KR100641595B1 - 핵산의 형광측정 검출 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 표적 핵산 서열을 함유하는 것으로 생각되는 샘플에 DNA 이중나선 결합제 및 상기 표적 서열에 특이적인 프로브(여기서, 프로브는 DNA 이중나선 결합제로부터 형광을 흡수하거나 상기 결합제에 형광 에너지를 제공할 수 있는 반응 분자를 포함한다)를 첨가하는 단계; (b) 이렇게 형성된 혼합물을 증폭 반응시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계; (c) 상기 샘플을 프로브가 표적 서열과 하이브리드화하는 조건하에 처리하는 단계 및 (d) 상기 샘플로부터 형광을 모니터하는 단계를 포함하는, 샘플내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 샘플내에 존재하는 표적 서열의 양을 측정할 수 있도록 예를 들어 PCR 반응과 같은 증폭 반응을 모니터하기 위해 사용할 수 있다. 또한 또는 대안적으로, 증폭 모니터, 또는 다형성 또는 대립유전자 변이의 검출 및 정량화를 위한 용융 히스테리스 정보와 같은 이중나선 불안정화 데이타를 제공하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 일반적인 진단법에 유용하다.
DNA 이중나선 결합제, 프로브, 하이브리드화, 형광 에너지 및 증폭 반응

Description

핵산의 형광측정 검출 시스템{Fluorimetric detection system of a nucleic acid}
본 발명은 예를 들어 증폭 반응을 정량적으로 모니터함으로써 샘플내에서 표적 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 방법, 및 이들 방법에 사용하기 위한 프로브 및 키트를 제공한다. 본 발명의 방법은 다형성 또는 대립유전자 변이의 검출에 특히 적합하며, 따라서 진단 방법에 사용될 수 있다.
공지된 형광 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 모니터 기술은 몇몇 2차 생성 PCR 열순환 장치에 사용될 수 있는 쇄 특이적 및 일반적 DNA 삽입 기술 모두를 포함한다.
일반적 방법은 2본쇄 DNA 종에 결합되는 경우에 형광이 증가되는 DNA 삽입 염료(intercalating dye)를 이용한다. 증폭 중에 DNA의 벌크 농도 상승에 기인하는 형광 증가를 사용하여 반응 진행을 측정하고 표적 분자 복제수를 측정할 수 있다. 또한, 온도 변화의 조절과 함께 형광을 모니터함으로써, 예를 들어 PCR 열 순환 종결시에 DNA 용융 곡선을 생성시킬 수 있다.
일반적 DNA 방법을 사용하여 핵산의 벌크 농도 상승을 모니터하는 경우, 이들 과정은 (하기 언급된 몇몇 다른 공지된 검정법에 비해) 최소의 시간 패널티로 모니터할 수 있다. 단일 형광 판독은 모든 반응에서 동일한 시점에서 수행할 수 있다. 종점 용융 곡선 분석을 사용하여 앰플리콘으로부터 합성물을 구별하고 앰플리콘을 구별할 수 있다. 생성물의 용융 피크는 아가로즈 겔 전기영동으로는 가시화될 수 없는 농도에 대해 측정할 수 있다.
예를 들면, 다수의 샘플에 대한 고해상도 용융 데이터를 수득하기 위해서는 용융 시험을 5분 이하에 걸쳐 현존하는 하드웨어상에서 서서히 수행하여야 한다. 그러나, 형광 증폭을 연속적으로 모니터함으로써, 용융 및 하이브리드화의 히스테레시스의 3차원 영상을 생성할 수 있다. 이러한 3차원 영상은 앰플리콘 의존적이며, 생성물 식별에 대한 충분한 정보를 제공할 수 있다.
일반적으로 DNA 용융 곡선 분석이 PCR 열 순환을 최적화하기 위한 강력한 도구임이 밝혀졌다. 앰플리콘의 용융 온도를 측정함으로써, 이후의 PCR 주기에서 변성 온도를 상기 온도까지 저하시킬 수 있다. 표적 DNA보다는 오히려 1차 생성 반응 생성물의 증폭을 위한 최적화가 이후의 주기에서 발생하는 합성물 형성을 감소시킨다. 프라이머 올리고뉴클레오타이드 및 이들의 상보체의 용융 온도를 사용하여 이들의 어닐링 온도를 측정할 수 있는데, 이는 실험상의 최적화 필요성을 감소시킨다.
그러나, 일반적 삽입 방법은 단지 준-쇄-특이적이며, 따라서 쇄 특이적 검출이 요구되는 경우에는 유용하지 않다.
쇄 특이적 방법은 추가의 핵산 반응 성분을 사용하여 증폭 반응의 진행을 모니터한다. 이들 방법은 종종 검출의 기초로서 형광 에너지 전이(FET)를 사용한다. 하나 이상의 핵산 프로브를 형광 분자로 표지하는데, 이들 형광 분자 중의 하나는 에너지 공여체로서 작용할 수 있고 다른 하나는 에너지 수용체 분자이다. 이들은 각각 리포터(reporter) 분자 및 소광제(quencher) 분자로서 알려져 있다. 공여체 분자는 이의 여기 범위내에 속하는 광의 특정한 파장에 의해 여기되며, 후속적으로 이의 형광 방사 파장내에서 광을 방사할 것이다. 또한, 수용체 분자는 다양한 거리-의존적 에너지 전이 기작에 의해 공여체 분자로부터 에너지를 수용함으로써 상기 파장에서 여기된다. 발생할 수 있는 형광 에너지 전이의 특정한 예는 형광 공명 에너지 전이 또는 "FRET"이다. 일반적으로, 수용체 분자와 공여체 분자가 비교적 근접하여 위치하는 경우(예를 들면, 동일한 분자에 위치하거나 인접한 분자에 위치하는 경우), 수용체 분자는 공여체 분자의 방사 에너지를 수용한다. 형광 에너지 전이 검출의 기초는 공여체 및 수용체 방사 파장의 변화를 모니터하는 것이다.
통상 사용되는 2가지 형태, 즉 수용체로부터 공여체를 분리하기 위해 핵산 프로브의 가수분해를 사용하는 형태 및 공여체와 수용체 분자의 공간적 상호관계를 변화시키기 위해 하이브리드화를 이용하는 형태의 FET 또는 FRET 프로브가 있다.
가수분해 프로브는 TaqManTM 프로브로서 시판 중이다. 이들은 공여체 및 수용체 분자로 표지되는 DNA 올리고뉴클레오타이드로 이루어져 있다. 상기 프로브는 PCR 생성물의 하나의 쇄상의 특정한 영역에 결합하도록 설계된다. 이러한 쇄에 PCR 프라이머를 어닐링한 다음, Taq 효소는 5'에서 3' 방향으로 폴리머라제 활성으로 DNA를 신장시킨다. 또한, Taq 효소는 5'에서 3' 방향으로 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. TaqManTM 프로브는 이들이 Taq 신장으로부터 프라이밍되지 않도록 포스포릴화에 의해 3' 말단에서 보호된다. TaqManTM 프로브가 생성물 쇄와 하이브리드화되는 경우, 신장하는 Taq 분자는 또한 프로브를 가수분해시켜 검출의 기초로서 공여체를 수용체로부터 유리시킨다. 상기 예에서 시그날은 누적되며, 여기서 유리 공여체 및 수용체 분자의 농도는 증폭 반응의 각 주기에 따라 증가한다.
시그날 생성이 프로브 가수분해 반응의 발생에 의존적이라는 사실은 이러한 방법과 관련된 시간 패널티가 존재한다는 것을 의미한다. 더욱이, 프로브의 존재는 PCR 과정의 원활한 작동을 중단시킬 수도 있다.
또한, 특히 다수의 증폭 주기, 예를 들어 50회 이상의 주기가 요구되는 경우에는 가수분해가 비특이적이 될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 경우, 프로브의 비특이적 가수분해는 과도하게 상승된 시그날을 나타낼 것이다.
이는 상기와 같은 기술이 아이다호 테크놀로지스 인코포레이티드(Idaho Technologies Inc.)사의 래피드사이클러(RapidCycler)TM 및 라이트사이클러(LightCycler)TM와 같은 신속한 고온 공기 열 순환기의 개발에 의해 더욱 유망해진 신속한 PCR 과정에는 적합하지 않는다는 것을 의미한다. 다른 신속한 PCR 장치는 예를 들어 동시 계류 중인 영국 특허원 제9625442.0호 및 제9716052.7호에 기재되어 있다. 통상의 열 순환보다 신속한 순환의 장점은 다른 곳에도 보고되어 있다. 이러한 기술은 예를 들어 인명 손실 또는 심각한 손상을 회피할 수 있는 경우에 결과의 속도가 중요한 생물학전(biological warfare)용 검출 시스템에 특히 유용하다.
더욱이, 가수분해 프로브는 시그날 생성이 거의 대부분 앰플리콘의 용융 온 도보다는 오히려 프로브의 가수분해에 의존적이기 때문에 용융물의 히스테레시스와 관련하여 중요한 정보를 제공하지 않는다.
미국 특허 제5,491,063호는 DNA 결합제에 의한 표지된 1본쇄 올리고뉴클레오타이드로부터의 시그날 변형에 의존하는 형광 표지된 프로브의 용액내 소광 방법을 기술한다. 폴리머라제 연쇄 반응중에 프로브 절단(가수분해)에 따른 프로브의 쇄 길이 감소에 기인하여 발생하는 이러한 시그날의 차이는 표적 핵산의 존재를 검출하기 위한 수단의 제공을 시사한다.
하이브리드화 프로브는 여러 형태로 이용 가능하다. 분자 표지(molecular beacon)는 이들이 헤어핀 루프를 형성하도록 상보적 5' 및 3' 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이다. 말단 형광 표지는 비교적 인접하여 위치함으로써 헤어핀 구조가 형성되는 경우에 FRET를 발생시킨다. 상보적 서열에 분자 표지를 하이브리드화시킨 후, 형광 표지를 FRET가 발생하지 않도록 분리하여 검출의 기초를 형성한다.
또한, 표지된 올리고뉴크레오타이드 쌍을 사용할 수 있다. 이들은 PCR 생성물 쇄상에서 비교적 인접한 상태에서 하이브리드화하여 공여체 분자와 수용체 분자가 함께 인접되게 함으로써 FRET를 발생시킬 수 있다. 증가된 FRET는 검출의 기초이다. 이러한 형태의 변형법은 1개의 인접한 프로브와 함께 표지된 증폭 프라이머를 사용하는 것을 포함한다.
2가지 프로브의 사용, 또는 2개의 표지화 분자를 포함하는 분자 표지 형태의 프로브의 사용은 당해 방법에 수반되는 비용을 증가시킨다. 또한, 이 방법은 근접하여 서로 특이적으로 결합하기에 충분히 긴 2개의 프로브가 식별되도록 상당히 긴 공지된 서열의 존재를 필요로 한다. 이것은 일부 진단적 적용시 문제가 될 수 있는데, 이는 HIV 바이러스와 같은 효과적인 프로브의 작제에 사용될 수 있는 유기체의 보존된 서열 길이가 비교적 짧을 수 있기 때문이다.
더욱이, 프로브 쌍의 사용은 더욱 복잡한 실험적 설계를 수반한다. 예를 들면, 프로브의 용융에 의해 제공된 시그날은 두 프로브의 용융 제거의 작용이다. 다소의 미스매치(mismatch)가 있는 경우 또는 프로브들 중의 하나가 스플라이싱 영역을 가로질러 결합하여야 하는 경우(예를 들어, 인트론의 어느 한 쪽에 있는 서열이 프로브 부위로서 사용될 수 있는 경우에 샘플내의 DNA와 비교하여 RNA를 검출하기 위해)의 연구는 다른 프로브가 먼저 용융된다면 부정확한 결과를 산출할 수 있다.
미국 특허 제4,868,103호는 공여체 분자로서 삽입 염료를 이용하는, 분석물의 존재를 검출하기 위한 FRET 시스템을 일반적인 측면에서 기술한다. 이 방법은 증폭 단계를 수반하지 않는다.
본 출원인은 특정한 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 쇄 특이적 시스템을 개발하였다.
본 발명은 표적 핵산 서열을 함유하는 것으로 생각되는 샘플에 DNA 이중나선 결합제 및 상기 표적 서열에 특이적인 프로브(여기서, 프로브는 DNA 이중나선 결합제로부터 형광을 흡수하거나 상기 결합제에 형광 에너지를 제공할 수 있는 반응 분자를 포함한다)를 첨가하는 단계(a),
이렇게 형성된 혼합물을 증폭 반응에 적용시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계(b),
상기 샘플을 프로브가 표적 서열과 하이브리드화하는 조건에 적용하는 단계(c) 및
상기 샘플로부터 형광을 모니터하는 단계(d)를 포함하는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "DNA 이중나선 결합제"는 이중나선 형태인 DNA에 부착하거나 결합하는 모든 물질을 의미한다. 여기에는 본 기술분야에서 공지된 바와 같은 삽입 염료가 포함된다.
프로브는 단계 (c)에서 표적 서열과 하이브리드화하기 때문에, 삽입 염료와 같은 DNA 이중나선 결합제는 쇄 사이에 포획된다. 일반적으로, 이것은 염료와 관련된 파장에서 형광을 증가시킬 것이다. 그러나, 반응 분자가 염료로부터 형광을 흡수할 수 있는 경우(즉, 이것은 수용체 분자이다), 반응 분자는 FET, 특히 FRET에 의해 염료로부터의 방사 에너지를 흡수하고, 따라서 이의 특징적인 파장에서 형광을 방사한다. 염료의 파장과는 다른 파장을 갖는 수용체 분자로부터의 형광 증가는 이중나선 형태에서 프로브의 결합을 나타낼 것이다. 따라서, 프로브를 수반하는 이중나선의 형성 또는 불안정화의 지표가 되는 형광의 변화는 단계 (d)에서 모니터하는 것이 바람직하다.
유사하게는, 반응 분자가 염료에 형광을 제공할 수 있는 경우(즉, 이것은 공여체 분자이다), 공여체 분자로부터의 방사는 FRET의 결과로서 감소하며, 이러한 감소는 검출될 수 있다. 염료의 형광은 이러한 상황하에 예상할 수 있는 것보다 증가한다.
바람직하게는, 반응 분자는 수용체 분자인데, 이는 시그날을 더욱 용이하게 검출할 수 있기 때문이다.
삽입 염료와 같은 DNA 이중나선 결합제 및 단일 표지되는 프로브의 사용은 이들 성분이 이중으로 표지된 프로브가 요구되는 다른 검정법보다 더욱 경제적이라는 점에서 유리하다. 단지 하나의 프로브를 사용함으로써, 프로브의 기초를 형성하는데 필요한 공지된 서열의 길이를 비교적 단축시킬 수 있으며, 따라서 어려운 진단 상황에서도 상기 방법을 사용할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 방법은 이의 적용분야가 매우 융통적이다. 본 발명의 방법은 이하 더욱 상세히 언급되는 바와 같이 샘플 내의 표적 핵산 서열에 관한 정량적 및 정성적 데이타 모두를 제공하기 위해 사용할 수 있다. 특히, 본 발명은 정량적 증폭을 위해 제공될 뿐만 아니라, 이중나선 불안정화 온도 또는 융점과 같은 특징적인 데이터를 수득하기 위해 추가로 또는 대안으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 샘플은 증폭 반응 중에 또는 증폭 반응이 완성된 후에 프로브가 샘플과 하이브리드화하는 조건에 적용될 수 있다. 따라서, 당해 방법은 증폭 및 모니터를 모든 시약이 초기에 첨가된 단일 용기내에서 수행할 수 있다는 점에서 검출이 균일한 방식으로 수행되도록 한다. 후속적인 시약 첨가 단계는 더 이상 요구되지 않는다. 또한, (선택사항이기는 하지만) 고체 지지체의 존재하에 상기 방법을 수행할 필요도 없다.
프로브는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산 분자를 포함할 수 있으며, 이는 나중에 1본쇄 형태로 존재하는 표적 핵산 서열과 하이브리드화할 것이다. 예를 들면, 단계(c)는 표적 핵산이 1본쇄화되도록 하는 조건의 채용을 수반할 것이다.
프로브는 용액 내에 유리되거나, 생성물을 분리하는데 유용한, 고체 지지체, 예를 들어 자기 비드와 같은 비드의 표면 또는 표면 플라스몬 공명 검출기의 도파관과 같은 검출기 장치의 표면에 고정화될 수 있다. 이의 선택은 고찰하고자 하는 특정한 검정의 특성 및 사용되는 특정한 검출 수단에 따라 결정된다.
특히, 사용되는 증폭 반응은, 샘플을, 서열 내에 존재하는 임의의 표적 핵산 서열을 1본쇄화되도록 하는 조건에 적용하는 단계를 포함할 것이다. 이러한 증폭 반응은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 리가제 연쇄 반응(LCR)을 포함하지만, PCR 반응이 바람직하다.
이어서, 증폭 반응 동안 프로브를 하이브리드화시키는 것이 가능하며, 단 이때는 적합한 하이브리드화 조건이 성립되어야 한다.
바람직한 양태에서, 프로브는 증폭 반응의 각 주기 동안 상기한 조건을 만족시키도록 설계될 수 있다. 따라서, 증폭 반응의 각 주기 동안 몇몇 시점에서, 프로브는 표적 서열과 하이브리드화하고, 프로브와 표적 서열 사이에 포획된 삽입 염료와 같은 DNA 이중나선 결합제와 프로브 사이의 FET 또는 FRET의 결과로서 시그날을 생성한다. 증폭이 진행됨에 따라, 프로브는 표적 서열로부터 분리되거나 용융되고, 이로 인해 생성되는 시그날이 감소될 것이다. 따라서, 증폭의 각 주기에서, 반응 분자로부터 형광 피크가 생성된다. 피크의 강도는 증폭을 진행함에 따라 증가하는데, 이는 보다 많은 표적 서열을 프로브의 결합에 사용할 수 있게 되기 때문이다.
각 주기 동안 샘플로부터 반응 분자의 형광을 모니터함으로써, 증폭 반응의 진행을 다양한 방식으로 모니터할 수 있다. 예를 들어, 용융 피크에 의해 제공되는 데이터는, 예를 들어 용융 피크하의 면적을 계산함으로써 분석할 수 있고, 이러한 데이터를 주기의 수에 대하여 플롯팅한다.
예를 들어, 형광은 적합하게는 공지된 형광측정기를 사용하여 모니터한다. 이들로부터의 시그날은 예를 들어, 광전자증배관 전압 형태로, 데이터 처리 보드로 보내어, 각 샘플 튜브와 관련된 스펙트럼으로 변환시킨다. 다중 튜브, 예를 들어 96개 튜브를 동시에 평가할 수 있다. 데이터는 반응 전반에 걸쳐 상기한 방식으로 빈번한 간격으로, 예를 들어, 매 10ms마다 한번씩 수집할 수 있다.
상기한 방식으로 생성된 스펙트럼은, 예를 들어 예비선택된 염료의 "피트"를 사용하여 분해되어 각각의 시그날형성 잔기(즉, 염료 및/또는 반응 분자)의 대표적인 피크를 형성할 수 있다. 각각의 시그날의 강도 값을 나타내는 피크 아래의 면적을 측정하고, 경우에 따라, 서로에 대한 지수로서 나타낸다. 시그날 강도 및/또는 비의 차이는 반응 전반에 걸쳐 기록되거나 온도와 같은 상이한 반응 조건에서 기록되는 FRET를 변화시킬 수 있다. 상기한 바와 같은 변화는 프로브와 표적 서열 사이의 결합 현상과 관련된다. 미분 피크하의 면적을 적분하면 FRET 효과에 대한 강도 값이 계산된다.
이러한 데이터는 샘플내에 존재하는 표적 핵산의 양을 정량화할 기회를 제공한다.
또한, 프로브 하이브리드화의 역학은 표적 서열 농도를 절대적으로 환산하여 측정하도록 한다. 샘플로부터의 형광 변화에 의해 샘플에 대한 프로브의 하이브리드화 속도를 계산할 수 있다. 하이브리드화 속도의 증가는 샘플내에 존재하는 표적 서열의 양에 관련된다. 증폭 반응이 진행됨에 따라 표적 서열 농도가 증가하기 때문에 프로브의 하이브리드화는 더욱 빠르게 일어날 것이다. 따라서, 이러한 파라메터는 또한 정량화의 기준으로서 사용될 수도 있다. 정보를 제공하는 시그날 강도에 의존하지 않는 상기한 데이터 처리 방식이 유용하다.
바람직하게는, 염료 및 반응 분자 둘 다의 형광을 모니터하고, 방출 사이의 관계를 계산한다. 이는 염료로부터 형광을 측정함으로써 제공되는 일반적인 DNA 정보를 보완하기 위한 쇄 특이적 수단을 제공한다. 이러한 방식으로, 비특이적 증폭 시그날에 대한 기여도는 구별될 수 있고, 따라서 당해 방법은 내부 검사를 제공한다.
적합한 반응 분자는 로다민 염료 또는 기타 염료(예: Cy5 또는 플루오레세인)이다. 이들은 통상적인 방법으로 프로브에 부착될 수 있다. 프로브와 함께 반응 분자의 위치는 비록 막연하다 해도 정해진 것은 아니며, 반응 분자는 프로브의 말단 영역에 위치된다.
삽입 염료는 당해 기술분야에 익히 공지되어 있다. 이들은, 예를 들어 SYBRGreen I과 같은 SYBRGreen, SYBRGold, 에티듐 브로마이드 및 YOPRO-1을 포함한다.
FET, 예를 들어 FRET를 반응 분자 및 염료 사이에서 발생시키기 위해, 공여체(프로브상의 삽입 염료 또는 반응 분자일 수 있다)의 형광 방출량은 수용체(즉, 염료 또는 반응 분자의 나머지)보다 단파장을 가져야 한다.
따라서, 적합한 배합물을 하기 표에 제시한다.
염료 수용체/공여체 반응 분자 수용체/공여체
SYBRGold 공여체 로다민 수용체
SYBRGreen I 공여체 로다민 수용체
SYBRGold 공여체 Cy5 수용체
SYBRGreen I 공여체 Cy5 수용체
에티듐 브로마이드 수용체 플루오레세인 공여체
바람직하게는, 공여체 및/또는 수용체로서 사용되는 분자는 날카로운 피크를 생성하고, 방출 파장은 거의 또는 전혀 중첩되지 않는다. 이러한 상황하에, DNA 이중나선 결합제 시그날로부터 쇄 특이적 피크를 분리하는 것이 필요하지 않을 수 있다. 쇄 특이적 시그날(즉, 반응 분자에 의해 제공된 것)을 단독으로 간단히 측정하면 표적 반응에 의해 유도되는 FRET의 정도에 관한 정보가 제공된다. 에티듐 브로마이드/플루오레세인 배합물이 이러한 요건을 만족시킨다. 이러한 경우, 쇄 특이적 반응은 적합하게는 1/형광으로서 나타낸, 520nm에서의 형광 감소에 의해 정량화될 수 있다.
그러나, 공여체 및 수용체 분자로부터의 형광 시그날에 스펙트럼 중첩이 존재하는 경우, 이는 결과적으로 예를 들어 스펙트럼 사이의 관계식을 실험적으로 측정함으로써 설명될 수 있고, 이러한 관계식을 사용하여 2개의 시그날로부터 시그날을 정규화할 수 있다.
증폭 반응에 사용된 DNA 폴리머라제에 의해 가수분해되어 반응 분자를 방출하도록 프로브를 설계할 수 있다. 이는 각 주기와 함께 증가하는 시스템 내에 존재하는 유리 반응 분자의 양과 함께 누적 시그날을 제공한다. 이러한 유형의 누적 시그날은 표적 서열의 양을 정량화하고자 하는 경우에 특히 바람직하다. 그러나, 당해 검정에서는 시그날이 단지 프로브의 해리에 의존하지 않기 때문에 프로브가 이러한 방식으로 소비될 필요가 없다.
각 반응 단계에서 존재하는 증폭 생성물의 양과 직접 관련되는 완전 가역성 시그날을 성취하기 위해서, 반응 속도가 예를 들어 신속한 PCR에서 가장 중요할 경우, 또는 이 둘 다의 경우, 프로브가 표적 서열로부터 온전한 상태로 방출되도록 설계하는 것이 바람직하다. 이는, 예를 들어 증폭 반응의 신장기 동안일 수 있다. 그러나, 시그날이 프로브 가수분해에 의존하지 않기 때문에, 프로브는 어닐링 또는 반응의 용융기를 포함하여 증폭 주기 동안 임의의 단계에서 표적 서열과 하이브리드화하고 이로부터 용융되도록 설계할 수 있다. 이러한 프로브는 증폭 반응에 의한 간섭의 최소화를 보장한다.
신장기 동안 결합하는 프로브가 사용될 경우, 표적 서열로부터 이들의 완전 방출은 Taq 또는 Pwo의 스토플(Stoffle) 단편과 같은 5'-3' 엑소뉴클레아제 결핍 효소를 사용하여 달성할 수 있다.
프로브가 상기한, 또는 실제로 모든 증폭 반응의 특정한 신장기 동안 신장되지 않음을 확신하기 위해, 프로브의 3' 말단은 적합하게는 포스포릴화에 의해 차단될 수 있다.
이어서, 프로브는 다시 반응에 참여할 수 있고, 이는 프로브의 경제적인 적용을 나타낸다.
이러한 방식으로 생성된 데이터는 각종 방식으로 해석될 수 있다. 이의 가강 간단한 형태에서, 증폭 반응 도중에 또는 말기에 수용체 분자의 형광 증가는 존재하는 표적 서열의 양이 증가한다는 것을 나타내고, 이는 증폭 반응이 진행되었으며, 따라서 표적 서열이 사실상 샘플내에 존재한다는 사실을 암시한다. 그러나, 상기한 바와 같이, 증폭 반응 전체를 모니터함으로써 정량화가 또한 가능하다. 또한, DNA 이중나선 결합제, 특히 삽입 염료로부터의 방출을 사용하여 샘플 내의 핵산의 다량 상승을 모니터할 수 있고, 이는 반응 분자와 염료 시그날 사이의 관계에 의해 측정된 쇄 특이적 증폭과 비교할 수 있다. 최종적으로, 종점 측정 또는 전체 측정으로서 특성 표시 데이타 및 특히 융점 분석을 수득하여 이하에 추가로 토의할 서열에 대한 정보를 수득할 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 양태는 핵산 폴리머라제(a), 표적 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화할 수 있는 하나 이상의 프라이머(b), 형광성 DNA 이중나선 결합제(c) 및 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있고 상기한 염료로부터 형광을 흡수할 수 있는 수용체 분자를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프로브(d)의 존재하에 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 핵산 증폭을 수행하는 단계 및 증폭 반응중에 형광의 변화를 모니터하는 단계를 포함하여, 핵산 증폭을 검출하는 방법을 포함한다.
상기한 바와 같이, DNA 이중나선 결합제는 적합하게는 삽입 염료이다. 증폭은 적합하게는 당해 기술 분야에 익히 공지된 바와 같이 DNA 쇄 내의 표적 뉴클레오타이드 서열만이 증폭되도록 설계된 프라이머 쌍을 사용하여 수행된다. 핵산 폴리머라제는 적합하게는 Taq 폴리머라제와 같은 열안정성 폴리머라제이다.
증폭 반응이 수행될 수 있는 적합한 조건은 당해 기술 분야에 익히 공지되어 있다. 최적 조건은 수반되는 특정 앰플리콘, 사용되는 프라이머의 특성 및 사용되는 효소에 따라 각각의 경우에 달라질 수 있다. 최적 조건은 숙련가에 의해 각각의 경우에 맞게 결정될 수 있다. 전형적인 변성 온도는 95℃ 정도이고, 전형적인 어닐링 온도는 55℃ 정도이며, 신장 온도는 72℃ 정도이다.
당해 방법은 특정한 서열의 특징을 측정하기 위한 하이브리드화 검정에 사용될 수 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 서열을 함유하는 것으로 생각되는 샘플에 DNA 이중나선 결합제와, 표적 서열에 특이적인 프로브(여기서, 프로브는 DNA 이중나선 결합제로부터 형광을 흡수하거나 DNA 이중나선 결합제에 형광 에너지를 제공할 수 있는 반응 분자를 포함한다)를 첨가하는 단계(a),
상기 샘플을 프로브가 표적 서열과 하이브리드화하는 조건에 적용하는 단계(b) 및
샘플로부터 형광을 모니터하고, 프로브의 샘플과의 하이브리드화 또는 프로브와 표적 핵산 서열 사이에 형성된 이중나선의 불안정화의 결과로서 형광이 변화하는, 서열의 특징인 특정한 반응 조건을 측정하는 단계(c)를 포함하여, 서열의 특징을 검출하는 방법을 제공한다.
적합한 반응 조건은 온도, 전기화학적, 또는 특정 효소 또는 화학물질의 존재에 대한 반응을 포함한다. 이러한 특성의 변화에 따른 형광의 변화를 모니터함으로써, 서열의 정확한 성질의 특징적인 정보를 달성할 수 있다. 예를 들어, 온도의 경우에, 프로브가 표적 서열로부터 분리되거나, "용융되는" 온도가 측정될 수 있다. 이는, 예를 들어 유전자 진단시에 대립유전자 변이를 포함하여 서열내의 다형성을 검출하고, 경우에 따라 또한 정량화하는데 유용하다. "다형성"이란 서열내에서 특히 자연적으로 발생할 수 있는 역위의 전이, 변위, 삽입, 결손을 포함한다.
프로브의 용융 히스테레시스는 표적 서열이 단지 하나의 염기쌍만 다를 경우에 상이할 것이다. 따라서, 샘플이 단일 대립유전자 변이만을 함유하는 경우, 프로브의 용융 온도는 또 다른 단일 대립유전자 변이만을 함유하는 샘플내에서 발견되는 것과 상이할 수 있는 특정한 값일 것이다. 상기 대립유전자 변이 둘다를 함유하는 샘플은 각각의 대립유전자 변이에 상응하는 2가지의 융점을 나타낸다.
유사한 고찰이 전기화학적 특성에 대해 적용되거나 특정한 효소 또는 화학물질의 존재하에 적용된다. 프로브는 전기화학적 전위가 인가될 수 있는 고체 표면에 고정화될 수 있다. 표적 서열은 서열의 정확한 성질에 따라 특정한 전기화학적 값에서 프로브에 결합되거나 프로브에 의해 반발될 것이다.
이 양태는 상기 언급된 PCR 반응과 같은 증폭 반응과 함께 수행되거나, 개별적으로 사용될 수 있다. 또한, 반응 분자는 바람직하게는 수용체 분자이다.
본 발명의 추가의 양태에는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트가 포함된다. 이들 키트는 반응 분자를 함유하는, 표적 뉴클레오타이드 서열에 특이적인 프로브를 함유할 것이다. 추가로, 키트는 상기 반응 분자와 FET 또는 FRET를 경험할 수 있다는 측면에서 적합한 삽입 염료와 같은 DNA 이중나선 결합제를 함유할 것이다. 키트의 다른 가능한 성분에는 DNA 폴리머라제와 같은 증폭 반응에 사용된 시약이 포함된다.
본 발명은 특히 이제 첨부되는 도면과 관련하여 예를 들어 설명될 것이다:
도 1은 본 발명의 발명에 사용되는 상호작용을 도식적으로 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 증폭 반응중의 단계들을 설명한다.
도 3은 본 발명에 따른 증폭 반응의 결과를 나타낸다.
도 4는 서열 내의 미스매치를 검출하기 위한 실험 결과를 나타낸다.
도 1A는 PCR 반응의 용융기 중에 발견될 수 있는, 1본쇄 DNA(2)의 존재하에 있는 삽입 염료(1)의 작용을 설명한다. 염료는 DNA 쇄에 부착하여 형광을 약하게 방출한다. 그러나, DNA가 2본쇄(3)로 되는 경우, 염료가 농축되어 형광을 현저하게 증가시킨다. 이러한 형광 증가를 사용하여 2본쇄 DNA의 형성을 검출할 수 있다. 염료의 형광은 특정한 파장, 예를 들어 스펙트럼의 녹색 영역내에 존재할 것이다.
본 발명에 따른 프로브(4)에 미치는 삽입 염료(1)의 효과는 도 1C에 설명된다. 일부 염료는 프로브의 뉴클레오타이드에 결합할 것이고, 배경 수준에서 형광을 나타낼 것이다. 그러나, FRET의 결과, 일부 에너지는 화살표로 나타낸 바와 같은 수용체 분자(5)로 전달되고, 따라서 이러한 분자는 또한 염료의 파장과는 다른 파장, 예를 들어 스펙트럼의 적색 영역에서 형광을 나타낼 것이다.
프로브가 도 1D에 설명된 바와 같이 1본쇄 표적 서열과 하이브리드화하는 경우, 염료로부터의 형광 에너지의 어떠한 증가분이라도 수용체 분자(5)로 전달되어 보다 높은 수준의 형광을 나타낸다. 따라서, 수용체 분자의 형광 증가는 표적 서열에 대한 프로브의 하이브리드화를 나타낼 것이다. 따라서, 수용체 분자의 형광 증가를 측정함으로써, 예를 들어 온도의 감소에 따른 하이브리드화 발생 지점을 검출할 수 있다. 유사하게는, 온도가 증가함에 따라 프로브가 표적 서열로부터 용융되는 온도에서 수용체 형광 감소가 발생할 것이다. 이것은 프로브와 표적 서열의 하이브리드화 특성에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 표적 서열과 완전히 상보적인 프로브는 표적 서열과 하이브리드화하지만 하나 이상의 미스매치를 함유하는 프로브와 상이한 온도에서 용융될 것이다.
도 2는 본 발명의 방법이 PCR 반응과 같은 증폭 반응에 어떻게 사용될 수 있는지를 설명한다. 프로브(4)는 삽입 염료(1)과 함께 1본쇄 DNA에 하이브리드화하여 수용체 시그날을 증가시킨다(도 2A). 이것은 주기의 어닐링기 중에 발생할 것이다. 표적 서열의 양이 증폭으로 인해 증가함에 따라, 수용체 분자에 의해 어닐링기 중에 생성된 시그날이 또한 증가할 것이다.
신장기에서, 프로브는 가수분해에 의해 또는 설명된 바와 같이 DNA 폴리머라제에 의해 치환되기 때문에 표적 서열로부터 제거된다. 이 때, 표적 서열의 양이 증가함에 따라 나타나는 바와 같이 염료(1)로부터의 시그날이 증가될 수 있으나, 수용체 시그날은 감소한다.
이러한 방식으로 증폭 반응의 진행을 모니터함으로써, 최초 샘플내에 존재하는 표적 서열의 양을 정량화할 수 있다.
실시예 1
PCR 증폭 반응
PCR 반응 혼합물은 다음 시약을 함유하며, 시험 농축물은 다음과 같이 제조한다: 1× 순수한 PCR 완충제(3mM Mg++, 제조원: Bio/Gene, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridge, PE18 ONJ, UK). Taq DNA 폴리머라제 0.025단위/μl, 및 dNTP's PCR 뉴클레오타이드 200μM(제조원: Boehringer Mannheim UK(Diagnostics & Biochemical) Limited, Bell Lane, Lewes, East Sussex, BN 7 1LG, UK). 통상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 각각 1μM(제조원: Cruachem Ltd, Todd Campus, West of Scotland Science Park, Acre Road, Glasgow G20 0UA, UK). 플라스미드 DNA를 최종 농도 10fg/μl(약 3000개 복사체)로 가한다. 음성 대조군 실험에서는, 유사한 PCR을 플라스미드 DNA의 부재하에 수행한다.
정배향 YPPA155(dATGACGCAGAAACAGGAAGAAAGATCAGCC) 및 역배향 YPP229R(dGGTCAGAAATGAGTATGGATCCCAGGATAT) 프라이머는 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)의 항-코아귤라제(coagulase) 유전자의 104bp 앰플리콘을 선별한다. 이를 pBluscript SK 벡터(Stragagene Europe, Hogehilweg 15, 1101 CB Amersterdam, Zuidoost, The Netherlands) 내로 미리 클로닝시켜 파지미드(phagemid) 작제물 pYP100ML을 형성시켰다.
형광 프로브(5'(CY5)CGCTATCCTGAAAGGTGATATATCCTGG, Bio/Gene, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridge, PE18 0NJ, UK)를 최종 농도 0.2μM로 가한다. SyberGold DYE(제조원: Molecular Probes)를 기준 농도 1:400,000의 최종 농도로 가한다.
반응은 복합식 유리 모세관 및 아이다호 테크놀로지 라이트사이클러(Idaho Technology Lightcycler)[Bio/Gene, Bio Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridge, PE18 0NJ, UK]내에서 열 순환시킨다. 한 주기는 95℃에서 1초 동안, 55℃에서 1초 동안 및 74℃에서 1초 동안이다.
열 주기에 이어서, 55℃에서 95℃까지 0.1℃/초로 용융 실험을 수행한다. 반응은 라이트사이클러(LightCycler)TM를 사용하여 광학적으로 신호를 보내고, 520nm 및 670nm에서의 형광 방출량을 기록한다.
온도(T)에 대한 형광(F)의 미분 함수(dF/dT)로서 표시하여 Y축상의 온도에 대해 플롯팅한 결과는 도 3에 제시되어 있다. 520nm에서는 SybrGold로부터의 형광만이 기록된다. 명백한 피크는 PCR 반응에서 증폭된 특이적 생성물의 용융 온도와 관련된다. 음성 대조군은 합성물만을 나타낸다.
670nm에서는 CY5 수용체 분자로부터의 시그날 및 또한 SybrGold로부터의 시그날 모두가 기록된다. 특이적 증폭 생성물을 나타내는 피크가 양성 실험군에서 관찰되지만, 합성물만을 나타내는 음성 관찰되지 않는다. 그러나, 이 경우에 추가적으로, 프로브의 용융으로부터 기인하는 명백한 피크가 양성 실험군에서 관찰된다.
실시예 2
하기 물질을 사용한다.
올리고뉴클레오타이드:
프로브: 5' (CY5)CGCTATCCTGAAAGGTGATATATCCTGGGA 3'
상동물: 5' TCCCAGGATATATCACCTTTCAGGATAGCG 3'
미스매치 1: 5' TCCCAGGATATATCAGCTTTCAGGATAGCG 3'
매스매치 2: 5' TCCCAGGATATATCAGGTTTCAGGATAGCG 3'
매스매치 3: 5' TCCCAGGATATATCTTTCAGGATAGCG 3'
(Bio/Gene Limited, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridgeshire, PE18 0NJ).
삽입 염료:
SYBR Green I(제조원: Molecular Probes)
하이브리드화 완충제:
PCRM0012(Bio/Gene Limited, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridgeshire, PE18 0NJ)
형광측정기:
Idaho Technology LC32(Bio/Gene Limited, Bio/Gene House, 6 The Business Centre, Harvard Way, Kimbolton, Cambridgeshire, PE18 0NJ)
방법:
다음으로 이루어진 하이브리드화 혼합물 4μl를 제조한다:
PCRM012: 제조업자에 의해 정의된 바와 같은 시험 농도
SYBR Green I: 기준 용액의 1/20,000 농도
프로브 올리고뉴클레오타이드: 100μM
표적 올리고뉴클레오타이드: 100μM
하이브리드화 혼합물을 라이트사이클러내에서 하기 온도 방식으로 처리한다: 95℃까지 20℃/초로 가열, 50℃까지 20℃/초로 냉각, 50℃에서 10초 동안 정치, 80℃까지 0.1℃/초로 가열. 형광은 최종 가열 단계중에 2개의 채널, 즉 16으로 설정된 눈금이 있는 F1(520nm 내지 580nm) 및 128로 설정된 눈금이 있는 F2(650nm 내지 690nm)에서 모니터한다.
SYBR Green I로부터 F2 내로의 스펙트럼 중첩은 다음과 같이 실험상 측정된 수학식 1의 관계식을 이용하여 F2 형광으로부터 제거한다.
Figure 112000010872956-pct00001
F2의 SYBR Green I과 독립적인 성분을 정규화시키고, 도 4에 제시된 바와 같이 X축상의 온도에 대해 Y축상에 플롯팅한다. 결과는 표적화된 서열의 성질에 대한 프로브 해리 온도의 의존성을 나타낸다. 표적화된 서열 내의 단일 염기 차이는 명백히 구별가능하다.

Claims (34)

  1. (a) 표적 핵산 서열을 함유하는 것으로 생각되는 샘플에 DNA 이중나선 결합제와 표적 서열에 특이적인 프로브(여기서, 프로브는 DNA 이중나선 결합제로부터 형광을 흡수하거나 DNA 이중나선 결합제에 형광 에너지를 제공할 수 있는 반응 분자를 포함한다)를 첨가하는 단계,
    (b) 이렇게 형성된 혼합물을 증폭 반응시켜 표적 핵산을 증폭시키는 단계,
    (c) 샘플을 프로브가 표적 서열과 하이브리드화하는 조건에 적용한 다음, 표적 서열로부터 프로브를 온전한 상태로 제거하는 단계 및
    (d) 샘플로부터 형광을 모니터하는 단계
    를 포함하여, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 프로브를 수반하는 이중나선의 형성 및 불안정화와 연관된 형광이 검출되는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 분자가 DNA 이중나선 결합제로부터 형광을 흡수할 수 있는 수용체 분자인, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 이중나선 결합제가 삽입 염료(intercalating dye)인, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 핵산이 단계(c)에서 프로브와 하이브리드화하기 전에 1본쇄화되는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 증폭 반응이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)인, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로브를 모든 주기의 증폭 반응 중에 표적 핵산과 하이브리드화시키는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 프로브를 증폭 주기의 신장기 이외의 시기 동안 표적 핵산과 하이브리드화시키는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 샘플로부터의 형광을 증폭 반응 전체에 걸쳐 모니터하는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 생성된 형광 데이터를 사용하여 반응을 통한 공여체 분자와 수용체 분자로부터의 상대적인 형광량 또는 프로브 하이브리드화 속도를 측정하는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 형광 데이터를 사용하여 샘플내에 존재하는 표적 핵산의 양을 정량하는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 염료와 반응 분자 둘 다로부터 형광을 모니터하는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 분자가 로다민 염료, Cy5 또는 플루오레세인인, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응 분자가 프로브의 말단 영역에 부착되는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  15. 삭제
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 증폭 반응이 5'-3' 엑소뉴클레아제 결핍 효소를 사용하여 수행되는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로브의 3' 말단을 차단시켜 신장기 동안 이의 신장을 억제하는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, (a) 핵산 폴리머라제, (b) 표적 폴리뉴클레오타이드와 하이브리화할 수 있는 하나 이상의 프라이머, (c) 형광 DNA 이중나선 결합제 및 (d) 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있고 DNA 이중나선 결합제로부터 형광을 흡수할 수 있는 수용체 분자를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 존재하에 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 핵산 증폭을 수행하는 단계 및 증폭 반응 동안 형광의 변화를 모니터하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 증폭이 증폭 프라이머 쌍을 사용하여 수행되는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 핵산 폴리머라제가 적합하게는 열안정성 폴리머라제인, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  21. 제1항 또는 제18항에 있어서, 하이브리드화 검정을 수행하고 서열의 특징인 하이브리드화 조건을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 조건이 온도, 전기화학적 전위, 또는 효소 또는 화학물질과의 반응인, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 조건이 온도인, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 표적 서열 내의 대립유전자 변이 또는 다형성을 검출하는 데 사용되는, 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 검출하는 방법.
  25. (a) DNA 이중나선 결합제와 표적 서열에 특이적인 프로브(여기서, 프로브는 DNA 이중나선 결합제로부터 형광을 흡수하거나 DNA 이중나선 결합제에 형광 에너지를 제공할 수 있는 반응 분자를 포함한다)를 당해 표적 서열을 함유하는 것으로 생각되는 샘플에 첨가하는 단계,
    (b) 샘플을 프로브가 표적 서열과 하이브리드화하는 조건에 적용하는 단계 및
    (c) 샘플로부터 형광을 모니터하고, 프로브의 샘플과의 하이브리드화 또는 프로브와 표적 핵산 서열 사이에 형성된 이중나선의 불안정화의 결과로서 형광이 변화하는, 서열의 특징인 특정한 반응 조건을 측정하는 단계
    를 포함하여, 서열의 특징을 측정하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 서열의 반응 조건 특징이 온도, 전기화학적 전위, 또는 효소 또는 화학물질과의 반응인, 서열의 특징을 측정하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 조건이 온도인, 서열의 특징을 측정하는 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 2개의 서열로부터 수득한 결과를 비교하여 이들 사이의 다형성 또는 변이의 존재를 측정하는, 서열의 특징을 측정하는 방법.
  29. 제25항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, DNA 이중나선 결합제가 삽입 염료인, 서열의 특징을 측정하는 방법.
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