CN102808020A - 基因多态性检测方法 - Google Patents

基因多态性检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102808020A
CN102808020A CN2012101812801A CN201210181280A CN102808020A CN 102808020 A CN102808020 A CN 102808020A CN 2012101812801 A CN2012101812801 A CN 2012101812801A CN 201210181280 A CN201210181280 A CN 201210181280A CN 102808020 A CN102808020 A CN 102808020A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
value
sequence numbering
genotypic
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2012101812801A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102808020B (zh
Inventor
井口亚希
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arkray Inc
Original Assignee
Arkray Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray Inc filed Critical Arkray Inc
Publication of CN102808020A publication Critical patent/CN102808020A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102808020B publication Critical patent/CN102808020B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明的课题是提供基因多态性检测方法：即使在测定装置能够检测的荧光波长的种类上存在限制的情况下或者在探针上能够修饰的荧光分子的种类上存在限制的情况下，也能够一次测定多种不同的基因多态性。解决手段：一种使用多种用荧光染料标记并与含有基因多态性的区域杂交的寡核苷酸同时检测多种基因多态性的方法，其特征在于标记该多种苷酸的荧光染料为具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料，该多种寡核苷酸被设计为针对含有该多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，该多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上，并在一种波长下同时检测多种基因多态性。

Description

基因多态性检测方法
技术领域
本发明涉及使用用具有相同或者接近的检测波长的荧光染料修饰的多种寡核苷酸、在一种波长下检测多种基因多态性的方法。
背景技术
存在很多使用用荧光染料标记的探针来分析靶标核酸的突变的方法。
专利文献1中记载了如下方法：用PCR扩增含有突变的区域之后，使用用荧光染料标记的核酸探针来进行熔解曲线分析，基于熔解曲线分析的结果来分析突变的方法。在专利文献1中，如权利要求13中记载的“在至少与核酸测定用的新型核酸探针的种类的数量相同种类的数量的波长下进行测定”那样，在使用多种探针的情况下，使用了用波长互不相同的荧光染料标记的探针。
在专利文献2中，记载了用固相化的探针检测基因突变的方法，如权利要求8中记载的“结合了发出不同波长的荧光的多种荧光物质”那样，在使用多种探针的情况下，使用了用波长互不相同的荧光染料标记的探针。
如此，在专利文献1、2中，使用多种探针的情况下，使用了用波长互不相同的荧光染料标记的探针。
在专利文献1、2中，需要与探针的数量(即，想要检测的突变的数量)相同数量以上的不同荧光波长。但是，在测定装置能够检测的荧光波长的种类上存在限制的情况下、或者在探针上能够修饰的荧光分子的种类上存在限制的情况下，能够测定的突变的数目也受到限制。另外，在这样的情况下，需要使用不同的试剂多次测定不同的基因突变，需要工时和成本。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利文献特开2002-355084号公报；
专利文献2：日本专利文献特开2006-166808号公报。
发明内容
发明要解決的问题
本发明的课题为：即使在测定装置能够检测的荧光波长的种类上存在限制的情况下、或者在探针上能够修饰的荧光分子的种类上存在限制的情况下，也能够一次测定多种不同的基因多态性的方法。
用于解决问题的手段
本发明人发现，将用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记、并且被设计为Tm值为相互接近的温度的多种探针添加到一个反应系统中，能够在一种波长下同时检测多种基因多态性，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)一种使用用荧光染料标记并与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸来同时检测多种基因多态性的方法，其特征在于，
标记所述多种寡核苷酸的荧光染料为具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料，
所述多种寡核苷酸被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，
所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上，并且
在一种波长下同时检测多种基因多态性。
(2)根据(1)所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为0℃～4℃。
(3)根据(1)所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为0℃～2℃。
(4)根据(1)所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为0℃～1℃。
(5)一种基因多态性的检测方法，其中，同时或者连续进行：
(1)～(4)中任一项所述的基因多态性的检测方法、以及
使用了所述相同或者接近波长之外的一种以上的荧光染料检测波长的基因多态性的检测方法。
(6)一种基因多态性检测方法，其中，同时或者连续进行：
(1)～(4)中任一项所述的基因多态性的检测方法、以及
使用了所述相同或者接近波长之外的两种以上的荧光染料检测波长的基因多态性的检测方法。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，含有所述第一基因型的序列为野生型序列，含有所述第二基因型的序列为相对于野生型序列具有一个碱基以上的取代突变、插入突变、缺失突变的序列。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，所述寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出，并且在与靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。
(9)根据(8)所述的基因多态性检测方法，其中，所述寡核苷酸为与靶标序列杂交时荧光强度减少的多态性检测用探针。
(10)一种试剂盒，其为在一种波长下同时检测多种基因多态性的试剂盒，包含包括用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记的多种寡核苷酸的多态性检测用探针，
所述多种寡核苷酸被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，
所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
(11)一种预测个体中的药效或体质的方法，包括使用(1)～(9)中任一项所述的基因多态性检测方法来测定与药效或体质相关的多态性的有无。
(12)一种基因多态性检测装置，其特征在于，包括：
容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应部；
将试样和/或反应液供给至所述反应部的送液部；
向所述反应部照射用于激发荧光的光的光源部；
控制所述反应部的温度的控制部；以及
检测荧光的检测部，
所述多种寡核苷酸用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
(13)一种基因多态性判定系统统，其特征在于，包括：
容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应系统；
向所述反应系统供给试样和/或反应液的送液系统；
向所述反应系统照射用于激发荧光的光的光源系统；
控制所述反应系统的温度的控制系统；
检测荧光的检测系统；以及
基于检测结果来判定多态性的判定系统，
所述多种寡核苷酸用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
发明的效果
通过本发明的方法，即使在使用能够检测的波长的种类较少的装置的情况下、或者能够修饰探针的荧光分子的种类较少的情况下，也能够一次检测多种多态性。
附图说明
图1A示出实施例1的Tm分析中每单位时间的Pacific Blue和BODIPY FL的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度的关系(左图表示Pacific Blue的变化量，右图表示BODIPY FL的变化量)，其中，探针使用了3PB-EGFR-insWT-R5(序列编号9)、3PB-EGFR-insWT-F4(序列编号10)和3FL-EGFR-ins7-F1(序列编号11)，模板使用了EGFR-e20-ins-WT-F(序列编号1)，荧光染料使用了Pacific Blue和BODIPY FL。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)、横轴为温度(℃)。在以下的图中示出用不同模板的组合进行同样的实验的结果。
图1B示出实施例1的、模板使用了EGFR-e20-ins9-F(序列编号2)时的结果。
图1C示出实施例1的、模板使用了EGFR-e20-insCAC-R3(序列编号14)时的结果。
图1D示出实施例1的、模板使用了EGFR-e20-insTGCGTG-F(序列编号4)时的结果。
图1E示出实施例1的、模板使用了EGFR-e20-insAACCCC-R6(序列编号16)时的结果。
图1F示出实施例1的、模板使用了EGFR-e20-insCCCCAC-R7(序列编号17)时的结果。
图1G示出实施例1的、模板使用了EGFR-e20-insAACCCCCAC-R8(序列编号18)时的结果。
图1H示出实施例1的、模板使用了EGFR-e20-insCACGTG-R9(序列编号19)时的结果。
图2A示出实施例2的Tm分析中每单位时间的Pacific Blue的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度的关系，其中探针使用了3PB-858-G-PM(序列编号20)和3PB-3A4-G-PM(序列编号21)、模板使用了100％的858-mm(序列编号22)和100％的3A4-mm(序列编号24)、荧光染料使用了Pacific Blue。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(℃)。在以下的图中示出用与不同模板的组合进行同样的实验的结果。
图2B示出实施例2的、模板使用了50％的858-mm(序列编号22)、50％的858-PM(序列编号23)和100％的3A4-mm(序列编号24)时的结果。
图2C示出实施例2的、模板使用了90％的858-mm(序列编号22)、10％的858-PM(序列编号23)和100％的3A4-mm(序列编号24)时的结果。
图2D示出实施例2的、模板使用了100％的858-mm(序列编号22)、50％的3A4-mm(序列编号24)和50％的3A4-PM(序列编号25)时的结果。
图2E示出实施例2的、模板使用了100％的858-mm(序列编号22)、90％的3A4-mm(序列编号24)和10％的3A4-PM(序列编号25)时的结果。
图3A示出实施例3的Tm分析中每单位时间的TAMRA的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度的关系，其中，探针使用了3T-719-G-PM(序列编号26)、3T-858-G-PM(序列编号27)和3T-790-T-PM(序列编号28)，模板使用了100％的719-G(序列编号29)、100％的858-G(序列编号31)和100％的790-T(序列编号33)，荧光染料使用了TAMRA。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)、横轴为温度(℃)。在以下的图中示出以不同模板的组合进行同样的实验的结果。
图3B示出实施例3的、模板使用了50％的719-G(序列编号29)、50％的719-C(序列编号30)、100％的858-G(序列编号31)和100％的790-T(序列编号33)时的结果。
图3C示出实施例3的、模板使用了100％的719-G(序列编号29)、50％的858-G(序列编号31)、50％的858-T(序列编号32)和100％的790-T(序列编号33)时的结果。
图3D示出实施例3的、模板使用了100％的719-G(序列编号29)、100％的858-G(序列编号31)、50％的790-T(序列编号33)、和50％的790-C(序列编号34)的情况下的结果。
图4A示出实施例4的Tm分析中每单位时间的TAMRA、Pacific Blue和BODIPY FL的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)和温度的关系(左图表示Pacific Blue的变化量，中间的图表示BODIPY FL的变化量，右图表示TAMRA的变化量)，其中，探针使用了3T-719-G-PM(序列编号26)、5PB-V12M-A-PM(序列编号35)、3PB-UGT-T-PM(序列编号36)、5FL-Q126X-T-PM(序列编号37)和3FL-NAT-C-PM(序列编号38)，模板使用了100％的V12M-PM(序列编号39)、100％的UGT-PM(序列编号41)、100％的Q126X-PM(序列编号43)、100％的NAT-mm(序列编号46)和100％的719-mm(序列编号30)，荧光染料使用了TAMRA、Pacific Blue和BODIPY FL。纵轴为每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴为温度(℃)。在以下的图中示出用不同的模板的组合进行同样的实验的结果。
图4B示出实施例4的、模板使用了50％的V12M-PM(序列编号39)、50％的V12M-mm(序列编号40)、100％的UGT-PM(序列编号41)、100％的Q126X-PM(序列编号43)、100％的NAT-mm(序列编号46)和100％的719-mm(序列编号30)时的结果。
图4C示出实施例4的、模板使用了100％的V12M-PM(序列编号39)、50％的UGT-PM(序列编号41)、50％的UGT-mm(序列编号42)、100％的Q126X-PM(序列编号43)、100％的NAT-mm(序列编号46)和100％的719-mm(序列编号30)时的结果。
图4D示出实施例4的、模板使用了100％的V12M-PM(序列编号39)、100％的UGT-PM(序列编号41)、50％的Q126X-PM(序列编号43)、50％的Q126X-mm(序列编号44)、100％的NAT-mm(序列编号46)和100％的719-mm(序列编号30)时的结果。
图4E示出实施例4的、模板使用了100％的V12M-PM(序列编号39)、100％的UGT-PM(序列编号41)、100％的Q126X-PM(序列编号43)、50％的NAT-PM(序列编号45)、50％的NAT-mm(序列编号46)和100％的719-mm(序列编号30)时的结果。
图4F示出实施例4的、模板使用了100％的V12M-PM(序列编号39)、100％的UGT-PM(序列编号41)、50％的Q126X-PM(序列编号43)、50％的Q126X-mm(序列编号44)、100％的NAT-mm(序列编号46)、50％的719-PM(序列编号29)和50％的719-mm(序列编号30)时的结果。
具体实施方式
<1>本发明的多态性检测方法
本发明的多态性检测方法是使用用荧光染料标记并与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸来同时检测多种基因多态性的方法，其特征在于，
标记所述多种寡核苷酸的荧光染料为具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料，
所述多种寡核苷酸设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，
所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上，
在一种波长下同时检测多种基因多态性。
本发明中的基因多态性是指基因上的特定的位置处的碱基的类型有多种，多态性的例示有碱基取代、插入或缺失一个以上的碱基等。
本发明中的“多种多态性”包含检测一个基因上的多种多态性的情况以及对多种基因检测每一个基因多态性的情况这两个方面。
本发明的方法中，使用用相互具有相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，分别与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸。
以使用两种寡核苷酸的情况为例进行说明，寡核苷酸1与第一多态性区域杂交，寡核苷酸2与第二多态性区域杂交，标记寡核苷酸1的荧光染料和标记寡核苷酸2的荧光染料具有相互相同或者接近的检测波长。
这里，接近是指在检测荧光值时受到对测定结果产生影响的干涉的波长区域。该接近的波长区域根据荧光染料的组合而不同，例如检测波长(最大波长)的差为200nm以内，100nm以内，50nm以内或30nm以内。作为如此检测波长接近的荧光染料的组合，例如有BODIPY FL和FAM、BODIPY FL和TRITC、Pacific Blue和Alexa Fluor 405、TAMRA和Alexa Fluor 670、TAMRA和Alexa Fluor 700、TAMRA和Texas Red等。即，在本发明的方法中，不一定要使用相同的荧光染料，若用具有接近的检测波长的荧光染料来标记各寡核苷酸，也能够在一种波长下同时检测多种多态性。
本发明的一种波长不仅是指相同波长，而且也指所述接近的波长范围。
此外，具有相同的检测波长的情况通常是指多种寡核苷酸用相同的荧光染料标记。
此外，在本发明的方法中，只要在一种波长下进行多种基因多态性的检测，也可以同时或者连续使用用具有一种或者两种以上的其他(除所述相同或者接近之外)的检测波长的荧光染料标记的一种或者两种以上的探针进行基因多态性(与所述多种基因多态性不同的基因多态性)的检测。即，只要在一种波长下进行多种基因多态性的检测，也可以同时或者连续进行在其他的一种或者两种以上的波长下的基因多态性的检测。
在本发明的方法中，使多种寡核苷酸对含有第一基因型的序列的Tm值集中到接近区域。这里，优选接近的温度区域是指多种寡核苷酸的各个对含有第一基因型的序列的Tm值之差例如为0℃～4℃，0℃～2℃或0℃～1℃。
另外，多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值分别相隔例如3℃以上，5℃以上，或10℃以上。
以使用与第一多态性区域杂交的寡核苷酸1和与第二多态性区域杂交的寡核苷酸2这两种寡核苷酸的情况为例进行说明(此外，寡核苷酸可以使用三种以上)。
针对第一多态性区域的第一基因型(例如野生型)的寡核苷酸1的Tm值和针对第二多态性区域的第一基因型(例如野生型)的寡核苷酸2的Tm值的温度差例如为0℃～4℃，0℃～2℃，或0℃～1℃。
并且，针对第一多态性区域的第一基因型(例如野生型)的寡核苷酸1的Tm值和针对第一多态性区域的第二基因型(例如突变型)的寡核苷酸1的Tm值的温度差为例如为3℃以上，5℃以上，或10℃以上。
另外，针对第二多态性区域的第一基因型(例如野生型)的寡核苷酸2的Tm值和针对第二多态性区域的第二基因型(例如突变型)的寡核苷酸2的Tm值的温度差例如为3℃以上，5℃以上或10℃以上。
此外，针对第一多态性区域的第二基因型(例如突变型)的寡核苷酸1的Tm值和针对第二多态性区域的第二基因型(例如突变型)的寡核苷酸2的Tm值的温度差可以为0℃，但为了判别两种突变，例如1℃以上。
在含有第一基因型的序列为野生型序列、含有第二基因型的序列为相对于野生型序列具有1个碱基以上的取代突变、插入突变和/或缺失突变的突变型序列的情况下，将针对野生型序列的峰集中在一定温度区域，使得能够不检测针对野生型的峰，而检测突变型序列。
即，由于野生型的Tm值包含在一定温度区域内，因此通过检测对应于突变型的、从野生型的Tm值变化了的峰，能够检测突变型的有无。
即，通过预先针对含有第一基因型的序列将熔解曲线分析的峰(即Tm值)集中到一定的温度区域，使得即使不针对含有第一基因型的序列测定熔解曲线分析的峰，也能够通过测定含有第二基因型的序列的峰(优选的是，如上所述，从含有第一基因型的序列的峰变化了3℃以上的峰)，来测定突变。
例如，作为寡核苷酸，选择含有与含第一基因型(野生型)的序列100％匹配、与含第二基因型(突变型)的序列错配的序列，如上所述，使针对含有第一基因型的序列的Tm值比针对含有第二基因型的序列的Tm值高3℃以上、优选高5℃以上，更优选高10℃以上。
或者，也可以选择如下探针序列：含有与含第一基因型(野生型)的序列错配、与含第二基因型(突变型)的序列100％匹配的探针序列，针对含有第一基因型的序列的Tm值比针对含有第二基因型的序列的Tm值低3℃以上、优选低5℃以上，更优选低10℃以上。
此外，第一基因型和第二基因型可以均为突变型。在含有第一基因型的序列和含有第二基因型的序列均为突变型序列的情况下，也能够检测相对于含有第一基因型的序列，含有第二基因型的序列是否还含有突变。
本发明的方法中使用的与含有基因多态性的区域杂交的寡核苷酸，例如可以使用日本专利文献特开2001-286300号公报和特开2002-119291号公报等中记载的末端部用荧光染料标记的淬灭探针。这样的寡核苷酸探针例如与未与靶标序列杂交时相比，与靶标序列杂交时荧光染料的荧光减少或增加。本发明中的寡核苷酸探针例如在未杂交时荧光染料的荧光发光、而杂交时荧光染料的荧光淬灭的淬灭探针。
作为本发明的寡核苷酸探针的长度，无特别限制，但为了在含有第一基因型的序列和含有第二基因型的序列之间获得Tm值的差，例如为40碱基长以下，例如11～40碱基长、12～30碱基长、15～30碱基长或18～30碱基长。
作为本发明中使用的用于检测基因多态性的探针的碱基序列的示例，例如可以举出序列编号9～11、序列编号20～21、序列编号26～28、序列编号35～38所示的探针。
作为荧光染料，可以使用日本专利文献特开2001-286300号公报和特开2002-119291号公报等中记载的荧光染料，作为具体例，可以举出Pacific Blue、FAM、TAMRA、BODIPY FL等。将荧光染料结合至寡核苷酸的方法，可以按照通常的方法、例如特开2001-286300号公报和特开2002-119291号公报中记载的方法来进行。
本发明的方法只要是使用上述寡核苷酸探针的方法则无特别限制，例如可以通过熔解曲线分析来分析基因多态性。
本发明方法使用用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记的多种寡核苷酸探针，并且该多种寡核苷酸探针分别被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值相互接近的温度，针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上，除此之外，能够按照通常的熔解曲线分析(Tm分析)的方法来进行。熔解曲线分析例如可以按照特开2001-286300号公报和特开2002-119291号公报中记载的方法来进行。
在熔解曲线分析中，在检测突变型的峰时，可以得出存在突变的结论。
另外，本发明的方法也可以含有在检测基因多态性之前或者与检测基因多态性同时扩增核酸。
作为核酸扩增的方法，例如为使用聚合酶的方法，作为其示例，可以举出PCR、ICAN、LAMP等。在通过使用聚合酶的方法来进行扩增的情况下，例如在本发明探针的存在下来进行扩增。根据使用的探针，来调节扩增的反应条件等，对本领域技术人员来说是容易的。由此，由于仅在核酸扩增后分析探针的Tm值，因此在反应结束后不需要精制扩增产物等。因此，不用担心扩增产物带来污染。另外，由于能够在与扩增所需的仪器相同的仪器内进行检测，因此不需要移动容器。因此也容易自动化。
在本发明中，试样中的DNA可以是单链DNA，也可以是双链DNA。在所述DNA为双链DNA的情况下，例如，包括在所述杂交步骤之前，通过加热使所述试样中的双链DNA解离的步骤。通过将双链DNA解离成单链DNA，使得能够在下一杂交步骤中，与检测用探针杂交。
作为进行核酸扩增时的模板的核酸，只要含有核酸则无特别限制，例如血液、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等的体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。
除了测定本发明探针的荧光染料的荧光之外，Tm分析可以按照通常的方法进行。荧光的测定可以通过使用与荧光染料对应的波长的激发光测定发光波长的光来进行。Tm分析中的升温速度通常为0.1～1℃/秒。进行Tm分析时的反应液的组成只要探针和具有与其碱基序列互补的序列的核酸能够杂交则无特别限制，通常一价阳离子浓度为1.5～5mM、pH为7～9。PCR等使用DNA聚合酶的扩增方法的反应液通常满足该条件，因此可以将扩增后的反应液直接用于Tm分析。
基于Tm分析的结果的基因多态性的检测可以按照通常的方法进行。本发明中的检测包含突变的有无的检测和突变的量的检测。
此外，通过本发明的多态性检测方法能够检测基因多态性，基于检测到的多态性的有无，能够判断与药效或体质相关的多态性的有无，并预测个体中的药效或体质。例如，在EGFR exon20 insertion的基因多态性的情况下，能够判定作为抗癌剂的吉非替尼(gefitinib)的有效率。
<2>本发明试剂盒
本发明试剂盒是为在本发明的多态性检测方法中使用的试剂盒。
即，本发明的试剂盒的特征在于，其为在一种波长下同时检测多种基因多态性的试剂盒，包含包括用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记的多种寡核苷酸的多态性检测用探针，所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
本发明检测试剂盒除了上述探针之外，还可以含有进行核酸扩增所需的试剂类，尤其可以含有用于使用DNA聚合酶的扩增的引物。
在本发明检测试剂盒中，探针、引物及其他的试剂类可以单独被容纳，也可以将它们的一部分制成混合物。
<3>本发明装置
本发明装置是用于在基因多态性检测方法中使用的装置，具体地，其特征在于，包括：容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应部；将试样和/或反应液供给至所述反应部的送液部；向所述反应部照射用于激发荧光的光的光源部；控制所述反应部的温度的控制部；以及检测荧光的检测部，所述多种寡核苷酸如<1>中本发明的多态性检测方法中说明的那样，用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
反应部中可以固定有所述多种寡核苷酸，也可以形成为在即将使用之前设置固定有所述多种寡核苷酸的基板。
送液部可以是能够同时输送含有基因的试样和反应液，也可以能够分别输送。另外，也可以形成为能够输送清洗液等。
光源部只要是能够照射与标记寡核苷酸的荧光染料相对应的激发波长的光源即可，在同时或连续使用用具有一种或者两种以上的其他(所述相同或者接近之外)的检测波长的荧光染料标记的一种或者两种以上的探针进行基因多态性(与所述多种基因多态性不同的基因多态性)的检测的情况下，也可以并用能够照射其他的激发波长的一种或两种以上的光源。
控制部例如能够以一定的速度升高或降低反应部的温度，并且能够保持在一定的温度。
检测部只要能够在与标记寡核苷酸的荧光染料对应的相同或接近的检测波长下进行检测即可，在同时或者连续使用用具有一种或者两种以上的其他(所述相同或者接近之外)的检测波长的荧光染料标记的一种或两种以上的探针进行基因多态性(与所述多种基因多态性不同的基因多态性)的检测的情况下，也可以形成为能够检测其他的检测波长。另外，也可以将检测对象仅设为第二基因型，仅检测含有第二基因型的序列的峰(例如从含有第一基因型的序列的峰变化了3℃以上的峰)。
<4>本发明系统
本发明系统是用于在基因多态性检测方法中使用的系统，具体地，其特征在于，包括：容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应系统；向所述反应系统供给试样和/或反应液的送液系统；向所述反应系统照射用于激发荧光的光的光源系统；控制所述反应系统的温度的控制系统；检测荧光的检测系统；以及基于检测结果来判定多态性的判定系统，所述多种寡核苷酸如在<1>中本发明的多态性检测方法中说明的那样，用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
反应系统、送液系统、光源系统、控制系统、检测系统能够使用所述的本发明装置。另外，判定系统可以是连接在本发明装置上的、基于输入的检测结果来输出多态性的类型的判定或突变的有无等的计算机之类的系统。
实施例
以下，举出实施例来具体说明本发明，但是本发明不限于以下的实施例。
实施例1(用三种探针和两种波长检测EGFR exon20 insertion的模板寡核苷酸的情况)
EGFR exon20 insertion中，除了野生型(以下WT)之外，还已知下述7个广范围的突变。据说EGFR exon20 insertion上带有突变的患者的吉非替尼有效率为0％，因此有必要检测EGFR exon20 insertion的突变型(以下mt)。
序列编号1所示的序列表示NM_005228.3GENE ID：1956中碱基编号2530-2579。
表1
  名称   序列(5’→3’)   序列编号
  WT   EGFR-e20-ins-WT-F   Gaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgct   序列编号1
  mt1   EGFR-e20-ins9-F   gaagcctacgtgatggccagcgtgGCCAGCGTGgacaacccccacgtgtgccgcctgct   序列编号2
  mt2   EGFR-e20-insCAC-F   gaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacCACgtgtgccgcctgct   序列编号3
  mt3   EGFR-e20-insTGCGTG-F   gaagcctacgtgatggccagcgtgTGCGTGgacaacccccacgtgtgccgcctgct   序列编号4
  mt4   EGFR-e20-insAACCCC-F   gaagcctacgtgatggccagcgtggacaaccccAACCCCcacgtgtgccgcctgct   序列编号5
  mt5   EGFR-e20-insCCCCAC-F   gaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacCCCCACgtgtgccgcctgct   序列编号6
  mt6   EGFR-e20-insAACCCCCAC-F   gaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacAACCCCCACgtgtgccgcctgct   序列编号7
  mt7   EGFR-e20-insCACGTG-F   gaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgtgCACGTGtgccgcctgct   序列编号8
*大写字母的碱基表示突变部位
为了使用专利文献1中记载的方法覆盖全部的mt型，需要使用40bp左右长的探针，这样很可能不能得到Tm值的差，不能检测到突变。因此，准备了几个与WT完全匹配、Tm值与WT的Tm值相同的探针，并且将其荧光基团设为相同波长。
基于EGFR exon20 insertion的含有基因多态性的位点的碱基序列(序列编号1(野生型))，设计了以下表2所示的、在3’末端部具有C的探针(野生型(序列编号9、10)和(突变型(序列编号11)。表2中，对于序列编号9、10而言，探针的位置表示序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号，对于序列编号11而言，探针的位置表示序列编号7所示的碱基序列中的碱基编号。利用Pacific Blue或BODIPY FL进行的标记按照通常的方法进行。
另外，作为检测对象使用的模板寡核苷酸(野生型反义链(序列编号12)和突变型反义链(序列编号13～19))的序列示于表2。这些序列编号12-19所示的序列分别为序列编号1-8的完全互补链。
此外，通过序列编号9的探针能够检测表1的mt1、3，通过序列编号10的探针能够检测表1的mt2、4、5、7，通过序列编号11的探针能够检测表1的mt6。
表2
  序列编号   探针名   序列(5’→3’)   位置
  序列编号9   3PB-EGFR-insWT-R5   tgtccacgctggccatc-(Pacific Blue)   28-12
  序列编号10   3PB-EGFR-insWT-F4   ggacaacccccacgtgtgc-(Pacific Blue)   24-42
  序列编号11   3FL-EGFR-ins7-F1   acaacccccacAACCCCCAC-(FL)   26-45
*大写字母的碱基表示突变部位。
  序列编号   模板寡核苷酸名   序列(5’→3’)
  序列编号12   WT   EGFR-e20-ins-WT-R1   agcaggcggcacacgtgggggttgtccacgctggccatcacgtaggcttc
  序列编号13   1   EGFR-e20-ins9-R2   agcaggcggcacacgtgggggttgtccacgctggccacgctggccatcacgtaggcttc
  序列编号14   2   EGFR-e20-insCAC-R3   agcaggcggcacacgtggtgggggttgtccacgctggccatcacgtaggcttc
  序列编号15   3   EGFR-e20-insTGCGTG-R5   agcaggcggcacacgtgggggttgtccacgcacacgctggccatcacgtaggcttc
  序列编号16   4   EGFR-e20-insAACCCC-R6   agcaggcggcacacgtgggggttggggttgtccacgctggccatcacgtaggcttc
  序列编号17   5   EGFR-e20-insCCCCAC-R7   agcaggcggcacacgtgggggtgggggttgtccacgctggccatcacgtaggcttc
  序列编号18   6   EGFR-e20-insAACCCCCAC-R8   agcaggcggcacacgtgggggttgtgggggttgtccacgctggccatcacgtaggcttc
  序列编号19   7   EGFR-e20-insCACGTG-R9   agcaggcggcacacgtgcacgtgggggttgtccacgctggccatcacgtaggcttc
使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy IS-5310，爱科来公司制)进行了Tm分析。此外，以下的Tm分析中，只要不特别说明，都使用了同一装置。探针溶液的组成如下所述。样品使用了以下的模板寡核苷酸。Tm分析的条件为95℃、1秒→40℃、60秒→(40℃→85℃、1℃/3秒)。
Tm分析中的激发波长和检测波长分别为365～415nm和445～480nm(Pacific Blue)、或分别为420～485nm和520～555nm(BODIPY FL)。
表3
  反应液量(10μl)
  1×PCR缓冲液
  3PB-EGFR-insWT-R5   0.2μM
  3PB-EGFR-insWT-F4   0.2μM
  3FL-EGFR-ins7-F1   0.2μM
  模板寡核苷酸   0.2μM
  测定ID   模板寡核苷酸   序列编号
  1   WT   序列编号1
  2   mt1   序列编号2
  3   mt2   序列编号14
  4   mt3   序列编号4
  5   mt4   序列编号16
  6   mt5   序列编号17
  7   mt6   序列编号18
  8   mt7   序列编号19
使用表2的探针和表3的模板寡核苷酸进行了Tm分析的结果，对于WT、mt1、mt2、mt3、mt4、mt5、mt7而言，可见到Pacific Blue的突变型的清楚的峰(图1A、1B、1C、1D、1E、1F、1H的左图)，对于mt6而言，未见到Pacific Blue的突变型的峰(图1G的左图)。另外，对于mt6而言，可见到BODIPY FL的突变型的峰(图1G的右图)，但是对于WT、mt1、mt2、mt3、mt4、mt5、mt7而言，未见到BODIPY FL的突变型的清楚的峰(图1A、1B、1C、1D、1E、1F、1H的右图)。
即，由于对于mt1～mt7的任何一者均能够检测到与野生型的峰(72℃)不同的峰，因此认为能够检测mt1～mt7的突变。
结果示于以下的表4。
表4
  测定ID   PB探针(Tm)   FL探针(Tm)
  1   WT   72
  2   mt1   64
  3   mt2   64
  4   mt3   60
  5   mt4   66
  6   mt5   59
  7   mt6   73
  8   mt7   63
根据上述，使用3PB-EGFR-insWT-R5、3PB-EGFR-insWT-F4这两种探针，能够在445～480nm这一种波长下检测多种突变。并且，通过与3FL-EGFR-ins7-F1组合，能够检测全部EGFR exon20 insertion突变。
实施例2(用两种探针和一种波长检测由不同的两种基因构成的模板寡核苷酸的情况)
如表5所示，设计了具有与由序列编号23构成的碱基序列互补的序列、在末端部具有C的探针(对应于3PB-858-G-PM(序列编号20))。在表5中，探针的位置表示序列编号23所示的碱基序列中的碱基编号。另外，设计了作为用作检测对象的模板寡核苷酸的完全匹配型、即以下PM型(序列编号23)、以及作为非检测对象的错配型、即以下mm型(序列编号22)。
并且如表5所示，设计了具有与由序列编号25构成的碱基序列互补的序列、在末端部具有C的探针(对应于3PB-3A4-G-PM(序列编号21))。在表5中，探针的位置表示序列编号25所示的碱基序列中的碱基编号。另外，设计了作为用作检测对象的模板寡核苷酸的PM型(序列编号25)、和作为非检测对象的mm型(对应于序列编号24)。
表5
  序列编号   探针名   序列(5’→3’)   位置
  序列编号20   3PB-858-G-PM   ttggccCgcccaaaatc-(Pacific Blue)   27-10
  序列编号21   3PB-3A4-G-PM   taaatcgccgctctcCtgccc-(Pacific Blue)   34-15
*大写字母的碱基表示突变部位。
  序列编号   模板寡核苷酸名   序列(5’→3’)
  序列编号22   858-mm   caagatcacagattttgggcTggccaaactgctgggtgcggaagagaaag
  序列编号23   858-PM   caagatcacagattttgggcGggccaaactgctgggtgcggaagagaaag
  序列编号24   3A4-mm   agccatagagacaagggcaAgagagaggcgatttaataga
  序列编号25   3A4-PM   agccatagagacaagggcaGgagagaggcgatttaataga
*大写字母的碱基表示突变部位。
PCR反应液的组成如下所述。试样使用了以下的组合的模板寡核苷酸。Tm分析的条件为95℃、1秒→40℃、60秒→(40℃→75℃、3℃/1秒)。
Tm分析中的激发波长和检测波长分别为365～415nm和445～480nm(Pacific Blue)。
表6
  反应液量(50μl)
  1×PCR缓冲液
  3PB-858-G-PM   0.2μM
  3PB-3A4-G-PM   0.2μM
  模板寡核苷酸   各0.2μM
Figure BSA00000730296200191
使用表5的探针进行了Tm分析的结果，不论含有50％(图2B、D)的作为检测对象的核酸序列、还是含有10％(图2C、E)的作为检测对象的核酸序列(序列编号23、25)时，除了mm型的峰之外，均可见到PM型的清楚的峰。
即，在任何一种情况下，均能够检测到与mm型的峰(55℃)不同的峰，因此认为能够以10％的灵敏度检测作为检测对象的PM型。
实施例3(用三种探针和一种波长检测由不同的三种基因构成的模板寡核苷酸的情况)
如表7所示，设计了具有与三种碱基序列(序列编号29、31、33)互补的序列、在末端部具有C的探针(3T-719-G-PM、3T-858-G-PM、3T-790-T-PM，对应于序列编号26-28)。在表7中，探针的位置分别表示序列编号29、31、33所示的碱基序列中的碱基编号。另外，设计了作为用作检测对象的模板寡核苷酸的mm型(序列编号30、32、34)、以及作为非检测对象的PM型(序列编号29、31、33)。
表7
  序列编号   探针名   序列(5’→3’)   位置
  序列编号26   3T-719-G-PM   gcaccggagCccagcac-(TAMRA)   34-19
  序列编号27   3T-858-G-PM   ttggccCgcccaaaatc-(TAMRA)   27-10
  序列编号28   3T-790-T-PM   tgagctgcAtgatgaggtgcac-(TAMRA)   25-14
*大写字母的碱基表示突变部位。
  序列编号   模板寡核酸名   序列(5’→3’)
  序列编号29   719-G   gaattcaaaaagatcaaagtgctggGctccggtgcgttcggcacggtgta
  序列编号30   719-C   gaattcaaaaagatcaaagtgctggCctccggtgcgttcggcacggtgta
  序列编号31   858-G   caagatcacagattttgggcGggccaaactgctgggtgcggaagagaaag
  序列编号32   858-T   caagatcacagattttgggcTggccaaactgctgggtgcggaagagaaag
  序列编号33   790-T   cctcacctccaccgtgcagctcatcaTgcagctcatgcccttcggctgcc
  序列编号34   790-C   cctcacctccaccgtgcagctcatcaCgcagctcatgcccttcggctgcc
*大写字母的碱基表示突变部位。
PCR反应液的组成如下所述。试样使用了以下组合的模板寡核苷酸。Tm分析的条件为95℃、1秒→40℃、60秒→(40℃→75℃、3℃/1秒)。
Tm分析中的激发波长和检测波长分别为520～555nm和585～700nm(TAMRA)。
表8
  反应液量(50μl)
  1×PCR缓冲液
  3T-719-G-PM   0.2μM
  3T-858-G-PM   0.2μM
  3T-790-T-PM   0.2μM
  模板寡核苷酸   各0.2μM
Figure BSA00000730296200201
使用表7的探针进行Tm分析的结果，在含有50％的作为检测对象的核酸序列(序列编号30、32、34)时(图3B、C、D)，除了PM型的峰之外，可见到mm型的清楚的峰。
即，在任何一种情况下均能够检测与野生型的峰(65～66℃)不同的峰，因此认为能够检测三种不同的基因多态性。
实施例4(用5种探针和三种波长检测由5种不同的基因构成的模板寡核苷酸)
如表9所示，设计了具有与5种碱基序列(序列编号29、39、41、43、45)互补的序列、在末端部具有C的探针(3T-719-G-PM、5PB-V12M-A-PM、3PB-UGT-T-PM、5FL-Q126X-T-PM、3FL-NAT-C-PM(对应于序列编号26、35-38))。在表9中，探针的位置分别表示序列编号29、39、41、43、45所示的碱基序列中的碱基编号。另外，设计了作为用作检测对象的模板寡核苷酸的PM型(序列编号39、41、43)和mm型(序列编号30、46)、以及作为非检测对象的mm型(序列编号40、42、44)和PM型(序列编号29、45)。
表9
  序列编号   探针名   序列(5’→3’)  位置
  序列编号26   3T-719-G-PM   gcaccggagCccagcac-(TAMRA)  34-18
  序列编号35   5PB-V12M-A-PM   (PB)-ccttgtgacaTtggga-(P)  36-21
  序列编号36   3PB-UGT-T-PM   gagacAgagcattttacac-(PB)  25-7
  序列编号37   5FL-Q126X-T-PM   (FL)-cccacttatacttacttAtaccac-(P)  43-20
  序列编号38   3FL-NAT-C-PM   tgccgtcaGtggtcac-(FL)  29-14
*大写字母的碱基表示突变部位。
  序列编号   模板寡核苷酸名   序列(5’→3’)
  序列编号29   719-PM   gaattcaaaaagatcaaagtgctggGctccggtgcgttcggcacggtgta
  序列编号30   719-mm   gaattcaaaaagatcaaagtgctggCctccggtgcgttcggcacggtgta
  序列编号39   V12M-PM   cagtaatgtcgaagtttttatcccaAtgtcacaaggaaacaccaatggct
  序列编号40   V12M-mm   cagtaatgtcgaagtttttatcccaGtgtcacaaggaaacaccaatggct
  序列编号41   UGT-PM   ttcaaggtgtaaaatgctcTgtctctgatgtacaacgagg
  序列编号42   UGT-mm   ttcaaggtgtaaaatgctcCgtctctgatgtacaacgagg
  序列编号43   Q126X-PM   caaatgtaattcaggttacgtggtaTaagtaagtattagtgggtttgcat
  序列编号44   Q126X-mm   caaatgtaattcaggttacgtggtaCaagtaagtattagtgggtttgcat
  序列编号45   NAT-PM   ccttctcctgcaggtgaccaCtgacggcaggaattacatt
  序列编号46   NAT-mm   ccttctcctgcaggtgaccaTtgacggcaggaattacatt
*大写字母的碱基表示突变部位。
PCR反应液的组成如下所述。试样使用了以下的模板寡核苷酸。Tm分析的条件为95℃、1秒→40℃、60秒→(40℃→85℃、3℃/1秒)。
Tm分析中的激发波长和检测波长分别为365～415nm和445～480nm(Pacific Blue)、分别为420～485nm和520～555nm(BODIPY FL)或者分别为520～555nm和585～700nm(TAMRA)。
表10
  反应液量(50μl)
  1×PCR缓冲液
  3T-719-G-PM   0.2μM
  5PB-V12M-A-PM   0.2μM
  3PB-UGT-T-PM   0.2μM
  5FL-Q126X-T-PM   0.2μM
  3FL-NAT-C-PM   0.2μM
  各0.2μM
Figure BSA00000730296200221
*表中的29、30、39-46的数字表示序列编号
使用表9的探针进行Tm分析的结果，对于Pacific Blue而言，仅在具有序列编号40和42的寡核苷酸的情况下检测到新的峰(图4B、4C的左图)，对于不具有序列编号40和42的寡核苷酸的样品而言，仅见到两个峰(图4A、4D、4E、4F的左图)。
对于BODIPY FL而言，仅在具有序列编号44和45的寡核苷酸的情况下检测到新的峰(图4D、4E的中间的图)，对于不具有序列编号44和45的寡核苷酸的样品而言，仅见到一个峰(图4A、4B、4C、4F的中间的图)。
对于TAMRA而言，仅在具有序列编号29的寡核苷酸的情况下检测到新的峰(图4F的右图)，对于不具有序列编号29的寡核苷酸的样品而言，仅见到一个峰(图4A～E的右图)。
根据上述，使用5PB-V12M-A-PM、3PB-UGT-T-PM这两种探针，在445～480nm这一种检测波长下能够检测到两种寡核苷酸(序列编号40和42)。另外，使用5FL-Q126X-T-PM、3FL-NAT-C-PM这两种探针，在520～555nm这一种检测波长下能够检测两种寡核苷酸(序列编号44和45)的突变。并且，通过与3T-719-G-PM组合，能够检测到全部5种突变。
产业上的可用性
本发明提供一种基因多态性检测方法，其例如能够一次测定与药效或体质相关的多种基因突变，或者也可用于非诊断或治疗目的的基因多态性检测。
Figure ISA00000730296400011
Figure ISA00000730296400031
Figure ISA00000730296400051
Figure ISA00000730296400061
Figure ISA00000730296400071
Figure ISA00000730296400081

Claims (13)

1.一种使用用荧光染料标记并与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸来同时检测多种基因多态性的方法，其特征在于，
标记所述多种寡核苷酸的荧光染料为具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料，
所述多种寡核苷酸被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，
所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上，并且
在一种波长下同时检测多种基因多态性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为0℃～4℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为0℃～2℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多种寡核苷酸的、针对含有第一基因型的序列的Tm值之差为0℃～1℃。
5.一种基因多态性的检测方法，其中，同时或者连续进行：
权利要求1～4中任一项所述的基因多态性的检测方法、以及
使用了所述相同或者接近波长之外的一种以上的荧光染料检测波长的基因多态性的检测方法。
6.一种基因多态性检测方法，其中，同时或者连续进行：
权利要求1～4中任一项所述的基因多态性的检测方法、以及
使用了所述相同或者接近波长之外的两种以上的荧光染料检测波长的基因多态性的检测方法。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，含有所述第一基因型的序列为野生型序列，含有所述第二基因型的序列为相对于野生型序列具有一个碱基以上的取代突变、插入突变、缺失突变的序列。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，所述寡核苷酸在未与靶标序列杂交时发出，并且在与靶标序列杂交时荧光强度减少或增加。
9.根据权利要求8所述的基因多态性检测方法，其中，所述寡核苷酸为与靶标序列杂交时荧光强度减少的多态性检测用探针。
10.一种试剂盒，其为在一种波长下同时检测多种基因多态性的试剂盒，包含包括用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记的多种寡核苷酸的多态性检测用探针，
所述多种寡核苷酸被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，
所述多种寡核苷酸分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
11.一种预测个体中的药效或体质的方法，包括使用权利要求1～9中任一项所述的基因多态性检测方法来测定与药效或体质相关的多态性的有无。
12.一种基因多态性检测装置，其特征在于，包括：
容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应部；
将试样和/或反应液供给至所述反应部的送液部；
向所述反应部照射用于激发荧光的光的光源部；
控制所述反应部的温度的控制部；以及
检测荧光的检测部，
所述多种寡核苷酸用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有所述多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和针对含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
13.一种基因多态性判定系统统，其特征在于，包括：
容纳有与含有基因多态性的区域杂交的多种寡核苷酸的反应系统；
向所述反应系统供给试样和/或反应液的送液系统；
向所述反应系统照射用于激发荧光的光的光源系统；
控制所述反应系统的温度的控制系统；
检测荧光的检测系统；以及
基于检测结果来判定多态性的判定系统，
所述多种寡核苷酸用具有相互相同或者接近的检测波长的荧光染料标记，并被设计为针对含有多种基因多态性中的第一基因型的序列的Tm值为相互接近的温度，并且分别被设计为针对含有第一基因型的序列的Tm值和含有第二基因型的序列的Tm值相隔3℃以上。
CN201210181280.1A 2011-05-31 2012-05-31 基因多态性检测方法 Active CN102808020B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011122900 2011-05-31
JP2011-122900 2011-05-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102808020A true CN102808020A (zh) 2012-12-05
CN102808020B CN102808020B (zh) 2016-12-14

Family

ID=46210127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210181280.1A Active CN102808020B (zh) 2011-05-31 2012-05-31 基因多态性检测方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20130029861A1 (zh)
EP (1) EP2530166B1 (zh)
JP (1) JP6059453B2 (zh)
KR (1) KR101596474B1 (zh)
CN (1) CN102808020B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020264220A1 (en) * 2019-06-25 2020-12-30 The Translational Genomics Research Institute Detection and treatment of residual disease using circulating tumor dna analysis
WO2024086277A1 (en) * 2022-10-20 2024-04-25 Ultima Genomics, Inc. Sequencing with concatemerization

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008018305A1 (en) * 2006-08-08 2008-02-14 Arkray, Inc. Method of detecting variation and kit to be used therein

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH068483B2 (ja) * 1989-02-27 1994-02-02 新日本製鐵株式会社 連続焼鈍によって製造された局部延性に優れた非時効焼付硬化性冷延鋼板
JP3437816B2 (ja) 1999-04-20 2003-08-18 環境エンジニアリング株式会社 核酸の測定方法
EP1046717B1 (en) * 1999-04-20 2010-10-06 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Method and probes for determining a concentration of target nucleic acid molecules and method for analyzing data obtained by the method
AU2001234883A1 (en) * 2000-02-10 2001-08-20 The Penn State Research Foundation Method of analyzing single nucleotide polymorphisms using melting curve and restriction endonuclease digestion
JP3501111B2 (ja) 2000-07-21 2004-03-02 ブラザー工業株式会社 読み取り装置
JP3963422B2 (ja) 2000-08-03 2007-08-22 日鉄環境エンジニアリング株式会社 核酸の測定方法
JP2002355084A (ja) 2001-03-27 2002-12-10 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 新規核酸プローブおよびそれを用いる新規核酸測定方法
WO2004074447A2 (en) 2003-02-18 2004-09-02 Applera Corporation Compositions and methods for multiplex analysis of polynucleotides
JP4336877B2 (ja) * 2003-04-18 2009-09-30 アークレイ株式会社 β３アドレナリン受容体変異遺伝子の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット
JP2006166808A (ja) 2004-12-16 2006-06-29 Olympus Corp 塩基配列解析用プローブ及び塩基配列解析用固相化担体、並びに塩基配列解析方法
CN101568646B (zh) * 2007-03-26 2013-02-27 爱科来株式会社 基因扩增用引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途
EP2116614A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-11 Qiagen GmbH Simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction
CN101463390B (zh) * 2008-12-31 2011-09-14 广州益善生物技术有限公司 Egfr基因外显子20突变的检测探针、液相芯片及其检测方法
US8039215B2 (en) * 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
EP3219814B1 (en) * 2010-10-29 2023-02-15 ARKRAY, Inc. Probe for detection of polymorphism in egfr gene, amplification primer, and use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008018305A1 (en) * 2006-08-08 2008-02-14 Arkray, Inc. Method of detecting variation and kit to be used therein

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MILLWARD H ET.AL: "Homogeneous amplification and mutation scanning of the P53 gene using fluorescent melting curves", <CLINICAL CHEMISTRY> *
WITTWER C T ET.AL: "Real-time multiplex PCR assays", <METHODS:A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY> *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2530166A1 (en) 2012-12-05
EP2530166B1 (en) 2014-07-16
KR20120134078A (ko) 2012-12-11
CN102808020B (zh) 2016-12-14
KR101596474B1 (ko) 2016-02-22
JP2013009669A (ja) 2013-01-17
JP6059453B2 (ja) 2017-01-11
US20130029861A1 (en) 2013-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100641595B1 (ko) 핵산의 형광측정 검출 시스템
EP2182077B1 (en) A method for single nucleotide polymorphism and mutation detection using real time polymerase chain reaction microarray
US7771944B2 (en) Methods for determining genetic haplotypes and DNA mapping
JP5354216B2 (ja) 核酸測定用の核酸プローブ、核酸プローブセットおよびそれらを用いる標的核酸の測定方法
US20120040853A1 (en) Real time multiplex pcr detection on solid surfaces using double stranded nucleic acid specific dyes
US8236498B2 (en) Method of detecting nucleotide sequence with an intramolecular probe
KR101038137B1 (ko) 서열 차이를 감지하는 방법
EP0868534A1 (en) Method for nucleic acid analysis using fluorescence resonance energy transfer
JP2000509608A (ja) Ｐｃｒ中のハイブリダイゼーションのモニタリング
EP2180066B1 (en) Single nucleotide polymorphism genotyping detection via the real-time invader assay microarray platform
CN107760764B (zh) 一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒
JP2002506655A (ja) ヌクレオチド配列の検出方法
Wenz et al. Identification of known p53 point mutations by capillary electrophoresis using unique mobility profiles in a blinded study
CN102808020A (zh) 基因多态性检测方法
US20140302501A1 (en) Mutation detection in highly homologous genomic regions
EP1207210B1 (en) Method for melting curve analysis of repetitive PCR products
US20140080726A1 (en) Enhanced method for probe based detection of nucleic acids
EP2383347B1 (en) Method for detecting mutation in Exon 12 of JAK2 gene, and nucleic acid probe and kit therefor
KR20160134982A (ko) Ｔｍ 값 분석을 이용한 동시다중 실시간 PCR 산물 분석 방법
EP2711435A1 (en) Mutation detection probe, mutation detection method, method of evaluating drug efficacy, and mutation detection kit
WO2006070667A1 (ja) Ｅｇｆｒ遺伝子変異の検出法ならびに検出キット
CN104995312A (zh) 用于表征ssdna序列的dsdna结合染料和探针的组合
US20150315634A1 (en) Calibration of High Resolution Melting
CN106916882A (zh) 用于辨识核苷酸基因多型性的基因型鉴定芯片的双重等位基因特异性聚合酶链锁反应的方法
JP2001299393A (ja) 核酸の塩基配列の変異検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant