发明的突变型HCV复制子RNA是具有显著增强的自我复制的复制子RNA。通过培养的继续,适应性突变在HCV复制子RNA中发生,并且复制可以得到显著改善。如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的氨基酸置换A(2218)S导致复制能力方面的此类显著增强。
(4)感染性HCV颗粒的产生
在本发明中,对通过引入根据本发明的HCV复制子RNA获得的转化细胞进行传代培养,从而使得感染性HCV颗粒可以产生且优选释放到培养基内。此处,根据本发明的HCV复制子RNA是这样的复制子RNA,其除丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区,分别编码NS3蛋白质、NS4A蛋白质、NS4B蛋白质、NS5A蛋白质和NS5B蛋白质的序列,和3'非翻译区外,还包括HCV结构区。具体地,HCV复制子RNA是:
除丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区,分别编码NS3蛋白质、NS4A蛋白质、NS4B蛋白质、NS5A蛋白质和NS5B蛋白质的序列,和3'非翻译区外,进一步包括丙型肝炎病毒基因组的核心蛋白质编码区、E1蛋白质编码区、E2蛋白质编码区和p7蛋白质编码区的核酸;
除丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区,分别编码NS3蛋白质、NS4A蛋白质、NS4B蛋白质、NS5A蛋白质和NS5B蛋白质的序列,和3'非翻译区外,进一步包括核心蛋白质编码区、E1蛋白质编码区、E2蛋白质编码区、p7蛋白质编码区和NS2蛋白质编码区的核酸(HCV全基因组复制子RNA);或
包括在序列表中的SEQ ID NO:12或13中所示的核苷酸序列的核酸,或
包括编码在序列表中的SEQ ID NO:5或6中所示的氨基酸序列中具有选自下述的一个或多个氨基酸置换的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸:M(1205)K、F(1548)L、C(1615)W、T(1652)N、A(2196)T、A(2218)S、H(2223)Q、Q(2281)R、K(2520)N和G(2374)S,如使用作为参考序列的在序列表中的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义。
能够产生感染性HCV颗粒的根据本发明的转化细胞的一般例子包括全长嵌合复制子RNA和此类全长嵌合复制子RNA已引入其内的转化细胞,其中所述全长嵌合复制子RNA包括JFH-1毒株衍生的5'非翻译区;J6CF毒株衍生的核心蛋白质编码区、E1蛋白质编码区、E2蛋白质编码区和p7蛋白质编码区;JFH-1毒株衍生的NS2蛋白质编码区;和此外,编码氨基酸序列的核苷酸序列,其中一个或多个且优选任何一个上述氨基酸置换已引入HCV JFH-2.1毒株或HCV JFH-2.3毒株衍生的NS3蛋白质编码区、NS4A蛋白质编码区、NS4B蛋白质编码区、NS5A蛋白质编码区、NS5B蛋白质编码区、和3'非翻译区。
此类转化细胞的病毒颗粒生产能力也可以使用针对HCV蛋白质(例如核心蛋白质、E1蛋白质或E2蛋白质)的抗体进行检测,所述HCV蛋白质组成释放到培养基(培养溶液)内的HCV病毒颗粒。此外,HCV病毒颗粒的存在也可以通过下述进行间接检测:使用特异性引物通过RT-PCR扩增且检测在培养溶液中的HCV病毒颗粒中包含的HCV复制子RNA。
通过上述转化细胞产生的HCV颗粒对细胞(优选地,HCV敏感细胞)是感染性的。在本发明中,术语“HCV敏感细胞”指由HCV感染的细胞。此类HCV敏感细胞优选肝细胞或淋巴谱系细胞,但例子并不限于这些。肝细胞的具体例子包括原代肝细胞、Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞和293细胞。淋巴谱系细胞的具体例子包括Molt4细胞、HPB-Ma细胞和Daudi细胞。然而,例子并不限于这些细胞。
制备的HCV颗粒是否是感染性的可以通过下述进行测定:使用通过培养上述转化细胞(HCV复制子RNA已引入其内)获得的培养上清液处理HCV容许细胞(例如Huh-7),在给定时间段后(例如在48小时后)用抗核心抗体免疫染色细胞,并且随后测定受感染细胞的数目。可替代地,测定可以通过下述进行:使细胞提取物接受在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳,通过蛋白质印迹检测核心蛋白质,并且从而检测受感染细胞。
本发明还涉及用于制备HCV颗粒的方法,通过下述进行:培养能够产生感染性HCV颗粒的上述转化细胞,并且随后优选获得(例如收集培养上清液)释放到培养基(优选地,培养溶液)内的HCV颗粒。本发明提供了通过该方法获得的HCV颗粒和优选地感染性HCV颗粒。HCV颗粒还感染HCV敏感动物例如黑猩猩,以便能够诱导HCV衍生的肝炎。
(5)亚基因组复制子RNA的用途
根据本发明的HCV亚基因组复制子RNA已引入其内的转化细胞可以用于筛选抑制HCV亚基因组复制子RNA复制的化合物。
更具体而言,例如,将其中在5'到3'方向,5’UTR、范围从核心编码区的5'末端到核苷酸36的序列、萤光素酶基因(标记基因)、脑心肌炎病毒IRES序列、NS3区、NS4A区、NS4B区、NS5A区、和NS5B区和3’UTR以这个次序连接的RNA引入Huh7细胞内。随后,用待筛选的化合物处理细胞。在48 – 72小时后,测量萤光素酶活性。与未用化合物处理的组比较抑制萤光素酶活性的化合物被视为具有抑制HCV亚基因组复制子RNA复制的作用。相应地,还可以测定哪种化合物可以具有抑制HCV复制的活性,所述HCV具有与复制子RNA或特别地NS3至NS5B区由其衍生的HCV毒株的基因型相同的基因型,或在相关HCV毒株已从其中分离的具有HCV相关疾病的患者等中观察到。
(6)HCV颗粒的用途
本发明的HCV颗粒也可以用于筛选抑制HCV感染的抗体或化合物。
根据本发明的HCV颗粒也优选用作疫苗或抗原用于制备抗HCV抗体。
具体地,根据本发明的HCV颗粒可以不作修饰地用作疫苗。HCV颗粒还可以进行经由本领域已知的方法减毒或灭活且随后使用。通过加入灭活剂且使灭活剂与例如病毒悬浮液混合,并且允许灭活剂与病毒反应,可以灭活病毒,所述灭活剂例如福尔马林、β-丙酸内酯或戊二醛(glutardialdehyde)(Appaiahgari,M. B. & Vrati,S.,Vaccine,22:3669-3675,2004)。
可以将疫苗配制成可以施用的剂型,例如溶液或悬浮液。疫苗可以以适合于将其溶解或悬浮于溶液中的固态进行制备。可替代地,此类制剂可以在脂质体中进行乳化或包封。活性免疫原性成分例如HCV颗粒通常与赋形剂混合,所述赋形剂是药学上可接受的且与待在本文中使用的活性成分相容。合适赋形剂的例子包括水、生理盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其混合物。进一步地,疫苗可以包含微量辅助剂(例如湿润剂或乳化剂)、pH缓冲剂和/或增强疫苗功效的佐剂。有效佐剂的例子包括但不限于氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲(nor)-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(被称为CGP11637、去甲-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(被称为CGP19835A、MTP-PE)和RIBI。RIBI包括在2%角鲨烯/Tween(R)80乳状液中的从细菌中提取的3种组分;即单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(HPL+TDM+CWS)。佐剂的作用可以通过测量得自包括HCV颗粒的疫苗施用的抗体量进行测定。
疫苗一般例如通过注射例如皮下注射或肌内注射肠胃外施用。作为其他剂量形式合适的其他制剂的例子包括栓剂和口服制剂。
具有佐剂活性的一种或多种化合物可以加入HCV疫苗中。佐剂是对于免疫系统的非特异性刺激剂。此类物质增强宿主针对HCV疫苗的免疫应答。本领域已知的佐剂的具体例子包括弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油和卡波普(Carbopol)。特别适合于经粘膜施用的佐剂的例子包括大肠杆菌(E. coli)不耐热毒素(LT)和霍乱毒素(CT)。其他合适佐剂的例子包括氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油乳剂(例如Bayol(R)或Marcol 5(R))、皂苷和维生素E加溶物。相应地,本发明的优选实施方案的疫苗包括佐剂。
关于用于皮下、皮内、肌内或静脉内施用的可注射溶液,在可注射溶液中用于与本发明的HCV疫苗组合施用的药学上可接受的载体或稀释剂的其他具体例子包括稳定剂、碳水化合物(例如山梨糖醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖或葡聚糖)、蛋白质(例如白蛋白或酪蛋白)、含蛋白质物质(例如牛血清或脱脂乳)和缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)。
用于栓剂的常规粘合剂和载体的例子可以包括聚亚烷基二醇和甘油三酯。此类栓剂可以由包括0.5%- 50%且优选1%- 20%活性成分的混合物进行制备。口服制剂包括一般使用的赋形剂。赋形剂的例子包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。
本发明的疫苗可以是溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式,并且它的活性成分(病毒颗粒或其部分)占其10%- 95%且优选25%- 70%。
本发明的疫苗以适合于剂型的方式和可以发挥预防和/或治疗作用的量施用。待施用的量一般范围为0.01 μg - 100,000 μg抗原/剂量。该量依赖于待治疗的患者、患者在免疫系统中抗体合成的能力和期望的保护程度而改变。此外,该量依赖于施用途径而改变,所述施用途径例如口服、皮下、皮内、肌内或静脉内施用。
本发明的疫苗可以根据单一施用方案且优选根据多次施用方案进行施用。在多次施用方案的情况下,在疫苗接种起始时执行1 – 10次分开施用,并且随后可以用维持或增强免疫应答所需的时间间隔执行另一次施用。例如,第二次施用可以在第一次后1 – 4个月执行。需要时,施用可以随后在第一次后数月执行。施用方案至少部分根据个别患者的需要来决定,并且方案取决于由医生做出的判断。
进一步地,包括本发明的HCV颗粒的疫苗可以与另一种免疫学试剂(例如免疫球蛋白)一起施用。
进一步地,本发明的HCV颗粒疫苗可以针对可能的新HCV感染预防性地使用,其经由施用于健康个体以诱导针对HCV的免疫应答而实施。本发明的HCV颗粒疫苗也可以用作治疗疫苗,以在体内诱导针对HCV的强免疫应答以消除HCV,其经由施用于由HCV感染的患者,经由施用于由HCV感染的患者而实施。
本发明的HCV颗粒还用作待用于制备抗HCV抗体的抗原。待用作抗原的HCV颗粒期望地具有较高纯度。通过离心和/或使用滤器等从包含HCV颗粒的培养溶液中去除细胞或细胞碎片。细胞碎片已从其中去除的此类溶液还可以使用超滤膜浓缩约10 - 100倍,所述超滤膜具有范围为100,000 - 500,000的分子量截止。细胞碎片已从其中去除的包含HCV颗粒的此类溶液可以通过以任何次序组合或单独的层析(例如凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析)和密度梯度离心进行纯化。
(7)针对HCV颗粒的抗体
本发明还提供了针对上文(4)中获得的HCV颗粒的抗体。此类抗体的优选例子特别地包括针对HCV颗粒的抗体,所述HCV颗粒具有JFH-2.1或JFH-2.3毒株的结构蛋白质(核心、E1、E2和p7)。更具体而言,针对具有JFH-2.3毒株的结构蛋白质(核心、E1、E2和p7)的HCV颗粒的抗体例子是针对通过转化细胞产生的HCV颗粒的抗体,所述转化细胞通过引入编码下述的HCV复制子RNA获得:作为核心蛋白质范围从序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸位置1到191的氨基酸序列;作为E1蛋白质范围从其氨基酸位置192到384的氨基酸序列;作为E2蛋白质范围从其氨基酸位置385到751的氨基酸序列;和作为p7蛋白质范围从氨基酸位置752到814的氨基酸序列。
抗体可以通过给哺乳动物或鸟类施用本发明的HCV颗粒进行制备。哺乳动物的例子包括小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、马、牛、豚鼠、单峰骆驼、双峰骆驼和美洲驼(lamas)。单峰骆驼、双峰骆驼和美洲驼适合于制备单独由H链组成的抗体。鸟类的例子包括鸡、鹅和鸵鸟。可以从本发明的HCV颗粒已施用于其的动物获得血清,并且随后可以通过众所周知的方法由其获得抗体。
产生单克隆抗体生产细胞的杂交瘤可以应用用本发明的HCV颗粒免疫的动物的细胞进行制备。用于产生杂交瘤的方法是本领域众所周知的,并且可以采用在例如Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,1988)中描述的方法。
单克隆抗体生产细胞可以经由细胞融合或经由其他方法进行制备,所述其他方法涉及引入癌基因的DNA或用EB病毒感染用于B淋巴细胞的永生化。
更具体而言,通过给小鼠施用HCV颗粒用于制备抗HCV单克隆抗体的程序如下所述。一般地,4 – 10周龄的小鼠用HCV颗粒作为抗原进行免疫,但在需要时可以省略纯化步骤。免疫接种一般通过与佐剂一起皮下或腹膜内施用抗原数次来执行。此类佐剂的例子包括但不限于弗氏完全和不完全佐剂、氢氧化铝凝胶、百日咳嗜血杆菌(Hemophilus pertussis)疫苗、Titer Max Gold(Vaxel)和GERBU佐剂(GERBU Biotechnik)。最后的免疫接种通过静脉内或腹膜内施用HCV颗粒执行,而不施用任何佐剂。在用HCV颗粒最后免疫接种后第3到10天时且优选在第4天时,根据已知方法从免疫接种的小鼠中切除脾(Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。
本文采用的方法涉及制备来自脾的脾细胞和脾细胞与骨髓瘤细胞融合,以便制备产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。作为待用于细胞融合的骨髓瘤细胞,可以使用任何骨髓瘤细胞,只要它们可在体外复制。此类骨髓瘤细胞的例子包括小鼠衍生的建立的细胞系,例如8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(BALB/c-衍生的)骨髓瘤细胞系(例如P3-X63Ag8-U1(P3-U1)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、P3-X63-Ag8653(653)、P3-X63-Ag8(X63)和P3/NS1/1-Ag4-1(NS1))。这些细胞系可从RIKEN BioResource Center、ATCC(美国典型培养物保藏中心)或ECACC(欧洲细胞培养物保藏中心European Collection of Cell Cultures)获得。培养和传代培养根据已知方法执行(Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,1988,Selected Methods in Cellular Immunology W.H. Freeman and Company,1980)。
洗涤因而获得的脾细胞和骨髓瘤细胞,并且随后以1(骨髓瘤细胞):1-10(脾细胞)的比率混合,随后为细胞融合反应。作为融合加速剂,可以使用具有平均分子量范围为1000 - 6000的聚乙二醇、聚乙烯醇等。此外,细胞还可以使用商购可得的细胞融合仪器使用电刺激(例如电穿孔)进行融合。
在细胞融合后,使细胞悬浮于培养基中,并且随后洗涤。细胞使用用于培养骨髓瘤细胞的培养基进行洗涤,例如Dulbecco改良Eagle培养基或RPMI-1640培养基。用于培养融合细胞的培养基补充有HAT补充物,以便仅选择性获得靶融合细胞。通过集落形成方法在甲基纤维素培养基中执行有限稀释(在稀释至103 - 107细胞/毫升(ml)后,将细胞以102 - 106细胞/孔种植到96孔细胞培养微量板内)或克隆。
杂交瘤可以通过一般方法进行筛选,并且方法并无特别限制。例如,收集培养上清液的部分,将上清液加入固定的HCV蛋白质中,并且随后加入标记的二次抗体用于温育。结合能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)进行测量,或接受斑点印迹分析或蛋白质印迹分析。选择证实产生与靶抗原反应的抗体的杂交瘤系作为产生单克隆抗体的杂交瘤系。
此外,产生具有抑制HCV感染活性的抗HCV单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用感染性HCV颗粒用于测量抑制HCV感染的活性的方法进行选择,如下述例子中所述。
首先,使感染性HCV颗粒(用于制备HCV颗粒的方法如上所述)和抗体样品混合,并且随后允许在37℃反应1小时。将样品(50 μl)加入在混合前那天以5 × 103细胞/孔在96孔板中培养的Huh7细胞中,并且随后使细胞在37℃培养2.5小时。在培养后,去除样品,用PBS洗涤细胞,加入新鲜培养基,并且随后连续培养细胞。在48小时后,去除培养上清液,将生成物用PBS洗涤1次,加入100 μl ISOGEN(Nippon Gene),并且随后由细胞制备RNA。在RNA定量后,测量HCV基因组RNA的量。通过定量RT-PCR的HCV RNA检测根据Takeuchi等人的方法通过检测HCV RNA的5'非翻译区的RNA来进行(Takeuchi T.等人,Gastroenterology,116:636-642,1999)。
用于评估抑制HCV感染的活性的另一种方法如下。首先,使抗体样品和感染性HCV颗粒混合,并且随后允许在37℃反应1小时。接下来,将50 微升(μl)上述样品加入在混合前那天以1 × 104细胞/孔在96孔板中培养的Huh-7细胞中,并且随后使细胞在37℃培养2.5小时。在培养后,去除样品,用PBS洗涤细胞,加入新鲜培养基,并且随后连续培养细胞。在72小时后,去除培养上清液,并且随后将板置于冰冷的甲醇中,从而将细胞固定。随后,通过风干去除甲醇,并且随后使用包含0.3%Triton(R)-X 100(GE Healthcare)的BlockAce(R)(Dainippon Pharmaceutical)溶解细胞。HCV感染的细胞在荧光显微镜检查(Olympus Corporation,IX-70)下进行计数,其使用克隆2H9抗HCV核心抗体(参见Nat Med.(2005)11:第791-6页.)和山羊抗小鼠IgG-Alexa488(Molecular Probes)。其中HCV感染已被抑制的孔中的样品证实为阳性克隆,从而可以选择靶杂交瘤。如上所述选择的杂交瘤产生的单克隆抗体是本发明的抗体的优选实施方案。
通过此类技术获得的单克隆或多克隆抗体用于HCV的诊断、治疗和预防。如果抗体来自动物,那么可以制备与人抗体形成的嵌合抗体。特别优选的嵌合抗体是通过将小鼠抗体的高变位点的序列移植到人抗体内制备的人源化抗体(人型抗体)等。此类人源化抗体对于HCV的治疗或预防是特别有用的。
应用本发明的HCV颗粒制备的抗体可以与药学上可接受的增溶剂、添加剂、稳定剂、缓冲剂等一起施用。此类抗体可以经由任何途径进行施用。皮下、皮内或静脉内施用是优选的,并且静脉内施用是更优选的。
本发明可以使用在相关领域的一般技术范围内的分子生物学和免疫学技术进行。此类技术在各种文献包括已知实验方案等中充分说明。例如,此类技术在Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3卷,2001),编辑Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual(1988)中详细描述。
(8)使用突变型HCV RNA复制细胞的HCV病毒颗粒的短时间产生
根据本发明的核酸例如突变型HCV复制子RNA或编码该突变型RNA的DNA,和优选地核酸例如衍生自2种或更多种HCV毒株的嵌合突变型HCV复制子RNAs或编码该RNAs的DNAs可以进一步包括引起氨基酸置换的核苷酸置换。
在一个实施方案中,核酸例如突变型HCV复制子RNA(其为HCV J6毒株和HCV JFH-2.1毒株的嵌合体)或编码该RNA的DNA,和优选地J6/JFH-2.1 A2217S RNA(其为具有SEQ ID NO:12中所示的核苷酸序列的嵌合突变型HCV复制子RNA)或编码该RNA的DNA可以包括核苷酸置换,其引起1或2个或更多个氨基酸和特别优选地7个或更多个氨基酸的置换。氨基酸置换可以是但不限于选自下述的至少1个、优选2个或更多个、进一步优选地3或4个或更多个、和特别优选地7或8个氨基酸置换:在位置148上的A→T(核心区),在位置356上的M→V(E1区),在位置405上的M→K、在位置417上的N→T和在位置626上的V→G(E2区),在位置868上的M→T(NS2区),在位置1642上的T→A(NS3区),在位置1687上的I→V(NS4A区),在位置1722上的I→V和在位置1767上的K→R(NS4B区),在位置2204上的S→G和在位置2219上的C→S(NS5A区),在位置2695上的T→I和在位置3016上的L→P(NS5B区),如使用作为参考序列的由J6/JFH-2.1 A2217S RNA编码的前体蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:88)定义的。例如,J6/JFH-2.1 A2217S RNA或编码该RNA的DNA可以具有这样的核苷酸置换,其引起选自下述的例如2个或更多个(优选地3或4个或更多个)、或所有7个氨基酸置换:在位置405上的M→K、在位置417上的N→T、在位置868上的M→T、在位置1642上的T→A、在位置1722上的I→V、在位置2204上的S→G和在位置2695上的T→I。可替代地,J6/JFH-2.1 A2217S RNA或编码该RNA的DNA可以具有这样的核苷酸置换,其引起选自下述的2个或更多个(优选地3或4个或更多个),例如所有8个氨基酸置换:在位置148上的A→T、在位置356上的M→V、在位置626上的V→G、在位置1687上的I→V、在位置1767上的K→R、在位置2219上的C→S、在位置2695上的T→I和在位置3016上的L→P。具有引起此类另外氨基酸置换的核苷酸置换的多突变型复制子(例如为HCV J6毒株与HCV JFH-2.1毒株或JFH-2.3毒株的嵌合体的突变型HCV复制子)的RNA或编码该RNA的DNA已引入其内的细胞,在复制起始后相对立即地起始病毒颗粒的产生,并且随后可以以大量稳定产生病毒颗粒数十天(例如40天)。因此,如果使用此类突变型复制子,那么病毒颗粒可以在复制起始后的短时间段内以大量产生。本发明还提供了此类有利的多突变型HCV复制子RNA或编码该RNA的DNA。本发明还提供了包括编码多突变型HCV复制子RNA的DNA的表达载体和载体已引入其内的重组细胞。本发明还提供了多突变型复制子RNA已引入其内的细胞。作为此类多突变型复制子引入其内的根据本发明的细胞,可以使用例如肝细胞衍生的细胞或淋巴样谱系细胞。肝细胞衍生的细胞的例子包括但不限于Huh7细胞、Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞和293细胞。淋巴样谱系细胞的例子包括但不限于Molt4细胞、HPB-Ma细胞和Daudi细胞。
将多突变型复制子已引入其内的细胞培养相对短的时间段,从而使得病毒颗粒可以以大量有效产生。培养期可以是例如从培养开始起1天或更多天、更优选地2天或更多天、甚至更加优选地3天或更多天、进一步优选地5天或更多天、和特别优选地10天或更多天。培养期可以是从培养开始起60天或更少天、更优选地50天或更少天、甚至更加优选地40天或更少天、进一步优选地30天或更少天、和特别优选地20天或更少天。虽然HCV复制子已引入其内的细胞一般已知在复制起始后从早期到中期其病毒颗粒生产量趋于急剧降低一次,但多突变型HCV复制子已引入其内的根据本发明的细胞是非常有利的,因为它们可以在短时间段内以大量稳定产生病毒颗粒。本发明还提供了使用多突变型复制子RNA或编码该RNA的DNA已引入其内的根据本发明的细胞用于产生HCV病毒颗粒的方法。
(9)序列概括
此外,在本申请中由SEQ ID NOS:指定的序列如下概括。
SEQ ID NO:1:包含在重组质粒pSGR-JFH-2.1中范围从T7启动子到3’UTR的部分的核苷酸序列
SEQ ID NO:2:包含在重组质粒pSGR-JFH-2.3中范围从T7启动子到3’UTR的部分的核苷酸序列
SEQ ID NO:3:HCV JFH-2.1毒株的全长基因组序列(编码全长基因组RNA的核苷酸序列)
SEQ ID NO:4:HCV JFH-2.3毒株的全长基因组序列(编码全长基因组RNA的核苷酸序列)
SEQ ID NO:5:HCV JFH-2.1毒株的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:6:HCV JFH-2.3毒株的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:7:HCV J6CF毒株的结构区(包含核心、E1、E2和p7)的核苷酸序列
SEQ ID NO:8:HCV JFH-1毒株的5’UTR的核苷酸序列
SEQ ID NO:9:HCV JFH-1毒株的NS2区的核苷酸序列
SEQ ID NO:10:HCV JFH-2.1毒株的范围从NS3区到3’UTR(包含NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B区和3’UTR)的序列
SEQ ID NO:11:嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1的核苷酸序列
SEQ ID NO:12:嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S的核苷酸序列
SEQ ID NO:13:突变型HCV基因组序列JFH-2.1 A2218S的核苷酸序列
SEQ ID NO:14:HCV JFH-2.1毒株的前体蛋白质的NS3至 NS5B区的氨基酸序列
SEQ ID NO:15:HCV JFH-2.3毒株的前体蛋白质的NS3至 NS5B区的氨基酸序列
SEQ ID NOS:16-77:引物
SEQ ID NO:78:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(CS)的核苷酸序列
SEQ ID NO:79:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(LP)的核苷酸序列
SEQ ID NO:80:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(TI)的核苷酸序列
SEQ ID NO:81:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(CS/LP)的核苷酸序列
SEQ ID NO:82:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI)的核苷酸序列
SEQ ID NO:83:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(TI/LP)的核苷酸序列
SEQ ID NO:84:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI/LP)的核苷酸序列
SEQ ID NO:85:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)的核苷酸序列
SEQ ID NO:86:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)的核苷酸序列
SEQ ID NO:87:突变型嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)的核苷酸序列
SEQ ID NO:88:由J6/JFH-2.1 A2217S编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:89:由J6/JFH-2.1 A2217S(CS)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:90:由J6/JFH-2.1 A2217S(LP)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:91:由J6/JFH-2.1 A2217S(TI)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:92:由J6/JFH-2.1 A2217S(CS/LP)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:93:由J6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:94:由J6/JFH-2.1 A2217S(TI/LP)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:95:由J6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI/LP)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:96:由J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:97:由J6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
SEQ ID NO:98:由J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)编码的前体蛋白质的氨基酸序列
本文引用的所有出版物、专利和专利申请整体引入本文作为参考。
[实施例]
本发明参考下述实施例进一步举例说明。然而,这些实施例并不限制本发明的技术范围。
(实施例1)JFH-2.1毒株和JFH-2.3毒株衍生的HCV亚基因组复制子RNA表达载体的构建
使用从暴发性肝炎患者中分离的基因型2a的HCV JFH-2.1毒株和JFH-2.3毒株的全长基因组克隆DNA的非结构区,如下分开构建HCV亚基因组复制子RNA表达载体质粒pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3(图1)。图1A显示了HCV JFH-2.1毒株和JFH-2.3毒株的全长基因组结构。
质粒pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3根据Kato等人的文献(Gastroenterology,125:1808-1817,2003)和WO05028652A1中所述的程序进行构建。具体地,首先,提供重组质粒pJFH-2.1和pJFH-2.3,其中将编码HCV JFH-2.1毒株或JFH-2.3毒株的全长基因组的cDNA插入质粒载体pUC19中的T7启动子的控制下。随后,用新霉素抗性基因(neo;也称为新霉素磷酸转移酶基因)和EMCV-IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)置换重组质粒pJFH-2.1和pJFH-2.3中的结构区和非结构区的部分。用限制酶执行切割,以切除插入的片段,并且随后将片段克隆到重组载体内,以分开构建质粒pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3。
图1B和图1C显示了质粒载体pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3的结构。在图1B和图1C中,“T7”指示T7启动子。T7启动子是使用来自每种质粒载体的T7 RNA聚合酶的HCV亚基因组复制子RNA表达所需的序列元件。在质粒载体pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3中,5’UTR、NS3-NS5B编码区和3’UTR是来自HCV JFH-2.1或JFH-2.3毒株的序列。此处,“neo”指示新霉素抗性基因,并且“EMCV IRES”指示脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点。由这些载体表达的HCV亚基因组复制子RNA是由T7启动子下游的区域转录的RNA,如图1D中所示。
在pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3中由T7启动子及其下游连接的HCV亚基因组复制子RNA编码区组成的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NOS:1和2中。
此外,本文使用的HCV JFH-2.1毒株和JFH-2.3毒株的全长基因组序列分别显示于SEQ ID NOS:3和4中。由HCV JFH-2.1和JFH-2.3毒株的全长基因组序列编码的病毒前体蛋白质(多聚蛋白质)的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NOS:5和6中。SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列由SEQ ID NO:3的核苷酸序列的核苷酸位置341 - 9445(包括终止密码子)编码。在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列由SEQ ID NO:4的核苷酸序列的核苷酸位置341 - 9445(包括终止密码子)编码。此外,HCV JFH-2.1毒株和JFH-2.3毒株的前体蛋白质中的NS3至NS5B区的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:14和15中。SEQ ID NO:14的氨基酸序列(NS3-NS5B区)对应于SEQ ID NO:5的氨基酸位置1032 - 3034。此外,SEQ ID NO:15的氨基酸序列(NS3-NS5B区)对应于SEQ ID NO:5的氨基酸位置1032 - 3034。此处,如图1B和图1C中所示,虽然HCV JFH-2.1毒株的前体蛋白质(SEQ ID NO:5)的氨基酸位置1205 - 1206(在NS3区中)的序列是丙氨酸(A)-异亮氨酸(I),但HCV JFH-2.3毒株的前体蛋白质(SEQ ID NO:6)的氨基酸位置1205 - 1206(在NS3区中)的序列是甲硫氨酸(M)-亮氨酸(L)。
(实施例2)HCV亚基因组复制子RNA的制备
对于HCV亚基因组复制子RNA的制备,将如实施例1中所述构建的表达载体pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3各自用限制酶Xba I进行切割,从而制备模板DNA用于PCR。随后,在将绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)20 U(反应溶液总体积:50 μl)加入10 μg - 20 μg模板DNA中用于酶处理后,将这些Xba I切割片段各自在30℃温育30分钟。绿豆核酸酶是催化使双链DNA的单链部分选择性地降解和成为平端的反应的酶。一般而言,当通过直接使用上述Xba I切割片段作为模板用RNA聚合酶进行RNA转录时,其中已在3'末端加入对应于Xba I识别序列的部分的额外CUGA(4个核苷酸)的复制子RNA得以合成。此处,在本实施例中,用绿豆核酸酶处理Xba I切割片段,从而从Xba I切割片段中去除CUGA的4个核苷酸。
接下来,对包含Xba I切割片段用绿豆核酸酶处理的溶液实施根据常规方法的蛋白质去除处理,以纯化CUGA的4个核苷酸已从其中去除的Xba I切割片段用于在接下来的反应中用作模板DNA。根据该模板DNA,使用MEGAscript(Ambion)通过基于T7启动子的转录反应在体外合成RNA。具体地,根据制造商的说明书,制备包含0.5 μg - 1.0 μg模板DNA的20 μl反应溶液,随后在37℃反应3 – 16小时。
在RNA合成完成后,将DNA酶(2U)加入反应溶液中用于在37℃反应15分钟,以去除模板DNA。使用酸性苯酚进一步执行RNA提取,从而获得由pSGR-JFH-2.1和pSGR-JFH-2.3转录的HCV亚基因组复制子RNAs。
(实施例3)HCV亚基因组复制子复制细胞克隆的建立
通过常规方法,使来自实施例2中制备的JFH-2.1毒株或JFH-2.3毒株的各(1 μg)合成HCV亚基因组复制子RNA与从Huh7细胞中提取的总细胞RNA混合,以将RNA总量调整至10 μg。随后,通过电穿孔将混合RNA引入Huh7细胞内。将电穿孔的Huh7细胞种植在培养皿上,并且培养16 – 24小时,并且随后将G418(新霉素)加入培养皿中。随后,继续培养,同时每周替换培养基2次。在种植后培养21天后,用结晶紫染色活细胞。作为结果,如图2中所示,对于来自JFH-2.1或JFH-2.3毒株的复制子RNA已引入其内的细胞,可以证实集落形成。集落形成指示HCV亚基因组复制子RNA已在细胞中复制。
关于对于其证实集落形成的上述复制子RNA转染的细胞,将活细胞的集落在培养21天后由上述培养皿进一步克隆,并且随后继续培养。通过此类集落克隆可以建立多个细胞克隆品系。将所得到的这些细胞克隆指定为JFH-2.1亚基因组复制子细胞和JFH-2.3亚基因组复制子细胞。认为所引入的JFH-2.1毒株衍生的亚基因组复制子RNA或JFH-2.3毒株衍生的亚基因组复制子RNA在如此建立的细胞克隆中自我复制。
(实施例4)在JFH-2.3亚基因组复制子细胞中的复制子RNA的序列分析
对于实施例3中建立的JFH-2.3亚基因组复制子细胞中存在的亚基因组复制子RNA进行序列分析。首先,从建立的JFH-2.3亚基因组复制子细胞的10个克隆中提取总RNA,并且随后通过RT-PCR扩增其中包含的HCV亚基因组复制子RNA。对于扩增,5’-TAATACGACTCACTATAG-3’(SEQ ID NO:16)和5’-GCGGCTCACGGACCTTTCAC-3’(SEQ ID NO:17)用作引物。将所得到的扩增产物克隆到测序克隆载体内,并且随后通过常规方法实施序列分析。
作为结果,在从细胞内获得的亚基因组复制子RNA中,发现引起在NS3区中的4个位置(在位置1205上的M→K、在位置1548上的F→L、在位置1615上的C→W和在位置1652上的T→N)、在NS5A区中的5个位置(在位置2196上的A→T、在位置2218上的A→S、在位置2223上的H→Q、在位置2281上的Q→R和在位置2373上的G→S)、在NS5B区中的1个位置(在位置2519上的K→N)(这在非结构区中)的氨基酸置换的核苷酸置换(图3)。这些氨基酸置换中的大多数存在于NS3区或NS5A区内,如上所述。这些氨基酸置换的位置基于JFH-2.3毒株的前体蛋白质的全长氨基酸序列(SEQ ID NO:6)进行描述。此外,在克隆2的位置2218上和在克隆3的位置2223上的氨基酸置换在ISDR区(干扰素敏感性决定区)内发生(图3)。在JFH-2.1/2.3毒株的前体蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)中,ISDR区对应于位置2214 - 2249。
(实施例5)在JFH-2.3亚基因组复制子细胞中的HCV亚基因组的突变分析
为了检查在实施例4中发现的核苷酸突变是否影响亚基因组复制子RNA在细胞中的复制,将引起在NS3区内的3个位置(在位置1548上的F→L、在位置1615上的C→W和在位置1652上的T→N)和在NS5A区内的3个位置(在位置2218上的A→S、在位置2223上的H→Q和在位置2281上的Q→R)上的氨基酸置换的核苷酸置换各自引入在实施例1中制备的HCV JFH-2.1毒株衍生的亚基因组复制子RNA表达质粒载体内(图4A)。
具体地,首先,将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2毫摩尔(mM)dNTP混合物,以及各1 μl的10微摩尔(μM)引物EcoT7-F(5’-CCGGAATTCTAATACGACTC-3’(SEQ ID NO:18))和1548FL-R(5’-GGGCGTGTTGAGATACGCTCTAAGCCTGAC-3’(SEQ ID NO:19)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号1。接下来,将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5563-R(5’-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3’(SEQ ID NO:20))和1548FL-F(5’-TTAGAGCGTATCTCAACACGCCCGGCCTAC-3’(SEQ ID NO:21)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号2。
使这些PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号1和PCR产物编号2的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物EcoT7-F(5’-CCGGAATTCTAATACGACTC-3’(SEQ ID NO:18))和5563-R(5’-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3’(SEQ ID NO:20)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号3。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pSGR-JFH-2.1和纯化的PCR产物编号3用限制酶EcoR I和EcoT22 I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置1548上的氨基酸置换F→L的核苷酸置换的重组表达载体指定为pSGR-JFH-2.1 F1548L。
将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物EcoT7-F(5’-CCGGAATTCTAATACGACTC-3’(SEQ ID NO:18))和1615CW-R(5’-AGTCGGGCCAGCCACTTCCACATGGCGTCC-3’(SEQ ID NO:22)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号4。接下来,将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5563-R(5’-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3’(SEQ ID NO:20))和1615CW-F(5’-ATGTGGAAGTGGCTGGCCCGACTCAAGCCT-3’(SEQ ID NO:23)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号5。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号4和PCR产物编号5的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物EcoT7-F(5’-CCGGAATTCTAATACGACTC-3’(SEQ ID NO:18))和5563-R(5’-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3’(SEQ ID NO:20)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号6。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pSGR-JFH-2.1和纯化的PCR产物编号6用限制酶EcoR I和EcoT22 I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置1615上的氨基酸置换C→W的核苷酸置换的重组表达载体指定为pSGR-JFH-2.1 C1615W。
将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物EcoT7-F(5’-CCGGAATTCTAATACGACTC-3’(SEQ ID NO:18))和1652TN-R(5’-CTTGCATGCAATTGGCGATGTACTTCGTCC-3’(SEQ ID NO:24)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号7。接下来,将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5563-R(5’-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3’(SEQ ID NO:20))和1652TN-F(5’-GTACATCGCCAATTGCATGCAAGCTGACCT-3’(SEQ ID NO:25)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号8。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号7和PCR产物编号8的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物EcoT7-F(5’-CCGGAATTCTAATACGACTC-3’(SEQ ID NO:18))和5563-R(5’-CTGCAGCAAGCCTTGGATCT-3’(SEQ ID NO:20)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号9。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pSGR-JFH-2.1和纯化的PCR产物编号9用限制酶EcoR I和EcoT22 I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置1652上的氨基酸置换T→N的核苷酸置换的重组表达载体指定为pSGR-JFH-2.1 T1652N。
将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和2196AT-R(5’-TGATCCCCGTGTCAAGCGCCGCGCCGCAGT-3’(SEQ ID NO:27)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号10。接下来,将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28))和2196AT-F(5’-CGCGGCGCTTGACACGGGGATCACCTCCAT-3’(SEQ ID NO:29)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号11。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号10和PCR产物编号11的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号12。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pSGR-JFH-2.1和纯化的PCR产物编号12用限制酶EcoT22 I和Psi I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2196上的氨基酸置换A→T的核苷酸置换的重组表达载体指定为pSGR-JFH-2.1 A2196T。
将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和2218AS-R(5’-GGTGCAGGTGGACCGCAGCGACGGTGCTGA-3’(SEQ ID NO:30)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号13。接下来,将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28))和2218AS-F(5’-CCGTCGCTGCGGTCCACCTGCACCACCCAC-3’(SEQ ID NO:31)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号14。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号13和PCR产物编号14的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号15。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pSGR-JFH-2.1和纯化的PCR产物编号15用限制酶EcoT22 I和Psi I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2218上的氨基酸置换A→S的核苷酸置换的重组表达载体指定为pSGR-JFH-2.1 A2218S。
将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和2223HQ-R(5’-TAGGTGTTGCTTTGGGTGGTGCAGGTGGCC-3’(SEQ ID NO:32)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号16。接下来,将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28))和2223HQ-F(5’-CTGCACCACCCAAAGCAACACCTATGACGT-3’(SEQ ID NO:33)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号17。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号16和PCR产物编号17的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号18。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pSGR-JFH-2.1和纯化的PCR产物编号18用限制酶EcoT22 I和Psi I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2223上的氨基酸置换H→Q的核苷酸置换的重组表达载体指定为pSGR-JFH-2.1 H2223Q。
将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和2281QR-R(5’-TGGGAATTGTTTCTCGGGG-3’(SEQ ID NO:35)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号X。接下来,将pSGR-JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28))和2281QR-F(5’-TACTTGATCCCCGAGAAAC-3’(SEQ ID NO:34)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号Y。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号X和PCR产物编号Y的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号Z。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pSGR-JFH-2.1和纯化的PCR产物编号Z用限制酶EcoT22 I和Psi I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2281上的氨基酸置换Q→R的核苷酸置换的重组表达载体指定为pSGR-JFH-2.1 Q2281R。
将这些质粒用Xba I进行切割,并且随后实施酚氯仿提取和乙醇沉淀。使用因而切割的质粒作为模板和MEGAscript T7试剂盒(Ambion)合成每种HCV RNA。
通过电穿孔将如上所述获得的突变型JFH-2.1衍生的亚基因组复制子RNA(3 μg)引入Huh7细胞内。将电穿孔的Huh7细胞种植在培养皿上,并且培养16 – 24小时,并且随后将G418(新霉素)加入培养皿中。随后,继续培养,同时每周替换培养基2次。在种植后培养21天后,用结晶紫染色活细胞(图4B)。作为结果,虽然在不含突变的JFH-2.1衍生的亚基因组复制子RNA已引入其内的细胞(图4B,上)中无法观察到集落形成,但在引入突变的亚基因组复制子RNA已引入其内的细胞中明确观察到集落形成。特别地,在位置2218上具有A→S突变的亚基因组复制子RNA发挥显著增加的集落形成能力,指示高复制子复制能力的获得。因此,证实如上所述在HCV前体蛋白质中发现的这些氨基酸突变,特别是在位置2218上的A→S氨基酸突变(在下文中也称为A(2218)S),增强HCV亚基因组复制子RNA的复制。
(实施例6)表达载体pJ6/JFH-2.1和pJ6/JFH-2.1 A2218S的构建
为了评估通过使用如上文实施例中获得的基于JFH-2.1毒株衍生的突变型HCV基因组序列的复制子RNA是否可以在培养细胞中产生HCV颗粒,构建表达具有全长HCV基因组序列的复制子RNA(HCV全基因组复制子RNA)的质粒载体。
具体地,参考J6/JFH-1嵌合HCV基因组能够有效产生HCV颗粒的报道(Lindenbach等人,Science(2005)309,第623-626页),使用另一种HCV毒株,JFH-1毒株(基因型2a)衍生的5’UTR序列(SEQ ID NO:8)、J6CF毒株(基因型2a)衍生的结构区的序列(包含核心、E1、E2和p7区的序列;SEQ ID NO:7)、JFH-1毒株衍生的NS2区(SEQ ID NO:9)、和范围为NS3区到3’UTR的JFH-2.1毒株衍生的序列(包含NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B区和3’UTR;SEQ ID NO:10)以这个次序进行连接,以形成嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1(SEQ ID NO:11)(图5B)。随后,将嵌合HCV基因组序列J6/JFH-2.1掺入质粒pUC19中的T7启动子的控制下,从而构建重组表达载体pJ6/JFH-2.1,如下所述。通过将在实施例5中证实增加复制子复制效率的NS5A区内的A(2218)S突变引入到J6/JFH-2.1内,制备表达突变型复制子J6/JFH-2.1 A2217S的载体pJ6/JFH-2.1 A2217S(图5B)。J6/JFH-2.1 A2217S的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:12中。在SEQ ID NO:12的序列中,在J6/JFH-2.1(SEQ ID NO:11)的核苷酸位置6989上的G变成T,从而引入在位置2217上从A到S的氨基酸突变。通过根据先前报道的程序执行构建(Wakita,T等人,Nat Med.,11:791-796,2005)。由J6/JFH-2.1 A2217S的全长基因组序列编码的前体蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:88中。在SEQ ID NO:5中所示的JFH-2.1全长氨基酸序列中在位置2218上的氨基酸是丙氨酸(A),并且定位于这个位置上的丙氨酸与嵌合HCV J6/JFH2.1的全长氨基酸序列中在位置2217上的丙氨酸比对。即,在由J6/JFH-2.1 A2217S的全长基因组核苷酸序列(SEQ ID NO:12)编码的蛋白质中,在位置2217上的丙氨酸由丝氨酸(S)置换。在这种情况下,这个置换也对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的氨基酸置换A(2218)S。仅因为方便的原因,突变型复制子的名称已从先前名称J6/JFH-2.1 A2218S变成J6/JFH-2.1 A2117S,并且因此它们指的是相同复制子。编码突变型复制子的表达载体的名称也类似地变成pJ6/JFH-2.1 A2117S。
具体地,将pJ6/JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和2218AS-R(5’-GGTGCAGGTGGACCGCAGCGACGGTGCTGA-3’(SEQ ID NO:30)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号19。接下来,将pJ6/JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28))和2218AS-F(5’-CCGTCGCTGCGGTCCACCTGCACCACCCAC-3’(SEQ ID NO:31)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号20。
使这些PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号19和PCR产物编号20的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物5162-F(5’-TGGGACGCCATGTGGAAGTG-3’(SEQ ID NO:26))和7827-R(5’-AAAGTTACCTTTTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:28)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号21。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pJ6/JFH-2.1和纯化的PCR产物编号21用限制酶EcoT22 I和Psi I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2218上的氨基酸置换A→S的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S。
(实施例7)J6/JFH-2.1和J6/JFH-2.1 A2217S RNA已引入其内的细胞中的HCV复制子复制能力的评估
使用实施例6中构建的表达载体pJ6/JFH-2.1和pJ6/JFH-2.1 A2217S,通过类似于实施例2中那些的程序制备HCV复制子RNA(嵌合HCV全基因组复制子RNA)。将因而获得的HCV复制子RNAs,J6/JFH-2.1 HCV RNA和J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA各自通过电穿孔引入Huh7细胞内。在引入后,在电穿孔后4、12、24、48、72和96小时时收集细胞,并且随后使用HCV抗原ELISA测试试剂盒(Ortho Clinical Diagnostics)定量细胞中包含的HCV核心蛋白质,并且从而评估细胞中的HCV复制子复制能力(图6)。
作为结果,发现J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA已引入其内的细胞中的核心蛋白质的量在引入后48小时时和其后增加,指示细胞中的HCV复制子的有效复制。相比之下,即使在引入后96小时时也未发现J6/JFH-2.1 HCV RNA已引入其内的细胞中的核心蛋白质的量增加。上述结果证实在NS5A区中在位置2218上的A→S突变对于细胞中嵌合HCV复制子RNA的有效复制也是重要的。此处,“位置2218”意指如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列定义的突变位置,并且突变的嵌合HCV的全长氨基酸序列中的相应突变是在位置2217上的A→S突变。
(实施例8)J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA已引入其内的细胞中的HCV颗粒生产能力的评估
在培养基(Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)-10%胎牛血清)中以类似于实施例7中那种的方式传代培养J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA已引入其内的Huh7细胞时,使用HCV抗原ELISA测试试剂盒(Ortho Clinical Diagnostics)随着时间过去定量培养上清液中包含的HCV核心蛋白质,以证实HCV颗粒的产生(图7)。
作为结果,虽然在HCV复制子RNA引入后60天在培养上清液中几乎未证实核心蛋白质,但发现核心蛋白质的量在引入后60天 – 80天时增加。在80天后,核心蛋白质以几乎恒定的水平检测到。这些结果证实当细胞在向其中引入RNA后传代培养时,J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA使得产生能够细胞外释放的病毒颗粒。
(实施例9)J6/JFH-2.1 A2217S HCV颗粒的感染性的评估
检查J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA衍生的HCV颗粒(在下文中,称为J6/JFH-2.1 A2217S HCV颗粒)是否具有感染性,所述HCV颗粒的产生在实施例8中加以证实。首先,类似于上述实施例,通过电穿孔将J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA引入Huh7细胞内,并且随后执行传代培养。将在引入细胞内后第88天时的培养上清液加入首次用于实验的(naive)Huh7细胞内。在72小时后,通过病灶(focus)形成测定来测定HCV感染细胞的数目,并且计算感染效价(图8)。
作为结果,发现感染效价是5.21 × 103 集落形成单位(ffu)/ml。将该值除以培养上清液中的HCV核心的量(3.96 × 103 飞摩尔/升(fmol/L))。因此,感染效价/单位HCV蛋白质计算为1.32(感染效价/核心值)。
结果证实经由J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA引入细胞内产生的HCV颗粒具有感染性。
(实施例10)JFH-2.1和JFH-2.1 A2218S HCV全基因组复制子RNA表达载体的构建
构建表达具有JFH-2.1毒株的全长基因组序列的复制子RNA(HCV全基因组复制子RNA(图9A))的质粒载体pJFH-2.1,所述复制子RNA包括5’UTR区、结构区(核心、E1、E2和p7区)、非结构区(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B区)和3’UTR区,以便评估使用JFH-2.1毒株的HCV基因组RNA在培养细胞中是否可以产生HCV颗粒,其基于证实嵌合HCV全基因组复制子J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA使得能够产生感染性HCV颗粒的实施例6-9的结果进行。
此外,将在实施例7-9中证实对于J6/JFH-2.1 A2217S嵌合HCV复制子RNA的细胞内复制或由其产生感染性HCV颗粒重要的在NS5A区中在位置2218上的A→S突变以类似于实施例6中那种的方式引入JFH-2.1基因组序列内。构建表达突变型全基因组复制子JFH-2.1 A2218S的载体pJFH-2.1 A2218S(图9B)。通过根据先前报道的程序执行构建(Wakita,T等人,Nat Med.,(2005))。JFH-2.1 A2218S的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:13中。在SEQ ID NO:13的序列中,A2218S氨基酸突变已通过在JFH-2.1(SEQ ID NO:3)的核苷酸位置6992上的G至T的改变引入。
(实施例11)JFH-2.1 A2218S HCV RNA已引入其内的细胞中的HCV颗粒生产能力的评估
使用实施例10中构建的表达载体pJFH-2.1 A2218S,通过类似于实施例2中那些的技术制备HCV复制子RNA(突变型HCV全基因组复制子RNA)。将因而获得的HCV复制子RNA,JFH-2.1 A2218S HCV RNA,通过电穿孔引入Huh7细胞内。其后,在培养基(含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM))中传代培养细胞时,使用HCV抗原ELISA测试试剂盒(Ortho Clinical Diagnostics)随着时间过去定量培养上清液中包含的HCV核心蛋白质,以证实HCV颗粒的产生(图10)。
作为结果,在HCV复制子RNA引入后40天在培养上清液中几乎未证实核心蛋白质。然而,发现核心蛋白质的量在引入后40 – 60天后增加。在60天时和其后,核心蛋白质以几乎恒定的水平检测到。这些结果证实在RNA引入细胞内后传代培养细胞时,JFH-2.1 A2218S HCV RNA使得产生能够细胞外释放的病毒颗粒。
(实施例12)JFH-2.1 A2218S HCV颗粒的感染性的评估
检查JFH-2.1 A2218S HCV RNA衍生的HCV颗粒(在下文中,称为JFH-2.1 A2218S HCV颗粒)是否具有感染性,所述HCV颗粒的产生在实施例11中加以证实。首先,类似于上述实施例,通过电穿孔将JFH-2.1 A2218S HCV RNA引入Huh7细胞内,并且随后执行传代培养。将在引入细胞内后第63天时的培养上清液加入首次用于实验的Huh7细胞内。在72小时后,通过病灶形成方法来测定HCV感染细胞的数目,并且计算感染效价(图11)。
作为结果,感染效价是4.32 × 104 ffu/ml。将该值除以培养上清液中的HCV核心的量(1.17 × 104 fmol/L)。因此,感染效价/单位HCV蛋白质计算为3.69(感染效价/核心值)。结果证实通过JFH-2.1 A2218S HCV RNA引入细胞内产生的HCV颗粒具有感染性,并且发现感染效价/单位蛋白质高于J6/JFH-2.1 A2217S HCV颗粒。
(实施例13)关于得自J6/JFH-2.1 A2217S RNA复制细胞的传代培养的核苷酸序列的突变分析
以0.03的moi(感染复数)用Huh-7细胞(J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA已引入其内的Huh-7细胞,其包含在实施例8中获得的具有高感染效价的J6/JFH-2.1 A2217S HCV颗粒)的培养上清液感染新鲜的未感染的Huh-7细胞。对受感染细胞进行传代培养,直至培养上清液中核心蛋白质的量和感染效价分别达到1,000 fmol/L和1,000 ffu/ml或更多。用包含病毒的培养上清液的感染并使受感染细胞的传代培养重复3 – 4次,并且随后对于培养上清液中包含的HCV RNA进行序列分析。采用2个感染系,并且将其分别指定为4A和4B。首先,从感染系4A和4B的包含J6/JFH-2.1 A2217S HCV颗粒的Huh-7细胞的每种培养上清液中提取RNA,并且随后通过RT-PCR扩增其中包含的HCV RNA。将随机引物(6聚体(6 mer),Takara Bio Inc.)用于扩增。将扩增产物克隆到测序克隆载体内,并且随后通过常规方法实施序列分析。
作为结果,在感染系4A的情况下,发现引起在7个位置上的氨基酸置换的核苷酸置换:在处于结构区中的E2区中的2个位置(在位置405上的M→K和在位置417上的N→T);以及在处于非结构区中的NS2区中的1个位置(在位置868上的M→T)、NS3区中的1个位置(在位置1642上的T→A)、NS4B区中的1个位置(在位置1722上的I→V)、NS5A区中的1个位置(在位置2204上的S→G)、和NS5B区中的1个位置(在位置2695上的T→I)。此外,在感染系4B的情况下,发现引起在8个位置上的氨基酸置换的核苷酸置换:在处于结构区中的核心区中的1个位置(在位置148上的A→T)、E1区中的1个位置(在位置356上的M→V)、E2区中的1个位置(在位置626上的V→G);以及在处于非结构区中的NS4A区中的1个位置(在位置1687上的I→V)、NS4B区中的1个位置(在位置1767上的K→R)、NS5A区中的1个位置(在位置2219上的C→S)、和NS5B区中的2个位置(在位置2695上的T→I和在位置3016上的L→P)。此外,在本实施例和下述实施例中所示的氨基酸突变的位置指示在相关突变型氨基酸序列中的位置。
(实施例14)J6/JFH-2.1 A2217S衍生的突变型HCV全基因组RNA表达载体的构建
通过将实施例13中获得的突变的各种组合引入质粒pJ6/JFH-2.1 A2217S内来制备质粒,以便证实在实施例13中发现的突变是否是适应性突变。具体地,将pJ6/JFH-2.1 A2217S用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物2219CS-S(5’-GCGTTCCACCAGTGCCACCCACGGCACGGC-3’(SEQ ID NO:36))和8035R-2a(5’-CCACACGGACTTGATGTGGT-3’(SEQ ID NO:37)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号22。接下来,将pJ6/JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物6586S-IH(5’-CAAGACCGCCATCTGGAGGGTGGCGGCCTC-3’(SEQ ID NO:38))和2219CS-R(5’-GGTGGCACTGGTGGAACGCAGCGACGGGGC-3’(SEQ ID NO:39)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行25个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号23。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号22和PCR产物编号23的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物6586S-IH(5’-CAAGACCGCCATCTGGAGGGTGGCGGCCTC-3’(SEQ ID NO:38))和8035R-2a(5’-CCACACGGACTTGATGTGGT-3’(SEQ ID NO:37)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行25个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号24。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pJ6/JFH-2.1 A2217S和纯化的PCR产物编号24用限制酶Blp I和Psi I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)和在位置2219上的C→S的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS)。克隆到pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS)内的突变型HCV全基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(CS)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:78中,并且由该核苷酸序列编码的HCV病毒前体蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:89中。
接下来,将pJ6/JFH-2.1 A2217S用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物9124S-IH(5’-TTCAGCCCTCAGAAAACTTGGGGCGCCACC-3’(SEQ ID NO:40))和3016LR-R(5’-GGAGTAGGCTAgGGAGTAACAAGCGGGGTC-3’(SEQ ID NO:41)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行25个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号25。接下来,将pJ6/JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物3016LP-S(5’-TTGTTACTCCCTAGCCTACTCCTACTCTTT-3’(SEQ ID NO:42))和M13R(5’-AACAGCTATGACCATG-3’(SEQ ID NO:43)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行25个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号26。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号25和PCR产物编号26的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物9124S-IH(5’-TTCAGCCCTCAGAAAACTTGGGGCGCCACC-3’(SEQ ID NO:40))和M13R(5’-AACAGCTATGACCATG-3’(SEQ ID NO:43)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行25个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号27。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pJ6/JFH-2.1 A2217S和纯化的PCR产物编号27用限制酶EcoR V和Xba I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)和在位置3016上的L→P的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(LP)。克隆到pJ6/JFH-2.1 A2217S(LP)内的突变型HCV全基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(LP)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:79中,并且由该核苷酸序列编码的HCV病毒前体蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:90中。
接下来,将通过逆转录由实施例13中获得的感染系4B的HCV RNA制备的cDNA用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物7993S-IH(5’-CAGCTTGTCCGGGAGGGC-3’(SEQ ID NO:44))和8892R-2a(5’-AGCCATGAATTGATAGGGGA-3’(SEQ ID NO:45)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号28。
pJ6/JFH-2.1 A2217S和纯化的PCR产物编号28用限制酶Bsu36 I和Srf I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用用作参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)和在位置2695上的T→I的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI)。克隆到pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI)内的突变型HCV全基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(TI)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:80中,并且由该核苷酸序列编码的HCV病毒前体蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:91中。
接下来,将pJ6/JFH-2.1 A2217S用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物450S-IH(5’-TGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGC-3’(SEQ ID NO:46))和148AT-S(5’-GAGAGCTCTGGtGACGCCGCCGAGCGGGGC-3’(SEQ ID NO:47)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行25个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号29。接下来,将pJ6/JFH-2.1用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物148AT-R(5’-GGCGGCGTCaCCAGAGCTCTCGCGCATGGC-3’(SEQ ID NO:48))和1440R-IH(5’-GCTCCCTGCATAGAGAAGTA-3’(SEQ ID NO:49)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、1分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号30。
使PCR产物各自纯化且溶解于15 μl H2O中。将PCR产物编号29和PCR产物编号30的DNAs以各1 μl的量混合。将生成物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物450S-IH(5’-TGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGC-3’(SEQ ID NO:46))和1440R-IH(5’-GCTCCCTGCATAGAGAAGTA-3’(SEQ ID NO:49)),并且加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行25个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、2分钟组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号31。使PCR产物纯化且随后溶解于30 μl H2O中。
pJ6/JFH-2.1 A2217S和纯化的PCR产物编号31用限制酶Cla I和Bsiw I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)和在位置148上的A→T的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT)。
类似地,构建重组表达载体pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI/LP)和pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)。此外,通过将上述氨基酸突变以各种组合引入J6/JFH-2.1 A2217S的全长氨基酸序列内构建这些载体。克隆到pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI/LP)和pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)载体内的突变型HCV全基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(CS/LP)、J6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI)、J6/JFH-2.1 A2217S(TI/LP)、J6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI/LP)和J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NOS:81、82、83、84和85中。由该核苷酸序列编码的HCV病毒前体蛋白质的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:92、93、94、95和96中。
如下制备感染系4A的所有突变已引入其内的病毒复制子。首先,将通过逆转录由实施例13中获得的感染系4A的HCV RNA制备的cDNA用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物2099S-2a(5’-ACGGACTGTTTTAGGAAGCA-3’(SEQ ID NO:50))和3509R-2a(5’-TCTTGTCGCGCCCCGTCA-3’(SEQ ID NO:51)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行35个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、20秒组成。将所得到的PCR产物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物2285S-2a(5’-AATTTCACTCGTGGGGATCG-3’(SEQ ID NO:52))和3280R-IH(5’-TGACCTTCTTCTCCATCGGACTG-3’(SEQ ID NO:53)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、20秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号32。pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI)和纯化的PCR产物编号32用限制酶Kpn I和Af III进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)、在位置2695上的T→I和在位置868上的M→T的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT)。
接下来,将通过逆转录由实施例13中获得的感染系4A的HCV RNA制备的包含引起在位置405上的M→K突变和在位置417上的N→T突变的核苷酸置换的cDNA用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物2099S-2a(5’-ACGGACTGTTTTAGGAAGCA-3’(SEQ ID NO:50))和3509R-2a(5’-TCTTGTCGCGCCCCGTCA-3’(SEQ ID NO:51)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、20秒组成。将PCR产物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物2285S-2a(5’-AATTTCACTCGTGGGGATCG-3’(SEQ ID NO:52))和3280R-IH(5’-TGACCTTCTTCTCCATCGGACTG-3’(SEQ ID NO:53)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行40个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、20秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号33。pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT)和纯化的PCR产物编号33用限制酶Kpn I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)、在位置2695上的T→I、在位置868上的M→T、在位置405上的M→K和在位置417上的N→T的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT)。
接下来,将通过逆转录由实施例13中获得的感染系4A的HCV RNA制备的包含引起在位置1722上的I→V突变的核苷酸置换的cDNA用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物4547S-2a(5’-AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3’(SEQ ID NO:54))和7677R-IH(5’-TATGACATGGAGCAGCACAC-3’(SEQ ID NO:55)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、3分钟组成。将PCR产物用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物4607S-IH(5’-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3’(SEQ ID NO:56))和7214R-NS(5’-CAGGCCGCGCCCAGGCCGGCAAGGCTGGTG-3’(SEQ ID NO:57)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、2分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号34。pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT)和纯化的PCR产物编号34用限制酶Xho I和Blp I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)、在位置2695上的T→I、在位置868上的M→T、在位置405上的M→K、在位置417上的N→T和在位置1722上的I→V的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV)。
接下来,将通过逆转录由实施例13中获得的感染系4A的HCV RNA制备的包含引起在位置2204上的S→G突变的核苷酸置换的cDNA用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物6499S-NS(5’-TAAGACCTGCATGAACACCTGGCAGGGGAC-3’(SEQ ID NO:58))和3’X-8077R-IH(5’-ACATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGG-3’(SEQ ID NO:59)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、3分钟组成。将PCR产物用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物6698S-NS(5’-ATACCATCTCCAGAGTTCTTTTCCTGGGTA-3’(SEQ ID NO:60))和3’X-75R-2a(5’-TACGGCACCTCTCTGCAGTCA-3’(SEQ ID NO:61)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、2分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号35。pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV)和纯化的PCR产物编号35用限制酶Blp I和Psi l进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)、在位置2695上的T→I、在位置868上的M→T、在位置405上的M→K、在位置417上的N→T、在位置1722上的I→V和在位置2204上的S→G的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG)。
接下来,将通过逆转录由实施例13中获得的感染系4A的HCV RNA制备的包含引起在位置1642上的T→A突变的核苷酸置换的cDNA用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物4547S-2a(5’-AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3’(SEQ ID NO:62))和7677R-IH(5’-TATGACATGGAGCAGCACAC-3’(SEQ ID NO:63)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、3分钟组成。将PCR产物用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物4607S-IH(5’-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3’(SEQ ID NO:64))和7214R-NS(5’-CAGGCCGCGCCCAGGCCGGCAAGGCTGGTG-3’(SEQ ID NO:65)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、2分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号36。pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG)和纯化的PCR产物编号36用限制酶Xho I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)、在位置2695上的T→I、在位置868上的M→T、在位置405上的M→K、在位置417上的N→T、在位置1722上的I→V、在位置2204上的S→G和在位置1642上的T→A的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)。克隆到pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)内的突变型HCV全基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:86中,并且由该核苷酸序列编码的HCV病毒前体蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:97中。因此,在感染系4A中发现的所有氨基酸突变都引入由J6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)编码的突变型前体蛋白质内。
如下制备感染系4B的所有突变已引入其内的病毒。首先,将通过逆转录由实施例13中获得的感染系4B的HCV RNA制备的包含在位置356上的M→V和在位置626上的V→G突变的cDNA用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物44S-IH(5’-CTGTGAGGAACTACTGTCTT-3’(SEQ ID NO:66))和3189R-IH(5’-CCAGTCCACCTGCCAAGG-3’(SEQ ID NO:67)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、3分钟组成。将PCR产物用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物63S-Con.1(5’-TTCACGCAGAAAGCGTCTAG-3’(SEQ ID NO:68))和2445R-2a(5’-TCCACGATGTTTTGGTGGAG-3’(SEQ ID NO:69)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、2分30秒组成。将所得到的PCR产物指定为PCR产物编号37。pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)和纯化的PCR产物编号37用限制酶Bsiw I和Sph I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)、在位置148上的A→T、在位置2219上的C→S、在位置2695上的T→I、在位置3016上的L→P、在位置356上的M→V和在位置626上的V→G)的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG)。
接下来,将通过逆转录由实施例13中获得的感染系4B的HCV RNA制备的包含引起在位置1687上的I→V突变和在位置1767上的K→R突变的核苷酸置换的cDNA用作模板,加入Phusion DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物4593S-2a(5’-CTGTGGCATACTACAGAGG-3’(SEQ ID NO:70))和5970R-2a(5’-TTCTCGCCAGACATGATCTT-3’(SEQ ID NO:71)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行35个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、20秒组成。将PCR产物用作模板,加入Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(FINNZYMES)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物4607S-IH(5’-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3’(SEQ ID NO:72))和5970R-2a(5’-TTCTCGCCAGACATGATCTT-3’(SEQ ID NO:73)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl Phusion DNA Polymerase(FINNZYMES),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、10秒,55℃、15秒和72℃、20秒组成。将所得到的PCR产物插入pGEM-T Easy载体内。随后将质粒用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物4547S-2a(5’-AAGTGTGACGAGCTCGCGG-3’(SEQ ID NO:74))和7677R-IH(5’-TATGACATGGAGCAGCACAC-3’(SEQ ID NO:75)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由98℃、30秒,60℃、30秒和72℃、3分钟组成。将PCR产物用作模板,加入LA-Taq DNA Polymerase试剂盒(Takara Bio Inc.)附带的10 μl的10 ×缓冲液和4 μl的2 mM dNTP混合物,以及各1 μl的10 μM引物4607S-IH(5’-AGAGGGTTGGACGTCTCCATAATACCA-3’(SEQ ID NO:76))和7214R-NS(5’-CAGGCCGCGCCCAGGCCGGCAAGGCTGGTG-3’(SEQ ID NO:77)),并且随后加入去离子水以使总量最终达到49.5 μl。其后,向其中加入0.5 μl LA-Taq DNA Polymerase(Takara Bio Inc.),并且执行PCR。PCR执行30个循环,其中每个循环由95℃、30秒,60℃、30秒和72℃、2分30秒组成。将因而获得的PCR产物指定为PCR产物编号38。pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG)和纯化的PCR产物编号39用限制酶Xho I进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳使每种HCV cDNA片段分级分离,并且随后纯化。使这2种DNA片段与Ligation Mix(Takara Bio Inc.)混合,并且使2种DNA片段彼此连接。将因而获得的具有引起在位置2217上的氨基酸置换A→S(对应于如使用作为参考序列的SEQ ID NO:6的氨基酸序列定义的在位置2218上的氨基酸置换A→S)、在位置148上的A→T、在位置2219上的C→S、在位置2695上的T→I、在位置3016上的L→P、在位置356上的M→V、在位置626上的V→G、在位置329上的T→S、在位置1687上的I→V和在位置1767上的K→R的核苷酸置换的重组表达载体指定为pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)。克隆到pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)内的突变型HCV全基因组序列J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:87中,并且由该核苷酸序列编码的HCV病毒前体蛋白质的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:98中。因此,在感染系4B中发现的所有氨基酸突变都引入由J6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR)编码的突变型前体蛋白质内。
(实施例15)关于得自JFH-2.1 A2218S RNA复制细胞的传代培养的核苷酸序列的突变分析
以0.03的moi(感染复数)用Huh-7细胞(JFH-2.1 A2218S HCV RNA已引入其内的Huh-7细胞,其包含在实施例8中获得的具有高感染效价的JFH-2.1 A2218S HCV颗粒)的培养上清液感染新鲜的未感染的Huh-7细胞。对受感染细胞进行传代培养,直至培养上清液中核心蛋白质的量和感染效价分别达到1,000 fmol/L和1,000 ffu/ml或更多。用包含病毒的培养上清液的感染并使受感染细胞的传代培养重复3 – 4次,并且随后对于培养上清液中包含的HCV RNA进行序列分析。采用2个感染系,并且将其分别指定为D3和D4。首先,从感染系D3和D4的包含JFH-2.1 A2218S HCV颗粒的Huh-7细胞的每种培养上清液中提取RNA,并且随后通过RT-PCR扩增其中包含的HCV RNA。将随机引物(6聚体,Takara Bio Inc.)用于扩增。将扩增产物克隆到测序克隆载体内,并且随后通过常规方法实施序列分析。
作为结果,在感染系D3的情况下,发现引起在7个位置上的氨基酸置换的核苷酸置换:在处于结构区中的E2区中的1个位置(在位置414上的I→T);以及在处于非结构区中的NS3区中的2个位置(在位置1510上的E→Q和在位置1617上的R→Q)、NS5A区中的3个位置(在位置2006上的K→Q、在位置2233上的A→V和在位置2234上的N→S);和NS5B区中的1个位置(在位置2695上的T→I)。此外,在感染系D4的情况下,发现引起在9个位置上的氨基酸置换的核苷酸置换:在处于结构区中的E2区中的1个位置(在位置387上的V→G);以及在处于非结构区中的NS2区中的1个位置(在位置828上的V→A)、NS3区中的2个位置(在位置1225上的R→Q和在位置1283上的R→G)、NS4B区中的1个位置(在位置1883上的V→A)、NS5A区中的3个位置(在位置2206上的S→A、在位置2279上的K→N和在位置2441上的C→R)、和NS5B区中的2个位置(在位置2695上的T→I)。
(实施例16)突变型J6/JFH-2.1 A2217S HCV RNA已引入其内的细胞的HCV颗粒生产能力的评估
使用实施例14中构建的表达载体pJ6/JFH-2.1 A2217S、pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(CS/TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP)、pJ6/JFH-2.1 A2217S(TI/MT/MK/NT/IV/SG/TA)和pJ6/JFH-2.1 A2217S(AT/CS/TI/LP/MV/VG/IV/KR),通过类似于实施例2中那些的技术制备HCV全基因组RNA(突变型HCV全基因组RNA)。将因而获得的HCV全基因组RNAs各自通过电穿孔引入Huh7细胞内。其后,在培养基(含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM))中传代培养细胞时,使用HCV抗原ELISA测试试剂盒(Ortho Clinical Diagnostics)随着时间过去定量培养上清液中包含的HCV核心蛋白质,以证实HCV颗粒的产生(图12)。
作为结果,证实当将在7或8个位置上的上述氨基酸突变独立地引入J6/JFH-2.1 A2217S基因组序列内时,RNA在RNA引入其内的细胞中有效自我复制,并且病毒在复制起始后的短时间段内分泌到培养上清液内。
产业应用性
使用从暴发性丙型肝炎患者中分离的基因型2a的HCV基因组制备的根据本发明的HCV复制子、HCV复制子引入其内的复制子复制细胞、使用HCV复制子用于在培养细胞系统中产生感染性HCV颗粒的方法、和通过该方法获得的感染性HCV颗粒作为用于评估抑制HCV复制和HCV感染的分子的系统是有用的。本发明可以提供具有显著高于迄今获得的HCV亚基因组复制子RNA的自我复制能力的HCV亚基因组复制子RNA和全基因组复制子RNA。这些复制子RNAs可以特别方便地用于筛选抑制HCV复制的抗HCV药剂或用于阐明HCV复制机制的研究。此外,本发明的HCV全基因组复制子RNA具有高于迄今获得的HCV全基因组复制子RNA的HCV颗粒生产能力,从而使得它可以用于构建用于以高水平有效产生HCV颗粒的系统,具有感染性的HCV颗粒可以由该系统在体外大量制备。此外,根据本发明的HCV复制子和感染性HCV颗粒对于用作HCV疫苗或抗原用于制备抗HCV抗体也是有用的。使用根据本发明的多突变型复制子用于产生HCV病毒颗粒的方法对于在短时间段内在体外产生HCV病毒颗粒也是非常有用的。
序列表单独文本(free text)
SEQ ID NOS:1、2、11-13和16-87是合成DNAs。
SEQ ID NOS:88-98是合成多肽。
Claims (9)
1.核酸,其包括在SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列中引起氨基酸置换的核苷酸置换,并且其中所述氨基酸置换是:
i)M405K、N417T、M868T、T1462A、I1722V、S2204G和T2695I,如使用作为参考序列的SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列定义的;或
ii)A148T、M356V、V626G、I1687V、K1767R、C2219S、T2695I和L3016P,如使用作为参考序列的SEQ ID NO:88中所示的氨基酸序列定义的。
2.根据权利要求1的核酸,其编码SEQ ID NO:97或98中所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的核酸,其包含SEQ ID NO:86或87中所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项的核酸,其为全基因组复制子RNA。
5.表达载体,其中根据权利要求1-3中任一项的核酸在启动子下游可操作地连接。
6.转化细胞,其通过向细胞中引入根据权利要求4的全基因组复制子RNA获得。
7.转化细胞,其通过向细胞中引入根据权利要求5的表达载体获得。
8.丙型肝炎病毒颗粒,其通过培养根据权利要求6的转化细胞获得。
9.丙型肝炎病毒颗粒,其通过培养根据权利要求7的转化细胞获得。
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