JP4608483B2 - ポリヌクレオチドの複合的分析のための組成物および方法 - Google Patents

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２００３年２月１８日出願の“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”という名称の米国特許出願第６０／４４８，４４０号、および２００３年３月１０日出願の“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”」という名称の米国特許出願第６０／４５３，７９１号（これらの開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）に対して、米国特許法第１１９条第ｅ項による利益を主張するものである。

（分野）
本開示は、特定の相対的熱融解温度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有するプローブ対を使用して、ポリヌクレオチドの複合的解析を行なうための組成物および方法に関する。

（背景）
核酸のハイブリダイゼーションは、分子生物学において基本的な現象である。配列特異的なハイブリダイゼーションを利用するプローブベースのアッセイが、核酸を検出、解析、および定量するための多くの適用において利用されている。例えば、プローブベースのハイブリダイゼーションは、遺伝子の発現レベルを定量したり、１塩基多型（ＳＮＰ）および他の遺伝子変異を検出したり、また、遺伝子をタイプ分け、マッピングおよび／またはフィンガープリントするために広く用いられている数多くのアッセイ法の中核をなしている。

このようなアッセイ法は、しばしば、さまざまな識別可能な標識をもつプローブを用いて複合的な様式で行なわれ、１回のアッセイ反応で多様な結果を得ることを可能にする。例えば、固有のスペクトル分解可能な波長の光を放出することができるフルオロフォアの
ように、それぞれが異なる識別可能な標識を有する複数の異なった配列特異的プローブを用いて、１回のアッセイで、目的の２種類以上の異なった配列の有無について、ポリヌクレオチド試料をアッセイすることができる。このようなアッセイでは、プローブが、それぞれに対する相補配列が存在するならば、それらとハイブリダイズする条件下で、ポリヌクレオチド試料を複数の標識された配列特異的プローブと接触させる。ハイブリダイズしなかったプローブを除去するために洗浄した後、その存在が目的の特定の配列の存在と相関している特定のスペクトルのシグナルまたは発色の有無を調べるためにアッセイ反応を評価する。

このような複合的アッセイ法は強力であるが、１回のアッセイ反応で評価できる異なった配列の数は、例えば、利用できる異なった識別可能な標識の数、および異なった識別可能な標識が発生させるシグナルを検出できる検出装置を使えるかなど、いくつかの要素によって制約される。このような複合的アッセイ法の複雑さの程度は、汎用または識別不能な標識のいずれかを有する異なった配列特異的プローブを含むハイブリダイゼーション事象を区別する能力によって大いに増加する。したがって、異なった識別可能な標識やそのような標識を検出できる装置が利用可能かどうかに制限されないポリヌクレオチドの複合的アッセイが求められている。

（概要）
本開示は、ポリヌクレオチド試料の複合的解析のための組成物および方法を提供する。本明細書に記載された組成物および方法は、異なる識別可能な標識を使用せずに、１回のアッセイで１つまたは複数の標的配列の検出を可能にする示差的な相対的熱融解温度（Ｔ_ｍ）を有する配列特異的シグナル−クエンチャーのプローブ対を使用する。実際、特定の相対的Ｔ_ｍを有するクエンチャープローブを使用することによって、シグナルプローブがすべて同じ標識を有している場合でも、複合的な様式で、複数の異なった標的配列を評価することができる。異なった識別可能な標識を有するシグナルプローブを使用することで、１回の複合的アッセイで解析または検出できる標的配列の種類を増やせる。このようにして、本明細書に記載された組成物および方法は、Ｔ_ｍまたはＴ_ｍおよび標識シグナルを併用することによってポリヌクレオチド試料の複合的解析を可能にする。

いくつかの実施態様において、本開示は、１つ以上の標的配列を含むと推定されたポリヌクレオチド試料を、２種類以上の異なったシグナル−クエンチャーのプローブ対と接触させる方法を提供する。このシグナル−クエンチャーのプローブ対は、１つ以上のポリヌクレオチドに存在する標的配列にハイブリダイズするように設計することができる。第１のシグナル−クエンチャーのプローブ対の配列は、第１の特定された標的配列の領域内において、クエンチできる近さで互いにハイブリダイズするように設計することができる。第２のシグナル−クエンチャーのプローブ対の配列は、第２の特定された標的配列の領域内において、クエンチできる近さで互いにハイブリダイズするように設計することができる。各シグナルプローブは、標的配列にハイブリダイズすると、検出可能なシグナルを発生させることのできる標識を有することができる。第１のシグナルプローブによって発生したシグナルは、第２のシグナルプローブによって発生したプローブと識別可能であってもよい。あるいは、第２のシグナルプローブによって発生したプローブと識別できなくてもよい。各クエンチャープローブは、シグナルプローブとクエンチャープローブが標的配列上において、クエンチできる近さで互いにハイブリダイズすると、その対応するシグナルプローブによって生じるシグナルをクエンチすることのできる部分を有することができる。

各シグナル−クエンチャーのプローブ対は、クエンチャープローブが、それに対応するシグナルプローブよりも低いＴ_ｍをもつように設計することができる。シグナルプローブが識別不能な標識を有する実施態様において、第２のシグナルプローブが、第１のクエンチャープローブよりも低いＴ_ｍを有するように設計することができる。シグナルプローブが識別可能な標識を有する実施態様においては、第２のシグナルプローブが、第１のシグナルプローブまたは第１のクエンチャープローブよりも低いか高いか、または同じＴ_ｍを有するように設計することができる。

接触させた後、シグナルプローブによって生じたシグナルを、温度の関数としてモニタリングすることができる。さまざまな異なったプローブのＴ_ｍを含む温度範囲を通して温度が上昇するか低下したときに、このようなシグナルを、継続的に、または、異なる別個の点でモニタリングすることができる。いくつかの実施態様では、複数の異なる別個の温度でシグナルをモニタリングする。例えば、いくつかの実施態様では、シグナル−クエンチャーのプローブ対のシグナルプローブとクエンチャープローブのＴ_ｍの中間の温度、および、第１の対のクエンチャープローブのＴ_ｍと第２の対のシグナルプローブのＴ_ｍの中間の温度などを利用することができる。いくつかの実施態様では、さまざまなシグナルプローブとクエンチャープローブのＴ_ｍとほぼ等しい温度を使用することができる。温度の関数として、シグナルプローブが発生させるシグナルは、ポリヌクレオチド試料が、１つ以上の標的配列を含んでいるか否かの指標を提供する。

本方法において使用されるシグナル−クエンチャーのプローブ対の数は、アッセイにおいて評価される標的配列の数に応じて決めることができる。例えば、診断に関連するときは、患者が、例えばウイルスに感染しているかどうかだけでなく、感染したウイルスの具体的な遺伝子型も判定することがしばしば望まれる。このような場合には、そのウイルスの既知の遺伝子型を判定するのに必要とされるだけの数のシグナル−クエンチャープローブ対を複合的アッセイ法に使用することができる。いくつかの実施態様では、各シグナル−クエンチャープローブ対のシグナルプローブとクエンチャープローブを、特異的な遺伝子型を示す配列にハイブリダイズするよう設計することができる。いくつかの実施態様では、各シグナルプローブを、ある特異的な遺伝子型を示す配列にハイブリダイズするよう設計し、１種類以上のクエンチャープローブを、異なる遺伝子型に共通する配列にハイブリダイズするように設計することができる。いくつかの実施態様では、各クエンチャープローブを、ある特異的な遺伝子型を示す配列にハイブリダイズするよう設計することができる。シグナルプローブはすべて、識別不能な標識を有するか、あるいは、シグナルプローブの全部または一部が識別可能な標識を有することができる。

いくつかの実施態様において、もっとも低いＴ_ｍをもつ、シグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブは必要に応じて存在しなくてもよい。

また、本明細書に記載されたさまざまな方法を実施するのに役立つ組成物およびキットも提供される。一般的に、このキットは、第１のシグナル−クエンチャープローブ対、および、少なくとも第２のシグナル−クエンチャープローブ対を含むが、もっとも低いＴ_ｍをもつ、シグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブは選択的である。いくつかの実施態様では、このキットは、２〜１０種類の異なったシグナル−クエンチャープローブ対を含むことができる。いくつかの実施態様では、シグナルプローブの全部が識別不能な標識を有することができる。いくつかの実施態様では、少なくとも１つのシグナルプローブが識別可能な標識を有することができる。いくつかの実施態様では、このキットは、そのすべてが第１の識別可能なシグナル標識で標識されている２〜１０種類の異なったシグナル−クエンチャープローブ対の第１のセット、および、そのすべてが第２の識別可能なシグナル標識であって、第１のシグナル標識とは識別可能な標識で標識されている２〜１０種類の異なったシグナル−クエンチャープローブ対の第２のセットを含むこと
ができる。このキットは、必要に応じて、さらなるセットのプローブ対のすべてが、他のすべてのセットのシグナル標識から識別可能なシグナル標識で標識され得る２〜１０種類の異なったプローブ対のセットをさらに含むことができる。

示差的なＴ_ｍを利用することによって、識別可能な標識システムを必要とすることなく、多数の標的配列を同時に解析することができる。さらに、クエンチャープローブの使用により、完全には相補的でないシグナルプローブと標的とのハイブリッドからのシグナルを低下させることができる。クエンチャープローブは、各非相補的シグナル−標的ハイブリッドからのシグナルをクエンチして、シグナルプローブの特異性を効果的に高めることができる。さらに、示差的なＴ_ｍと、異なった検出可能なシグナル（例えば、異なった色を付けたフルオロフォア）との組み合わせを利用する実施態様では、１回のアッセイで、多数の異なった標的配列を調査および／または解析することが可能になる。同時に調査または解析することができる標的配列の数は、識別可能な検出可能シグナルの数と、識別可能なＴ_ｍの数とを合わせたものであるから、唯一制限となるのは、Ｔ_ｍと検出可能なシグナルを識別する能力である。

本明細書に記載された組成物および方法は、多くの適用においてポリヌクレオチド試料を解析するために使用することができる。具体的で非制限的な例として、この組成物および方法を用いて、複数の変異を同時に解析したり、多型性を検出したり、試料中の１つ又は複数の病原体の有無を検出したり、また、ウイルスなどの病原体の遺伝子型を決定したりすることができる。他の数多くの利用法や利点が、好適な実施態様の詳細な説明を概観することによって明らかになる。

（詳細な説明）
（略語と規則）
本明細書全体および図面において、特異的核酸塩基配列を含む標的配列、ポリヌクレオチド、シグナルプローブおよびクエンチャープローブを示すために使用されている略語は、通常の一字略記法である。大文字がヌクレオチド配列（例、ＲＮＡおよびＤＮＡの配列）を示し、小文字がヌクレオチドの模倣配列（例、ＰＮＡ配列）を表す。したがって、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに含まれるとき、天然型のコード核酸塩基は、以下のように略記される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）。ＰＮＡなどの模倣のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに含まれるとき、天然型のコード核酸塩基は、以下のように略記される：アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、およびウラシル（ｕ）。「核酸塩基配列」または「配列」は互換的に使用される。

また、特段の記載がない限り、一連の一文字略記で表示されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの配列は、一般的な規則に従って５’→３’方向に表示されている。ＰＮＡなど、アミノ末端とカルボキシル末端を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの模倣配列は、一般的な規則に従ってアミノからカルボキシル方向に表示されている。逆平行のハイブリダイゼーション方向を平行方向のそれと区別するためには、オリゴヌクレオチドの５’末端がＰＮＡのアミノ末端に相当し、オリゴヌクレオチドの３’末端がＰＮＡのカルボキシル末端に相当すると理解すべきである。

（定義）
本明細書と特許請求の範囲を通じて用いられるとき、以下の用語は、以下に記載する定義を有することが意図される。単数形で定義された用語は複数形も含み、逆の場合も同じである。

「核酸塩基」は、核酸またはポリヌクレオチドの技術を利用するか、ポリアミドまたは
ペプチドの核酸技術を利用して、配列特異的な様式でポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリマーを作製している者に広く知られている天然および合成のヘテロ環状部分を意味する。適当な核酸塩基の非限定的な例には、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）などがある。その他の適当な核酸塩基の非限定的な例は、Ｂｕｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，（国際公開第９２／２０７０２号または第９２／２０７０３号）の図２（Ａ）および２（Ｂ）に示されている核酸塩基などである。

「核酸塩基ポリマーまたはオリゴマー」は、得られた核酸塩基ポリマーまたはオリゴマーが、相補的な核酸塩基配列をもつポリヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする結合によって結合している２個以上の核酸塩基を意味する。核酸塩基のポリマーまたはオリゴマーは、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（例、ＤＮＡおよびＲＮＡのポリマーおよびオリゴマー）、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの類似化合物、ならびにポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの模倣化合物、例えば、ポリアミド核酸またはペプチド核酸などであるが、これらに限定されるものではない。核酸塩基のポリマーまたはオリゴマーのサイズはさまざまなで、数核酸塩基、２から４０核酸塩基から、数百核酸塩基まで、数千核酸塩基またはそれ以上まで変動し得る。

「ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド」は、核酸塩基が糖リン酸結合（糖−リン酸骨格）によって結合されている核酸塩基のポリマーまたはオリゴマーを意味する。例示的なポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、２’−デオキシリボヌクレオチドのポリマー（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチドのポリマー（ＲＮＡ）などである。ポリヌクレオチドは、全部がリボヌクレオチドからなるか、全部が２’−デオキシリボヌクレオチドからなるか、またはそれらを組み合わせたものからなる。

「ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの類似化合物」は、核酸塩基が、１つ以上の糖リン酸類似化合物を含む糖リン酸骨格によって結合されている、核酸塩基のポリマーまたはオリゴマーを意味する。代表的な糖リン酸類似化合物は、糖アルキルホスホネート、糖ホスホアミダイト、糖アルキル型または置換型のアルキルホスホトリエステル、糖ホスホロチオエート、糖ホスホロジチオエート、糖リン酸、および、糖が２’−デオキシリボースまたはリボース以外である糖リン酸類似化合物、米国特許第６，０１３，７８５号および米国特許第５，６９６，２５３号（Ｄａｇａｎｉ １９９５， Ｃｈｅｍ． ＆
Ｅｎｇ． Ｎｅｗｓ ４−５：１１５３；Ｄｅｍｐｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：６１４０−６１４１も参照）に記載されているような正に荷電した糖−グアニジル鎖交をもつ核酸塩基ポリマーなどであるが、これらに限定されるものではない。糖が２’−デオキシリボースである、正に荷電した類似化合物は「ＤＮＧ」と称され、一方、糖がリボースである同様の化合物は「ＲＮＧ」と称される。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの類似化合物の定義に具体的に含まれるのは、ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡ：例えば、Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００２， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：９９７３−９９８１；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１３２５２−３；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３９：４３８１−４３８４；Ｊｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ８：２２１９〜２２２２；Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，１９９８，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：１２４７−１２４８；国際公開００／５６７４６号、国際公
開０２／２８８７５号および国際公開０１／４８１９０号を参照；これらはすべて、その全体が参考として本明細書中に援用される。

「ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの模倣化合物」は、骨格の１つ以上の糖リン酸結合が、糖−リン酸類似化合物に置換されている、核酸塩基のポリマーまたはオリゴマーを意味する。このような模倣物は、相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの類似化合物、または別のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの模倣物にハイブリダイズすることができ、以下の結合を１つ以上含む骨格を含むことができる：米国特許第５，７８６，４６１号；米国特許第５，７６６，８５５号；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，５３９，０８２号および国際公開第９８／０３５４２号（また、Ｈａａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ’ｌ Ｅｄ．ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ ３５：１９３９−１９４２；Ｌｅｎｓｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ．１６：１７７５−１７７９；Ｄ’Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ．１：１５１３−１５１６も参照のこと。また、Ｎｉｅｌｓｅｎ， １９９９、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５も参照）に記載されているようなアルキルアミン側鎖をもつ正に荷電したポリアミド骨格；国際公開第９２／２０７０２号および米国特許第５，５３９，０８２号に記載されているような非荷電性ポリアミド骨格；米国特許第５，６９８，６８５号、米国特許第５，４７０，９７４号、米国特許第５，３７８，８４１号および米国特許第５，１８５，１４４号（また、Ｗａｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１１１６−１１２１も参照）に記載されているような非荷電性モノホリノ−ホスホラミデート骨格；ペプチドベースの核酸模倣骨格（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号を参照）；カルバメイト骨格（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，１９８７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２）；アミド骨格（例えば、Ｌｅｂｒｅｔｏｎ，１９９４，Ｓｙｎｌｅｔｔ．Ｆｅｂｒｕａｒｙ、１９９４：１３７を参照）；メチルヒドロキシルアミン骨格（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６を参照）；３’−チオホルムアセタール骨格（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照）およびスルファメート骨格（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照）。上記参考文献はすべて、参考として本明細書中に援用される。

「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、核酸塩基が、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，５２７，６７５号、第５，６２３，０４９号、第５，７１４，３３１号、第５，７１８，２６２号、第５，７３６，３３６号、第５，７７３，５７１号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号、第５，８３７，４５９号、第５，８９１，６２５号、第５，９７２，６１０号、第５，９８６，０５３号、第６，１０７，４７０号、第６，４５１，９６８号、第６，４４１，１３０号、第６，４１４，１１２号および第６，４０３，７６３号のいずれかに記載されているアミノ結合（非荷電ポリアミド骨格）によって結合されているポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの模倣物を意味する。これらの文献はすべて参考として本明細書中に援用される。「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、以下の刊行物に記載されているポリヌクレオチド模倣物の２つ以上のサブユニットを含む任意のオリゴマーまたはポリマーにも適用するものとする：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８；Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７；Ｊｏｒｄ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０；Ｋｒｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６；Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４；Ｌｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５５５−５６０；Ｈｏｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，１９９８，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ
＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔ．，８：１６５−１６８；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ｍｔ．Ｅｄ．，３７：３０２−３０５；Ｃａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．，３８：４２１１−４２１４；Ｃｉａｐｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．１．’３：９１２−９１９；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）：１２６９−１２７２；および国際公開第９６／０４０００号として開示されているＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．，のペプチドに基づく核酸模倣物（ＰＥＮＡＭ）（Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｉｍｉｃｓ （ＰＥＮＡＭｓ））。これらはすべて参考として本明細書中に援用される。

ＰＮＡのいくつかの例は、核酸塩基がＮ−（２−アミノエチル）−グリシン骨格に結合しているもの、すなわちペプチド様のアミド結合ユニットである（例えば、米国特許第５，７１９，２６２号：Ｂｕｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，国際公開第９２／２０７０２号；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１４９７−１５００を参照）。本明細書記載の方法および組成物において使用するのに適したＰＮＡであるＮ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡの部分構造を以下の構造式（Ｉ）に示す：
（Ｉ）

式中、（ａ）ｎは、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンＰＮＡの長さを規定する整数であり、各Ｂは個々に核酸塩基であり、また、Ｒは、−ＯＲ’または−ＮＲ’Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、それぞれ独立して、水素または（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキル基、好ましくは水素である。

「キメラオリゴ」は、複数の異なったポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似化合物
、およびポリヌクレオチド模倣化合物を含む核酸塩基のポリマーまたはオリゴマーを意味する。例えば、キメラオリゴは、ＲＮＡ配列に連結したＤＮＡ配列を含むことが可能である。キメラオリゴの別の例は、ＰＮＡの配列に連結したＤＮＡ配列、およびＰＮＡの配列に連結したＲＮＡ配列などである。

「シグナル標識」は、本明細書記載のプローブに結合すると、そのプローブを、例えば、分光学的方法、光化学的方法、または電気化学発光法など、既知の検出法を用いて検出可能なプローブとする部分を意味する。例示的な標識としては、フルオロフォアおよび化学発光標識などがあげられるが、これらに限定されるものではない。このような標識によって、例えば、フルオロメータなど適当な検出装置で標識化合物を直接に検出することが可能になる。いくつかの実施態様において、標識は、フルオロメータによって検出できる蛍光発生性のレポーター色素であって、レポーター−クエンチャー色素対の一部を構成する。

「クエンチャー標識」は、クエンチできるような近さに置かれると、シグナル標識によって産生される検出可能なシグナルをクエンチすることのできる部分を意味する。

「ワトソン−クリック塩基対」は、例えば、ＡがＴおよびＵと対合し、ＧがＣと対合するなど、配列特異的な水素結合によって一緒に結合する核酸塩基および類似化合物の特異的な対合パターンを意味する。

「ヌクレオシド」は、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシンなどのような、プリン、デアザプリンまたはピリミジン核酸塩基を含む化合物であって、１’位でペントースに連結している化合物を意味する。ヌクレオシド核酸塩基がプリンまたは７−デアザプリンの場合、ペントースは、そのプリンまたはデアザプリンの第９位で核酸塩基に結合し、核酸塩基がピリミジンの場合には、ペントースは、そのピリミジンの第１位で核酸塩基に結合している（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ， ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）を参照）。本明細書において「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味し、例えば、もっとも一般的なエステル化部位が、ペントースのＣ−５位に結合しているヒドロキシル基である３リン酸エステルである。本明細書において「ヌクレオシド／チド」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを含む一群の化合物を意味する。

「クエンチする」とは、測定可能な低下がどのようなメカニズムで起きるかには関わらず、シグナル標識によって産生される検出可能なシグナルの量が測定可能に減少することを意味する。

「クエンチできる近さ」とは、標的配列上におけるシグナル−クエンチャーのプローブ対の位置を意味する。「クエンチできる近さ」に存在するためには、シグナル標識によって産生される検出可能なシグナルの量が測定可能に減少するという結果になるよう、シグナル標識をクエンチャー標識から十分な近さに置く配置でシグナルプローブとクエンチャープローブをハイブリダイズさせなければならない。

「アニーリング」または「ハイブリダイゼーション」は、ある核酸塩基ポリマーが別の核酸塩基ポリマーと塩基対合相互作用して、２本鎖構造、３本鎖構造または４本鎖構造の形成を生じさせることを意味する。アニーリングまたはハイブリダイゼーションは、ワトソン−クリック塩基対合相互作用を介して生じてもよいが、フーグスティーン塩基対合のような別の水素結合相互作用によって媒介されてもよい。

（さまざまな例示的実施態様）
ここでは、ポリヌクレオチド試料の複合的解析を行なうための組成物および方法を提示する。いくつかの実施態様において、識別不能な標識を有し、かつ特定の相対的熱融解温度を有する複数のシグナル−クエンチャー核酸塩基オリゴマープローブ対を使用する、Ｔ_ｍによってポリヌクレオチド試料の複合的解析を行なうための方法（Ｔ_ｍ複合的解析法）が提供される。例えば、シグナルプローブが標的配列の一領域にハイブリダイズすると、シグナルプローブによって検出可能なシグナルが放出され（すなわちスイッチが入り）、クエンチャープローブが、クエンチできる近さでシグナルプローブにハイブリダイズするとクエンチされ得る（すなわちスイッチがオフになる）。各クエンチャープローブは、対応するシグナルプローブよりも低いＴ_ｍ値をもつことも可能であり、アッセイにおいて使用されるシグナルプローブおよびクエンチャープローブのすべての中で最も高いＴ_ｍ値をもつことができる第１のシグナルプローブ以外の各シグナル−クエンチャープローブ対のシグナルプローブは、前記クエンチャープローブ対のクエンチャープローブよりも低いＴ_ｍ値をもつことが可能である。特定の相対的Ｔ_ｍ値によって、温度が、さまざまなプローブのＴ_ｍ値を含む温度範囲にわたって上昇するか下降すると、シグナルプローブによって産生させるシグナルは、対応するクエンチャープローブが標的配列にハイブリダイズするか、融解して標的配列から離れるかによって、スイッチが入ったり切れたりすることになる。したがって、ポリヌクレオチド試料の１つ以上の標的配列の有無は、温度の関数としてのシグナルのオンやオフの状態によって評価される。

複合的アッセイを用いて、多くの異なった供給源由来のポリヌクレオチド試料を分析することができる。試料は、１つ以上の異なった標的配列を有すると疑われる１つのポリヌクレオチドを含むことができ、あるいは、それぞれが、０個、１つまたは複数の異なった標的配列を含み得る複数の異なったポリヌクレオチドを含むことも可能である。

ここで「標的配列」とは、検出しようとするポリヌクレオチド上の核酸塩基の配列を意味する。標的配列の性質によって、本明細書記載の組成物および方法が制限されるものではないことが理解されるべきである。各標的配列は、ある標的配列を他の標的配列から区別するために使用することができる固有の核酸塩基配列の一領域を含む。さらに、各標的配列は、他の標的配列と共通で、ある標的配列を他の標的配列から区別するために使用することができない核酸塩基配列の領域を含むことも可能である。標的配列を含む核酸塩基配列は、２本鎖ポリヌクレオチドの同じ鎖上に存在することも（図６Ａ）、２本鎖ポリヌクレオチドの異なった鎖上に存在することも（図６Ｂ）可能である。

標的配列を含むポリヌクレオチドは、任意の供給源から提供されるものであってもよい。例えば、標的配列は、核酸塩基のポリマーもしくはオリゴマー、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの類似化合物、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドの模倣物、またはキメラオリゴの一部として存在することも可能である。標的配列を含む試料を自然界から提供することもできるし、合成することも、製造過程から供給することも可能である。標的配列は、任意の供給源からも得ることができ、増幅することが可能である。例えば、標的配列は、細胞または生物における増幅プロセスから産生させることができ、さもなければ、細胞または生物から抽出することができる。標的配列の供給源となりうる増幅プロセスの例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ；例えば、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＰＮＡＳ ８９：３９２−３９６；Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−１６９６；Ｎａｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６（２）：１７７−１８７；および米国特許第５，２７０，１８４号、第５，４２２，２５２号、第５，４５５，１６６号および第５，４７０，７２３号を参照）、転写媒介性増幅法（ＴＭＡ）、Ｑ−ベータレプリカーゼ増幅法（Ｑ−ｂｅｔａ）、ローリングサークル増
幅法（ＲＣＡ）、Ｌｉｚａｒｄｉ，１９９８，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（３）：２２５−２３２および米国特許第５，８５４，０３３号）または非同期ＰＣＲ（Ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ＰＣＲ）（例えば、国際公開第０１／９４６３８号を参照）などがあるが、これらに限定されるものではない。

本発明のシグナルプローブおよびクエンチャープローブは、ポリヌクレオチドの１本鎖または標的配列を含むポリヌクレオチドの一領域と２本鎖のハイブリッドを形成するように設計することができる。標的配列の領域内において１本鎖状態では存在しないポリヌクレオチドは、検出またはハイブリダイゼーションの前に、そのような領域内で１本鎖になるようにすることができる。増幅によって得られたポリヌクレオチドについては、１本鎖増幅産物を生成するのに適した方法が好適である。１本鎖増幅産物ポリヌクレオチドを生成するのに適した増幅方法の非制限的な例には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるラン−オフ転写、ＲＣＡ、非対称ＰＣＲ（Ｂａｃｈａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１８，１３０９）、および非同期ＰＣＲ（国際公開第０１／９４６３８号を参照）などがあるが、これらに限定されるものではない。ＰＮＡ開裂因子を使用する（米国特許第６，２６５，１６６号）など、２本鎖ポリヌクレオチドの領域を１本鎖化する周知の方法を用いて、ポリヌクレオチド上に１本鎖の標的配列を生じさせることもできる。

シグナルおよびクエンチャーのプローブ対の核酸塩基配列は、一緒に使用して標的配列を検出できるように設計することができる。図１Ａは、シグナルプローブおよびクエンチャープローブの核酸塩基配列を、識別用の核酸塩基配列を含む標的配列の領域にハイブリダイズするように設計することができるという実施態様を図解している。ここで「識別用の核酸塩基配列」とは、所定の標的配列にとって固有で、該標的配列を別の標的配列から区別するために使用できる配列を意味する。

別の実施態様において、クエンチャープローブの核酸塩基配列を、識別用の核酸塩基配列を含む標的配列の領域にハイブリダイズするように設計し、シグナルプローブの核酸塩基配列を、識別できない核酸塩基配列を含む標的配列の領域にハイブリダイズするように設計することができる。ここで、「識別できない」核酸塩基配列とは、別の標的配列と共通する核酸塩基配列を意味する。例示的な実施態様を図１Ｂに図示する。

さらに別の実施態様において、シグナルプローブの核酸塩基配列を、識別用の核酸塩基配列を含む標的配列の領域にハイブリダイズするように設計し、クエンチャープローブの核酸塩基配列を、識別できない核酸塩基配列を含む標的配列の領域にハイブリダイズするように設計することができる。例示的な実施態様を図１Ｃに図示する。

上記実施態様は、同一のポリヌクレオチド鎖上に存在する標的配列について図示したものであるが、所定のシグナル−クエンチャーのプローブ対は、ポリヌクレオチドの別々の鎖にハイブリダイズしてもよい。図６Ｂは、ポリヌクレオチドの両鎖上に標的配列が存在する実施態様を図解している。これらの実施態様では、シグナルプローブが、ポリヌクレオチドの一方の鎖上に位置する標的配列の一部にハイブリダイズし、一方で、クエンチャープローブは、ポリヌクレオチドの他方の鎖上に位置する標的配列の一部にハイブリダイズする。

シグナルプローブとクエンチャープローブの化学組成は、本明細書記載の組成物および方法を成功させる上で決定的に重要ではない。実際に、配列特異的様式で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズできる任意の核酸塩基オリゴマーを、本明細書記載の組成物および方法に使用することができる。したがって、本明細書記載の組成物および方法に役立つシグナルプローブとクエンチャープローブは、上に定義したように、オリゴヌクレオチド
、オリゴヌクレオチドの類似化合物、ＰＮＡやキメラオリゴなどオリゴヌクレオチドの模倣化合物を含むが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施態様において、シグナルプローブおよびクエンチャープローブは、ヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）による分解にたいして抵抗性であってもよい。ヌクレアーゼ抵抗性プローブには、例示であって制限的ではないが、ＰＮＡプローブなどのオリゴヌクレオチド模倣プローブなどがある。

多くの場合、特異的なシグナル−クエンチャープローブ対のシグナルプローブおよびクエンチャープローブは、同一の化学組成をもつはずである（例えば、どちらもＤＮＡオリゴマーあるいはどちらもＰＮＡオリゴマー）が、そうである必要はない。実際、以下で詳細に考察するように、場合によっては、必要な示差的Ｔ_ｍ値を達成するために、異なった化学組成をもつシグナルプローブとクエンチャープローブを利用することが望ましいかもしれない。

さらに、さまざまな異なったシグナルプローブおよびクエンチャープローブの化学組成は同一であっても異なっていてもよい。具体的な例として、シグナルプローブはすべてＤＮＡオリゴマーでもよく、すべてＰＮＡオリゴマーでもよい。あるいは、いくつかは、ＤＮＡオリゴマーであり、他はＰＮＡオリゴマーであってもよい。同様に、クエンチャールプローブはすべてＤＮＡオリゴマーでもよく、すべてＰＮＡオリゴマーでもよい。あるいは、いくつかは、ＤＮＡオリゴマーであり、いくつかは、ＰＮＡオリゴマーであってもよい。

その化学組成に関わらず、シグナルプローブは、標的配列にシグナルプローブがハイブリダイズしたときに検出可能なシグナルを発生させることができるレポーターまたはシグナル標識を含む。シグナル標識は、直接標識、すなわち、それ自体が検出可能な標識であるか検出可能なシグナルを発生させる標識でもよく、あるいは、間接標識、すなわち、別の化合物が存在するときに検出可能なシグナルを発生させる標識でもよい。標識の種類は成功にとって決定的に重要ではないが、標識が、クエンチできる近さでハイブリダイズしたクエンチャープローブによってクエンチできる検出可能シグナルを発生させることが重要である。適当な直接的シグナル標識の例は、フルオロフォア、クロモフォア、化学発光部分などであるが、これらに限定されるものではない。適当な間接的シグナル標識の例は、基質と反応して検出可能なシグナルを発生させることができる酵素（例、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼなど）、または別の標識に結合できるその他の分子または部分であるが、これらに限定されるものではない。例えば、ストレプトアビジン−化学発光接合体を用いてビオチンを検出することができる。

クエンチャープローブは、シグナルプローブ上にあるシグナル標識によって産生される検出可能なシグナルをクエンチすることができるクエンチャー標識を含む。クエンチャープローブが、クエンチできる近さでシグナルプローブにハイブリダイズして、クエンチャー標識がシグナル標識に十分近づき、シグナル標識によって産生される検出可能なシグナルの量が測定可能に減少する結果、クエンチが起きる。どの所定のシグナル−クエンチャープローブ対についても、クエンチャー標識とシグナル標識の同一性、シグナル−クエンチャーのプローブ対がどのように標的配列にハイブリダイズするよう設計されているのか、また、シグナルプローブのクエンチャープローブへの近さ（すなわち、シグナルプローブとクエンチャープローブが隣接しているか、または、１個以上のヌクレオチドによって分離されているか否か）などの要素によって、クエンチは影響を受ける。クエンチャー標識の同一性は、シグナルプローブ上に含まれるシグナル標識の同一性に依存するし、当業者にも明らかである。例えば、シグナルプローブが間接的な酵素標識を含む場合には、クエンチャー標識は、その酵素のインヒビターであってもよい（例えば、共有結合したイン
ヒビター−ＤＮＡ−酵素モジュールを含む、ＤＮＡ検出のためのシステムについて記載しているＳａｇｈａｔｅｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５：３４４−３４５を参照のこと、この文献はその全体が、参考として本明細書中に援用される）。シグナル標識がフルオロフォアであれば、クエンチャー標識は、シグナルであるフルオロフォアの発光をクエンチすることができるフルオロフォア、クロモフォア、またはその他の成分部分であってもよい（このような種類のシグナル−クエンチャー標識対については、以下で詳細に検討する）。

シグナル標識およびクエンチャー標識は、それぞれ、シグナルプローブおよびクエンチャープローブに結合することができ、シグナルプローブとクエンチャープローブが、同一の標的配列上のそれぞれの領域または部位にハイブリダイズする場合、クエンチャー標識が、シグナル標識によって産生された検出可能なシグナルをクエンチできる限り、実質的にどの部位で結合してもよい。したがって、シグナル標識とクエンチャー標識は、それぞれ別個に、末端、末端もしくは内部にある核酸塩基、またはシグナルプローブおよびクエンチャープローブの骨格に結合することができる。

いくつかの実施態様において、シグナル標識とクエンチャー標識は、それらに対応するシグナルプローブとクエンチャープローブの末端残基で、またはその近傍で結合している（例えば、オリゴヌクレオチドプローブの５’−または３’−末端のヌクレオチド、またはＰＮＡプローブのアミノ末端またはカルボキシル末端の残基）。標識は、核酸塩基あるいは末端で、末端の残基に結合している（例えば、オリゴヌクレオチドプローブの５’−または３’−末端、またはＰＮＡプローブのアミノ末端またはカルボキシル末端）。末端の残基に結合すると、シグナル標識とクエンチャー標識は、シグナルプローブとクエンチャープローブが標的配列にハイブリダイズする場合に、クエンチできる間隔で好適に方向づけられるよう、反対側の末端に位置できるようになる。例えば、シグナルプローブとクエンチャープローブがオリゴヌクレオチドの場合、シグナル標識が５’末端のヌクレオチドに結合していれば、クエンチャー標識が３’末端のヌクレオチドに置かれなければならず、逆の場合にも同様である。ＰＮＡのシグナルプローブおよびクエンチャープローブでは、標識の位置は、プローブが、逆平行か平行のいずれの方向で標的配列にハイブリダイズするよう設計されているか否かによって決まる。例えば、シグナルとクエンチャーの両プローブが、同一方向で標的配列にハイブリダイズするよう設計されていて、シグナル標識が、シグナルプローブのアミノ末端残基に結合する場合には、クエンチャー標識は、クエンチャープローブのカルボキシル末端残基に結合させなければならない。逆の場合にも同様である。シグナルプローブとクエンチャープローブが、逆方向で標的配列にハイブリダイズするよう設計されている（すなわち、一つが平行、もう一つが逆平行の）場合には、シグナル標識とクエンチャー標識は、同じ種類の末端残基に結合しなければならない。すなわちシグナル標識とクエンチャー標識は、それぞれのプローブのアミノ末端に結合するか、それぞれのプローブのカルボキシル末端に結合しなければならない。

クエンチが起きるメカニズムは決定的に重要ではない。クエンチが起こるメカニズムであれば何でも、本明細書記載の方法を実施する際に使用することができる。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、衝突や直接的な接触など非ＦＲＥＴメカニズム（例えば、Ｙａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９５：２２８−２３５を参照）によって、ＦＲＥＴと非ＦＲＥＴメカニズムを組み合わせることによって、または、未解明の単一または複数のメカニズムによってクエンチが起きる。

一つの部分から別の部分にエネルギーを移動させることができる色素部分を本明細書記載の方法で使用することができる。いくつかの実施態様において、一つの部分から別の部分にエネルギーを移動させることができる複数の色素部分を、本明細書記載の方法におい
て使用することができる。例えば、一つの部分が第１の供与体として働き、その他の色素部分が、励起エネルギーを受け取って移動させることができる受容体／供与体として働くという、３種類の色素部分を用いることができる。当業者なら理解できるように、多数の色素を含むエネルギー移動カスケードも、本明細書記載の方法において使用することができる。

いくつかの実施態様において、色素対の供与体成分から受容体成分にエネルギーを移動させることができる色素対を、シグナル標識およびクエンチャー標識として使用することができる。このような色素対は、当技術分野においてよく知られている。

具体的な一例として、クエンチャー部分は、よく知られている現象であるＦＲＥＴ（非放射活性エネルギー移動またはフェルスターエネルギー移動としても知られている）によるシグナルフルオロフォアの蛍光をクエンチできる色素分子でもよい。ＦＲＥＴでは、励起されたフルオロフォア（供与体色素；この場合にはシグナルフルオロフォア）が、その励起エネルギーを別のクロモフォア（受容体色素；この場合にはクエンチャー）に移動させる。このようなＦＲＥＴ受容体すなわちクエンチャーは、それ自体がフルオロフォアでもよく、移動されたエネルギーを蛍光として放出する（蛍光発光性ＦＲＥＴクエンチャーまたは受容体）か、または、非蛍光性で、別の崩壊メカニズムによって移動したエネルギーを放出させてもよい（暗黒性（ｄａｒｋ）ＦＲＥＴクエンチャーもしくは受容体）。以下で詳しく論じるように、効率的なエネルギー移動は、ＦＲＥＴ供与体と受容体の間の距離だけでなく、ＦＲＥＴ供与体の発光スペクトルとＦＲＥＴクエンチャーまたは受容体の吸光スペクトルの間のスペクトル重複に直接依存する。

ＦＲＥＴ色素対であるシグナル標識とクエンチャー標識の例は、当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｍａｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０（２１）ｅ１２２；Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１３０−１３８；Ｌａｙ ａｎｄ Ｗｉｔｔｗｅｒ，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：２２６２−２２６７；Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：１０１−１０７；米国特許第６，４２７，１５６号；および米国特許第６，１４０，０５４号を参照。これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。

いくつかの実施態様において、シグナルプローブのシグナル標識はフルオロフォアであり、クエンチャープローブのクエンチャー標識は、シグナルフルオロフォアの蛍光シグナルをクエンチできる部分である。フルオロフォアは当技術分野において既知である。蛍光シグナルをクエンチできる部分の例は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ダブシルＢＨＱ−１、ＴＭＲ、ＱＳＹ−７、ＢＨＱ−２、ブラックホールクエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、およびニトロ基またはアゾ基を有する芳香族化合物などである。

別の具体的な例において、クエンチ部分は、非ＦＲＥＴメカニズムによって、シグナルフルオロフォアの蛍光をクエンチできる分子またはクロモフォアであってもよい。衝突または直接の接触によるクエンチでは、シグナルフルオロフォアとクエンチクロモフォアとの間のスペクトル重複は必要でないが、シグナルフルオロフォアとクエンチクロモフォアは、互いに衝突するのに十分な近さに位置している必要がある。

前記したように、供与体（シグナル）と受容体（クエンチャー）の標識間のエネルギー移動の効率は、それらの間の距離に依存しうる。供与体の標識と受容体の標識との間の距離は、シグナルプローブとクエンチャープローブが互いにハイブリダイズできる近さなど、多くの要素によって決まる。したがって、いくつかの実施態様において、シグナルプローブとクエンチャープローブは、標的配列上で互いに連続してハイブリダイズするように
設計することができる。シグナルプローブとクエンチャープローブは、標的配列上で互いに非連続的にハイブリダイズするように設計することができる。例えば、１から５個の核酸塩基で、シグナルプローブとクエンチャープローブの間を隔てることができる。代表的には、シグナルプローブとクエンチャープローブを、それらが標的配列にハイブリダイズすると０個から１個の核酸塩基で隔てられるように設計することができる。

当業者には認識できるように、標識をプローブに結合させるために使用されるリンカーの長さは、とりわけ、標識がプローブに結合する地点（すなわち、末端の核酸塩基または末端の残基のどちらか）と、シグナルプローブとクエンチャープローブが互いにハイブリダイズする近さによって決まる。例えば、シグナルプローブとクエンチャープローブが、標的配列上で互いに連続してハイブリダイズするように設計されていて、それらに対応する標識が、近接した末端残基に結合していれば、比較的短いリンカーを使用できる。非連続的にハイブリダイズするように設計されたシグナルプローブとクエンチャープローブは、長いリンカーを使用する必要がある。これらの原理はすべて十分に理解されており、当業者は、特定の適用に適した標識シグナルプローブおよびクエンチャープローブを規定通りに設計することができる。

いくつかの実施態様において、シグナルプローブは、自己指示プローブであってもよい。本明細書において、「自己指示」シグナルプローブは、溶液中に遊離しているときには検出可能なシグナルをほとんど発生させないか、全く発生させない（すなわち、標的配列にハイブリダイズしない）が、標的配列にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを発生させるシグナルプローブである。あるいは、自己指示プローブは、溶液中に遊離しているときには、第１の検出可能なシグナルを発生させ、標的配列にハイブリダイズすると、第１の検出可能なシグナルとは識別可能な第２の検出可能なシグナルを発生させることもできる。これらの示差的シグナルによって、自己指示プローブは、ハイブリダイズしないと「オフ」になり、ハイブリダイズすると「オン」になる。

自己指示プローブの示差的シグナルの性質は決定的に重要ではない。必要なのは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたときと、ハイブリダイズしなかったときとで、シグナルプローブによって産生されるシグナルを何らかの方法で識別できることである。例えば、示差的シグナルは、ハイブリダイゼーションしたときのシグナル強度の増加または低下であったり、ハイブリダイゼーションしたときの発光スペクトルの変化であったり、蛍光偏光の変化であったり、電気化学的電位の変化であったり、電気化学発光状態の変化であったりすることも可能である。

蛍光性自己指示シグナルプローブの使用には多くの利点がある。このような利点の一つは、プローブが溶液中に遊離しているときには、プローブは検出可能なシグナルをほとんどか全く発生させないため、蛍光シグナルのバックグランドレベルが低いせいで、シグナル対ノイズ比が低いことである。もう一つの利点は、溶液中に遊離しているときには、ハイブリダイズしなかったプローブは、蛍光シグナルをほとんどか全く発生させないため、洗浄段階を省略または最小化できる点である。自己指示プローブを使用することのさらに別の重要な利点は、アッセイを閉鎖系で実施して、試料または将来試料となるもののコンタミネーションを防止できる点である（下記参照）。

組成物および方法において自己指示シグナルプローブとして使用するために容易に使用できるか、日常的に用いられうる数多くの自己指示プローブが当技術分野において知られている。適当な自己指示シグナルプローブの具体例では、シグナル標識は、１本鎖ポリヌクレオチド対２本鎖ポリヌクレオチドの存在下で示差的なシグナルを発生させる部分である。この性質をもつ部分は、一例として、かつ非制限的に、２本鎖ＤＮＡなどの２本鎖ポリヌクレオチドの塩基対の間にインターカレートする色素、および２本鎖ＤＮＡなどの２
本鎖ポリヌクレオチドの浅い方の溝に結合する色素などである（ＭＧＢ色素）。このようなインターカレートする色素やＭＧＢ色素が数多く知られている。適当なインターカレート色素の具体例は、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシウムエチジウムブロマイドのホモダイマー、ヨウ化３，３’−ジエチルチアジカルボシアニン（Ｗｉｌｈｅｌｍｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２）ｅ３）、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩおよびＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、７−アミノアクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＤ（インターカレーションすると吸光度を変化させる非蛍光性色素）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手できるその他のインターカレート色素（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ８．１を参照。本文献は参考として本明細書中に援用される。

適当なＭＧＢ色素の特定の例は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８９、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、およびＨｏｅｃｈｓｔ３４５８０などのビスベンズイミド色素、ならびにＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）などのインドール色素などであるが、これらに限定されるものではない。また、他のＭＧＢ色素をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手できる（例えば、前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ８．１を参照）。

これらのインターカレート色素およびＭＧＢ色素は、周知技術を用いてシグナルプローブに連結することができる。インターカレート色素を、シグナルプローブなどの核酸塩基オリゴマーに連結させるのに適した方法が、例えば、米国特許第４，８３５，２６３号に記載されており、その開示内容は参考として本明細書中に援用される。ＭＧＢ色素を、シグナルプローブなどの核酸塩基オリゴマーに連結させるのに適した方法は、例えば、米国特許第５，８０１，１５５号、第６，４９２，３４６号および第６，４８６，３０８号に記載されており、その開示は参考として本明細書中に援用される。

さらに、自己指示シグナルプローブとして使用するのに適した自己指示プローブの別の特定の例は、二重標識ヘアピン型自己指示プローブである。「ヘアピン型」とは、１本鎖のループ領域と２本鎖のステム領域を含む構築物を意味する。二重標識ヘアピン型プローブは、一方の末端上に供与体分子をもち、他方の末端に受容体分子をもつように設計されている。標的配列にハイブリダイズしないと、受容体分子は、供与体分子によって産生された検出可能なシグナルをクエンチする。ヘアピン型プローブが標的配列にハイブリダイズすると、供与体と受容体は、効率的なエネルギー移動を行なうには大きすぎる距離に隔てられてしまい、受容体は、供与体によって産生されるシグナルを効率的にクエンチできなくなる。したがって、標的配列にハイブリダイズしていないと、ヘアピン型プローブは「オフ」であり（溶液の温度が、ヘアピンステム領域のＴ_ｍ値よりも低い場合）、標的配列にハイブリダイズすると検出可能なシグナルを産生する。すなわち、「オン」になる。

ヘアピン型自己指示プローブは、当技術分野においてに周知されており（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８；Ｎａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５１６−１５２１参照。概説としては、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．６：１１０７；Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：７４７Ａ参照；これらはすべて参考として本明細書中に援用される）、溶液中でヘアピン型立体構造をとることができる核酸塩基配列を有する。いくつかの実施態様において、ヘアピン型プローブは、一方の末端（例えば３’−末端）にＦＲＥＴ供与体を、もう一方の末端（例えば５’−末端）にＦＲＥＴ受容体を含み、プローブがヘアピン型立体構造になると、ＦＲＥＴ受容体が、ＦＲＥＴ供与体から産生され
る検出可能なシグナルをクエンチする。いくつかの実施態様では、非ＦＲＥＴの供与体および受容体が使用される（米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと。本文献は、参考として本明細書中に援用される）。ヘアピン型自己指示プローブは、完全にＰＮＡから作製することができる（米国特許第６，３５５，４１２号を参照のこと。本文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。

自己指示シグナルプローブとして使用するのに適した自己指示プローブの別の特定の例は、直鎖型二重標識プローブである。本明細書において「直鎖型」とは、ヘアピン型立体構造でない立体構造と考えられるプローブを意味する。しかしながら、「直鎖型」という用語は、該プローブが、２次構造または３次構造を含まないという意味ではない。すなわち、直鎖型二重標識プローブは直鎖状でもよいし、ヘアピン型立体構造でない立体構造を想定してもよい。ヘアピン型プローブ同様、二重標識直鎖型プローブは、供与体および受容体を含む。また、ヘアピン型プローブ同様、二重標識直鎖型プローブは、標的配列にハイブリダイズするまで、実質的にクエンチされたままでいることも可能である。自己指示シグナルプローブとして使用するのに適した二重標識直鎖型プローブは、当技術分野においてさまざまなタイプが知られているが、一例を挙げれば、当技術分野において広くＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと呼ばれている二重標識ＤＮＡプローブ（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第６，２５８，５６９号、および第６，５０３，７２０号を参照）；Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４（６）：１０９７−１１０３（また、そこで引用されている文献）に記載されている二重標識ＰＮＡプローブ、また、米国特許第６，４８５，９０１号（また、そこで引用されている文献）にも記載されているものなどがあるが、これらに限定されるものではない。これらの文献の開示は全体が参考として本明細書中に援用される。

ヘアピン型および直鎖型の二重標識自己指示プローブを用いる実施態様において、シグナルプローブのシグナル標識は、二重標識されたプローブの供与体に相当する。受容体は、シグナルプローブの対応するクエンチャープローブのクエンチャー標識と同じであってもよいし、異なっていてもよい。スペクトル重複に関係なく、多くの異なった供与体色素からの蛍光シグナルをクエンチできるため、汎用受容体色素として当技術分野において認知されている色素の例はダブシルである。適当なシグナル標識と受容体の選択は、シグナルプローブに結合するのに適した位置とリンカーの選択同様、当業者にとって明らかなことである。

適当に標識されたシグナルおよびクエンチャープローブは、常法を用いて合成することができる。例えば、オリゴヌクレオチドプローブを合成する方法が、米国特許第４，９７３，６７９号；Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９９２，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４８：２２２３−２３１１；米国特許第４，４１５，７３２号；米国特許第４，４５８，０６６号；米国特許第５，０４７，５２４号および米国特許第５，２６２，５３０号に記載されており、これらはすべて、その全体が参考として本明細書中に援用される。合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手できる３９２型，３９４型，３９４８型および／または３９００型のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置など、市販されている自動合成装置を使用して行なうことができる。

標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成する方法も周知されている。特定の例としては、国際公開第０１／９４６３８号（特に、第１６〜２１頁の開示内容）を参照のこと。本文献の開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

標識されたオリゴヌクレオチド類似化合物プローブを合成する方法も周知されている。例えば、米国特許第６，４７９，６５０号および米国特許第６，４３２，６４２号を参照のこと。これら両文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

ＰＮＡを化学的に組み立てる方法も周知されている（米国特許第５，５３９，０８２号、第５，５２７，６７５号、第５，６２３，０４９号、第５，７１４，３３１号、第５，７１８，２６２号、第５，７３６，３３６号、第５，７７３，５７１号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号、第５，８３７，４５９号、第５，８９１，６２５号、第５，９７２，６１０号、第５，９８６，０５３号、および第６，１０７，４７０号を参照。これらの文献は全て、その全体が参考として本明細書中に援用される）。ＰＮＡ合成法に関する一般的な参考書としては、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｏｒｆｏｌｋ Ｅｎｇｌａｎｄ （１９９９）も参照のこと。

ＰＮＡを標識する非限定的な方法が、米国特許第６，１１０，６７６号、同第６，２８０，９６４号、現在米国特許第６，３５５，４２１号として発行されている国際公開第９９／２２０１８号、現在米国特許第６．４８５，９０１号として発行されている国際公開第９９／２１８８１号、現在米国特許第６，３２６，４７９号として発行されている国際公開第９９／３７６７０号、および現在米国特許第６，３６１，９４２号として発行されている国際公開第９９／４９２９３号、本明細書の実施例の節に記載されており、または、その他、ＰＮＡ合成およびペプチド合成の技術分野において周知されている。また、ＰＮＡを標識する方法は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｏｒｆｏｌｋ Ｅｎｇｌａｎｄ （１９９９）でも検討されている。シグナルおよびクエンチャープローブとして使用できるＰＮＡオリゴマーを標識する非限定的な方法は以下のとおりである。会合の合成化学法は本質的に同じであるから、ペプチドを標識するために広く使用されている方法を用いて、しばしばＰＮＡオリゴマーを標識することができる。

ＰＮＡキメラの合成、標識および改変には、当業者に既知の方法および上記の方法を利用することができる。ＰＮＡキメラの合成、標識および改変に関する適当な参考資料は、現在米国特許第６，０６３，５６９号として発行されているＷＩＰＯ公開特許出願第９６／４０７０９号に記載されており、その全体が参考として本明細書中に援用される。さらに、ＰＮＡ合成および標識のための上記の方法は、しばしば、ＰＮＡキメラのＰＮＡ部分を改変するためにも利用することができる。また、核酸を合成および標識するための周知の方法も、しばしば、ＰＮＡキメラのオリゴヌクレオチド部分を改変するためにも利用することができる。例示的な方法は、米国特許第５，４７６，９２５号、米国特許第５，４５３，４９６号、米国特許第５，４４６，１３７号、米国特許第５，４１９，９６６号、米国特許第５，３９１，７２３号、米国特許第５，３９１，６６７号、米国特許第５，３８０，８３３号、米国特許第５，３４８，８６８号、米国特許第５，２８１，７０１号、米国特許第５，２７８，３０２号、米国特許第５，２６２，５３０号、米国特許第５，２４３，０３８号、米国特許第５，２１８，１０３号、米国特許第５，２０４，４５６号、米国特許第５，２０４，４５５号、米国特許第５，１９８号、米国特許第５４０号、米国特許第５，１７５，２０９号、米国特許第５，１６４，４９１号、米国特許第５，１１２，９６２号、米国特許第５，０７１，９７４号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第４，９８０，４６０号、米国特許第４，９２３，９０１号、米国特許第４，７８６，７２４号、米国特許第４，７２５，６７７号、米国特許第４，６５９，７７４号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，４５８，０６６号および米国特許第４，４１５，７３２号に記載されており、これらの文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

Ｔ_ｍ 複合化の基本原理を、２つの異なった標的配列１２、１４および３組のシグナル−
クエンチャーのプローブ対１６、２２、２８を有するポリヌクレオチド１０を用いた実施態様を参照して図２Ａに示す。各標的配列は、識別配列１１、１５の領域および非識別配列１３、１７の領域を含む。第１のシグナル−クエンチャープローブ対は、第１のシグナルプローブ１８と第１のクエンチャープローブ２０を、第２のプローブ対は、第２のシグナルプローブ２４と第２のクエンチャープローブ２６を、そして第３のプローブ対は、第３のシグナルプローブ３０と選択的な第３のクエンチャープローブ３２を含んでいる。図に示すように、各シグナルプローブ１８、２４、３０は、自己指示シグナルプローブであり、１９ａで示されるシグナル標識と１９ｂで示されるクエンチャー色素（例えばＦＲＥＴ受容体）を含んでいる。クエンチャープローブ２０、２６、３２はすべて、自己指示シグナルプローブ１８、２４、３０のクエンチャー色素と同じクエンチャー標識を含んでいる。図示された実施態様では、シグナルプローブ１８、２４、３０は、標的配列の識別領域にハイブリダイズするよう設計されており、クエンチャープローブ２０、２６、３２は、標的配列の非識別領域にハイブリダイズするよう設計されている。

図２Ａに図示されているように、Ｔ_ｍ複合のために、以下のような特定の相対的Ｔ_ｍ値をもつように、さまざまなシグナルプローブとクエンチャープローブが設計されている。Ｔ_ｍ（第１シグナルプローブ１８）＞Ｔ_ｍ（第１クエンチャープローブ２０）＞Ｔ_ｍ（第２シグナルプローブ２４）＞Ｔ_ｍ（第２クエンチャープローブ２６）＞Ｔ_ｍ（第３シグナルプローブ３０）＞Ｔ_ｍ（第３クエンチャープローブ２２）などである。プローブＴ_ｍ値の最小から最大までの範囲は変動し得るが、いくつかの実施態様において、この範囲は、約２０〜９５℃の間であり、約３０〜８５℃での範囲であることがより好適である。

任意の連続した２つのプローブ間（例えば、第１シグナルプローブ１８と第１クエンチャープローブ２０、第１クエンチャープローブ２０と第２シグナルプローブ２４など、ここでは、ΔＴ_ｍ ^プローブと呼ぶ）のＴ_ｍ値の違いも変動し得る。いくつかの実施態様において、ΔＴ_ｍ ^プローブは、少なくとも５℃であり、代表的には、約５〜１０℃の範囲である。ΔＴ_ｍ ^プローブ値の間隔は全部同じでもよいが、異なっていてもよい。

任意の連続した２つのシグナル−クエンチャープローブ対間のＴ_ｍの差の値も変動し得る。本明細書において使用される場合、特異的なシグナル−クエンチャープローブ対のＴ_ｍ値は、シグナルプローブのＴ_ｍ値である。したがって、連続した２つのプローブ対間の差をΔＴ_ｍ ^{シグナルプローブ}と名付けることができる。いくつかの実施態様において、ΔＴ_ｍ ^{シグナルプローブ}は、少なくとも約７〜１５℃であり、代表的には、約１０〜１５℃の範囲である。ΔＴ_ｍ ^{シグナルプローブ}値の間隔は全部同じでもよいが、異なっていてもよい。

当業者は認識できるように、１回の複合的Ｔ_ｍアッセイに含まれうるシグナル−クエンチャープローブ対の数は、選択されたΔＴ_ｍ ^プローブとΔＴ_ｍ ^{シグナルプローブ}の間隔に一部依存する。さらに詳しく後述するように、さまざまな色の蛍光を発生させるシグナル標識のように識別可能なシグナルプローブ標識を使用することによって、１回の複合的アッセイでさらなる複雑さの程度が達成され得る。

当技術分野において周知されているように、特定のプローブのＴ_ｍ値は、外的要素（例えば、塩濃度、ｐＨなど）および内的要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ＧＣ含量、最も近くの隣接する相互作用など）によって決まる（例えば、Ｗｅｔｍｕｒ，１９９１，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：２２７−２５９；Ｗｅｔｍｕｒ，１９９５，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｙｅｒｓ，Ｅｄ．ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．６０５−６０８；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１２：４３７−４４０；Ｇａｆｆｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ ２
８：５８８１−５８８９など参照）。プローブと標的配列の間のミスマッチが、プローブのＴ_ｍ値を低下させる原因となりうる（例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：３３１−３３５；Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３５４３−３５５７を参照）。ミスマッチのタイプも、プローブのＴ_ｍ値の低下量に影響を与えうる。例えばＧ−Ｔミスマッチのように比較的安定したミスマッチは、ＤＮＡプローブのＴ_ｍ値を２〜３℃低下させることが知られている（例えば、Ｂｅｒｎａｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：１０１−１０７を参照）が、一方、より不安定なＣ−Ａミスマッチは、ＤＮＡプローブのＴ_ｍ値を８〜１０℃変化させることが知られている（例えば、Ｌａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：２２６２−２２６７；Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１０５５−１０６１を参照）。ミスマッチの位置と数もプローブのＴ_ｍ値に影響することが知られている（例えば、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，１９７９、前掲参照）。このように、標的配列に対するプローブの配列同一性％が、標的配列の相補鎖からプローブが解離するか、または融解する温度に直接影響を与えうる。プローブと標的配列との間の配列の違いまたはミスマッチが大きくなるほど、プローブのＴ_ｍ値は低下する。したがって、例えば、標的配列に完全に相補的な配列をもつプローブは、１個以上のミスマッチを含む配列をもつプローブよりも高い温度で解離するはずである。

特定のプローブのＴ_ｍ値は、その骨格の組成にも依存し得る。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡのオリゴのようなオリゴヌクレオチドプローブは、負に荷電したホスホジエステル骨格を有する。これも負に荷電したホスホジエステル骨格を有するｃＤＮＡ鎖などの標的配列にハイブリダイズすると、負電荷は互いに反発し合う。これに対して、ＰＮＡ核酸塩基オリゴマーなどのオリゴヌクレオチド模倣物には、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのポリヌクレオチドにハイブリダイズしても静電気的に反発しない中性の骨格をもつものがある。糖−グアニジル鎖交を含む核酸塩基オリゴマーなどの核酸塩基オリゴマーには、正に荷電していて、標的であるＤＮＡまたはＲＮＡのポリヌクレオチドにハイブリダイズすると静電気的に引かれるものがある。

上記の要素は、外在的なものであっても内在的なものであってもすべて、具体的な複合的適用について適当なＴ_ｍ値を有するシグナルプローブおよびクエンチャープローブを設計するために使用することができる。いくつかの実施態様において、シグナルプローブとクエンチャープローブの核酸塩基配列は、標的配列の領域に完全に相補的になるよう設計される。これらの実施態様では、上記した他の要素を合わせることで、必要であればプローブのＴ_ｍ値を調整したり変更したりすることができる。

また、１個以上の立体構造的にロックされたヌクレオチド（ＬＮＡヌクレオチド）をプローブ配列に取り込むことによって、プローブのＴ_ｍ値を調整したり変更したりすることができる。ＬＮＡヌクレオチドの同一性によって、ＬＮＡヌクレオチド当り２〜５℃までプローブのＴ_ｍ値を増加させることができる。例えば、立体構造的にロックされたヌクレオチドの二環式チミジン（Ｔ）を含むプローブのＴ_ｍ値を、１回の修飾あたり２．０〜３．５℃の範囲で上昇させることができる。同様に、二環式シチジン（Ｃ）を含むプローブ配列のＴ_ｍ値を、１回の修飾あたり２℃以上上昇させることができる。１個よりも多いヌクレオチドをＬＮＡヌクレオチドで置換することによって、より大きな増加を達成することができる。例えば、米国特許第６，５０３，５６６号、国際公開第９９／１４２２６号および国際公開第００／５６９１６号を参照のこと。また、これらの文献はすべて、その全体が参考として本明細書中に援用される。

１個以上の二重鎖結合部分（ＤＢＭ）をプローブに結合させることによって、プローブのＴ_ｍ値をさらに調整したり変更したりすることができる。本明細書において、「二重鎖
結合部分」または「ＤＢＭ」とは、２本鎖のポリヌクレオチドに結合する分子を意味する。シグナルプローブまたはクエンチャープローブに含まれている場合、ＤＢＭは、ハイブリダイズしたプローブによって形成される二重鎖に結合して、ハイブリッドを安定化させ、Ｔ_ｍ値を増加させる。使用に適したＤＢＭは、インターカレート色素（既述）および浅い方の溝結合（ＭＧＢ）部分などであるが、これらに限定されるものではない。ＭＧＢ部分は、ＭＧＢ色素（既述）を含み、また、ポリヌクレオチドの２本鎖の浅い方の溝に結合する非蛍光分子を含む。使用に適した非蛍光ＭＧＢ部分は、ネトロプシン、ディスタマイシンおよびレキシトロプシン、ミトラマイシン、クロモマイシンＡ３、オリボマイシン、アントラマイシン、シビロマイシンなどであり、さらに関連抗生物質および合成誘導化合物である、ペンタミジン、スチルバミジンおよびベレニル（ｂｅｒｅｎｉｌ）などのジアリールアミジン、ＣＣ−１０６５および関連するピロロインドールおよびインドールポリペプチド、ならびに天然または合成のアミノ酸からなる多くのオリゴペプチドなどであるが、これらに限定されるものではない。

さらに適当なＭＧＢ部分、また、化学的性質、リンカー、およびそれらが結合するのに適している位置が、米国特許第６，４９２，３４６号および第６，４８６，３０８号に記載されており、これらの開示内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

蛍光性のＤＢＭが、シグナル標識でないシグナルプローブに含まれる場合には、シグナル標識の発光スペクトルからＤＢＭの発光スペクトルを確実に識別できるように（スペクトルによって分離できるように）注意しなければならない。また、シグナルプローブが標的配列にハイブリダイズしているときにシグナル標識によって産生されるシグナルを、シグナルプローブに含まれるこのようなＤＢＭがクエンチすることのないよう注意を払う必要がある。

再び、図２Ａを参照すると、標的ポリヌクレオチド１０は、シグナル−クエンチャーのプローブ対１６、２２、２８と接触する。標的配列（１２および１４）とプローブ対が接触するときの条件（例えば、標的／プローブ濃度、塩濃度、ｐＨなど）は変動し得るが、シグナルプローブとクエンチャープローブのＴ_ｍ値を計算および／または実験的に測定した条件によって決めることができる。理想的には、標的配列とプローブ対が接触させられる条件は、シグナルプローブとクエンチャープローブのＴ_ｍ値を計算および／または実験的に測定するのに使用した条件と同じである。当業者は、特定の適用に適したハイブリダイゼーション条件を選択することに精通している。

本発明のプローブおよび標的配列に関するハイブリダイゼーション条件を最適化するために変えることができるハイブリダイゼーション変数は、標的／プローブの濃度、シグナルプローブ／クエンチャープローブの濃度、塩濃度、ｐＨおよびハイブリダイゼーション用緩衝液のその他の成分などである。ホルムアミドのような不安定化剤を緩衝液に加えることもできる。当業者は、特定の適用についてハイブリダイゼーション条件を最適化するために変えられる適当なハイブリダイゼーション変数を選択することに精通している。

ポリヌクレオチド試料１０がシグナル−クエンチャープローブ対に接触すると、シグナルプローブのシグナル標識によって産生される検出可能なシグナルを温度の関数として観測する。使用される検出システムは、シグナルプローブ標識によって産生される検出可能なシグナルの性質によって決まり、それは当業者にとって明らかに分かる。蛍光シグナル標識からの発光を（１つ以上の波長で）測定する装置は、さまざまな温度で蛍光シグナル標識からの発光を（１つ以上の波長で）測定する装置として市販されている。このような装置は、一例を挙げれば、Ｒｏｃｈｅ（以前はＩｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手できるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ^ＴＭ 計器、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手できるＰｒｉｓｍ ^ＴＭ ７７００、７
９００、７０００配列検出装置などであるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施態様において、シグナルプローブのシグナル標識における発光を、好ましくは、その最大発光波長そのものか、その近傍で、低下する温度の関数として観測する。測定は、第１の温度で発光を得、それよりも低い温度で測定を繰り返すことによって段階的に行なうことができる。あるいは、発光の測定は、継続的に観測するか、温度が下がって行くにつれて不連続な温度点で観測することができる。発光の測定を継続的に観測するとき、温度は、約１００〜１０，０００ミリ秒／℃の速度で低下する。発光の測定を不連続な温度点で観測するとき、温度を、約０．０１〜５℃／分の範囲の速度で、またはより好ましくは、約０．０１〜１℃／分、０．１〜１℃／分または０．５〜１℃／分の範囲で測定する。

継続的に観測する場合でも、不連続な温度で観測する場合でも、最も高いＴ_ｍ値をもつプローブ（一般的には第１シグナルプローブ）のＴ_ｍ値と最も低いＴ_ｍ値をもつプローブ（一般的にはｎ番目のシグナルプローブ、または場合によってｎ番目のクエンチャープローブ）のＴ_ｍ値を含む温度範囲にわたり、シグナルプローブによって産生される検出可能なシグナルを観測する。好適には、すべてのシグナルプローブとクエンチャープローブがハイブリダイズしていないことを保証するのに十分な高温である開始温度から、すべてのシグナルプローブとクエンチャープローブがハイブリダイズしていることが確実な十分に低い最終温度まで、検出可能なシグナルを観測する。３０〜８５℃の範囲になるＴ_ｍ値を有するシグナル−クエンチャープローブ対については、９５〜２０℃の温度範囲にわたってシグナルプローブの検出可能なシグナルを観測することができる。

再び、図２Ａを参照すると、シグナルプローブ１８、２４および３０はすべて自己指示型である（すなわち、すべてのシグナルプローブは「オフ」である）ため、第１シグナルプローブ１８（パネルＡ）のＴ_ｍ値よりも高い開始温度では、すべてのプローブはハイブリダイズしないのでシグナルは検出されない。第１シグナルプローブ１８のＴ_ｍ値と第１クエンチャープローブ２０の間の温度において、シグナルプローブ１８が、ポリヌクレオチド１０上の標的配列１２の相補的な識別領域１１にハイブリダイズする（パネルＢ）。この温度では、シグナル標識１９ａが検出可能なシグナルを産生する（「オン」になる。１９ｃに図示）。第１クエンチャープローブ２０と第２シグナルプローブ２４のＴ_ｍ値の間の温度においては、第１クエンチャープローブ２０が、ポリヌクレオチド１０上の標的配列１２の相補的な非識別領域１３にハイブリダイズして、第１シグナルプローブ２０のシグナル標識１９ａによって産生されるシグナルをクエンチする（「オフ」にする）（パネルＣ）。第２シグナルプローブ２４と第２クエンチャープローブ２６のＴ_ｍ値の間の温度では、ポリヌクレオチド１０が、第２シグナルプローブ２０に相補的な標的配列の領域を含んでいたなら、ポリヌクレオチド１０への第２シグナルプローブ２４のハイブリダイゼーションが生じるが、図示した例においては、それは生じていない（パネルＤ）。したがって、第２シグナルプローブ２０はハイブリダイズしないままで、検出可能なシグナルを産生しない（「オフ」のままである）。図示した例では、第２クエンチャープローブ２６と第３シグナルプローブ３０のＴ_ｍ値の間の温度では（パネルＥ）、第２クエンチャープローブ２６もハイブリダイズしないままである。第３シグナルプローブ３０と選択的な第３クエンチャープローブ３２のＴ_ｍ値の間の温度では（パネルＦ）、第３シグナルプローブ３０がポリヌクレオチド１０上の標的配列１４の相補的な識別領域１７にハイブリダイズして、「オン」の状態にさせる。第３のシグナル−プローブ対２８が選択的な第３クエンチャープローブ３２を含んでいれば、温度を、ポリヌクレオチド１０上にある標的配列１４の相補的非識別領域１５にハイブリダイズする第３クエンチャープローブ３２のＴ_ｍ値よりも低くして（パネルＧ）、第３シグナルプローブ３０の検出可能なシグナルを「オフ」にすることができる。

各シグナルプローブの検出可能なシグナルが「オフ」と「オン」になったことは、温度に対して、検出可能シグナルの強度をプロットすることによって図に表すことができ（例えば、図２Ｂ参照）、その結果を、本明細書では、複合的Ｔ_ｍ曲線（またはシグナルプロフィール）と呼ぶ。特定の温度で検出された各シグナルは、特定の標的配列の存在を示す指標である。さらに、シグナルプロフィールの第１導関数を計算して、特定の温度において、検出可能なシグナルが「オン」になることを下降または谷として示し、シグナルが「オフ」になることを上昇またはピークとして示すグラフに描くことができる（例えば図２Ｃ参照）。当業者は、どのようにシグナルプロフィールをプロットして、その第１導関数を計算するか知っている。さらに、蛍光シグナル標識が使用される場合には、ほとんどの蛍光分光光度計が、その能力をもつソフトウエアとコンピュータを備えていて、所定の間隔で自動的に解析を行なうようプログラムすることができる。

あるいは、最も低いプローブＴ_ｍ値よりも低い温度から開始して、最も高いプローブＴ_ｍ値よりも高い温度で終わる上昇温度の関数として、シグナルプローブの検出可能なシグナルを観測することができる。ここでも、第１の温度での発光を得、それよりも高い温度で測定を繰り返すことによって測定を段階的に行なうことができる。あるいは、発光の測定を、約１００〜１０，０００ミリ秒／℃の速度で継続的に観測するか、例えば、約０．０１〜５℃／分の範囲の速度で、またはより好ましくは、約０．０１〜１℃／分、０．１〜１℃／分または０．５〜１℃／分の範囲で、温度が上昇して行くにつれて不連続な温度点で測定することができる。ハイブリダイゼーションの順序は、図２Ａに描かれている順序と逆になる。すなわち、図２ＡのパネルＧから始まって、図２ＡのパネルＡで終わる。したがって、解析を始めるときには、相補的プローブはすべて標的にハイブリダイズしていて、シグナルプローブはすべて「オフ」になっている。温度が上昇するにつれて、第３クエンチャープローブ３２が融解して離れ、第３シグナルプローブ３０が「オン」になることができ、その他も同じようになって、全てのプローブが融解して離れ（パネルＡ）、シグナルが検出されなくなる。パネルＧからパネルＡまでの過程で得られるシグナルプロフィール、およびこのシグナルプロフィールの第１導関数を、それぞれ図２Ｄおよび２Ｅに示す。選択的な第３クエンチャープローブ３２を使用しない場合には、一連の事象は、図２ＡのパネルＦから始まり、図２ＡのパネルＡまで進行することに留意されたい。

したがって、アッセイの間、温度を上昇（または増加）させることによって、または、温度を下降（または減少）させることによって、標的配列の存在に対応するシグナルを、温度の関数として検出することができる。したがって、多数のプローブを用いて、１つのポリヌクレオチド上または多数のポリヌクレオチド上にある１つ以上の標的配列を検出することができる。標的配列の存在に対応するシグナルは、温度の関数として検出されるため、いくつかの実施態様では、多数のさまざまな標的配列を検出するための識別可能な、またはスペクトルによって分析可能なシグナル標識を使用する必要はない。各プローブは異なったＴ_ｍ値をもち、標的配列の存在に対応するシグナルは温度の関数として検出されるため、複数のシグナルプローブ上で同一のシグナル標識を用いることができる。

シグナル−クエンチャープローブ対を利用するＴ_ｍ 複合化は、ミスマッチによるハイブリダイゼーションの報告がないとおり、シグナルプローブの特異性を効果的に高める。この重要で有利な特徴が図３に示されている。図３では、シグナル−クエンチャープローブ対が、一塩基多型性を含むポリヌクレオチド試料に接触している。シグナルプローブとクエンチャープローブのＴ_ｍ値の間の温度で、シグナルプローブがその相補配列にハイブリダイズして、検出可能なシグナルを産生する（パネルＡ）。シグナルプローブのＴ_ｍ値より低いが、ミスマッチハイブリダイゼーションのＴ_ｍ値より高い温度では（パネルＢ）、クエンチャープローブが、３つの多型標的のすべてにハイブリダイズして、ハイブリダイズしたシグナルプローブのシグナルをクエンチする。ミスマッチハイブリダイゼーションのＴ_ｍ値よりも低い温度では（パネルＣ）、シグナルプローブが、多型標的の一つに（ま
たは、ミスマッチのＴ_ｍ値によってはもっと多くに）ハイブリダイズする。しかし、この温度では、クエンチャープローブも多型標的にハイブリダイズするため、ミスマッチしたシグナルプローブは検出可能なシグナルを産生せず、そのシグナルは、隣接してハイブリダイズしたクエンチャープローブによってクエンチされる。クエンチャープローブを使用するため、ミスマッチハイブリダイゼーション現象は観察されない。その結果、シグナルプローブの特異性が効果的に高められる。多型的な標的の存在による干渉を受けることなく、正確な配列解析結果を得ることができる。異なった多型標的に相補的で、異なった識別可能標識をもつ、さらに別のシグナルプローブを使用することによって、１回のアッセイで、３つの多型的な標的配列をすべて正確に同定することができる。

当業者には理解できるように、シグナルプローブが自己指示プローブでなかったら、目的とする標的配列にハイブリダイズしなかった検出可能なシグナルプローブを除去するために、シグナルの検出は、洗浄段階が何回も必要になるか、連続的なフローシステムの使用を必要とする。

上記したところから明らかなように、Ｔ_ｍ複合的法とシグナル複合的法の両方を使用することによって、１回の複合的アッセイで同時に同定または解析できる配列の数の複雑さを高めることができる。本明細書において、「シグナル複合化」とは、シグナルプローブによって産生される検出可能なシグナルに基づいて行なわれる複合的方法を意味する。シグナル複合的方法では、シグナルプローブの少なくとも一部は、他から識別できる検出可能なシグナルを産生するシグナル標識を含む。このようにして、標的配列の有無は、特定の検出可能なシグナルの有無と相関している。このようなシグナル複合的法は、異なった多型に相補的なプローブを、さまざまなスペクトル分解可能な発光シグナルを放出するフルオロフォアで標識することによって、通常のＳＮＰポリヌクレオチドアッセイ法でも広く使用されている（すなわち、プローブはさまざまな色のフルオロフォアで標識される）。

二重のＴ_ｍおよびシグナルによる複合的方法の例を、各シグナルプローブ４０、４２が、第１の色を発色するフルオロフォアで標識されている２つのＴ_ｍ複合シグナル−クエンチャープローブ対と、シグナルプローブ４４が、第２のスペクトル分解可能な色を発色するフルオロフォアで標識されている１つのＴ_ｍ複合的のシグナル−クエンチャープローブ対を使用する実施態様を参照して図４に図解する。図解されている実施態様において、シグナルプローブはすべて自己指示シグナルプローブである。さらに、当業者は、クエンチャー標識の選択は、選択された特異的なシグナル標識によって決まることは認識しているが、クエンチャープローブはすべて同じクエンチャー標識で標識される。パネルＡにおいて、温度は、すべてのプローブのＴ_ｍ値よりも高い。その結果、シグナルプローブのいずれも、検出可能なシグナルを産生しない。パネルＢでは、温度は、シグナルプローブ４２および４４のＴ_ｍ値よりも低いが、すべてのクエンチャープローブのＴ_ｍ値よりは高い。この温度で、シグナルプローブ４２は、第１の色のシグナルを放出し、シグナルプローブ４４は、第２の色のシグナルを放出する。どちらのシグナルも同じ温度で出現するが、異なった色によって分析することができる。パネルＣでは、温度を下げるにつれて、プローブ４２と４４のシグナルが、それらに対応するクエンチャープローブのハイブリダイゼーションによってクエンチされる。さらに低い温度で（パネルＤ）、シグナルプローブ４０は、その相補的な標的配列にハイブリダイズして、第１の色のシグナルを放出する。シグナルプローブ４０および４２は、同じ色のシグナルを放出するが、異なったＴ_ｍ値によって互いを識別することが可能である。最後に、さらに低い温度では（パネルＥ）、シグナルプローブ４０に対応するクエンチャープローブは、それに相補的な標的配列にハイブリダイズして、シグナルプローブ４０のシグナルをクエンチする。図４から明らかなように、２つの異なった識別可能なシグナルのそれぞれに対応するシグナルプロフィールを得ることによって、数多くの標的配列を解析することができる。

この二重のＴ_ｍおよび色による複合的方法は、使用できる識別可能な標識の数によってのみ制限される。図４は、単一の第２発色シグナル−クエンチャープローブ対のみの使用を図解しているが、当業者は、特定の温度範囲で識別できるシグナル−クエンチャープローブ対の数によってのみ制限されるが、Ｔ_ｍ複合シグナル−クエンチャープローブ対を各識別可能な標識に使用できると認識できるはずである。さらに、図４に示すように、異なった識別可能な標識（例えば、色）で標識されたシグナルプローブは、同じＴ_ｍ値を有していてもよいし、異なったＴ_ｍ値であってもよい。同様に、それらに対応するクエンチャープローブは、異なって標識されたシグナルプローブのＴ_ｍ値と同一のＴ_ｍ値をもつことも可能であるが、異なっていてもよい。

本発明のＴ_ｍおよび二重のシグナル−Ｔ_ｍ複合的アッセイ法は、ポリヌクレオチド配列を解析または検出するのに有用なあらゆるタイプのハイブリダイゼーションによるアッセイ法において実際に使用することができる。一定の実施態様において、Ｔ_ｍおよび二重のシグナル−Ｔ_ｍ複合的アッセイ法を、増幅反応のエンドポイント解析法として使用することができる。このようなアッセイ法において、シグナル−クエンチャープローブ対は、増幅過程における増幅反応に含ませることも可能であるし、また、増幅が完了したところで反応混合物に加えることも可能である。増幅反応に含まれるとき、シグナルプローブとクエンチャープローブは、好ましくは、増幅反応で使用される酵素によっては作用を受けることのない核酸塩基ポリマー（例えば、ＰＮＡオリゴマー）である。増幅後、シグナル標識の検出可能なシグナルを、既に述べたように、温度の関数として観測する。増幅の後にＴ_ｍおよび／または二重Ｔ_ｍ−シグナル複合的解析を行なうのに適した機器としては、好ましくは、熱サイクル装置、コンピュータ、レポーター色素を励起するための光源（例えば、整調フィルターをもつレーザーまたはそれ以外の広域スペクトルの光源）、蛍光励起と発光のデータを収集するための光学装置、およびデータ収集と解析のためのソフトウエアを有する計測プラットフォームが挙げられる。本発明に係る方法において使用するのに適した増幅および検出システムの一例は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ５７００、７０００、７７００および７９００_ＨＴ検出システムであるが、これらに限定されるものではない。ＡＢＩの検出システムは、熱サイクル装置、蛍光検出ユニット、および、本発明に係る方法を用いて、増幅の各サイクルの間標的配列のリアルタイム検出を行なうための適用特異的ソフトウエアを含み、増幅反応後にさらに精製または解析を行なうことなく、検出された標的ポリヌクレオチドの定量的な測定を提供する。

（標的ポリヌクレオチドを検出するためのキット）
本明細書記載の方法で使用される組成物と試薬をパッケージしてキットにすることができる。いくつかの実施態様において、このキットは、感染症、遺伝的疾患、または細胞性疾患に関連する標的配列を検出するため、したがって、そのような疾患を診断するために使用することができる。

このような診断用キットは、例えば、標識されたシグナル−クエンチャープローブ対および選択的な増幅用プライマーを含むことも可能である。プローブまたはプライマーが非標識の状態で供給される場合には、特異的標識試薬もキット中に含ませることができる。また、このキットは、例えば、緩衝液、ｄＮＰＴ、および／または重合手段（例えば、逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼ）など、選択的な増幅に必要な、また、例えば、酵素および固相抽出剤など、検出解析に必要な別の適当なパッケージ化された試薬および材料、そして、アッセイ法を実施するための説明書を含むこともできる。

いくつかの実施態様において、キットは、一つ以上のポリヌクレオチドの複数の遺伝子座における変異または多型性の有無を判定するために使用することができ、１）第１の標的配列にあるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、それにハイブリダイズ
すると第１の検出可能な蛍光シグナルを発生させることができる第１のシグナルプローブ；２）第１のシグナルプローブとして同じ標的配列にクエンチできる近さでハイブリダイズすることができ、クエンチできる近さでそれにハイブリダイズすると、第１のシグナルプローブのシグナルをクエンチすることができる第１のクエンチャープローブであって、第１のシグナルプローブのＴ_ｍ値よりも低いＴ_ｍ値をもつ第１のクエンチャープローブ；３）第２の標的配列にある同じか異なるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、それにハイブリダイズすると第２の検出可能な蛍光シグナルを発生させることができる第２のシグナルプローブであって、第１のクエンチャープローブのＴ_ｍ値よりも低いＴ_ｍ値をもつ第２のシグナルプローブ；および４）第２のシグナルプローブとして同じ標的配列にクエンチできる近さでハイブリダイズすることができ、クエンチできる近さでそれにハイブリダイズすると、第２のシグナルプローブのシグナルをクエンチすることができる選択的な第２のクエンチャープローブであって、第２のシグナルプローブのＴ_ｍ値よりも低いＴ_ｍ値をもつ選択的な第２のクエンチャープローブを含む。

（本発明の方法および組成物の診断への適用）
いくつかの実施態様において、本明細書記載の組成物および方法は、感染症、遺伝的疾患、または細胞性疾患に関連する標的配列を検出して、そのような疾患を診断するために使用することができる。より具体的には、本明細書記載の組成物および方法を用いて、そのような疾患に関連する変異または配列の変動（例えば、遺伝子型判定）、および、例えば一塩基多型性（ＳＮＰｓ）などの多型性を検出することができる。

標的配列は、細菌（古細菌などの極限環境微生物（ｅｘｔｒｅｍｅｏｐｈｉｌｅ）を含む）、真菌、昆虫、魚、貝、は虫類、および／または哺乳類など、原核生物および真核生物から得ることができる。適当な哺乳類は、齧歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、家畜動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマなど）およびヒトであるが、これらに限定されるものではない。

いくつかの実施態様において、本明細書記載の組成物および方法を用いて、一定の疾患に関連するＳＮＰを検出することができる。例えば、いくつかのＳＮＰ、特にコード配列の中および近傍にあるＳＮＰには、治療上関連のある表現型改変体および／または病気の素因の直接の原因である可能性のあるものもある。臨床上重要な表現型をもたらす、数多くのよく知られている多型がある。例えば、ａｐｏＥ２／３／４改変体は、アルツハイマー病およびその他の病気のさまざまな関連リスクと関連がある（Ｃｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：８２８−９参照）。

いくつかの実施態様において、遺伝子診断にプローブを使用することができる。例えば、本明細書に開示されている技術を用いて、非ポリープ性結腸癌の遺伝子、ＢＲＣＡ１乳癌遺伝子、さまざまな癌に関連する遺伝子であるＰ５３、アルツハイマー病の大きなリスクを示すＡｐｏＥ４遺伝子などの標的配列を検出するためにプローブを作製することができ、患者、嚢胞性線維症遺伝子中の変異、またはその他当技術分野において周知のもののいずれかの簡単な発症前スクリーニングが可能になる。

いくつかの実施態様において、本明細書記載の組成物および方法を用いて、診断および／または遺伝子型判定のために細菌の配列を検出することができる。細菌の配列は、バチルス属；コレラ菌などのビブリオ菌；腸毒素産生性大腸菌などのエシェリキア属；志賀赤痢菌などの赤痢菌属；チフス菌などのサルモネラ属；ヒト結核菌、らい菌などのミコバクテリウム属；ボツリヌス菌、破傷風菌、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、ウェルチ菌などのクロストリジウム属；ジフテリア菌などのコリネバクテリウム属；化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌などの連鎖球菌；黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌；インフルエンザ菌などのヘモフィルス属；髄膜炎菌、淋菌などのナイセリア属；ペスト菌などのエルジニア属；緑膿菌、Ｐ
．ｐｕｔｉｄａなどのシュードモナス属；トラコーマクラミジアなどのクラミジア属；百日咳菌などのボルデテラ属；梅毒トレポネーマなどのトレポネーマ属など、目的の幅広い種類の病原性および非病原性の原核生物から得ることができる。

いくつかの実施態様において、本明細書記載の組成物および方法を用いて、診断および／または遺伝子型判定のためにウイルスの配列を検出することができる。どのウイルス由来のウイルス配列でも、本明細書記載の組成物および方法を用いて遺伝子型判定または同定を行なうことができる。特に関心があるのは、ヒトの病気の原因となるＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスである。例えば、ピコルナウイルス科（例、ポリオウイルス１−３、Ａ型肝炎）、カリシウイルス科、アストロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科（例、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）ウイルス）、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科（例、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（例、エボラウイルス）、オルトミクソウイルス科（例、Ａ型およびＢ型のインフルエンザ）、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、およびレトロウイルス科（例、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））に属するＲＮＡウイルスを、本明細書記載の組成物および方法を用いて検出できる。同様に、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎）、シルコウイルス科、パルボウイルス科、パピローマウイルス科（ヒトパピローマウイルス）、ポリオーマウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科（ヒトサイトメガロウイルス、ポックスウイルス科、およびイリドウイルス科に属するＤＮＡウイルスを、本明細書記載の組成物および方法を用いて検出できる。Ｆｉｅｌｄｓ「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（２００１）、第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，第１巻および２巻参照；これらは両方とも、その全体が参考として本明細書中に援用される。

例えば、いくつかの実施態様において、本明細書記載の組成物および方法を用いて「ウイルス特異的配列」を検出することができる。本明細書において「ウイルス特異的配列」とは、あるウイルスにとって遺伝子型特異的配列を有する標的配列を意味する。本明細書において、「遺伝子型特異的配列」とは、特定のウイルスの遺伝子型を同定し、少なくとも一つの別のウイルス遺伝子型、好ましくは３から５種類の別のウイルス遺伝子型、最も好ましくは、他のすべてのウイルス遺伝子型からそのウイルス遺伝子型を識別する配列を意味する。したがって、本明細書記載の方法では、遺伝子型特異的配列のプローブは、特定のウイルス遺伝子型を同定する配列に特異的に結合することによって、さまざまなウイルスの遺伝子型を区別する。

ウイルスの遺伝子型特異的配列を選択する方法は、当技術分野において知られている。例えば、既知のＨＣＶ配列を整列させて、ある遺伝子型を他の遺伝子型から区別する、配列間の変異をさがすことによって、ＨＣＶの遺伝子型特異的配列を選択することができる。さらに、ＨＣＶ配列を単離し配列決定して、既知のＨＣＶ配列と比較することができる。特に、ＨＣＶの全長ＲＮＡゲノムのＤＮＡ相補配列がクローニングされているので（例えば、Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：６５４７−６５４９（１９９０）；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２５４１−２４５５（１９９１）；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２６９７−２７０４（１９９１）；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：３３１−３４１（１９９２）を参照のこと）ので、ＨＣＶ遺伝子型特異的配列を選択するために利用することができる。ＨＣＶ単離株（例えば、患者の試料から）を単離して配列決定する方法、ならびにＨＣＶ遺伝子型特異的配列を選択する方法は、当技術分野においてよく知られている。さらに、既知または単離された配列を整列して、既知または単離された配列間の違いまたは変異に基づいてＨＣＶ遺伝子型特異的配列を選択する方法も、当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｌｉｅｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ９１：１０１３４−１０１３８（１９９４）；Ｌｅｉｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３４（９）：２２５９−２２６６（１９９６）参照）。

例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．のＬａｓｅｒｇｅｎｅソフトウエアパッケージを用いて、目的とする配列を整列させることができる。アラインメントの結果に基づいて、可能性のあるプローブを同定して、２次構造の程度について解析する。次に、可能性のあるプローブのＴ_ｍ値を計算して、必要があれば、Ｔ_ｍ値を調整して所望のＴ_ｍ値を得る。そして、プローブを合成して、実際のＴ_ｍ値を測定する。実際のＴ_ｍ値が、所望のＴ_ｍ値と相当に異なっていたら、改変したプローブを設計して合成する。Ｔ_ｍ値を予測／計算するために多くの刊行物を利用することが可能である。例えば、Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：３５５５−３５６２、およびＧｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：５００４−５００６を参照のこと。

ウイルスによっては、ウイルスゲノムのいくつかの領域を利用して、プローブの配列を設計することができる。例えば、ＨＣＶゲノムのいくつかの領域が、遺伝子型判定およびＨＣＶ単離株の分類に関連して調べられている。例えば、ＨＣＶゲノムの３２９から３４０塩基対の非構造（ＮＳ）５Ｂ領域、コア領域、および５’非翻訳領域が、ＨＣＶの遺伝子型判定の既知の方法において利用されている領域である（例えば、Ｓｔｕｙｖｅｒ ｅｔ ａ１，１９９５，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３８：１３７−１５７；Ｔｏｋｉｔａ ｅｔ
ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１０２２−１１０２６；Ｗｉｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ． ４４：２７２−２７９；Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ１． ７４：２３８５−２３９０；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１７４９−１７６１参照。これらの文献は全てその全体が参考として本明細書中に援用される）。

本明細書記載の方法では、シグナルプローブがそれぞれ、異なったウイルス遺伝子型特異的配列に結合する複合的アッセイ法において、多数のプローブを用いて複数のウイルス遺伝子型を同定することができる。例えば、１回の複合的アッセイで３種類の異なったシグナルプローブを使用して、３種類の異なったウイルス遺伝子型特異的標的配列の存在を検出することができる。したがって、シグナルプローブは、それぞれ、異なったウイルス遺伝子型特異的標的配列に相補的な識別配列を含む。同様に、１回の複合的アッセイで３種類の異なったクエンチャールプローブを使用して、３種類の異なったウイルス遺伝子型特異的標的配列の存在を検出することができる。各クエンチャープローブは、異なったウイルス遺伝子型特異的標的配列に相補的な識別配列を含む。

以下の実施例は、開示されている組成物および方法の例示であり、本明細書記載の組成物および方法の範囲を制限するものではない。本明細書記載の組成物および方法の精神と範囲を逸脱することなく、さまざまな変更および改変を加えうることは当業者に明らかであり、本明細書記載の組成物および方法をさまざまな用法および状態に適合させることができる。したがって、他の実施態様も包含される。

２００３年２月１８日に出願された米国特許出願第６０，４４８，４４０号の明細書の内容はすべて、その全体が参考として、また、あらゆる目的のために本明細書中に援用される。

（実施例１：Ｔ_ｍ複合的解析法を用いた標的配列識別法）
Ｔ_ｍ複合的アッセイ法が、さまざまな標的配列を明確に識別できることが、４種類の異なった標的配列に特異的なシグナル−クエンチャープローブ対によって実証された。標的、シグナルプローブおよびクエンチャープローブの配列を下の表１に示す。色素「ＤＹＥ１」の構造を以下に示す。

シグナルプローブは、アミノ末端をＤＹＥ１（シグナル標識）で、カルボキシル末端をダブシル部分（非蛍光クエンチャー）で標識した自己指示直鎖型ＰＮＡプローブであった。Ｄｙｅ１およびダブシルは、表１に示すように、それぞれの末端に直接結合しているか、アミノ酸リンカーを用いて間隔をおいて結合していた。

表１では、Ｌｙｓはアミノ酸Ｌ−リジンで、Ｇｌｕはアミノ酸Ｌ−グルタミン酸である。

ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ ７７００配列検出装置上でＴ_ｍ複合的解析法を実施した。各アッセイは、１種類の高Ｔ_ｍＰＮＡシグナルプローブ（ＰＮＡ１またはＰＮＡ２）およびそれに対応する標的ＤＮＡ、１種類の低Ｔ_ｍＰＮＡシグナルプローブ（ＰＮＡ３またはＰＮＡ４）およびそれに対応する標的ＤＮＡを含んでいた。高Ｔ _ｍ プローブと低Ｔ_ｍプローブの各組み合わせで、アッセイを２回、すなわち、ＰＮＡクエンチャープローブであるＰＮＡ５とともに１回、ＰＮＡ５なしで１回行った。クエンチャープローブは、ＰＮＡ１プローブおよびＰＮＡ２プローブがハイブリダイズする位置から１塩基下流の位置で標的配列とハイブリダイズする。各アッセイの試料容量は５０μＬで、５μＬの１０ＸＴａｑＭａｎバッファーＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、および１μＬの各プローブ、標的、およびクエンチャーを含んでいた。シグナルプローブと標的の最終濃度は、別段の記載がない限り０．２μＭであった。クエンチャープローブの最終濃度は０．４μＭであった。

アッセイのために、試料を速やかに９５℃まで加熱して、０．３３℃／分の速さで９０℃から３０℃までの蛍光データを収集した。すべてのアッセイを３回反復して行った。Ｄｙｅ１の蛍光シグナルは、配列検出装置のソフトウエアを用いて測定した。これらのシグナルの導関数（導関数プロフィール）は、蛍光分光光度計装置と同梱されていた解離曲線ソフトウエアを用いて計算した。

シグナルプローブＰＮＡ２とＰＮＡ４を用いて行われたアッセイのための蛍光シグナルの導関数プロフィールを図５Ａに示した。シグナルプローブＰＮＡ１とＰＮＡ３を用いて行われたアッセイのための導関数プロフィールを図５Ｂに示した。各図において、プラス記号（「＋」）を付されたプロフィールは、クエンチャープローブ存在下で行われたアッセイから得られたものである。マイナス記号（「−」）を付されたプロフィールは、クエンチャープローブ不在下で行われたアッセイから得られたものである。既に述べたように、図５Ａでは、ＰＮＡシグナルプローブのＰＮＡ４を２倍濃度（０．４μＭ）で用いた。

図５Ａを参照して、「＋」のプロフィールを温度が低下するのを追って（右から左に）見てみると、谷の後にピークがあり、その後にもう一つの谷が観察される。同じように「−」プロフィールを見ると、谷があるだけで、はっきりしたピークは見られない。２つのアッセイの唯一の違いは、第１の高Ｔ_ｍシグナルプローブ（ＰＮＡ２シグナルプローブ）からのシグナルを「オフにする」クエンチャープローブの存在である。ＰＮＡ２シグナルプローブのＴ_ｍ値は約７７℃であり、一方、ＰＮＡ４シグナルプローブのＴ_ｍ値は約６６℃である（約１１℃の差が得られる）。クエンチャープローブ（ＰＮＡ５）のＴ_ｍ値は約７２℃である。９０〜３０℃の範囲で温度を下げると、プローブがハイブリダイズする順序は、ＰＮＡ２＞ＰＮＡ５＞ＰＮＡ４の順である。「＋」プロフィールで見られた谷−ピーク−谷は、明確にプローブ−クエンチャーのハイブリダイゼーションがあったことを示している。これに対して、「−」曲線で観察された谷は、ＰＮＡ２とＰＮＡ４のシグナルプローブが、それぞれのＴ_ｍ値でハイブリダイズしてできた蛍光シグナルの混成物である。特定のＴ_ｍ値そのものか、その近傍にあるピークおよび谷として現れる結果のシグナルは、プローブと標的のこの特定の組み合わせの診断である。

図５Ｂのプロフィールは、図５Ａのプロフィールと同様である。この実験では、両シグナルプローブが０．２μＭで存在していた。ここでも、非常にはっきりした谷−ピーク−谷という形跡が、クエンチャープローブが存在する場合に得られたプロフィール（「＋」プロフィール）において明らかである。クエンチャープローブがない場合に得られたプロフィール（「−」プロフィール）も、谷−ピーク−谷という形跡を示しているが、明確ではない。この例では、２つのシグナルプローブにおけるＴ_ｍ値の差は、この前の例における差よりも大きい（Ｔ_ｍ ^ＰＮＡ１≒７９℃；Ｔ_ｍ ^ＰＮＡ３≒６４℃；約１５℃の差が得られる）。

上記実施例は、Ｔ_ｍ複合的アッセイ法が、密接な関係にある配列を明確に識別できることを実証しているが、このアッセイ法は、一定の疾患状態と関連している多型を識別するためにも利用することができる。臨床上重要な表現型をもたらす周知の多型性が数多くある。例えば、ａｐｏＥ／３／４改変体は、アルツハイマー病およびその他の病気のさまざまな相対的リスクと関連があり（Ｃｏｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：８２８−９参照）、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、血友病、嚢胞性線維症、およびさまざまな癌が、一つ以上の遺伝子変異と関連づけられてきた。これらの病気と関連する一塩基変異を検出できるようにプローブ対を設計することができる。

（実施例２：Ｔ_ｍ複合的解析法は、シグナルプローブの特異性を効果的に高める）
本実施例は、Ｔ_ｍ複合的アッセイ法が、シグナルプローブの特異性を効果的に高めて、非常に密接な関係にある標的配列を識別できることを実証する。

この実施例では、実施例１で説明された実験と同様の実験を、ＰＮＡ１プローブにミスマッチを１つ含む標的ＤＮＡを用いて行った。この実験では、シグナルプローブ−標的配列ハイブリッドのＴ_ｍ値が、クエンチャープローブ−標的ハイブリッドのＴ_ｍ値よりも低かったため、ＰＮＡ１プローブからのシグナルは、「＋」導関数プロフィールに記録されなかった。クエンチャープローブがまずハイブリダイズするため、シグナルプローブからのシグナルがクエンチされて観察されなかった（とても弱いシグナルだけが検出された）。クエンチャープローブが欠如している時には、シグナルはより低い温度で観察された。したがって、ミスマッチハイブリッドからのシグナルをクエンチすることによって、クエンチャープローブを使用することでシグナルプローブの特異性を効果的に高めた。

（実施例３：Ｔ_ｍ複合的解析法を用いた遺伝子型識別法）
Ｔ_ｍ複合的アッセイ法が、特定のＨＣＶ遺伝子型配列に特異的なシグナル−クエンチャープローブ対および合成したＨＣＶ特異的ＤＮＡ標的によって、近縁のＨＣＶ遺伝子型配列を明確に識別できることを実証した。プローブと標的配列の配列を、下の表２に示す。Ｄｙｅ１は、実施例１で使用したものと同じ色素である。下線を施したヌクレオチドは、シグナルプローブがハイブリダイズする配列を示している。

実施例１に記載したように複合的解析を行った。図７は、５つのＰＮＡと表２に示した３つの（合成）ＤＮＡ分子を含むハイブリダイゼーション実験からの蛍光の一次導関数を示している。蛍光シグナルの増加は、一次導関数において、冷却曲線における谷に対するピークとして現れる。用いた温度範囲は、図７のＸ軸に示されている。試料は３回反復で行った。９５℃から３０℃までの１９：５９分の冷却ステップの後、１９：５９分間にわたって３０℃から９５℃まで加熱してデータを集めた（冷却データは、示さず）。

５種類のハイブリダイゼーションが起きたことは図７で明らかである。これらの事象は
、約５６℃、６８℃および８３℃で観察された３つのピークと、約６３℃と７６℃で観察された２つの谷によって示されている。これらの結果は、本発明に係る方法を用いて、近縁の配列を容易に識別できることを示している。

本明細書で引用されている参考文献はすべて、その全体が、あらゆる目的のために参考として本明細書に明白に援用される。

図１Ａは、シグナルプローブとクエンチャープローブがともに、クエンチできる近さで標的配列を他の標的配列から識別するために使用することができる「識別力のある」核酸塩基配列を含む標的配列の一領域にハイブリダイズするように設計されているシグナル−クエンチャーのプローブ対を具体的に例示するものである。 図１Ｂは、シグナルプローブが、標的配列を試料中に存在しうる他の標的配列から識別するために使用することができる「識別力のある」核酸塩基配列を含む標的配列の領域にハイブリダイズするように設計されていて、クエンチャープローブが、「識別力のない」核酸塩基配列を含む標的配列の一領域にハイブリダイズするように設計されているシグナル−クエンチャーのプローブ対の例を例示するものである。 図１Ｃは、クエンチャープローブが、「識別力のある」核酸塩基配列を含む標的配列の領域にハイブリダイズするように設計されていて、シグナルプローブが、「識別力のない」核酸塩基配列を含む標的配列の一領域にハイブリダイズするように設計されているシグナル−クエンチャーのプローブ対の例を例示するものである。 図２Ａは、３種類の異なった自己指示（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ）型シグナルプローブが、識別不能なシグナル標識を有し、標的配列の区別領域にハイブリダイズするという例を参照して、Ｔ_ｍ複合的方法の基本原理を図示したものである。 図２Ｂは、図２Ａの例から、低下する温度の関数として得られたシグナルの理論的プロフィールを示している。 図２Ｃは、図２Ｂのシグナルプロフィールの理論的第１導関数のプロフィールを示している。 図２Ｄは、図２Ａの例から、上昇する温度の関数として得られたシグナルの理論的プロフィールを示している。 図２Ｅは、図２Ｄのシグナルプロフィールの理論的第１導関数のプロフィールを示している。 図３は、シグナル−クエンチャーのプローブ対によるＴ_ｍ 複合化の有利な特徴の１つを図示したものである。 図４は、２倍のＴ_ｍと色の複合化を使用する例（すなわち、第１の蛍光シグナル標識で標識されたシグナル−クエンチャープローブ対の第１のセット、および異なった色の第２の蛍光シグナル標識で標識されたシグナル−クエンチャープローブ対の第２のセット）を図示したものである。 図５Ａは、本明細書に記載されたＴ_ｍ 複合的方法を用いて得られたアッセイの実際のシグナルプロフィールを示している。 図５Ｂは、図５Ａのシグナルプロフィールの第１導関数を示す。 図６Ａは、シグナル−クエンチャーのプローブ対が、ポリヌクレオチドの同一鎖上にある標的配列にハイブリダイズする例を図示したものである。 図６Ｂは、シグナル−クエンチャーのプローブ対が、ポリヌクレオチドの別の鎖上にある標的配列にハイブリダイズする例を図示したものである。 図７は、実施例３に記載されたハイブリダイゼーション実験から得られたシグナルプロフィールの第１導関数を示している。

Claims (119)

1. 一つ以上の標的配列について、ポリヌクレオチド試料を分析する方法であって、該方法は、以下：
   一つ以上の標的配列を含むと推定されるポリヌクレオチド試料を、（ｉ）第１の標的配列の少なくとも一部にハイブリダイズし得、それにハイブリダイズする場合、第１の検出可能なシグナルを発生し得る第１のシグナルプローブ；（ｉｉ）該第１のシグナルプローブにクエンチする近さでハイブリダイズし得、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、該第１のシグナルプローブのシグナルをクエンチし得る第１のクエンチャープローブであって、該第１のシグナルプローブのＴ_ｍよりも低いＴ_ｍを有する第１のクエンチャープローブ；（ｉｉｉ）第２の標的配列の少なくとも一部にハイブリダイズし得、それにハイブリダイズする場合、第２の検出可能なシグナルを発生し得る少なくとも第２のシグナルプローブ；および（ｉｖ）該第２のシグナルプローブにクエンチする近さでハイブリダイズし得、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、該第２のシグナルプローブのシグナルをクエンチし得る任意の第２のクエンチャープローブであって、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも低いＴ_ｍを有する該任意の第２のクエンチャープローブと接触させる工程；
   該シグナルプローブの検出可能なシグナルを、温度の関数として直接検出する工程；ならびに
   該ポリヌクレオチド試料に一つ以上の標的配列が存在するか否かをそれから決定する工程、を包含し、
   さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、方法。
2. 前記第１の検出可能なシグナルおよび第２の検出可能なシグナルが、蛍光シグナルである、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の蛍光シグナルおよび第２の蛍光シグナルがスペクトル分解可能である、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが、前記第１のシグナルプローブのＴ_ｍよりも５〜１０℃低い範囲にあり、そして前記任意の第２のクエンチャープローブのＴ_ｍが、前記第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも５〜１０℃低い範囲にある、請求項１に記載の方法。
5. 前記第１の蛍光シグナルおよび第２の蛍光シグナルがスペクトル分解可能ではない、請求項２に記載の方法。
6. 前記第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが、前記第１のシグナルプローブのＴ_ｍよりも５〜１０℃低い範囲にあり、そして前記任意の第２のクエンチャープローブのＴ_ｍが、前記第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも５〜１０℃低い範囲にある、請求項５に記載の方法。
7. 前記第２のシグナルプローブのＴ_ｍが、前記第１のシグナルプローブのＴ_ｍよりも７〜１５℃低い範囲にある、請求項５に記載の方法。
8. 前記第１の蛍光シグナルおよび第２の蛍光シグナルが同一である、請求項５に記載の方法。
9. 前記任意の第２のクエンチャープローブが存在する、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１のシグナルプローブおよび第２のシグナルプローブが自己指示シグナルプローブである、請求項１に記載の方法。
11. 前記自己指示プローブがヘアピン型プローブである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記第１のシグナル、第１のクエンチャー、第２のシグナル、および任意の第２のクエンチャープローブが、ヌクレアーゼによる分解に抵抗性である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第１のシグナル、第１のクエンチャー、第２のシグナル、および任意の第２のクエンチャープローブが、それぞれ互いに独立に、ＤＮＡ核酸塩基オリゴマー、ＲＮＡ核酸塩基オリゴマー、およびＰＮＡ核酸塩基オリゴマーからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記第１のシグナル、第１のクエンチャー、第２のシグナル、および任意の第２のクエンチャープローブが、すべてＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡの核酸塩基オリゴマーである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記自己指示プローブが直鎖型自己指示プローブである、請求項１０に記載の方法。
16. 前記第１のシグナル、第１のクエンチャー、第２のシグナル、および任意の第２のクエンチャープローブが、ヌクレアーゼによる分解に抵抗性である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第１のシグナル、第１のクエンチャー、第２のシグナル、および任意の第２のクエンチャープローブが、それぞれ互いに独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡの核酸塩基オリゴマーからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
18. 前記第１のシグナル、第１のクエンチャー、第２のシグナル、および任意の第２のクエンチャープローブが、すべてＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡの核酸塩基オリゴマーである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記第１のシグナル、第１のクエンチャー、第２のシグナル、および任意の第２のクエンチャープローブが、すべてＰＮＡの核酸塩基オリゴマーである、請求項１７に記載の方法。
20. 各自己指示プローブが、ハイブリダイズしなかったシグナルプローブからハイブリダイズしたシグナルプローブを区別し得る標識を含む、請求項１０に記載の方法。
21. 前記標識が蛍光性のインターカレート色素である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記蛍光性インターカレート色素が、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、エチジウムブロマイドのホモダイマー、ヨウ化３，３’−ジエチルチアジカルボシアニン、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩおよびＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ、７−アミノアクチノマイシンＤ、およびアクチノマイシンＤからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記標識が、浅い方の溝に結合する蛍光性の色素である、請求項２０に記載の方法。
24. 前記浅い方の溝に結合する蛍光性の色素が、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８９、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、およびＨｏｅｃｈｓｔ ３４５８０などのビスベンズイミド色素、ならびにＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）などのインドール色素からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記検出可能なシグナルが、前記第１シグナルプローブのＴ_ｍよりも高い温度から、前記任意の第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低い温度まで低下する温度の関数として検出される、請求項１に記載の方法。
26. 前記検出可能なシグナルが、前記シグナルプローブおよびクエンチャープローブのＴ_ｍにほぼ等しい温度で検出される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記検出可能なシグナルが、前記シグナルプローブとクエンチャープローブのＴ_ｍとのほぼ中間の温度で検出される、請求項２５に記載の方法。
28. 前記温度が、０．０１℃／分〜５℃／分の範囲内の割合で低下する、請求項２５に記載の方法。
29. 前記検出可能なシグナルが、温度の関数として、１００ミリ秒〜１０，０００ミリ秒毎の範囲の割合で連続して検出される、請求項２５に記載の方法。
30. 前記検出可能なシグナルが、前記任意の第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低い温度から、前記第１のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高い温度まで上昇する温度の関数として検出される、請求項１に記載の方法。
31. 前記検出可能なシグナルが、前記シグナルプローブおよびクエンチャープローブのＴ_ｍにほぼ等しい温度で検出される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記検出可能なシグナルが、前記シグナルプローブおよびクエンチャープローブのＴ_ｍの中間の温度で検出される、請求項３０に記載の方法。
33. 前記温度が、０．０１℃／分〜５℃／分の範囲内の割合で上昇する、請求項３０に記載の方法。
34. 前記検出可能なシグナルが、温度の関数として、１００ミリ秒〜１０，０００ミリ秒毎の範囲の割合で連続して検出される、請求項３０に記載の方法。
35. 前記検出可能なシグナルが、前記第１のシグナルプローブおよび第２のシグナルプローブのＴ_ｍを決定することによって、温度の関数として検出される、請求項１に記載の方法。
36. 前記ポリヌクレオチド試料が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび増幅産物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
37. 前記ポリヌクレオチド試料が１本鎖である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記ポリヌクレオチド試料が、２つ以上の異なったポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
39. 前記標的配列が、２つ以上のポリヌクレオチド上に存在する、請求項１に記載の方法。
40. 前記標的配列が、同一のポリヌクレオチド鎖上に存在する、請求項１に記載の方法。
41. 前記標的配列が、２つの異なったポリヌクレオチド鎖上に存在する、請求項１に記載の方法。
42. 一つ以上の標的配列について、ポリヌクレオチド試料を分析する方法であって、該方法は、以下：
    ポリヌクレオチド試料を、（１）ｍ個のシグナル−クエンチャープローブ対の第１のセットであって、それぞれ、（ｉ）標的配列の一部にハイブリダイズし得、それにハイブリダイズする場合、第１の検出可能なシグナルを発生させ得る第１のシグナルプローブ、および（ｉｉ）該シグナルプローブにクエンチする近さでハイブリダイズし得、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、その検出可能なシグナルをクエンチし得る、対応する第１のクエンチャープローブを含む、第一のセットであって、ここで、該第１のシグナルプローブがもっとも高いＴ_ｍを有し、各クエンチャープローブのＴ_ｍが、それに対応するシグナルプローブのＴ_ｍよりも低く、各シグナルプローブのＴ_ｍが、それに先行するシグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低く、そして、さらに、最も低いＴ_ｍを有する該第１のセットの該シグナル−クエンチャープローブ対の該クエンチャープローブが任意である、第１のセット；ならびに（２）ｎ個のシグナル−クエンチャープローブ対の第２のセットであって、それぞれ、（ｉ）標的配列の一部にハイブリダイズし得、それにハイブリダイズする場合、該第１の検出可能なシグナルと区別可能な第２の検出可能なシグナルを発生させ得る第２のシグナルプローブ、および（ｉｉ）該シグナルプローブにクエンチする近さでハイブリダイズし得、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、その検出可能なシグナルをクエンチし得る、対応する第２のクエンチャープローブを含む第２のセットであって、ここで、各クエンチャープローブのＴ_ｍが、それに対応するシグナルプローブのＴ_ｍより低く、各シグナルプローブのＴ_ｍが、それに先行するシグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブのＴ_ｍより低く、そして、さらに、最も低いＴ_ｍを有する該第２のセットの該シグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブが任意である、第２のセットと接触させる工程；
    該第１および第２の検出可能なシグナルを、温度の関数として直接検出する工程；ならびに、
    該ポリヌクレオチド試料に一つ以上の標的配列が存在するか否かを決定する工程；
    を包含し、
    さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、方法。
43. ｍが、１〜１０までの範囲の整数であり、ｎが１〜１０までの範囲の整数である、請求項４２に記載の方法。
44. 各シグナル−クエンチャープローブ対のシグナルプローブとクエンチャープローブとの間のＴ_ｍの差が、５〜１０℃の範囲である、請求項４２に記載の方法。
45. 前記第１のセットのシグナルプローブのＴ_ｍが、７〜１５℃の温度範囲で互いに異なり、前記第２のセットのシグナルプローブのＴ_ｍが、７〜１５℃の温度範囲で互いに異なる、請求項４２に記載の方法。
46. 前記第１のセットの各シグナルプローブのＴ_ｍが、直前のシグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも５〜１０℃の範囲で低く、前記第２のセットの各シグナルプローブのＴ_ｍが、直前のシグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも５〜１０℃の範囲で低い、請求項４２に記載の方法。
47. 前記第１のセットおよび第２のセットのプローブのＴ_ｍが、２０℃〜９０℃の範囲である、請求項４２に記載の方法。
48. 請求項４２に記載の方法であって、該方法は、さらに、ｐ個のシグナル−クエンチャープローブ対の第３のセットを含み、該第３のセットのそれぞれが、標的配列の一部にハイブリダイズし得、前記第１の判別可能なシグナルおよび第２の判別可能なシグナルから判別され得る第３の検出可能なシグナルを発生させ得るシグナルプローブ、および、該シグナルプローブにクエンチする近さでハイブリダイズし得、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、その検出可能なシグナルをクエンチし得る、対応するクエンチャープローブを含み、ここで、各クエンチャープローブのＴ_ｍが、それに対応するシグナルプローブのＴ_ｍよりも低く、各シグナルプローブのＴ_ｍが、それに先行するシグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低く、そして、さらに、最も低いＴ_ｍを有するシグナル−クエンチャープローブ対のクエンチャープローブが選択的であり；そして、第１、第２および第３の検出可能なシグナルが温度の関数として検出される、方法。
49. 前記検出可能なシグナルが蛍光シグナルである、請求項４８に記載の方法。
50. 前期選択的なクエンチャープローブが存在する、請求項４８に記載の方法。
51. 前記シグナルプローブが自己指示シグナルプローブである、請求項４８に記載の方法。
52. 各自己指示シグナルプローブが、ヘアピン型の自己指示プローブである、請求項５１に記載の方法。
53. 各自己指示プローブが、直鎖型の自己指示プローブである、請求項５１に記載の方法。
54. 各自己指示シグナルプローブが、ハイブリダイズしたシグナルプローブをハイブリダイズしていないシグナルプローブから区別し得る標識を含む、請求項５１に記載の方法。
55. 前記プローブが、ヌクレアーゼによる分解に抵抗性である、請求項４８に記載の方法。
56. 各プローブが、ＤＮＡ核酸塩基オリゴマー、ＲＮＡ核酸塩基オリゴマー、およびＰＮＡ核酸塩基オリゴマーからなる群より独立に選択される、請求項４８に記載の方法。
57. 各プローブがＰＮＡ核酸塩基オリゴマーである、請求項５６に記載の方法。
58. 前記ポリヌクレオチドサンプルが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび増幅産物からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
59. 前記標的配列が同一のポリヌクレオチド鎖上に存在する、請求項４８に記載の方法。
60. 前記標的配列が、２つの異なったポリヌクレオチド鎖上に存在する、請求項４８に記載の方法。
61. 前記検出可能なシグナルが、前記第１シグナルプローブのＴ_ｍよりも高い温度から、選択的な前記第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低い温度まで低下する温度の関数として検出される、請求項４８に記載の方法。
62. 前記検出可能なシグナルが、前記シグナルプローブおよびクエンチャープローブのＴ_ｍにほぼ等しい温度で検出される、請求項６１に記載の方法。
63. 前記検出可能なシグナルが、前記シグナルプローブのＴ_ｍとクエンチャープローブのＴ_ｍとの中間の温度で検出される、請求項６１に記載の方法。
64. 前記温度が、０．０１℃／分〜５℃／分の範囲内の割合で低下する、請求項６１に記載の方法。
65. 前記検出可能なシグナルが、温度の関数として、１００ミリ秒〜１０，０００ミリ秒の範囲の割合で連続して検出される、請求項６１に記載の方法。
66. 前記検出可能なシグナルが、選択的な前記第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低い温度から、前記第１のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高い温度まで上昇する温度の関数として検出される、請求項４８に記載の方法。
67. 前記検出可能なシグナルが、前記シグナルプローブおよびクエンチャープローブのＴ_ｍにほぼ等しい温度で検出される、請求項６６に記載の方法。
68. 前記検出可能なシグナルが、前記シグナルプローブのＴ_ｍとクエンチャープローブのＴ_ｍとの中間の温度で検出される、請求項６６に記載の方法。
69. 前記温度が、０．０１℃／分〜５℃／分の範囲内の割合で上昇する、請求項６６に記載の方法。
70. 前記検出可能なシグナルが、温度の関数として、１００ミリ秒〜１０，０００ミリ秒毎の範囲の割合で連続して検出される、請求項６６に記載の方法。
71. 前記検出可能なシグナルが、前記第１のシグナルプローブおよび第２のシグナルプローブのＴ_ｍを決定する工程によって、温度の関数として検出される、請求項４８に記載の方法。
72. 生物の遺伝子型を判定する方法であって、該方法は、以下：
    該生物からのポリヌクレオチド試料、またはそれの増幅産物を、第１の複数のシグナル−クエンチャープローブ対と接触させる工程であって、該シグナル−クエンチャープローブ対のそれぞれは、種々の遺伝子型特異的配列に、クエンチする近さでハイブリダイズして、分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生成し得る、工程；
    該シグナル−クエンチャープローブ対に対して、温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを得る工程、および
    該生物の遺伝子型をそれから決定する工程、
    を包含し、
    該第１の複数のシグナル−クエンチャープローブ対が、第１および第２のシグナルプローブと第１および第２のクエンチャープローブとを含み、
    さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、方法。
73. 請求項７２に記載の方法であって、各シグナル−クエンチャーのプローブ対が、それぞれの遺伝子型特異的配列にハイブリダイズする場合、検出可能な蛍光シグナルを発生するシグナルプローブ、および、該シグナルプローブにクエンチする近さでハイブリダイズする場合、該シグナルプローブの検出可能な蛍光シグナルをクエンチするクエンチャープローブを含む、方法。
74. 前記シグナルプローブによって発生される前記検出可能な蛍光シグナルが、スペクトル分解可能ではない、請求項７２に記載の方法。
75. 少なくとも１つのシグナルプローブによって発生される前記検出可能な蛍光シグナルが、他のシグナルプローブによって発生される検出可能な蛍光シグナルからスペクトル分解され得る、請求項７２に記載の方法。
76. ウイルスの遺伝子型を判定する方法であって、該方法は、以下：
    ウイルス由来のポリヌクレオチドサンプル、またはそれの増幅産物を、第１の複数のシグナル−クエンチャープローブ対と接触させる工程であって、該シグナル−クエンチャープローブ対のそれぞれが、種々のウイルス遺伝子型特異的配列に、クエンチする近さでハイブリダイズして分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生み出し得る、工程；
    該シグナル−クエンチャープローブ対に対して、温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを得る工程、および
    該ウイルスの遺伝子型をそれから決定する工程、
    を包含し、
    該第１の複数のシグナル−クエンチャープローブ対が、第１および第２のシグナルプローブと第１および第２のクエンチャープローブとを含み、
    さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、方法。
77. 前記ウイルスがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、請求項７６に記載の方法。
78. 請求項６８または７６に記載の方法であって、種々の遺伝子型特異的配列に、クエンチする近さでハイブリダイズして分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生み出し得る第２の複数のシグナル−クエンチャープローブ対をさらに含む、方法。
79. 請求項７８に記載の方法であって、前記第１の複数の各シグナル−クエンチャーのプローブ対が、それぞれの遺伝子型特異的配列にハイブリダイズする場合、第１の検出可能な蛍光シグナルを発生するシグナルプローブ、および、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、該シグナルプローブの蛍光シグナルをクエンチするクエンチャープローブを含み、そして、該第２の複数の各シグナルプローブが、それぞれの遺伝子型特異的配列にハイブリダイズする場合、第２の検出可能な蛍光シグナルを発生するシグナルプローブ、および、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、該シグナルプローブの蛍光シグナルをクエンチするクエンチャープローブを含み、ここで、第１および第２の検出可能な蛍光シグナルが互いからスペクトル分解可能である、方法。
80. 前記第１の複数が、２〜１０個のシグナル−クエンチャープローブ対を含み、前記第２の複数が、２〜１０個のシグナル−クエンチャープローブ対を含む、請求項７９に記載の方法。
81. 前記シグナルプローブが自己指示シグナルプローブである、請求項７２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
82. 前記自己指示シグナルプローブが自己指示直鎖型ＰＮＡプローブである、請求項８１に記載の方法。
83. 前記遺伝子型特異的配列が、同一のポリヌクレオチド鎖上に存在する、請求項７２または７６に記載の方法。
84. 前記遺伝子型特異的配列が、異なったポリヌクレオチド鎖上に存在する、請求項７２または７６に記載の方法。
85. 目的のポリヌクレオチド配列の存在についてサンプルを分析する方法であって、該方法は、以下：
    該試料からのポリヌクレオチド、またはそれの増幅産物を、第１の複数のシグナル−クエンチャープローブ対に接触させる工程であって、該シグナルクエンチャープローブ対のそれぞれが、種々の既知の標的配列に、クエンチする近さでハイブリダイズして、分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生み出し得る、工程；
    該シグナル−クエンチャープローブ対に対して、温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを得る工程、および
    １つ以上の異なる標的配列の有無を決定する工程、
    を包含し、
    該第１の複数のシグナル−クエンチャープローブ対が、第１および第２のシグナルプローブと第１および第２のクエンチャープローブとを含み、
    さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、方法。
86. 請求項８５に記載の方法であって、前記第１の複数の各シグナル−クエンチャープローブ対のそれぞれが、それぞれの標的配列にハイブリダイズする場合、第１の検出可能な蛍光シグナルを発生させるシグナルプローブ、および、該シグナルプローブにクエンチする近さでハイブリダイズする場合、該シグナルプローブの検出可能な蛍光シグナルをクエンチするクエンチャープローブを含む、方法。
87. 請求項８５に記載の方法であって、前記第１の複数が、１個〜ｎ個までのシグナル−クエンチャープローブ対を含み、ある対の各クエンチャープローブのＴ_ｍが、前記シグナルプローブのＴ_ｍよりも低く、各ｎ番目のシグナルプローブのＴ_ｍが、１つ前の（ｎ−１）番目のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低い、方法。
88. 第２の複数のシグナルクエンチャープローブ対をさらに含む請求項８５に記載の方法であって、該シグナルクエンチャープローブ対のそれぞれは、種々の既知の標的配列に、クエンチする近さでハイブリダイズして、分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生み出し得る、方法。
89. 請求項８８に記載の方法であって、前記第２の複数の各シグナル−クエンチャーのプローブ対が、それぞれの標的配列にハイブリダイズする場合に第２の検出可能な蛍光シグナルを発生するシグナルプローブ、および、クエンチする近さでシグナルプローブにハイブリダイズする場合、シグナルプローブの蛍光シグナルをクエンチするクエンチャープローブを含み、ここで、該第１の検出可能な蛍光シグナルおよび第２の検出可能な蛍光シグナルが互いからスペクトル分解可能である、方法。
90. 請求項８８に記載の方法であって、前記第１の複数が、１〜ｍ個までのシグナル−クエンチャープローブ対を含み、そして、前記第２の複数が、１〜ｎ個までのシグナル−クエンチャープローブ対を含み、ここで、各対のクエンチャープローブが、そのシグナルプローブよりも低いＴ_ｍを有し、該第１の複数の各ｍ番目のシグナルプローブが、その１つ前の（ｍ−１）番目のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低いＴ_ｍを有し、そして、該第２の複数の各シグナルプローブが、その１つ前の（ｎ−１）番目のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低いＴ_ｍを有する、方法。
91. 前記シグナルプローブが自己指示シグナルプローブである、請求項８５〜９０のいずれか１項に記載の方法。
92. 前記自己指示シグナルプローブが自己指示直鎖型ＰＮＡプローブである、請求項９１に記載の方法。
93. 生物のポリヌクレオチドの遺伝子型を判定する複合的方法であって、該方法は、以下：
    複数の遺伝子型特異的アンプリコンおよび複数のシグナル−クエンチャープローブ対を生成するのに適した増幅プライマーの存在下でポリヌクレオチドを増幅する工程であって、該各シグナル−クエンチャーのプローブ対が、種々の遺伝子型特異的アンプリコンに、クエンチする近さでハイブリダイズし得、分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生み出し得る、工程；
    該シグナル−クエンチャープローブ対に対して、温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを得る工程、および
    それから該生物の遺伝子型を決定する工程、
    を包含し、
    該複数のシグナル−クエンチャープローブ対が、第１および第２のシグナルプローブと第１および第２のクエンチャープローブとを含み、
    さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、方法。
94. 前記増幅プライマーが遺伝子型特異的ではない、請求項９３に記載の方法。
95. 前記増幅プライマーが遺伝子型特異的である、請求項９３に記載の方法。
96. 前記ポリヌクレオチドが、ヒト、動物、細菌、真菌およびウイルスからなる群より選択される生物由来である、請求項９３に記載の方法。
97. 前記生物が、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からなる群より選択される、請求項９７に記載の方法。
98. 前記ポリヌクレオチドがＨＣＶのポリヌクレオチドである、請求項９７に記載の方法。
99. 前記プライマーが、ＨＣＶポリヌクレオチドの５’非翻訳領域を増幅する、請求項９３に記載の方法。
100. 前記ＨＣＶポリヌクレオチドが、ＨＣＶ ＲＮＡ、またはそれから誘導されたｃＤＮＡである、請求項９８に記載の方法。
101. 前記シグナル−クエンチャープローブ対が、直鎖型のＰＮＡ自己指示プローブである、請求項９３に記載の方法。
102. 目的の疾患について患者を診断するためのデータを提供する複合的方法であって、該方法は、以下：
     該患者に由来するポリヌクレオチドサンプルを、複数のシグナル−クエンチャープローブ対の存在下でインキュベートする工程であって、ここで、該シグナルクエンチャープローブ対のそれぞれは、目的の特定の疾患を示す種々の標的配列に、クエンチする近さでハイブリダイズし得、それにハイブリダイズする場合、分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生み出し得る、工程、および
     該シグナル−クエンチャープローブ対に対して、温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを得る工程、
     を包含し、
     該複数のシグナル−クエンチャープローブ対が、第１および第２のシグナルプローブと第１および第２のクエンチャープローブとを含み、
     さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、方法。
103. 目的の疾患について患者を診断するためのデータを提供する複合的方法であって、該方法は、以下：
     該患者に由来するポリヌクレオチドサンプルを、複数の異なったアンプリコンを生成させるのに適した増幅プライマー、および複数のシグナルクエンチャープローブ対の存在下で増幅する工程であって、該アンプリコンのそれぞれが、種々の目的の疾患と関連し、そして、該シグナルクエンチャープローブ対のそれぞれが、種々のアンプリコンに、クエンチする近さでハイブリダイズし得、分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生み出し得る、工程、および
     該シグナル−クエンチャープローブ対に対して、温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを得る工程、
     を包含し、
     該複数のシグナル−クエンチャープローブ対が、第１および第２のシグナルプローブと第１および第２のクエンチャープローブとを含み、
     さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、方法。
104. 複合ポリヌクレオチド分析のためのキットであって、該キットは、複数のシグナルクエンチャープローブ対を備え、該対のそれぞれは、クエンチする近さで種々の標的配列にハイブリダイズし得、そして、そのそれぞれの標的配列の存在下で分析可能な温度依存的ハイブリダイゼーションプロフィールを生み出し得、
     該複数のシグナル−クエンチャープローブ対が、第１および第２のシグナルプローブと第１および第２のクエンチャープローブとを含み、
     さらに該第１のシグナルプローブのＴ_ｍが該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高く、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍが該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも高く、かつ、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍが該第２のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも高いことを条件とする、キット。
105. 請求項１０４に記載のキットであって、各シグナル−クエンチャーのプローブ対が、そのそれぞれの標的配列の一部にハイブリダイズする場合、検出可能な蛍光シグナルを発生するシグナルプローブ、および該シグナルプローブに、クエンチする近さでハイブリダイズする場合、該シグナルプローブの検出可能な蛍光シグナルをクエンチするクエンチャープローブを備える、キット。
106. 請求項１０４に記載のキットであって、前記複数のシグナル−クエンチャープローブ対が、１個からｎ個までの範囲の数であり、ここで、選択的なｎ番目のクエンチャープローブのＴ_ｍが、そのそれぞれのｎ番目のシグナルプローブのＴ_ｍよりも低く、ｎ番目のシグナルプローブのＴ_ｍが、その前の（ｎ−１）番目のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低い、キット。
107. 前記シグナルプローブがヘアピン型自己指示プローブである、請求項１０４に記載のキット。
108. 前記シグナルプローブが直鎖型自己指示プローブである、請求項１０４に記載のキット。
109. 前記シグナルプローブが直鎖型自己指示ＰＮＡプローブである、請求項１０４に記載のキット。
110. 前記シグナルプローブが、蛍光シグナルを発生させ得る、請求項１０４に記載のキット。
111. 前記シグナルプローブのすべてが、同一の蛍光発生性レポーター色素で標識される、請求項１０４に記載のキット。
112. １つ以上のポリヌクレオチドの複数の遺伝子座に変異または多型があるか否かを決定するためのキットであって、該キットは、第１の標的配列の一領域でポリヌクレオチドとハイブリダイズして、それにハイブリダイズする場合、第１の検出可能な蛍光シグナルを発生させ得る第１のシグナルプローブ、該第１のシグナルプローブと同一の標的配列の別の領域に、クエンチする近さでハイブリダイズして、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、該第１のシグナルプローブのシグナルをクエンチし得、該第１のシグナルプローブのＴ_ｍよりも低いＴ_ｍを有する第１のクエンチャープローブ、第２の標的配列の一領域で同一かまたは異なったポリヌクレオチドにハイブリダイズして、それにハイブリダイズする場合、第２の検出可能な蛍光シグナルを発生させ得、該第１のクエンチャープローブのＴ_ｍよりも低いＴ_ｍを有する第２のシグナルプローブ、および、該第２のシグナルプローブと同一の標的配列の別の領域に、クエンチする近さでハイブリダイズして、クエンチする近さでそれにハイブリダイズする場合、該第２のシグナルプローブのシグナルをクエンチし得、該第２のシグナルプローブのＴ_ｍよりも低いＴ_ｍを有する任意の第２のクエンチャープローブを備え、該キットは、請求項１または４２に記載される直接検出する方法の実行を可能にする、キット。
113. 前記第１のシグナルプローブおよび第２のシグナルプローブがヘアピン型自己指示プローブである、請求項１１２に記載のキット。
114. 前記第１のシグナルプローブおよび第２のシグナルプローブが直鎖型自己指示プローブである、請求項１１２に記載のキット。
115. 前記第１のシグナルプローブおよび第２のシグナルプローブが直鎖型自己指示ＰＮＡプローブである、請求項１１２に記載のキット。
116. 前記第１のシグナルプローブおよび第２のシグナルプローブの全てが、同一の蛍光発生性レポーター色素によって標識される、請求項１１２に記載のキット。
117. ポリヌクレオチドの１つ以上の標的配列を増幅する工程に適した増幅プライマーをさらに備える、請求項１０４〜１１６のいずれか１項に記載のキット。
118. ポリメラーゼをさらに備える、請求項１１７に記載のキット。
119. 増幅に適したヌクレオシド三リン酸をさらに備える、請求項１１８に記載のキット。

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