KR101596474B1 - 동일 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 수식된 복수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형을 검출하는 방법 - Google Patents
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Abstract
[과제] 본 발명은, 측정 장치가 검출할 수 있는 형광 파장의 종류에 제한이 있는 경우, 또는, 프로브에 수식할 수 있는 형광 분자의 종류에 제한이 있는 경우에도, 한번에, 다수의 다른 유전자 변이를 측정하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
[해결수단] 형광 색소로 표지되며, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 복수 사용하여 복수의 유전자 다형을 동시에 검출하는 방법으로서, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드를 표지하는 형광 색소는 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소이며, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는, 상기 복수의 유전자 다형에 있어서의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 서로 근방의 온도가 되도록 설계되어 있고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있고, 1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
[해결수단] 형광 색소로 표지되며, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 복수 사용하여 복수의 유전자 다형을 동시에 검출하는 방법으로서, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드를 표지하는 형광 색소는 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소이며, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는, 상기 복수의 유전자 다형에 있어서의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 서로 근방의 온도가 되도록 설계되어 있고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있고, 1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형을 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
Description
본 발명은, 동일 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 수식된 복수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형을 검출하는 방법에 관한 것이다.
형광 색소로 표지한 프로브를 사용하여 표적 핵산의 변이를 해석하는 방법은 다수 존재한다.
특허문헌 1에는, 변이를 포함하는 영역을 PCR로 증폭한 후, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 변이를 해석하는 방법이 기재되어 있다. 특허문헌 1에서는, 청구항13에 「핵산 측정용의 신규 핵산 프로브의 종의 수와 적어도 동수(同數)의 종의 수의 파장에서 측정한다」고 기재되어 있는 바와 같이, 복수의 프로브를 사용하는 경우, 각각이 다른 파장의 형광 색소로 표지한 프로브를 사용하고 있다.
특허문헌 2에서는, 고상화(固相化)한 프로브로 유전자 변이를 검출하는 방법이 기재되어 있고, 청구항8에 「다른 파장의 형광을 발하는 복수종의 형광 물질이 결합하고 있다」고 기재되어 있는 바와 같이, 복수의 프로브를 사용하는 경우, 각각이 다른 파장의 형광 색소로 표지한 프로브를 사용하고 있다.
이와 같이 특허문헌 1, 2에서는, 복수의 프로브를 사용하는 경우, 각각이 다른 파장의 형광 색소로 표지한 프로브를 사용하고 있다.
특허문헌 1, 2에서는, 프로브의 수(즉, 검출하고자 하는 변이의 수)와 동수 이상의 다른 형광 파장이 필요하다고 되어 있다. 그러나, 측정 장치를 검출할 수 있는 형광 파장의 종류에 제한이 있는 경우, 또는, 프로브에 수식할 수 있는 형광 분자의 종류에 제한이 있는 경우에는, 측정할 수 있는 변이의 수도 제한되어 버린다. 또한, 그러한 경우에는 다른 시약을 사용하여, 수회에 걸쳐서 다른 유전자 변이를 측정할 필요가 있고, 시간이나 비용을 요한다.
본 발명은, 측정 장치가 검출할 수 있는 형광 파장의 종류에 제한이 있는 경우, 또는, 프로브에 수식할 수 있는 형광 분자의 종류에 제한이 있는 경우에도, 한번에, 다수의 다른 유전자 다형을 측정하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는, 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지되며, 또한, Tm값이 서로 근방의 온도가 되도록 설계된, 복수의 프로브를 1개의 반응계에 첨가하는 것에 의해, 1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형을 동시에 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 형광 색소로 표지되고, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 복수 사용하여 복수의 유전자 다형을 하나의 반응계에서 동시에 검출하는 방법으로서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드를 표지하는 형광 색소는 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소이며,
상기 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드는, 당해 유전자 다형의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과, 당해 유전자 다형의 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값을 갖고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼4℃이고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있고,
동일한 파장에서 복수의 유전자 다형을 하나의 반응계에서 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
(3) 상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼2℃인 (1) 기재의 방법.
(4) 상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼1℃인 (1) 기재의 방법.
(5) (1), (3) 또는 (4)에 기재된 유전자 다형의 검출 방법과, 상기 동일 또는 근방 파장 이외의 1종류 이상의 형광 색소 검출 파장을 사용한 유전자 다형의 검출 방법을 동시에 또는 연속하여 행하는, 유전자 다형의 검출 방법.
(6) (1), (3) 또는 (4)에 기재된 유전자 다형의 검출 방법과, 상기 동일 또는 근방 파장 이외의 2종류 이상의 형광 색소 검출 파장을 사용한 유전자 다형의 검출 방법을 동시에 또는 연속하여 행하는, 유전자 다형 검출 방법.
(7) 상기 제1 유전자형을 포함하는 서열이 야생형 서열이며, 상기 제2 유전자형을 포함하는 서열이, 야생형 서열에 대하여, 1염기 이상의 치환 변이, 삽입 변이, 결실(缺失) 변이를 갖는 서열인, (1) 및 (3)∼(6)의 어느 하나에 기재된 유전자 다형 검출 방법.
(8) 상기 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하며, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는, 다형 검출용 프로브인, (1) 및 (3)∼(7)의 어느 하나에 기재된 유전자 다형 검출 방법.
(9) 상기 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는, 다형 검출용 프로브인, (8) 기재의 유전자 다형 검출 방법.
(10) 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지된, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 복수의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 다형 검출용 프로브를 포함하는, 동일한 파장에서 복수의 유전자 다형을 하나의 반응계에서 동시에 검출하기 위한 키트로서,
상기 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드는, 당해 유전자 다형의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과, 당해 유전자 다형의 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값을 갖고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼4℃이고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있는, 키트.
(11) (1) 및 (3)∼(9)의 어느 하나에 기재된 유전자 다형 검출 방법을 사용하여 약효나 체질에 관련하는 유전자 다형의 유무를 측정하는 것을 포함하는, 개체에 있어서의 약효나 체질을 예측하는 방법.
(12) 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드가 복수 수용된 하나의 반응부,
상기 반응부에 시료 및/또는 반응액을 공급하는 송액부,
상기 반응부에 형광을 여기(勵起)시키기 위한 광을 조사하는 광원부,
상기 반응부의 온도를 제어하는 제어부, 및
형광을 검출하는 검출부
를 포함하는, 유전자 다형 검출장치로서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는, 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지되어 있으며, 상기 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드는, 당해 유전자 다형의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과, 당해 유전자 다형의 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값을 갖고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼4℃이고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있음을 특징으로 하는, 유전자 다형 검출 장치.
(13) 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드가 복수 수용된 반응계,
상기 반응계에 시료 및/또는 반응액을 공급하는 송액계,
상기 반응계에 형광을 여기시키기 위한 광을 조사하는 광원계,
상기 반응계의 온도를 제어하는 제어계,
형광을 검출하는 검출계, 및
검출 결과에 의거해 다형을 판정하는 판정계
를 포함하는, 유전자 다형 판정 시스템으로서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는, 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지되어 있으며, 상기 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드는, 당해 유전자 다형의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과, 당해 유전자 다형의 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값을 갖고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼4℃이고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있음을 특징으로 하는, 유전자 다형 판정 시스템.
본 발명의 방법에 의해, 검출 가능한 파장의 종류가 적은 장치를 사용한 경우나, 프로브를 수식 가능한 형광 분자의 종류가 적은 경우에도, 다수의 다형을 한번에 검출할 수 있다.
[도 1a] 실시예1의, 프로브로 3PB-EGFR-insWT-R5(서열 번호9), 3PB-EGFR-insWT-F4(서열 번호10), 및 3FL-EGFR-ins7-F1(서열 번호11)을 사용하고, 주형(鑄型)으로 EGFR-e20-ins-WT-F(서열 번호1)를 사용하고, 형광 색소는 Pacific Blue 및 BODIPY FL을 사용한 경우의, Tm 해석에 있어서의 단위 시간당의 Pacific Blue 및 BODIPY FL의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)과 온도와의 관계를 나타낸다(좌측 도면; Pacific Blue의 변화량, 우측 도면; BODIPY FL의 변화량을 나타낸다). 세로축은, 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t), 가로축은, 온도(℃)이다. 이하의 도면에 있어서는, 다른 주형의 조합으로 같은 실험이 이루어진 결과를 나타내고 있다.
[도 1b] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-ins9-F(서열 번호2)를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1c] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insCAC-R3(서열 번호14)을 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1d] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insTGCGTG-F(서열 번호4)를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1e] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insAACCCC-R6(서열 번호16)을 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1f] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insCCCCAC-R7(서열 번호17)을 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1g] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insAACCCCCAC-R8(서열 번호18)을 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1h] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insCACGTG-R9(서열 번호19)를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 2a] 실시예2의, 프로브로 3PB-858-G-PM(서열 번호20) 및 3PB-3A4-G-PM(서열 번호21)을 사용하고, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 100% 및 3A4-㎜(서열 번호24) 100%를 사용하고, 형광 색소는 Pacific Blue를 사용한 경우의, Tm 해석에 있어서의 단위 시간당의 Pacific Blue의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)과 온도와의 관계를 나타낸다. 세로축은, 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t), 가로축은, 온도(℃)이다. 이하의 도면에 있어서는, 다른 주형과의 조합으로 같은 실험이 이루어진 결과를 나타내고 있다.
[도 2b] 실시예2의, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 50%, 858-PM(서열 번호23) 50% 및 3A4-㎜(서열 번호24) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 2c] 실시예2의, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 90%, 858-PM(서열 번호23) 10% 및 3A4-㎜(서열 번호24) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 2d] 실시예2의, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 100%, 3A4-㎜(서열 번호24) 50% 및 3A4-PM(서열 번호25) 50%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 2e] 실시예2의, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 100%, 3A4-㎜(서열 번호24) 90%, 및 3A4-PM(서열 번호25) 10%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 3a] 실시예3의, 프로브로 3T-719-G-PM(서열 번호26), 3T-858-G-PM(서열 번호27) 및 3T-790-T-PM(서열 번호28)을 사용하고, 주형으로 719-G(서열 번호29) 100%, 858-G(서열 번호31) 100% 및 790-T(서열 번호33) 100%를 사용하고, 형광 색소는 TAMRA를 사용한 경우의, Tm 해석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)과 온도와의 관계를 나타낸다. 세로축은, 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t), 가로축은, 온도(℃)이다. 이하의 도면에 있어서는, 다른 주형의 조합으로 같은 실험이 이루어진 결과를 나타내고 있다.
[도 3b] 실시예3의, 주형으로 719-G(서열 번호29) 50%, 719-C(서열 번호30) 50%, 858-G(서열 번호31) 100% 및 790-T(서열 번호33) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 3c] 실시예3의, 주형으로 719-G(서열 번호29) 100%, 858-G(서열 번호31) 50%, 858-T(서열 번호32) 50% 및 790-T(서열 번호33) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 3d] 실시예3의, 주형으로 719-G(서열 번호29) 100%, 858-G(서열 번호31) 100%, 790-T(서열 번호33) 50% 및 790-C(서열 번호34) 50%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4a] 실시예4의, 프로브로 3T-719-G-PM(서열 번호26), 5PB-V12M-A-PM(서열 번호35), 3PB-UGT-T-PM(서열 번호36), 5FL-Q126X-T-PM(서열 번호37) 및 3FL-NAT-C-PM(서열 번호38)을 사용하고, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 100%, NAT-㎜(서열 번호46) 100% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용하고, 형광 색소는 TAMRA, Pacific Blue 및 BODIPY FL을 사용한 경우의, Tm 해석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA, Pacific Blue 및 BODIPY FL의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)과 온도와의 관계를 나타낸다(좌측 도면; Pacific Blue의 변화량, 중앙 도면; BODIPY FL의 변화량, 우측 도면; TAMRA의 변화량을 나타낸다). 세로축은, 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t), 가로축은, 온도(℃)이다. 이하의 도면에 있어서는, 다른 주형의 조합으로 같은 실험이 이루어진 결과를 나타내고 있다.
[도 4b] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 50%, V12M-㎜(서열 번호40) 50%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 100%, NAT-㎜(서열 번호46) 100% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4c] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 50%, UGT-㎜(서열 번호42) 50%, Q126X-PM(서열 번호43) 100%, NAT-㎜(서열 번호46) 100% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4d] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 50%, Q126X-㎜(서열 번호44) 50%, NAT-㎜(서열 번호46) 100% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4e] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 100%, NAT-PM(서열 번호45) 50%, NAT-㎜(서열 번호46) 50% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4f] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 50%, Q126X-㎜(서열 번호44) 50%, NAT-㎜(서열 번호46) 100%, 719-PM(서열 번호29) 50% 및 719-㎜(서열 번호30) 50%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1b] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-ins9-F(서열 번호2)를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1c] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insCAC-R3(서열 번호14)을 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1d] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insTGCGTG-F(서열 번호4)를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1e] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insAACCCC-R6(서열 번호16)을 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1f] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insCCCCAC-R7(서열 번호17)을 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1g] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insAACCCCCAC-R8(서열 번호18)을 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 1h] 실시예1의, 주형으로 EGFR-e20-insCACGTG-R9(서열 번호19)를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 2a] 실시예2의, 프로브로 3PB-858-G-PM(서열 번호20) 및 3PB-3A4-G-PM(서열 번호21)을 사용하고, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 100% 및 3A4-㎜(서열 번호24) 100%를 사용하고, 형광 색소는 Pacific Blue를 사용한 경우의, Tm 해석에 있어서의 단위 시간당의 Pacific Blue의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)과 온도와의 관계를 나타낸다. 세로축은, 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t), 가로축은, 온도(℃)이다. 이하의 도면에 있어서는, 다른 주형과의 조합으로 같은 실험이 이루어진 결과를 나타내고 있다.
[도 2b] 실시예2의, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 50%, 858-PM(서열 번호23) 50% 및 3A4-㎜(서열 번호24) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 2c] 실시예2의, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 90%, 858-PM(서열 번호23) 10% 및 3A4-㎜(서열 번호24) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 2d] 실시예2의, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 100%, 3A4-㎜(서열 번호24) 50% 및 3A4-PM(서열 번호25) 50%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 2e] 실시예2의, 주형으로 858-㎜(서열 번호22) 100%, 3A4-㎜(서열 번호24) 90%, 및 3A4-PM(서열 번호25) 10%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 3a] 실시예3의, 프로브로 3T-719-G-PM(서열 번호26), 3T-858-G-PM(서열 번호27) 및 3T-790-T-PM(서열 번호28)을 사용하고, 주형으로 719-G(서열 번호29) 100%, 858-G(서열 번호31) 100% 및 790-T(서열 번호33) 100%를 사용하고, 형광 색소는 TAMRA를 사용한 경우의, Tm 해석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)과 온도와의 관계를 나타낸다. 세로축은, 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t), 가로축은, 온도(℃)이다. 이하의 도면에 있어서는, 다른 주형의 조합으로 같은 실험이 이루어진 결과를 나타내고 있다.
[도 3b] 실시예3의, 주형으로 719-G(서열 번호29) 50%, 719-C(서열 번호30) 50%, 858-G(서열 번호31) 100% 및 790-T(서열 번호33) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 3c] 실시예3의, 주형으로 719-G(서열 번호29) 100%, 858-G(서열 번호31) 50%, 858-T(서열 번호32) 50% 및 790-T(서열 번호33) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 3d] 실시예3의, 주형으로 719-G(서열 번호29) 100%, 858-G(서열 번호31) 100%, 790-T(서열 번호33) 50% 및 790-C(서열 번호34) 50%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4a] 실시예4의, 프로브로 3T-719-G-PM(서열 번호26), 5PB-V12M-A-PM(서열 번호35), 3PB-UGT-T-PM(서열 번호36), 5FL-Q126X-T-PM(서열 번호37) 및 3FL-NAT-C-PM(서열 번호38)을 사용하고, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 100%, NAT-㎜(서열 번호46) 100% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용하고, 형광 색소는 TAMRA, Pacific Blue 및 BODIPY FL을 사용한 경우의, Tm 해석에 있어서의 단위 시간당의 TAMRA, Pacific Blue 및 BODIPY FL의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t)과 온도와의 관계를 나타낸다(좌측 도면; Pacific Blue의 변화량, 중앙 도면; BODIPY FL의 변화량, 우측 도면; TAMRA의 변화량을 나타낸다). 세로축은, 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t), 가로축은, 온도(℃)이다. 이하의 도면에 있어서는, 다른 주형의 조합으로 같은 실험이 이루어진 결과를 나타내고 있다.
[도 4b] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 50%, V12M-㎜(서열 번호40) 50%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 100%, NAT-㎜(서열 번호46) 100% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4c] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 50%, UGT-㎜(서열 번호42) 50%, Q126X-PM(서열 번호43) 100%, NAT-㎜(서열 번호46) 100% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4d] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 50%, Q126X-㎜(서열 번호44) 50%, NAT-㎜(서열 번호46) 100% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4e] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 100%, NAT-PM(서열 번호45) 50%, NAT-㎜(서열 번호46) 50% 및 719-㎜(서열 번호30) 100%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
[도 4f] 실시예4의, 주형으로 V12M-PM(서열 번호39) 100%, UGT-PM(서열 번호41) 100%, Q126X-PM(서열 번호43) 50%, Q126X-㎜(서열 번호44) 50%, NAT-㎜(서열 번호46) 100%, 719-PM(서열 번호29) 50% 및 719-㎜(서열 번호30) 50%를 사용한 경우의 결과를 나타내고 있다.
<1> 본 발명의 다형 검출 방법
본 발명의 다형 검출 방법은, 형광 색소로 표지되어, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 복수 사용하여 복수의 유전자 다형을 동시에 검출하는 방법으로서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드를 표지하는 형광 색소는 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소이며,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는, 상기 복수의 유전자 다형에 있어서의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 서로 근방의 온도가 되도록 설계되어 있고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있고,
1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형을 동시에 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서의 유전자 다형이란, 유전자 상의 특정한 위치에서의 염기의 형이 복수 있는 것을 의미하고, 다형에는 염기 치환, 1염기 이상의 삽입, 결실 등이 예시된다.
본 발명에 있어서의 「복수의 다형」이란, 1개의 유전자에서의 복수의 다형을 검출하는 경우, 및, 복수의 유전자에 대해서 각각 1개의 유전자 다형을 검출하는 경우의 양쪽이 포함된다.
본 발명의 방법에서는, 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지되어, 각각 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 복수의 올리고뉴클레오티드를 사용한다.
2종류의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우를 예로 하여 설명하면, 올리고뉴클레오티드1은 제1 다형 영역에 하이브리다이즈하고, 올리고뉴클레오티드2는 제2 다형 영역에 하이브리다이즈하고, 올리고뉴클레오티드1을 표지하는 형광 색소와 올리고뉴클레오티드2를 표지하는 형광 색소는 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는다.
여기에서, 근방이란, 형광값의 검출시에 측정 결과에 영향을 주는 것과 같은 간섭을 받는 파장 영역을 가리킨다. 이 근방인 파장 영역은 형광 색소의 조합에 따라 다르지만, 검출 파장(극대 파장)의 차가 예를 들면 200㎚ 이내, 100㎚ 이내, 50㎚ 이내, 또는 30㎚ 이내이다. 이렇게 검출 파장이 근방에 있는 형광 색소의 조합으로서는, 예를 들면, BODIPY FL과 FAM, BODIPY FL과 TRITC, Pacific Blue와 Alexa Fluor 405, TAMRA와 Alexa Fluor 670, TAMRA와 Alexa Fluor 700, TAMRA와 Texas Red 등이 있다. 즉, 본 발명의 방법에 있어서는, 반드시 동일한 형광 색소를 사용하지 않아도, 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 각 올리고뉴클레오티드를 표지하면, 1종류의 파장에서 복수의 다형을 동시에 검출할 수 있다.
본 발명에 있어서의 1종류의 파장이란, 동일 파장뿐만 아니라, 상기 근방의 파장 범위도 의미한다.
또, 동일한 검출 파장을 갖는 경우란, 통상은 복수의 올리고뉴클레오티드가 같은 형광 색소로 표지되어 있는 것을 의미한다.
또, 본 발명의 방법에 있어서는, 1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형의 검출이 행해지는 한, 1종류 또는 2종류 이상의 다른(상기 동일 또는 근방 이외) 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지된 1종류 또는 2종류 이상의 프로브를 사용한 유전자 다형(상기 복수의 유전자 다형과는 다른 유전자 다형)의 검출을 동시 또는 연속하여 행해도 된다. 즉, 1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형의 검출이 행해지는 한, 다른 1종류 또는 2종류 이상의 파장에서의 유전자 다형의 검출을 동시 또는 연속하여 행해도 된다.
본 발명의 방법에 있어서는, 복수의 올리고뉴클레오티드의 제1 유전자형을 포함하는 서열에의 Tm값을 근방 영역에 집약시켜 둔다. 여기에서, 근방의 온도 영역이란, 복수의 올리고뉴클레오티드의, 각각의 제1 유전자형을 포함하는 서열에의 Tm값 간의 차가 예를 들면, 0℃∼4℃, 0℃∼2℃, 또는 0℃∼1℃이다.
또한, 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 예를 들면, 3℃ 이상, 5℃ 이상, 또는 10℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있다.
제1 다형 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드1과, 제2 다형 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드2의 2종류의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우를 예로 하여 설명한다(또, 올리고뉴클레오티드는 3종류 이상 사용해도 된다).
제1 다형 영역의 제1 유전자형(예를 들면 야생형)에 대한 올리고뉴클레오티드1의 Tm값과, 제2 다형 영역의 제1 유전자형(예를 들면 야생형)에 대한 올리고뉴클레오티드2의 Tm값과의 온도차가 예를 들면, 0℃∼4℃, 0℃∼2℃, 또는 0℃∼1℃이다.
그리고, 제1 다형 영역의 제1 유전자형(예를 들면 야생형)에 대한 올리고뉴클레오티드1의 Tm값과, 제1 다형 영역의 제2 유전자형(예를 들면 변이형)에 대한 올리고뉴클레오티드1의 Tm값과의 온도차가 3℃ 이상, 5℃ 이상, 또는 10℃ 이상이다.
또한, 제2 다형 영역의 제1 유전자형(예를 들면 야생형)에 대한 올리고뉴클레오티드2의 Tm값과, 제2 다형 영역의 제2 유전자형(예를 들면 변이형)에 대한 올리고뉴클레오티드2의 Tm값과의 온도차가 예를 들면, 3℃ 이상, 5℃ 이상, 또는 10℃ 이상이다.
또, 제1 다형 영역의 제2 유전자형(예를 들면 변이형)에 대한 올리고뉴클레오티드1의 Tm값과, 제2 다형 영역의 제2 유전자형(예를 들면 변이형)에 대한 올리고뉴클레오티드2의 Tm값과는 온도차가 0℃여도 되지만, 양(兩)변이를 판별하기 위해서는 1℃ 이상이다.
제1 유전자형을 포함하는 서열이 야생형 서열이며, 제2 유전자형을 포함하는 서열이, 야생형 서열에 대하여, 1염기 이상의 치환 변이, 삽입 변이 및/또는 결실 변이를 갖는 변이형 서열인 경우에는, 야생형 서열에 대한 피크를 일정 온도 영역에 집약시켜 두고, 야생형에 대한 피크를 검출하지 않고, 변이형 서열을 검출하는 것이 가능하게 된다.
즉, 야생형의 Tm값은 일정 온도 영역에 포함되므로, 변이형에 해당하는, 야생형의 Tm값으로부터 변동한 피크를 검출하는 것에 의해, 변이형의 유무를 검출할 수 있다.
즉, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대하여 융해 곡선 해석의 피크(즉 Tm값)를 미리 일정한 온도 영역에 집약시켜 두는 것에 의해, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대해서는 융해 곡선 해석의 피크를 측정하지 않아도, 제2 유전자형을 포함하는 서열의 피크(바람직하게는, 상술과 같이, 제1 유전자형을 포함하는 서열의 피크로부터 3℃ 이상 변동한 피크)를 측정하는 것에 의해, 변이를 검출하는 것이 가능하게 된다.
예를 들면, 올리고뉴클레오티드로서, 제1 유전자형(야생형)을 포함하는 서열과 100% 매치하고, 제2 유전자형(변이형)을 포함하는 서열에 미스 매치를 포함하는 서열을 선택하고, 상술과 같이, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값보다 3℃ 이상, 바람직하게는 5℃ 이상, 보다 바람직하게는 10℃ 이상 높아지도록 하는 것이 바람직하다.
혹은, 제1 유전자형(야생형)을 포함하는 서열에 대하여 미스 매치를 포함하고, 제2 유전자형(변이형)을 포함하는 서열에 100% 매치하는 프로브 서열을 선택하고, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값보다 3℃ 이상, 바람직하게는 5℃ 이상, 보다 바람직하게는 10℃ 이상 낮아지도록 해도 된다.
또, 제1 유전자형과 제2 유전자형은 어느 것이나 변이형이어도 된다. 제1 유전자형을 포함하는 서열 및 제2 유전자형을 포함하는 서열이 함께 변이형 서열인 경우에는, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대하여, 제2 유전자형을 포함하는 서열이, 새로운 변이를 포함하는가 아닌가를 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 사용되는, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 일본 특개2001-286300호 공보 및 일본 특개2002-119291호 공보 등에 기재되는 것과 같은, 말단부가 형광 색소에 의해 표지된 소광 프로브를 사용할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 프로브는, 예를 들면, 표적 서열에 하이브리다이제이션하지 않을 때와 비교하여, 표적 서열에 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 감소 또는 증가한다. 본 발명에 있어서의 올리고뉴클레오티드 프로브는, 예를 들면, 하이브리다이제이션하지 않을 때에 형광 색소의 형광이 발광하고, 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 소광하는, 소광 프로브이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이로서는, 특별히 제한되지 않지만, 제1 유전자형을 포함하는 서열과 제2 유전자형을 포함하는 서열의 사이에서, Tm값의 차를 얻기 위해 예를 들면, 40 염기길이 이하이고, 예를 들면, 11∼40 염기길이, 12∼30 염기길이, 15∼30 염기길이, 또는 18∼30 염기길이이다.
본 발명에 있어서 사용되는 유전자 다형을 검출하기 위한 프로브의 염기 서열의 예로서는, 예를 들면, 서열 번호9∼11, 서열 번호20∼21, 서열 번호26∼28, 서열 번호35∼38로 나타내는 프로브를 들 수 있다.
형광 색소로서는, 일본 특개2001-286300호 공보 및 일본 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 것을 사용할 수 있지만, 구체적인 예로서는, Pacific Blue, FAM, TAMRA, BODIPY FL 등을 들 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드에의 결합 방법은, 통상의 방법, 예를 들면 일본 특개2001-286300호 공보 및 일본 특개2002-119291호 공보에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 방법이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 융해 곡선 분석에 의해, 유전자 다형을 해석할 수 있다.
본 발명 방법은, 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지한 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것, 그리고, 당해 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브가 각각, 상기 복수의 유전자 다형에 있어서의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 서로 근방의 온도가 되도록 설계되고, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있는 것 외에는, 통상의 융해 곡선 분석(Tm 해석)의 방법에 따라 행할 수 있다. 융해 곡선 분석은, 예를 들면 일본 특개2001-286300호 공보 및 일본 특개2002-119291호 공보에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.
융해 곡선 분석에 있어서, 변이형의 피크가 검출되었을 때에, 변이가 존재하면 결론지을 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은, 유전자 다형을 검출하기 전 또는 유전자 다형을 검출하는 것과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 포함하고 있어도 된다.
핵산 증폭의 방법으로서는, 예를 들면 폴리머라제를 사용하는 방법이고, 그 예로서는, PCR, ICAN, LAMP 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우에는, 예를 들면 본 발명 프로브의 존재 하에서 증폭을 행한다. 사용하는 프로브에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다. 이에 의해, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm값을 해석하는 것뿐이므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 정제 등 할 필요가 없다. 따라서, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 같은 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요조차 없다. 따라서, 자동화도 용이하다.
본 발명에 있어서, 시료 중의 DNA는, 1본쇄 DNA여도 되고 2본쇄 DNA여도 된다. 상기 DNA가 2본쇄 DNA의 경우에는, 예를 들면, 상기 하이브리다이즈 공정에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 2본쇄 DNA를 분해시키는 공정을 포함한다. 2본쇄 DNA를 1본쇄 DNA에 분해하는 것에 의해, 다음 하이브리다이즈 공정에 있어서, 검출용 프로브와의 하이브리다이즈가 가능하게 된다.
핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산으로서는, 핵산을 함유하고 있으면 되며, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 혈액, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것이다. 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 또는 당해 샘플의 특성을 개변(改變)하기 위해 전처리한 후에 사용할 수 있다.
Tm 해석은, 본 발명 프로브의 형광 색소의 형광을 측정하는 것 외에는 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 형광의 측정은, 형광 색소에 따른 파장의 여기광을 사용하여 발광 파장의 광을 측정하는 것에 의해 행할 수 있다. Tm 해석에 있어서의 승온 속도는, 통상으로는, 0.1∼1℃/초이다. Tm 해석을 행할 때의 반응액의 조성은, 프로브와 그 염기 서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산과의 하이브리다이제이션이 가능하면 특별히 제한되지 않지만, 통상으로는, 1가의 양이온 농도가 1.5∼5mM, pH가 7∼9이다. PCR 등의 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭 방법의 반응액은, 통상, 이 조건을 만족하므로, 증폭 후의 반응액을 그대로 Tm 해석에 사용할 수 있다.
Tm 해석의 결과에 의거하는 유전자 다형의 검출은 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 본 발명에 있어서의 검출이란, 변이의 유무의 검출이나 변이의 양의 검출을 포함한다.
또, 본 발명의 다형 검출 방법에 의해, 유전자 다형을 검출할 수 있고, 검출된 다형의 유무에 의거하여, 약효나 체질에 관련하는 다형의 유무를 판단하고, 개체에 있어서의 약효나 체질을 예측할 수 있다. 예를 들면, EGFR 엑손20 삽입의 유전자 다형의 경우, 항암제인 게피티닙의 주효율(奏效率)을 판정할 수 있다.
<2> 본 발명 키트
본 발명 키트는, 본 발명의 다형 검출 방법에 사용하기 위한 키트이다.
즉, 본 발명의 키트는, 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지된 복수의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 다형 검출용 프로브를 포함하는, 1종류의 파장에서 복수의 유전자 다형을 동시에 검출하기 위한 키트로서, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 상기 복수의 유전자 다형에 있어서의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 서로 근방의 온도가 되도록 설계되어, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명 검출 키트는, 상기 프로브 외에, 핵산 증폭을 행하는데 필요한 시약류, 특히 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭을 위한 프라이머를 더 포함하고 있어도 된다.
본 발명 검출 키트에 있어서 프로브, 프라이머 및 기타의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.
<3> 본 발명 장치
본 발명 장치는 유전자 다형 검출 방법에 사용하기 위한 장치이며, 구체적으로는, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 복수의 올리고뉴클레오티드가 수용된 반응부, 상기 반응부에 시료 및/또는 반응액을 공급하는 송액부, 상기 반응부에 형광을 여기시키기 위한 광을 조사하는 광원부, 상기 반응부의 온도를 제어하는 제어부, 및 형광을 검출하는 검출부를 포함하고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는, <1> 본 발명의 다형 검출 방법에서 설명한 대로, 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지되어 있으며, 복수의 유전자 다형에 있어서의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 서로 근방의 온도가 되도록 설계되어 있고, 각각이 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있는 것을 특징으로 한다.
반응부에는 상기 복수의 올리고뉴클레오티드가 고정되어 있어도 되고, 사용 직전에 상기 복수의 올리고뉴클레오티드가 고정된 기판을 셋팅하도록 되어 있어도 된다.
송액부는 유전자를 포함하는 시료와 반응액을 동시에 송액할 수 있는 것이어도 되고, 별도로 송액할 수 있는 것이어도 된다. 또한, 세정액 등을 송액할 수 있도록 해도 된다.
광원부는 올리고뉴클레오티드를 표지하는 형광 색소에 대응한 여기 파장을 조사할 수 있는 광원이면 되지만, 1종류 또는 2종류 이상의 다른(상기 동일 또는 근방 이외) 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지된 1종류 또는 2종류 이상의 프로브를 사용한 유전자 다형(상기 복수의 유전자 다형과는 다른 유전자 다형)의 검출을 동시 또는 연속하여 행하는 경우에는, 다른 여기 파장을 조사할 수 있는 1종류 또는 2종류 이상의 광원을 병용해도 된다.
제어부는, 예를 들면, 반응부의 온도를 일정한 속도로 승온 및 강온할 수 있으며, 또한 일정한 온도로 유지할 수 있다.
검출부는 올리고뉴클레오티드를 표지하는 형광 색소에 대응한 동일 또는 근방의 검출 파장에서 검출할 수 있는 것이면 되지만, 1종류 또는 2종류 이상의 다른(상기 동일 또는 근방 이외) 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지된 1종류 또는 2종류 이상의 프로브를 사용한 유전자 다형(상기 복수의 유전자 다형과는 다른 유전자 다형)의 검출을 동시 또는 연속하여 행하는 경우에는, 다른 검출 파장을 검출할 수 있도록 해도 된다. 또한, 검출 대상을 제2 유전자형만으로 하고, 제2 유전자형을 포함하는 서열의 피크(예를 들면, 제1 유전자형을 포함하는 서열의 피크로부터 3℃ 이상 변동한 피크)만을 검출해도 된다.
<4> 본 발명 시스템
본 발명 시스템은 유전자 다형 검출 방법에 사용하기 위한 시스템이며, 구체적으로는, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 복수의 올리고뉴클레오티드가 수용된 반응계, 상기 반응계에 시료 및/또는 반응액을 공급하는 송액계, 상기 반응계에 형광을 여기시키기 위한 광을 조사하는 광원계, 상기 반응계의 온도를 제어하는 제어계, 형광을 검출하는 검출계, 및 검출 결과에 의거해 다형을 판정하는 판정계를 포함하고, 상기 복수의 올리고뉴클레오티드는, <1> 본 발명의 다형 검출 방법에서 설명한 대로, 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지되어 있으며, 복수의 유전자 다형에 있어서의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 서로 근방의 온도가 되도록 설계되어 있고, 각각이 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있는 것을 특징으로 한다.
반응계, 송액계, 광원계, 제어계, 검출계는 상기의 본 발명 장치를 사용할 수 있다. 또한, 판정계는 본 발명 장치에 접속되어, 입력된 검출 결과에서 다형의 형의 판정이나 변이의 유무 등을 출력하는 컴퓨터와 같은 것이어도 된다.
[실시예]
이하, 실시예를 들어서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 제한되지 않는다.
실시예1(EGFR 엑손20 삽입의 주형 올리고뉴클레오티드를, 3종류의 프로브 및 2파장에서 검출하는 경우)
EGFR 엑손20 삽입에는 야생형(이하 WT) 외에 하기 7개의 광범위한 변이가 알려져 있다. EGFR 엑손20 삽입에 변이를 가진 환자의 게피티닙 주효율은 0%라고 말해지고 있으므로, EGFR 엑손20 삽입의 변이형(이하 mt)을 검출할 필요성이 있다.
서열 번호1로 나타내는 서열은, NM_005228.3 GENE ID : 1956에 있어서의 염기 번호2530-2579를 나타낸다.
[표 1]
특허문헌 1에 기재된 방법을 사용하여 모든 mt 타입을 커버하기 위해서는, 40bp 정도의 긴 프로브를 사용할 필요가 있지만, 이것으로는 Tm값의 차를 얻을 수 없고, 변이를 검출할 수 없을 가능성이 높다. 따라서, WT에 퍼펙트 매치이며, Tm값이 WT의 Tm값과 같은 프로브를 몇 개 준비하고, 또한, 그 형광기를 같은 파장으로 했다.
EGFR 엑손20 삽입의 유전자 다형의 부위를 포함하는 염기 서열(서열 번호1(야생형))에 의거하여, 이하의 표 2에 나타내는, 3’ 말단부에 C를 갖는 프로브(야생형(서열 번호9, 10) 및 변이형(서열 번호11))을 설계했다. 표 2 중, 프로브의 위치는, 서열 번호9, 10에 대해서는 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타내고, 서열 번호11에 대해서는 서열 번호7에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다. Pacific Blue 또는 BODIPY FL에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.
또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드(야생형 안티센스(서열 번호12) 및 변이형 안티센스(서열 번호13∼19))의 서열을 표 2에 나타낸다. 이들의 서열 번호12-19로 나타내는 서열은, 각각 서열 번호1-8의 완전 상보쇄이다.
또, 서열 번호9의 프로브에 의해 표 1의 mt1, 3을 검출할 수 있고, 서열 번호10의 프로브에 의해 표 1의 mt2, 4, 5, 7을 검출할 수 있고, 서열 번호11의 프로브에 의해 표 1의 mt6을 검출할 수 있다.
[표 2]
전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy IS-5310, 아크레이사제)를 사용하여 Tm 해석을 행했다. 또, 이하의 Tm 해석에서도, 특별히 명기하지 않는 한, 동(同)장치를 사용했다. 프로브 용액의 조성은 하기와 같다. 샘플은, 이하의 주형 올리고뉴클레오티드를 사용했다. Tm 해석의 조건은, 95℃, 1초→40℃, 60초→(40℃→85℃, 1℃/3초)로 했다.
Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 365∼415㎚ 및 445∼480㎚(Pacific Blue), 또는, 각각 420∼485㎚ 및 520∼555㎚(BODIPY FL)로 했다.
[표 3]
표 2의 프로브 및 표 3의 주형 올리고뉴클레오티드를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, WT, mt1, mt2, mt3, mt4, mt5, mt7에 대해서는, Pacific Blue의 변이형의 명료한 피크가 보였지만(도 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1h의 좌측 도면), mt6에 대해서는, Pacific Blue의 변이형의 피크는 보이지 않았다(도 1g의 좌측 도면). 또한, mt6에 대해서는, BODIPY FL의 변이형의 피크가 보였지만(도 1g의 우측 도면), WT, mt1, mt2, mt3, mt4, mt5, mt7에 대해서는, BODIPY FL의 변이형의 명료한 피크는 보이지 않았다(도 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1h의 우측 도면). 즉, mt1∼mt7의 어느 것에 대해서도 야생형의 피크(72℃)와는 다른 피크를 검출할 수 있었으므로, mt1∼mt7의 변이의 검출이 가능하다고 생각된다.
결과를 이하의 표 4에 나타낸다.
[표 4]
이상으로부터, 3PB-EGFR-insWT-R5, 3PB-EGFR-insWT-F4라고 하는 2종류의 프로브를 사용하여, 445∼480㎚라고 하는 1종류의 파장에서 복수의 변이를 검출할 수 있었다. 그리고, 3FL-EGFR-ins7-F1과 조합하는 것에 의해, EGFR 엑손20 삽입 변이의 전부를 검출할 수 있었다.
실시예2(다른 2종류의 유전자로 이루어지는 주형 올리고뉴클레오티드를, 2종류의 프로브 및 1파장에서 검출하는 경우)
표 5에 나타내는 대로, 서열 번호23으로 이루어지는 염기 서열에 상보적인 서열을 가지고, 말단부에 C를 갖는 프로브(3PB-858-G-PM(서열 번호20)에 대응)를 설계했다. 표 5 중, 프로브의 위치는, 서열 번호23으로 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다. 또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드인 퍼펙트 매치형, 이하 PM형(서열 번호23) 및 비검출 대상인 미스 매치형, 이하 ㎜형(서열 번호22)을 설계했다.
또한 표 5에 나타내는 바와 같이, 서열 번호25로 이루어지는 염기 서열에 상보적인 서열을 가지고, 말단부에 C를 갖는 프로브(3PB-3A4-G-PM(서열 번호21)에 대응)를 설계했다. 표 5 중, 프로브의 위치는, 서열 번호25에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다. 또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드인 PM형(서열 번호25) 및 비검출 대상인 ㎜형(서열 번호24)에 대응)을 설계했다.
[표 5]
PCR 반응액의 조성은 하기와 같다. 시료는, 이하의 조합의 주형 올리고뉴클레오티드를 사용했다. Tm 해석의 조건은, 95, 1초→40℃, 60초→(40℃→75℃, 3℃/1초)이었다.
Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 365∼415㎚ 및 445∼480㎚(Pacific Blue)로 했다.
[표 6]
표 5의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, 검출 대상인 핵산 서열(서열 번호23, 25)을 50% 포함하는 경우(도 2b, d), 10% 포함하는 경우(도 2c, e)에 상관없이, ㎜형의 피크에 더하여, PM형의 명료한 피크가 보였다.
즉, 어느 경우에 대해서도 ㎜형의 피크(55℃)와는 다른 피크를 검출할 수 있었으므로, 10%의 감도로 검출 대상인 PM형의 검출이 가능하다고 생각된다.
실시예3(다른 3종류의 유전자로 이루어지는 주형 올리고뉴클레오티드를, 3종류의 프로브 및 1파장에서 검출하는 경우)
표 7에 나타내는 바와 같이, 3종류의 염기 서열(서열 번호29, 31, 33)에 상보적인 서열을 가지고, 말단부에 C를 갖는 프로브(3T-719-G-PM, 3T-858-G-PM, 3T-790-T-PM(서열 번호26-28)에 대응)를 설계했다. 표 7 중, 프로브의 위치는, 각각 서열 번호29, 31, 33에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다. 또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드인 ㎜형(서열 번호30, 32, 34)과 비검출 대상인 PM형(서열 번호29, 31, 33)을 설계했다.
[표 7]
PCR 반응액의 조성은 하기와 같다. 시료는, 이하의 조합의 주형 올리고뉴클레오티드를 사용했다. Tm 해석의 조건은, 95℃, 1초→40℃, 60초→(40℃→75℃, 3℃/1초)이었다.
Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 520∼555㎚ 및 585∼700㎚(TAMRA)로 했다.
[표 8]
표 7의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, 검출 대상인 핵산 서열(서열 번호30, 32, 34)을 50% 포함하는 경우(도 3b, c, d), PM형의 피크에 더하여, ㎜형의 명료한 피크가 보였다.
즉, 어느 경우에 대해서도 야생형의 피크(65∼66℃)와는 다른 피크를 검출할 수 있었으므로, 다른 3종류의 유전자 다형의 검출이 가능하다고 생각된다.
실시예4(다른 5종류의 유전자로 이루어지는 주형 올리고뉴클레오티드를, 5종류의 프로브 및 3파장에서 검출하는 경우)
표 9에 나타내는 바와 같이, 5종류의 염기 서열(서열 번호29, 39, 41, 43, 45)에 상보적인 서열을 가지고, 말단부에 C를 갖는 프로브(3T-719-G-PM, 5PB-V12M-A-PM, 3PB-UGT-T-PM, 5FL-Q126X-T-PM, 3FL-NAT-C-PM((서열 번호26,35-38)에 대응))을 설계했다. 표 9 중, 프로브의 위치는, 각각 서열 번호29, 39, 41, 43, 45에 나타내는 염기 서열에 있어서의 염기 번호를 나타낸다. 또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드인 PM형(서열 번호39, 41, 43) 및 ㎜형(서열 번호30, 46), 및 비검출 대상인 ㎜형(서열 번호40, 42, 44) 및 PM형(서열 번호29, 45)을 설계했다.
[표 9]
PCR 반응액의 조성은 하기와 같다. 시료는, 이하의 주형 올리고뉴클레오티드를 사용했다. Tm 해석의 조건은, 95℃, 1초→40℃, 60초→(40℃→85℃, 3℃/1초)이었다.
Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 365∼415㎚ 및 445∼480㎚(Pacific Blue), 각각 420∼485㎚ 및 520∼555㎚(BODIPY FL), 또는, 각각 520∼555㎚ 및 585∼700㎚(TAMRA)로 했다.
[표 10]
표 9의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, Pacific Blue에 대해서는, 서열 번호40 및 42의 올리고뉴클레오티드를 갖는 경우에만 새로운 피크가 검출되고(도 4b, 4c의 좌측 도면), 서열 번호40 및 42의 올리고뉴클레오티드를 가지지 않는 샘플에 대해서는 2개의 피크만이 보였다(도 4a, 4d, 4e, 4f의 좌측 도면).
BODIPY FL에 대해서는, 서열 번호44 및 45의 올리고뉴클레오티드를 갖는 경우에만 새로운 피크가 검출되고(도 4d, 4e의 중앙도), 서열 번호44 및 45의 올리고뉴클레오티드를 가지지 않는 샘플에 대해서는 1개의 피크만이 보였다(도 4a, 4b, 4c, 4f의 중앙도).
TAMRA에 대해서는, 서열 번호29의 올리고뉴클레오티드를 갖는 경우에만 새로운 피크가 검출되고(도 4f의 우측 도면), 서열 번호29의 올리고뉴클레오티드를 가지지 않는 샘플에 대해서는 1개의 피크만이 보였다(도 4a∼e의 우측 도면).
이상으로부터, 5PB-V12M-A-PM, 3PB-UGT-T-PM이라고 하는 2종류의 프로브를 사용하고, 445∼480㎚라고 하는 1종류의 검출 파장에서 2종류의 올리고뉴클레오티드(서열 번호40 및 42)를 검출할 수 있었다. 또한, 5FL-Q126X-T-PM, 3FL-NAT-C-PM이라고 하는 2종류의 프로브를 사용하고, 520∼555㎚라고 하는 1종류의 검출 파장에서 2종류의 올리고뉴클레오티드(서열 번호44 및 45)의 변이를 검출할 수 있었다. 그리고, 3T-719-G-PM과 조합하는 것에 의해, 5종류의 변이의 전부를 검출할 수 있었다.
본 발명은, 약효나 체질에 관련하는 복수의 유전자 변이를 한번에 측정할 수 있는 방법을 제공한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Arkray Inc.
<120> METHOD FOR DETECTING A PLURALITY OF NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS AT A SINGLE WAVELENGTH USING A PLURALITY OF OLIGONUCLEOTIDES MODIFIED WITH FLUORESCENT DYE HAVING THE SAME OR CLOSE DETECTION WAVELENGTH
<130> P-110585
<150> JP2011-122900
<151> 2011-05-31
<160> 46
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
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<220>
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<223> 790-T
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<213> Artificial
<220>
<223> 790-C
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ccttctcctg caggtgacca ttgacggcag gaattacatt 40
Claims (13)
- 형광 색소로 표지되고, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 복수 사용하여 복수의 유전자 다형을 하나의 반응계에서 동시에 검출하는 방법으로서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드를 표지하는 형광 색소는 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소이며,
상기 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드는, 당해 유전자 다형의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과, 당해 유전자 다형의 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값을 갖고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼4℃이고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있고,
동일한 파장에서 복수의 유전자 다형을 하나의 반응계에서 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼2℃인 방법. - 제1항에 있어서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼1℃인 방법. - 제1항, 제3항 또는 제4항에 기재된 유전자 다형의 검출 방법과, 상기의 동일 또는 근방 파장 이외의 1종류 이상의 형광 색소 검출 파장을 사용한 유전자 다형의 검출 방법을 동시에 또는 연속하여 행하는, 유전자 다형의 검출 방법.
- 제1항, 제3항 또는 제4항에 기재된 유전자 다형의 검출 방법과, 상기의 동일 또는 근방 파장 이외의 2종류 이상의 형광 색소 검출 파장을 사용한 유전자 다형의 검출 방법을 동시에 또는 연속하여 행하는, 유전자 다형 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 유전자형을 포함하는 서열이 야생형 서열이며, 상기 제2 유전자형을 포함하는 서열이, 야생형 서열에 대하여, 1염기 이상의 치환 변이, 삽입 변이, 결실(缺失) 변이를 갖는 서열인, 유전자 다형 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하며, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는, 다형 검출용 프로브인, 유전자 다형 검출 방법. - 제8항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는, 다형 검출용 프로브인, 유전자 다형 검출 방법. - 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지된, 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 복수의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 다형 검출용 프로브를 포함하는, 동일한 파장에서 복수의 유전자 다형을 하나의 반응계에서 동시에 검출하기 위한 키트로서,
상기 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드는, 당해 유전자 다형의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과, 당해 유전자 다형의 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값을 갖고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼4℃이고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있는, 키트. - 제1항에 기재된 유전자 다형 검출 방법을 사용하여 약효나 체질에 관련하는 다형의 유무를 측정하는 것을 포함하는, 개체에 있어서의 약효나 체질을 예측하는 방법.
- 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드가 복수 수용된 하나의 반응부,
상기 반응부에 시료 및/또는 반응액을 공급하는 송액부,
상기 반응부에 형광을 여기시키기 위한 광을 조사하는 광원부,
상기 반응부의 온도를 제어하는 제어부, 및
형광을 검출하는 검출부
를 포함하는, 유전자 다형 검출 장치로서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지되어 있으며,
상기 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드는, 당해 유전자 다형의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과, 당해 유전자 다형의 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값을 갖고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼4℃이고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있음을 특징으로 하는, 유전자 다형 검출 장치. - 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드가 복수 수용된 하나의 반응계,
상기 반응계에 시료 및/또는 반응액을 공급하는 송액계,
상기 반응계에 형광을 여기시키기 위한 광을 조사하는 광원계,
상기 반응계의 온도를 제어하는 제어계,
형광을 검출하는 검출계, 및
검출 결과에 의거하여 다형을 판정하는 판정계
를 포함하는, 유전자 다형 판정 시스템으로서,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 서로 동일하거나 또는 근방의 검출 파장을 갖는 형광 색소로 표지되어 있으며,
상기 유전자 다형을 포함하는 영역에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드는, 당해 유전자 다형의 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과, 당해 유전자 다형의 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값을 갖고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드의, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값 간의 차가 0℃∼4℃이고,
상기 복수의 올리고뉴클레오티드는 각각, 제1 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값과 제2 유전자형을 포함하는 서열에 대한 Tm값이 3℃ 이상 떨어지도록 설계되어 있음을 특징으로 하는, 유전자 다형 판정 시스템.
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| JP5859274B2 (ja) * | 2010-10-29 | 2016-02-10 | アークレイ株式会社 | Ｅｇｆｒ遺伝子の多型検出用プローブ、増幅用プライマーおよびその用途 |
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