CN104995312A - 用于表征ssdna序列的dsdna结合染料和探针的组合 - Google Patents

Abstract

本发明包括利用当与双链结合时发出荧光的染料(所谓的DNA结合染料或dsDNA-染料)分析单链核酸序列(RNA序列或者DNA序列(ssDNA))的方法。根据本发明的方法利用dsDNA-染料与一个或多个杂交探针的组合，所述探针杂交于靶核酸序列并用非荧光猝灭剂部分例如黑洞猝灭剂标记。

Description

用于表征SSDNA序列的DSDNA结合染料和探针的组合

相关申请的交叉参照

本申请要求2012年9月17日提交的美国临时专利申请61/702,019的优先权，该申请通过引用以其整体结合到本文中。

本发明涉及核酸序列的荧光检测方法，并且涉及用于进行这样的方法的试剂盒。

发明背景

单链核酸靶序列的检测和分析可包括使用荧光标记的寡核苷酸杂交探针、引物或二者。检测可能是或可能不是“均相检测”。均相检测意思是不需要使结合的(杂交于靶的)引物或探针与未结合的引物或探针分离的检测。在适合于均相检测的探针中有一端用荧光团标记而另一端用猝灭剂(最常用的为非荧光猝灭剂)标记的线性探针(例如，在Livak等人 (1995) PCR Methods Appl. 4:357-362中描述的5’核酸外切酶探针)、一端用荧光部分例如荧光团标记而另一端用猝灭剂标记的发夹探针(例如，在Tyagi等人 (1996) Nature Biotechnology 14:303-308中描述的分子信标探针)、在一条链上具有荧光团而在另一条链上具有猝灭剂的双链探针(例如，在Li等人 (2002) Nucl. Acids Res. 30, No. 2 e5中描述的阴阳探针)、具有吸收来自荧光染料的发射和以较长的波长再发射的荧光团的线性探针(例如，在美国公布的专利申请US2002/0110450中描述的探针)和线性探针对，其中一个探针用供体荧光团标记和一个探针用猝灭剂或受体荧光团标记，它们彼此在靶链上接近地杂交，以致它们的标记相互作用。标记对例如荧光团和猝灭剂可通过FRET相互作用(例如，在美国专利6,140,054中描述的FRET探针对)。作为对FRET猝灭的替代，分子信标探针、5’核酸外切酶探针和阴阳探针可利用接触猝灭，这不需要荧光部分的发射光谱和猝灭剂的吸收光谱之间的大量的光谱重叠。Tyagi等人 (1998) Nature Biotechnology 16: 49-53；欧洲专利EP 0 892 808。公布的国际专利申请WO 2011/050173公开了单链核酸靶序列的分析，该分析通过杂交于靶序列多个探针(包括一个或多个“On”探针(在杂交时发信号的荧光团/猝灭剂双重标记的探针)和一个或多个“Off”探针(在杂交时猝灭从“On”探针发出的荧光的猝灭剂-标记的探针))和分析作为温度的函数的“On”探针的荧光团的荧光(一般借助于解链曲线或退火曲线)来进行。

DNA结合染料(dsDNA-染料)是当与双链核酸相互作用时发荧光的染料，例如SYBR                                                绿。dsDNA-染料已以两种方式用于核酸检测。第一种方式是检测双链，不论在单独存在下还是在单链的存在下。这包括在双链的存在下刺激染料并检测从染料的发射。通过dsDNA-染料检测双链是非特异性的；即是说，它告知是否存在双链，但没有告知链的一个或多个序列。第二种方式是将dsDNA-染料嵌入荧光标记的探针和单链靶的杂合体中，以其吸收波长刺激染料并以其发射波长检测从探针的荧光标记的发射，其中探针的标记通过FRET经染料的发射激发。由于这涉及FRET，探针的荧光部分的吸收光谱必须显著重叠染料的发射光谱。当染料通过检测作为双链的非特异性指示剂的染料发射和通过检测作为特定序列的指示剂的探针发射与一个或多个探针结合使用时，通常有一种限制，即探针信号必须可检测地不同于染料信号。由于最常用的dsDNA-染料SYBR绿具有与最常用的探针荧光部分(荧光团FAM)基本相同的发射光谱(见Van Poucke等人 (2012) BioTechniques 52: 81-85的图1)，二者通常不能一起使用。另外见Lind等人 (2006) BioTechniques 40:315-318，该作者报告FAM具有在493 nm的最大激发和在525 nm的最大发射，而SYBR绿具有在497 nm的最大激发和在516 nm的最大发射。Lind等人通过使用FAM-标记的探针，不是与SYBR绿，而是与可与FAM区分的不同dsDNA-染料即BEBO (其具有在515 nm最大激发和在552 nm的最大发射)解决了该问题。Van Poucke等人报告TaqMan (5’核酸酶)测定，一种生成携带荧光团标记的探针片断的对称PCR测定，其中探针的标记是FAM和其中SYBR绿被用来检测制备的扩增子，在这种情况下为双链扩增子。解链峰在约82℃获得。由于SYBR信号占优势，这指示双链的解链——一种某些产物已制得的非特异性指示。然后通过在较高的温度(在此温度双链解链，85℃)检测，作者断定由无模板对照(NTC)生成的以上荧光是来自探针片断。支持该结论的是这样一个事实，即没有高温解链峰，不变地是发荧光探针片断不产生解链峰。当然，没有检测探针-靶杂合体，因为它们将在低于双链扩增子的解链温度的温度下熔解掉。Neither Lind等人和Van Poucke等人均没有利用SYBR绿dsDNA-染料分析单链。Van Poucke等人未使用FAM用于对作为温度的函数的探针结合进行任何分析。

概述

本发明包括利用当与双链缔合时发出荧光的染料(所谓的DNA结合染料或dsDNA-染料)分析单链核酸序列(RNA序列或者DNA序列(ssDNA))的方法。根据本发明的方法利用dsDNA-染料与杂交于靶核酸序列并用非荧光猝灭剂部分例如黑洞(Black Hole)猝灭剂标记的一个或多个杂交探针的组合。这样的探针一般在此称为“猝灭剂标记的探针”。根据本发明的方法包括在包括一个或多个这样的杂交探针的解链温度的温度范围内，分析作为温度的函数的来自dsDNA结合染料的荧光。靶序列可以是一个或多个探针与之完全互补或不完全互补的序列。在某些实施方案中，猝灭剂标记的探针可以是如在下文解释的“原位探针”。

为了在本发明的方法中使用dsDNA-染料，含有至少一个非荧光-猝灭剂标记的探针的猝灭剂标记的探针或探针组可用来检测和分析它们所杂交的有关序列。可用于本发明的方法中的探针组可另外包括一个或多个包含荧光猝灭剂标记或不包含任何猝灭剂标记的探针。

 dsDNA-结合染料通常可用于本发明的方法中。最常用的dsDNA-结合染料是SYBR绿染料。其它dsDNA-染料包括溴化乙锭、DAPI、BO和BEBO (Bengtsson等人 (2003) Nucleic Acids Research 31:e45)。还有的另一种是BOXTO (Lind等人 (2006) BioTechniques 40:315-318)。据报道这些染料中的至少一些是小沟结合染料(minor groove binding dyes)。在本发明的方法中dsDNA-染料可单独或组合使用。

 可用于本发明的方法中的杂交探针包括线性的或无规卷曲探针和结构化探针二者。它们可以是RNA、DNA或RNA和DNA的组合。它们可包括非天然核苷酸、核苷酸类似物和非天然核苷酸间键合。增加探针的结合亲和力的非天然核苷酸和类似物包括，例如，2'-O-甲基核糖核苷酸和PNA。结构化探针可包含一条链(例如，分子信标探针)或两条链(例如，阴阳探针)。本发明的某些实施方案利用最初包含引物延伸和作为扩增后检测的部分原位完成其构建的探针。为了方便起见，我们称这样的探针为“原位探针”。

可用于本发明的方法中的杂交探针包括未标记的探针，或未标记的寡核苷酸，和标记的探针。标记根据探针与之一起应用的dsDNA-染料进行分类。为获得染料发射，人们用具有在或接近染料的最大吸收的波长的光激发样品，并以染料的最大发射波长或接近染料的最大发射波长检测发射。这通常被称为在仪器的染料通道中读出，或者如果染料是SYBR绿，则在SYBR绿通道中读出。作为一个例子，对于SYBR绿染料，典型的激发是在470 nm，例如通过蓝色LED，而检测使用510-nm发射滤波器进行。第一类标记是“染料猝灭标记”，即当探针杂交于其靶，形成双链区，而染料以其或接近其最大吸收波长激发时，猝灭染料荧光的标记。我们相信染料猝灭是通过荧光共振能量转移(FRET)，为了方便起见，在此将其称为FRET猝灭。一般来说，或出现FRET，在染料的发射光谱和标记的吸收光谱之间应该有显著的重叠。染料猝灭标记可以是非荧光猝灭剂，例如DABCYL、黑洞猝灭剂、QSY猝灭剂、掩蔽猝灭剂(Eclipse quencher)、深黑猝灭剂(Deep Dark quencher)、爱荷华黑猝灭剂(Iowa Black quencher)或黑莓猝灭剂(Blackberry quencher)。如果非荧光猝灭剂是高度有效的，例如，黑洞猝灭剂1或黑洞猝灭剂2，单一猝灭剂标记就是足够的。如果猝灭剂的效率较低，例如DABCYL，至少两个猝灭剂标记可能是需要的或甚至是必要的。合成具有单一猝灭剂部分的探针比合成双重标记的探针要简单且成本较低。最后构建的原位探针可包括单一的非荧光猝灭剂或没有标记。或者，染料猝灭标记可以是荧光部分，例如荧光团或量子点，其不直接在用来激发染料的激发波长激发，而是经FRET从染料接受能量，从而猝灭染料发射，并以不同于(长于)检测染料发射的波长的波长减弱荧光。例如，荧光团Cal橙从染料SYBR绿接受能量。这样的标记通过激发ds-DNA染料而间接刺激，但不在或接近染料的最大发射波长，而是在或接近荧光标记的最大发射的较长波长获得其荧光。当发射在或接近染料最大发射的波长检测时，未检测从标记发射的荧光，且其影响仅仅是猝灭染料。已知这一类荧光标记用于ResonSense?探针。ResonSense?探针为用接受来自dsDNA-染料的荧光的荧光团标记的单链寡核苷酸。当含有杂交的ResonSense?探针的样品以dsDNA-染料吸收波长发光时，标记经FRET从染料吸收能量并以相当于荧光团的发射光谱的较长波长再发射光。荧光团是光谱上不同于染料的荧光团。当如此标记的探针未杂交时，染料的激发并不间接地激发荧光团，如此荧光团不需要猝灭。然而，如果需要直接刺激荧光团，具有染料猝灭荧光标记的探针被双重标记并且具有使得其在未杂交时猝灭，但在杂交时为未猝灭的并发射可检测的信号的构造，例如，猝灭的ResonSense?探针、分子信标探针或阴阳探针。第二类标记是通过用来激发染料的光的波长激发的标记。一个实例是当与SYBR绿染料使用时的荧光团FAM。FAM具有493 nm的最大激发波长和525 nm的最大发射波长，而SYBR绿具有497 nm的最大激发波长和521 nm的最大发射波长。激发染料也激发标记，而在适合于染料的发射波长的检测检测来自染料和标记二者的发射。这一类标记导致这样的发射光谱，其不同于会在标记不存在下仅从染料获得的发射光谱(两者作为解链曲线和一阶导数曲线)。我们称这类标记为“染料重合标记”。具有染料重合标记的探针是双重标记的并具有使得其在未杂交时猝灭，但在杂交时为未猝灭的并发射可检测的信号的构造，例如，分子信标探针或阴阳探针。第三类标记为既不能通过用来激发染料的光激发，也不能通过FRET从染料接受能量的标记，因为它们的吸收光谱既不与染料的吸收光谱，也不与染料的发射光谱重叠。一个实例是当与染料DAPI使用时的荧光团Alexa Fluor 790。Alexa Fluor 790在长于DAPI发射的波长吸收，因此染料的激发不直接或间接地激发标记。在这种类别中的标记就涉及在适合于染料的波长下激发和检测而言是无关的，但它们可用来通过独立激发和检测而获得信息。我们称这类标记为“非重叠标记”。具有非重叠标记的探针是双重标记的并具有使得其在未杂交时猝灭，但在杂交时为未猝灭的并发射可检测的信号的构造，例如，分子信标探针或阴阳探针。

在本说明书中，我们提及引物和探针的解链温度(“Tm”)。“解链温度”是核酸杂合体(例如，探针-靶杂合体或引物-靶杂合体)为50%双链和50%单链时的温度。应该意识到，探针相对于更多互补的靶序列的Tm高于该探针相对于含有缺失、添加或一个或多个错配核苷酸的较少互补靶序列的Tm。对于具体的测定，可测定相关的Tm。Tm也可采用已知的技术通过计算来估计。为此目的，我们采用Tm_[0]，一种利用“最近邻”方法计算的Tm (Santa Lucia, J. (1998)，PNAS (USA) 95: 1460-1465；和Allawi, H.T.和Santa Lucia, J. (1997), Biochem. 36: 10581-10594)。对于标记的探针(线性的和结构化二者)，应该理解，计算的Tm_[0]为近似值。例如，在实施例1中获得的数据表明，用黑洞猝灭剂1标记探针减少探针的实际Tm约5℃。以下更全面地描述的“原位探针”具有初始Tm和最终Tm。初始Tm是在引物延伸中初始探针序列的50% 3’末端接触相同链内的靶序列时的温度。原位延伸以建立最终探针后，杂合体的初始Tm被较高的最终Tm替代。

本发明的方法利用探针组，所谓探针组我们指指杂交于靶序列的一个探针或多个探针。单一探针，包括单一原位探针，可用来检测单核苷酸多态性(“SNP”)。在这样一个实施方案中，探针为其在靶中的互补序列包括SNP的染料猝灭探针。当用于特定靶序列的探针组包含单一探针时，所述探针包括非荧光猝灭剂标记。这样的实施方案的一个实例由实施例1举例说明，其中单一探针用或者一个或者两个黑洞猝灭剂标记。单一染料猝灭探针也可用非荧光染料猝灭标记和荧光染料猝灭标记、染料重合标记或非重叠标记进行多重标记。我们通常设计与靶序列的野生型或药物敏感性变体更多互补和与突变体或耐药变体较少互补的单一探针。在包括一些利用原位探针的实施方案在内的某些实施方案中，我们作了相反的工作。在自报道原位探针的情况下，通常需要设计单链3’末端以与一个序列变体例如序列的野生型版本更完全互补，而与3’末端最初与其杂交的序列中的其它版本、SNP较不完全互补。

当探针组含有多个探针时，探针组包括如在前面的段落中描述的至少用非荧光猝灭剂标记的至少一个染料猝灭探针。染料猝灭探针可以是原位探针。优选的多探针组包括两个或更多个这样的染料猝灭探针。这样一个实施方案的实例由实施例2举例说明，其中探针组包括6个探针，各自单独地用黑洞猝灭剂标记。再次回到这里，多探针组中的这样的探针可以用染料猝灭荧光标记(见实施例5)、染料重合标记(见实施例3)或非重叠标记进行多重标记。在一些实施方案中，多探针组可包括一个或多个未标记的探针或一个或多个仅用荧光染料猝灭标记标记的探针。在某些实施方案中，原位探针例如可以是未标记的。在多探针组的情况下，需要有足够的染料猝灭以提供有意义的区分信息，所述信息涉及当样品以或接近dsDNA-染料的最大吸收波长激发和检测以或接近染料的最大发射波长进行时获得的靶序列，如在下文结合实施例5所阐述的。

用来设计多探针组的主要标准是用来检测的温度范围和探针组所杂交的靶序列的长度。温度范围低于双链扩增子的Tm，这确定了上限。下限为在检测仪器的能力范围内选择的温度，通常至少与室温一样高。在选择了温度范围的情况下，探针Tm被设计在该范围内。为使给定类型的探针，比如说DNA探针适合于该范围，人们可调整探针的长度或其与靶序列变体互补的程度，或二者。当多探针组的探针杂交于它们的单链核酸靶序列时，探针沿着靶序列展开以便选出序列变体。它们可彼此直接邻接杂交，可有邻近的探针的中度重叠，或者可在邻近杂交的探针之间存在一个、几个或甚至许多个核苷酸的缺口。我们优选缺口最小。在探针组中的探针可具有，且通常确实具有不同的探针-靶Tm，其允许荧光轮廓和荧光特征(fluorescent signature)的变化发生在检测范围内的多个温度下。相差至少2℃的探针Tm将通过改变谷(或峰)的形状改变荧光特征。其Tm相差5℃或更大的探针有利地导致分开解链或退火峰。然而，某些实施方案可包括具有相同或几乎相同的Tm的两个探针，我们称之为“Tm叠加”，在这种情况下，两个探针将促成单一解链或退火峰，例如参见图5，507行。在设计用于LATE-PCR扩增反应的探针组中，我们优选针对所有靶序列变体的最大探针Tm低于用于扩增反应的退火温度，其通常不高于约80℃。

本发明的方法包括多个探针组在相同检测混合物中的应用，即是说，探针组用于至少两个靶序列的每一个。探针组可通过Tm区分。例如，用于第一个靶序列的探针组可包括具有在55-70℃范围内的Tm的探针，和用于第二个靶序列的探针组可包括具有在40-54℃范围的Tm的探针。或者，两个探针组可具有重叠的Tm。见实施例3，其中16s-基因靶序列的探针组与促旋酶B-基因靶序列的探针组用于单一检测混合物中，且各探针组，当单独使用时，产生接近50℃的(负)解链峰。尽管如此，当各探针组一起使用时，已表明合并的检测能够获得可区分菌株的信息。

原位探针可与另外的仅有猝灭剂的探针或双重标记的探针组合使用。序列特异性探针在这样的组中是特别有用的，因为它们选择性地与特定的SNP杂交，或选择性地不与特定的SNP杂交。这样的探针-靶杂合体的形成显著地减少所述单链的柔性并因此抑制自报道原位探针的形成。序列特异性探针的Tm (例如60℃)被设计得高于其靶的3’末端的初始Tm (如45℃)。在3’末端延伸时，3’末端的最终Tm将增加并可变得等于或高于序列特异性探针的Tm。

本发明的方法包括在杂交条件下，使包含至少一个单链寡核苷酸(为含有至少一个靶序列的核酸链)的拷贝的样品与dsDNA-染料和用于至少一个靶序列的探针组接触，以便使探针组中的探针与一个或多个靶序列杂交。这样的核酸链可以是DNA或RNA。它可含有单一靶序列，在这种情况下，靶序列可基本上包含整条链，或它可含有至少两个靶序列，在这种情况下，链足够长以包含所有靶序列。单链核酸靶序列的拷贝可由任何方式提供。用于分析的单链核酸靶序列在一些情况下可通过分离和纯化样品中的核酸靶链而直接获得。例如，含有靶序列的DNA正链可通过分开正和负的DNA链和分离含有靶序列链的(例如正链)，通过除去互补链(例如负链)，从含有双链DNA的样品获得。根据本发明的方法的一些实施方案包括核酸扩增。如果扩增是对称的，一种或多种扩增产物是双链的，至少一条靶链的拷贝可以如上所述通过分开正和负链而获得。可使用许多已知的扩增方法，包括使用聚合酶链反应(PCR)、NASBA、SDA和滚环扩增的方法。例如对称的PCR方法可包括用生物素标记一个引物并通过捕获到含抗生物素蛋白的表面，然后对其洗涤，使含生物素的产物链与其它链分开。扩增可用含有靶序列的双链核酸链开始，或扩增可用含有靶序列或与靶序列互补的序列的单链开始。扩增可包括反转录，接着扩增cDNA，其中起始样品是RNA。以上方法可以在微流体装置中执行，这可允许，例如，包括洗涤步骤。为使dsDNA-染料用于微流体装置中，本发明的方法包括加入双链载体至染料源中，以克服染料粘附到装置壁的问题。

在某些优选的方法中，单链靶序列的拷贝由非对称的核酸扩增提供。用于分析的单链脱氧核糖核苷酸(DNA)靶序列(保守的序列或者可变序列)，可通过非对称扩增方法而获得，所述方法利用限制量的一个引物，以使它在扩增反应期间被用完(限制引物)，此后单链扩增产物继续利用其它引物(过量的引物)生成。最常用的非对称扩增方法是PCR方法，包括不对称的PCR和LATE-PCR，其中的任何一种可与用RNA序列开始的反转录结合。我们的优选的扩增方法是LATE-PCR。非对称扩增方法生成双链的扩增产物，或“扩增子”，和含有待分析的靶序列的单链扩增产物(扩增子)两者。

在荧光采集期间，样品中双链的存在对检测方法的设计有影响。当双链与单链存在于待分析的样品中时，dsDNA-染料以足以不仅结合双链，而且也结合相对短的探针-靶杂合体的量加入。如果样品只含有单链核酸，探针Tm不受限制。它们可从非常低的温度(通常为室温)变化至非常高的温度(例如90℃)。然而，如果在荧光采集期间也存在产生信号的双链，例如，双链扩增产物(或双链“扩增子”)，探针Tm保持低于产生信号的双链的Tm。

本发明的方法包括用在或接近染料的最大吸收处的波长的光刺激含有至少一个靶的样品、染料和用于所述至少一个靶的探针组并在包括探针的Tm的温度范围内检测在或接近染料的最大发射处的发射。考虑到含单一靶序列的链(其在某些实施方案中为单链扩增子)，如果杂交于其互补序列或互补体，最高的Tm将是链本身的解链温度。探针组中的探针(短于整条链)会具有较低的Tm，所以探针解链的检测在低于链Tm的温度下进行。检测的温度范围优选地包括双链靶(如果存在的话)的Tm。检测步骤可以解链的方式进行，其中温度下降至范围的底部，然后随着时间的过去逐渐增加至范围的顶部，伴随发射的频繁采集以生成荧光轮廓，即解链曲线。该步骤可以相反的方式进行，其中温度上升至该范围的顶部，然后随着时间的过去逐渐降低至范围的底部，伴随发射的频繁采集以生成退火曲线。在一些情况下，可能需要进行两个循环的解链或退火。例如，当原位探针与序列特异性探针一起使用时，解链的第一循环可导致3’末端延伸，从而增加初始Tm至最终Tm。这种变化反过来可改变序列特异性探针杂交的水平。Tm的这种变化可通过使用探针-靶杂合体的两轮退火或解链而观察到。

在一些实施方案中，完整的解链曲线或退火曲线可通过在仅仅几个选择的温度，在一些情况下仅在单一选择的温度下的荧光采集替代。如果一个或多个探针含有非重叠标记，该方法可包括分别地用适当的波长的光直接刺激该标记，并检测在或接近标记的最大发射处的发射(作为温度的函数或作为实时检测的循环数的函数，或二者)。如果一个或多个探针含有荧光染料猝灭标记，该方法可包括直接地或者间接地(通过激发染料)刺激该标记并检测作为温度的函数或作为实时检测的循环数的函数或二者的来自标记的发射。检测通常地在相对狭窄的波长范围进行，该范围例如获取仅来自dsDNA-染料和染料重合标记的荧光并排除来自其它荧光团的荧光。然而，不排除在宽的波长范围下检测，该范围获取来自染料、染料重合标记和至少一个另外的荧光团的荧光。

本发明的方法包括比较来自含有靶核酸序列的样品的在染料波长处的作为温度函数的发射与已知组成的参照样品(通常为已知序列的样品)的至少一个相应的发射的步骤。可比较解链曲线，同样可比较退火曲线。在选择温度下读数可以与选择温度下读数进行比较。当检测包括获得作为解链荧光轮廓或者退火荧光轮廓测量的温度依赖性荧光轮廓时，荧光轮廓可数学转换成荧光特征，其是荧光轮廓的一阶导数。与参照比较可以是荧光特征的比较。低于背景的每一个负峰的最低值(我们有时称其为“谷”)，或低于背景的每一个谷的总面积，与样品中最初存在的靶量成比例。荧光特征可通过将荧光特征的所有值除以最低谷或最高正峰值，进一步转换成归一化荧光特征，如果存在促成荧光峰的荧光标记的话。与参照比较可以是归一化荧光特征的比较。可用于本发明的方法中的另一个比较为在两个选择的温度下的荧光比，其中含有靶的样品的比率与参照的比率进行比较。比较可通过平行分析样品和一个或多个参照进行。或者，比较可以是与从参照样品获得的荧光特征或其它结果的库进行的比较。

根据本发明的方法可用来例如分析样品的人或病原体突变的存在情况，或筛选样品以检测多个可能的目标物种中的哪一个存在。本发明的方法可包括多重检测；即是说，可包括探针组用于超过一个目标。

本发明也包括用于进行本发明的分析方法的试剂盒，所述分析方法包括非对称的核酸扩增以供应ssDNA靶序列供分析。这样的试剂盒包括对于各个靶而言至少一个限制引物和过量的引物、dNTP、dsDNA-染料、至少一个如上所述的探针组和DNA聚合酶。

附图简述

图1A-1D是未使用探针(图1A)或者使用DNA杂交探针的以下3个版本之一对结核分枝杆菌(M. tuberculosis)两个菌株的基因的可变单链靶区域所得的荧光特征(dsDNA-染料荧光强度对比温度的一阶导数，在这种情况下随着温度增加)：一个未标记的(图1B)，第二个是用单一非荧光染料猝灭部分标记的(图1C)，和第三个是用2个非荧光染料猝灭剂标记的(图1D)。

图2A是使用由6个不同的DNA染料猝灭剂标记的杂交探针组成的探针组对几个结核分枝杆菌菌株的基因的可变单链靶区域所得的荧光特征，每个Off探针仅用单一非荧光猝灭剂标记。

图2B为探针对图2A中所示的不同靶的平均最小荧光率值对比相应的阈值热循环(C_T) (在该热循环下在dsDNA-染料通道中检测信号)的图线图。

图3A-3C是来自6个分枝杆菌菌种的两个基因的可变区域的多重LATE-PCR扩增的荧光特征，其中反应混合物含有针对一个基因的探针组(图3A)、针对另一个基因的探针组(图3B)或两个探针组(图3C)。一个探针组由两个探针组成：一个探针用非荧光染料猝灭部分和在光谱上与dsDNA-染料没有不同的染料重合荧光团双重标记(On探针)，一个探针用非荧光染料猝灭部分单独标记(Off探针)。另一探针组由4个探针组成：一个探针为未标记的和3个探针为染料猝灭剂标记的。在这3个探针中，一个探针用非荧光染料猝灭部分单独标记(Off探针)和两个探针用非荧光染料猝灭部分和在光谱上与dsDNA-染料没有不同的染料重合荧光团双重标记(On探针)。

图4A-4C是来自如图3使用2个探针组对两个菌种的多重LATE-PCR扩增的荧光特征，其中On探针与实施例3中的相同，但Off探针用有效的非荧光染料猝灭标记单独标记(图4C)或用较不有效的猝灭剂单独标记(图4A)或用较不有效的猝灭剂双重标记(图4B)。

图5A-5C是在染料通道(5A、5C、5E、5G)和在Quasar 670通道(5B、5D、5F、5H)中来自2个菌种的基因靶序列的LATE-PCR扩增的荧光特征，其中探针组最初包含3个单独标记的Off探针和3个具有非重叠荧光团的双重标记的On探针，和其中逐渐地一个，然后两个，然后三个On探针被未标记的探针替代。

图6为实施例6中使用的微流体装置示意图。

图7A-7D为显示用图6中所示装置从实施例6中各种样品获得的荧光斑点的一系列显微照片，证实dsDNA传送dsDNA-染料的能力。

图8A-8D是原位探针如何设计，它们如何形成，和它们的形成如何受结合的序列特异性探针的存在所影响的示意图。

详细描述

虽然不希望受任何理论的束缚，我们明显基于实施例中报道的工作相信，含有多个荧光或猝灭组分的封闭管反应的荧光轮廓提供系统的所有组分(不论是寡核苷酸或是dsDNA-染料)的瞬时或近乎瞬时的温度依赖性描述，所述组分包括其荧光或吸收作为温度的函数增加的那些和其荧光或吸收作为温度的函数减少的那些；以及提供系统中所有这样的荧光和非荧光组分的所有分子相互作用，其包括例如在特定温度下杂交或未杂交于可能的靶的各种染料猝灭探针的比例。虽然我们有时将“荧光轮廓”的一阶导数(即是说荧光强度对比温度的曲线图)在这样一个系统中称为解链曲线或退火曲线，但其不是传统的解链曲线或退火曲线，传统的解链曲线或退火曲线的峰传统上限定探针/靶杂合体的解链温度，Tm值。相反，在本发明的方法中，荧光轮廓及其一阶导数（“荧光特征”）描述在所有它们可能的构象中的所有反应组分中许多温度依赖性动态平衡的总和,以及这些组分的所有相互作用。尽管如此，使人惊讶的是，单一组分(如扩增靶的序列)的改变，导致从dsDNA-染料获得的荧光特征的明显可检测的变化。

在本发明的方法中，dsDNA-染料在荧光采集期间包含在反应混合物中。测定在特定的实施方案中的染料最适量可容易地通过简单的反复试验进行。在实施例中，我们进行LATE-PCR扩增，其中0.24x和0.48x 的SYBR绿浓度是满意的，但0.72x的浓度防止扩增(完全抑制)。我们也使用具有PDMS填充通道(已知SYBR绿染料粘附于其)的微流体装置进行了LATE-PCR反应。在那样的情况下，当初始SYBR绿浓度为0.96x时，我们在反应混合物中包含在扩增期间携带足够的染料进入反应混合物的双链源。

用于本发明的方法中的探针组包括使用至少一个标记的杂交探针。可用于本发明的方法中的杂交探针包括线性的或无规卷曲探针和结构化探针二者。它们也包括原位探针。它们可以是RNA、DNA或RNA和DNA的组合。它们可包括非天然核苷酸、核苷酸类似物和非天然核苷酸间键合，例如，PNA探针或2'-O-甲基核糖核苷酸。它们可以是线性(无规卷曲)或结构化的，例如LNA探针。结构化探针可包含一条链(例如，分子信标探针)或两条链(例如，阴阳寡核苷酸结构)。可使用的另外的探针类型包括Light Cycler探针和小沟结合探针。几种这样的探针描述于WO 20111/050173A1中，其中它们被称为信号传导探针。

可用于本发明的方法中的结构化探针也包括“原位探针”。原位探针的构造和使用图示于图8A-8D中。用于非对称扩增优选LATE-PCR扩增的初始形式的原位探针与双链靶序列81、82一起示于图8A中。最初探针包含过量的引物83、限制引物84和限制引物延伸85。在某些实施方案中，过量的引物83包括5’-末端dsDNA猝灭部分，优选黑洞猝灭剂或其它有效的非荧光猝灭剂。在图8A中也示出探测位点互补体86，其例如在药物敏感菌株和突变体耐药株之间在靶序列变体上是不同的。限制引物延伸85包括探测序列86A，其与序列86的一个变体互补(互补性可以是，但不必是完美的)，但与其它一个或多个变体错配(或更多错配)。应该意识到，限制引物延伸85被设计得不能与过量的引物83形成引物二聚体。图8B显示单链扩增产物(过量的引物链)，其含有过量的引物83，限制引物的互补体84A，和限制引物延伸的互补体85A，包括探测序列86。图8B也显示了探测位点86A。设计限制引物延伸的探测位点互补体86A，以使杂合体86、86A的Tm为低于在扩增期间的引物退火温度至少5℃，优选至少10℃。在这些条件下，过量的引物链的3’末端在扩增期间不结合到其内部的互补序列。

最终原位探针构造示于图8C中。限制-引物延伸的5’末端用作为合成与过量的引物链的3’末端互补的序列的模板。扩增后，扩增反应混合物的温度降低至足够低于引物-退火温度，以使探测序列86仅与预期的序列86A的变体杂交并通过DNA聚合酶延伸以包含与过量的引物83互补的序列87，从而形成包含在一侧的序列83、86A和另一侧的序列87、86的双链茎区域。茎的Tm是原位探针的最终Tm。它由生成的双链区长度和序列组成确定。因此，有对单链区、双链区的长度和双链区形成的温度的实验性控制。通过在反应混合物中包括试剂例如PrimeSafe^TM可增强形成茎的选择性延伸。应该意识到，由于延伸87，茎的Tm高于杂合体86、86A的Tm。该茎的形成创建环89A。图8C显示另一个探针89及其探针结合位点89A，其在靶序列的变体之间或之中也是不同的。探针结合位点89A在由原位探针的形成产生的环中。

示于图8C的原位探针可从或者正常的(例如，野生型)靶序列变体或者突变体变体形成。如果测定被设计成检测单一SNP，例如，我们优选用突变体序列形成原位探针并利用具有猝灭剂83A的过量的引物，这导致原位探针为与同探针的茎缔合的dsDNA-染料相互作用的高温Off探针。如果可存在多个突变体变体，限制引物(图8A)可以是具有不同延伸的限制引物(具有针对各个突变体的序列86A的限制引物)的混合物，，因此，导致突变体中不同的Tm。对于多重反应，用dsDNA-染料例如SYBR绿?检测在相同反应中生成的类似尺寸的不同双链扩增子通常是不可能的，因为染料的转移有利于最高的Tm扩增子。利用原位探针的本发明方法能够通过设计用于各个不同的单链扩增子的限制引物上的5’末端序列以形成其自身的具有独特Tm和结构的分子内原位探针，使用dsDNA-染料进行多产物检测。

对于这种方法，探测序列86被设计成非常等位基因特异的，以致它在原位探针形成期间和在检测期间采用的相当低的温度下，不会杂交于正常的靶序列。这样的等位基因特异性的分子内引发和延伸可通过用设计等位基因特异性引物的本领域已知的方法实现。见，例如，Tyagi等人美国专利号6,277,607。在通过在茎形成温度以上的温度下解链的检测中，正常的单链将不产生染料信号，因为它们保持单链。检测突变体特异性的原位探针仅仅取决于混合物中的突变体靶的绝对数目和染料通道中检测的灵敏性。

图8C也显示当靶序列中的探针结合序列86A是正常的、野生型或药物敏感性靶序列变体时，用于正常序列的原位探针的最终构造。对于这样一个实施方案，图8D显示不选择用于原位探针形成的突变体或其它靶序列变体。那种变体的单链扩增产物不形成环，并且不存在吸引其荧光受猝灭剂83A影响的dsDNA-染料的茎。这种类型的某些实施方案包括使用至少一个染料猝灭探针88，其与序列86A的非选择的(突变体)变体互补(互补性可以是，但不必是完美的)，但与选择的(正常的)变体错配(或更多错配)。探针88具有低于引物退火温度的Tm，以便不会不利地影响扩增的效率。原位探测序列86具有甚至更低的Tm。探测序列86具有相对于序列86A的正常变体的Tm，以致杂合体仅在温度充分降低至基本上所有探针88杂合体已经形成时形成。扩增后，反应混合物的温度首次降低以使探针88杂交于突变体靶序列中的探针结合序列86A (图8D)。然后，进一步降低温度以创建正常的靶序列中的原位探针(图8C)。在含有突变体变体的链中存在相对刚性的双链杂合体86A、88防止这些链中的原位杂交。由于那个双链区域的存在，突变体链中原位杂合体的形成(图8C)由于物理约束而得以完全避免，或者原位杂交的Tm明显降低。不管怎样，等位基因识别的温度窗口有效地增加。在建立这种类型的实施方案中，过量的引物83可包括猝灭剂83A，或它可以是未标记的。在后一种情况中，最终原位探针(图8C)的茎可为未标记的。图8C和8D也显示包含染料猝灭标记89A且与探针结合序列89B互补的第二种染料猝灭探针89，探针结合序列89B也在正常的链和突变体链之间变化。如同探针88，探针89被设计成具有针对突变体链比针对正常的链更高的Tm。应该注意到，在突变体链中(图8D)，探针结合序列89B是线性的，而在正常的链中(图8C)，探针结合序列89B是在原位探针的环中。这显著地增加了其相对于突变体链的Tm对比(图8D)和其相对于正常的链的Tm(图8C)之间的差异，从而增加这种第二种探针的等位基因识别的窗口。相对于在具有等效数目的100%正常的过量的引物链的对照样品中制得的正常分子内原位探针的量，在正常和突变体单链产物的混合物中存在突变体过量的引物链降低所形成的正常的分子内原位探针的总量。因此，有可能计算突变体特异性探针88结合于突变体过量的引物链的量(在染料通道中的信号增加)和正常的过量引物链上分子内原位杂合体的量的相对减少之间的比率。这样一种比率提供混合物中突变体靶的分数的极度灵敏的测量，特别是在低百分比时。

用于本发明的方法中的探针组包括至少一个具有dsDNA-染料猝灭标记的探针。优选的染料猝灭标记是非荧光猝灭剂，更优选为来自被利用的deDNA-染料的能量的有效受体的非荧光猝灭剂。经FRET接受来自dsDNA-染料的能量的较低效率的非荧光猝灭剂或荧光部分作为染料猝灭标记是较不优选的。如果探针仅具有例如用于染料的荧光猝灭剂，即是说，线性ResonSense探针，当探针未杂交时，标记在用来激发染料的激发波长处不激发；但当探针杂交时，标记将通过染料激发间接地激发。具有染料猝灭标记的探针可包括至少一个另外的标记。例如，非荧光染料猝灭标记可加入到ResonSense探针中，其提供另外的染料猝灭并且还允许通过直接激发那个标记在荧光标记的发射波长处进行荧光采集。具有非荧光染料猝灭标记的探针也可包括至少一个染料重合或非重叠标记，例如荧光团或量子点，并具有当其杂交于核酸靶序列时引起来自其荧光标记的荧光信号的可检测变化的结构。当这样一种探针在溶液中时，荧光标记经非荧光猝灭剂标记猝灭。所述猝灭可通过任何机制，通常通过荧光部分之间的FRET (荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer))，或通过接触猝灭(其通常是更有效的，并因此是优选的)实现。我们有时将这样的探针称为“信号传导探针”或简称为“On”探针。On探针可以是线性的(末端标记的线性探针例如用于5’核酸外切酶测定的作为TaqMan探针销售的那些)。它们可以是分子信标探针(Tyagi等人 (1996) Nature Biotechnology 14:303-308)，包括低Tm分子信标(WO 2006/044994；Sanchez等人 (2004) PNAS (USA) 101: 1933-1938)。分子信标探针是单链发夹形成寡核苷酸，其在一端携带荧光标记部分(通常是荧光团)，在另一端携带非荧光猝灭剂(在这里其猝灭来自荧光团和dsDNA-染料二者的发射)。当分子信标探针在溶液中时，其呈闭合构象，其中猝灭剂与荧光部分相互作用，和探针是黑色的。当探针杂交于其靶时，荧光团和猝灭剂部分被分开和探针以荧光部分的色彩发荧光。我们有时称这样的探针为“Lights-On”或简称为“On”探针。我们开发的“On”探针的另外的类型为具有阴阳探针的寡核苷酸结构的双链探针(Li等人 (2002) Nucl. Acids Res. 30, No. 2 e5)，其中猝灭剂标记的链，而不是荧光标记的链，具有较高的Tm。

为了用于本发明，On探针的荧光标记落入例如以下的几类之一：

a. 它可以是如上讨论的“染料猝灭”标记，在这样的事件中，杂交的探针的两种标记将用作染料通道中的猝灭剂。我们有时称这样的探针为猝灭的ResonSense?探针。来自荧光标记的发射可通过激发染料并在或接近荧光标记的最大发射波长检测而获取。由于当探针在溶液中游离时，荧光标记被猝灭，来自荧光标记的发射也可通过直接激发标记并在或接近其最大发射处检测而获取。分析 可包括利用两种荧光轮廓，一种来自染料发射和另一种来自荧光标记发射。

b. 它可以是“染料重合”标记，其在光谱上类似于被使用的染料，以便用来激发染料的刺激光也激发荧光部分，且染料发射的检测也检测荧光部分的发射。例如，dsDNA-染料可以是SYBR?绿和On探针的荧光部分可以是荧光团FAM。SYBR?绿和FAM具有几乎相同的吸收和发射光谱，但是与传统思维形成对比，它们可一起用于根据本发明的方法以获得关于单链核酸靶序列的序列的信息。

c. 它可以是在光谱上不同于dsDNA-染料的“非重叠”标记；即是说，它不通过用来激发染料的光激发，且它不经FRET接受来自染料的能量。一个实例是当与DAPI染料一起使用时的荧光团Alexa Fluor 790。Alexa Fluor 790在长于DAPI的发射的波长处吸收，因此染料的激发既不直接也不间接激发标记。这个类别中的标记就涉及在染料的波长下激发和检测而言是无关的，但它们可用来通过在适合于荧光标记的波长处独立激发和检测来获得信息。分析可包括利用两个发射光谱，例如两个荧光轮廓，两个荧光特征，或二者。

用于本发明的方法中的探针组可包含或包括仅具有一个或多个染料猝灭标记的探针。如果一个或多个标记是非荧光猝灭剂，我们称这样的探针为“仅猝灭剂”探针或简称为“Off”探针。可用于本发明的方法中的仅猝灭剂探针包括线性探针和发夹探针(描述于WO 2011/0501731的探针，在此它们被称为猝灭剂探针，该专利通过引用结合到本文中)。在一些实施方案中，仅猝灭剂探针的非荧光猝灭剂用从dsDNA-染料经FRET吸收能量的荧光部分替代。这样一种探针被称为ResonSense?探针。ResonSense?探针为用接受来自dsDNA-染料的荧光的荧光团标记的单链寡核苷酸。以dsDNA-染料的吸收波长激发样品导致荧光团的间接激发，其在相当于荧光团的发射光谱的较长波长处再发射可见光。荧光团是光谱上不同于染料的荧光团。当在染料的波长处检测发射时，ResonSense?探针用作染料猝灭探针，即是说，它用作染料通道中的Off探针。ResonSense?探针与用非荧光猝灭剂标记的仅猝灭剂探针的不同之处在于，除了在dsDNA-染料的波长处猝灭外，它也可在染料被激发时以其自身的发射波长发信号。当使用ResonSense?探针时，分析通常包括激发染料并且不仅在dsDNA染料的发射波长处检测荧光，而且也独立地在ResonSense?探针的荧光部分的发射波长处检测荧光。不同于原位探针和ResonSense?探针的Off探针典型地为完全线性(或无规卷曲)探针。然而，不排除结构化的仅猝灭剂探针。例如，这样一种探针可具有分子信标探针的发夹结构，但仅含有一个或多个染料猝灭标记(荧光或者非荧光)。或它可具有阴阳探针的双链结构(Li等人 (2002) Nucl. Acids Res. 30, No. 2 e5)，其中与单链靶互补的探针链仅用一个或多个染料猝灭标记(荧光或者优选非荧光猝灭剂)标记，特别是其中猝灭剂标记的链具有针对其靶的较高的Tm，在这种情况下，单链靶序列被研究。

用于本发明的方法中的探针组可包括On探针，具有至少一个荧光标记和至少一个非荧光猝灭剂标记并具有使得当未杂交时荧光标记被猝灭，而当杂交时荧光标记未被猝灭的结构的探针。通常地，这样的On探针用荧光团和非荧光猝灭剂双重标记。当优选的多探针组在靶序列上杂交时，On探针的荧光标记位于Off探针或另一个On探针的非荧光猝灭剂的猝灭距离内。见实施例5，其中On探针5的荧光团用Off探针6猝灭。在本发明的探针组中，On探针或者猝灭其的邻近探针可具有较高的Tm。如上所述，某些优选的On探针是单链分子信标探针。另一类有用的Off探针是包含一对部分互补的寡核苷酸的双链的和双重标记的探针，其中的一个寡核苷酸仅用非荧光猝灭剂标记，而其另一个寡核苷酸仅用荧光团(染料猝灭或非重叠)标记，以致当在靶的不存在下降低温度时，这两条链彼此杂交，从而猝灭荧光团的荧光。这种类型的探针可不同于常用的阴阳探针，因为非荧光猝灭剂标记的链是与待分析的单链靶序列互补的链。该链对于靶链比对于探针的荧光团标记的链具有更高的Tm。当非荧光猝灭剂标记的链结合于其靶时，它就像单链的仅猝灭剂探针那样起作用，其与靶的杂交被检测为系统的总dsDNA-染料荧光的降低。对来自在不同的荧光通道中荧光团标记链的现在未猝灭的单链拷贝的荧光的检测作为荧光增加被观察到，荧光增加用作积累的靶链的量度。两个探针链之间的互补性程度通过改变任一条链的组成来调整，优选前提是猝灭剂标记的链对于靶的Tm超过其对于荧光团标记的链的Tm。当该对于靶的Tm仅高几度，通常≤ 5℃时，猝灭剂标记的链与靶的结合将是序列特异性的。相比之下，当该对于靶的Tm高许多度，通常≥10℃时，猝灭剂链与靶的结合将是错配耐受的(mismatch tolerant)。其中一条链是猝灭剂标记的和另一条链是未标记的的双链探针是类似的，除了只有一条链被标记外。未标记的链不产生指示猝灭剂标记的链与靶链结合的信号。

可用于本发明的方法中的探针组也可包括一个或多个未标记的探针。在实施例3中的促旋酶B探针组包括杂交于两个染料猝灭剂标记的On探针之间的可变靶序列的未标记探针。在那种情况下，测试的两个变体的未标记探针-靶杂合体含有两个错配。探针组中的多个未标记的探针倾向于减少染料通道中所述组的区分力。在设计探针组时，关注于这种趋势，避免过度包含未标记的探针。可用于本发明的方法中的探针组可包括未标记的原位探针。

用于本发明的方法中的多探针组的设计在熟悉探针设计的普通技术人员的能力范围内。我们在此描述了我们重视的几个考虑事项。如上所述，两个首要的考虑事项是可用于检测的温度范围(我们称之为“温度空间”)和单链靶序列长度。我们的优选组具有含有分布在靶序列上的不同Tm的探针。至于温度，我们通常设计具有针对靶序列的不同Tm的探针的组，其允许荧光轮廓和荧光特征的变化在检测范围内的多个温度发生。相差至少2℃的探针Tm将通过改变谷(或峰)的形状改变荧光特征。其Tm相差5℃或更高的探针有利地导致荧光特征谷(或峰)分开。然而，某些实施方案可包括两个具有相同或几乎相同Tm的探针，我们称之为“Tm叠加”，在这样的情况下，两个探针将促成单一解链或退火峰。在设计用于LATE-PCR扩增反应的探针组时，我们优选针对所有靶序列变体的最大探针Tm低于用于扩增反应的退火温度，其通常不高于约80℃。达到所需探针Tm的设计参数包括改变其长度，改变其G-C含量(沿着靶调整探针)，引入错配，改变标记(包括非常规核苷酸)，或引入结构。可获得利用“最近邻”公式的计算机程序，用于通过计算针对完全互补靶序列和针对错配靶序列的探针和引物的Tm，估算用于组设计的实际Tm。例如在本说明书中，我们已利用采用最近邻方法的程序Visual OMP (DNA Software, Ann Arbor, Michigan, USA)，以计算针对靶序列的野生型或药物敏感性变体的引物或探针的结合序列的浓度调整的Tm，其被我们称为Tm_[0]。特别是对于标记的探针(线性和结构化的二者)，应该理解如此计算的Tm为近似值。例如，实施例1中获得的数据显示，用黑洞猝灭剂1标记探针减少探针的实际Tm达约5℃。使用原位探针时，考虑初始Tm和最终Tm二者——初始Tm用于构建和最终Tm用于检测。

在如实施例3所示的多路技术中，两个探针组可具有在相同范围内的Tm，以致在给定温度下染料通道中的荧光受两个探针组的影响。如果在一个或多个探针组中的两个或更多个探针具有相同或非常类似的Tm (即<2℃的差别)，它们与靶的同时杂交通过在合并的Tm温度下猝灭的荧光的合并幅度观察到。相比之下，如果在一个或多个组中的两个或更多个探针具有彼此分开2℃或更多的Tm，它们与靶的同时杂交通过它们在高于单一探针的温度范围的温度范围内的合并猝灭而观察到。为此原因，通常期需设计在一个或多个组中的探针，使其Tm相差至少2℃，优选至少5℃并且在某些实施方案相差至少10℃。

至于沿着靶序列的间距，组中的邻近的探针可彼此紧邻地杂交。或者，邻近的探针可具有重叠结合位点，前提是重叠的量不阻止任一探针的杂交(见实施例2, 其中Off探针2和3重叠一个核苷酸)。或者，在邻近的探针之间可以有几个核苷酸的缺口。我们优选缺口最小。我们优选放置具有至少一个互补于靶序列中的各个可变核苷酸的非荧光猝灭剂标记的探针。如果靶序列具有二级结构——具有某一Tm的发夹，我们优选用具有相等或较高的Tm的两个邻近的探针跨过该发夹。用于根据本发明的方法的探针组包括染料猝灭探针。如果所述组仅包括一个探针，则它为染料猝灭探针，优选仅用一个或多个非荧光猝灭剂，最优选单一的强非荧光猝灭剂标记的探针。如果所述组包括多个探针，其包括足够数目的染料猝灭探针(仅猝灭剂探针或者具有非荧光猝灭剂的双重标记的探针)以提供关于靶序列的信息。如在实施例5中所示，其可凭经验确定。

用于本发明的探针具有靶互补序列，其对于平均结合亲和力的典型DNA或RNA探针通常为约10-40个核苷酸。实施例说明具有靶结合序列11-30个核苷酸长的DNA探针的使用(具有分子信标探针的寡核苷酸结构的低温发夹探针具有不与靶互补但当探针未杂交于靶序列时参与形成双链茎的另外核苷酸)。如果包括手段以增加探针的结合亲和力，探针可以更短，短至7个核苷酸，如本领域技术人员应该理解的。标记可在任何核苷酸位置(包括但不限于探针的一个末端)连接于探针。可购买用于合成寡核苷酸的柱，其中非荧光猝灭剂已经连接于将变成在柱上合成的探针的3'末端的寡核苷酸。

在自报道原位探针的情况下，探针的长度通过几个因素确定：1) 相同分子的3’末端是否初始杂交于互补靶序列；2) 是否3’末端向5’末端延伸；3) 初始杂交序列与分子5’末端的距离。因此，探针的长度只有提前预测。此外，可设计探针茎的最终(延伸的)长度以显著长于常规探针。长的常规探针将可能具有高于用于扩增的退火温度的Tm，但具有等同长度的茎的自报道原位探针只有在扩增已经发生后才形成。

通过本发明的方法分析的靶序列可以是，且通常是可变序列。可构建探针，特别是结构化探针，以便在用于检测的温度范围的最低端，甚至是室温下仅杂交于完全匹配的靶序列变体(即是说，是“等位基因特异性的”)。在本发明的方法中，我们在单一探针组中不使用这样的探针，因为虽然它们区分完全互补性和不完全互补性，但它们不能区分一种不完全互补性与另一种不完全互补性。如果靶序列变体不完全地与探针互补，它们也不产生荧光特征。等位基因特异性的探针可以包括在用于本发明的方法的多探针组中，因为它们将影响整体特征。然而，优选大多数或在一些情况下，全部探针在所用的温度范围内的温度下杂交于两个或更多个靶序列变体。这样的探针的Tm将随着错配的数目和类型而变化。例如，实施例1中的探针完全地互补于药物敏感性菌株，但相对于耐药菌株，探针具有单一的C-与-C错配。如示于图1C (荧光特征)中的，探针杂交于靶序列的两种变体，但完全的探针-靶杂合体具有在约62℃，在SYBR通道中的负峰，而具有错配的探针-靶杂合体具有转移至约50℃的负峰。为分析可变序列以确定存在何种变体，探针组可最初针对野生型序列或一个菌种设计，然后检查以确保其产生针对突变体或相关菌种的不同的荧光特征。在某些实施方案中，一个或多个探针可不完全地互补于每一个可能的参与的靶序列。

在自报道原位探针的情况下，关注的可变序列的3’末端(图8A中的序列86A)与其与之互补或部分互补的3’末端(图8A中的序列86)相比更接近靶序列的5’末端。

当使用非对称扩增时，我们优选在探针组中的一个或多个探针为“低Tm探针”，即在扩增期间不杂交于靶序列并因此在反应期间不被裂解的探针。优选地，这样的探针针对所有可疑的或预期的靶序列变体的Tm低于限制引物的Tm至少5℃。采用的延伸温度对于限制引物的延伸而言是足够低的，但足够高以避免探针裂解。当使用低Tm探针时，作为温度的函数的单链的检测和分析可不仅在扩增后的解链或退火期间，而且也在扩增反应(例如，所有的或选择的PCR扩增循环)期间的间隔，通过使温度暂时降低至低于退火温度，然后在较高的温度恢复扩增而获得。为了在扩增后生成荧光轮廓，在荧光采集期间，在检测步骤中探针必须可用于杂交。某些扩增方法，特别是5’核酸酶(TaqMan)方法，依赖于扩增反应期间的探针裂解，而我们采用探针裂解仅仅是为了独立分析在扩增期间产生的双链扩增子的量。如果使用只有一个或多个仅猝灭剂探针，探针裂解不增加dsDNA-染料特征性荧光颜色中的背景荧光，因此可以足够高以允许用未裂解的探针进行扩增后杂交和分析的探针浓度使用。然而，优选避免甚至仅猝灭剂探针的裂解，使得它们的浓度在终点分析之前不以可变的方式改变。如果至少一个探针是以dsDNA-染料的色彩荧光标记的，其在扩增期间的裂解产生将在单链检测和分析期间存在的背景荧光，这是不合需要的。在那种情况下，应使用其荧光不取决于裂解的探针，优选低Tm探针。

在本发明的方法中，用于探测的单链靶序列可以为获得解链轮廓或退火轮廓提供足够的拷贝的任何方式提供。许多实施方案包括利用引物对扩增靶序列的核酸扩增。扩增可以是对称的，例如对称的PCR，接着分离与单链靶序列互补的链，以获得大量的含有靶序列的单链。或者，扩增可以是非对称的，即产生双链扩增子和大量的含有靶序列的单链扩增子二者的扩增方法。非对称扩增方法的实例包括不对称的PCR和LATE-PCR。优选的非对称扩增方法是用DNA或RNA (RT-LATE-PCR)起始的LATE-PCR方法。LATE-PCR扩增和扩增测定描述于，例如，欧洲专利EP 1,468,114和相应的美国专利7,198,897；公开的欧洲专利申请EP 1805199 A2；Sanchez等人 (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 101: 1933-1938；和Pierce等人 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 102: 8609-8614中。LATE-PCR为采用聚合酶链反应(PCR)方法的非对称的DNA扩增方法，其利用以相对于其它引物(“限制引物”)至少5倍过量的一个寡核苷酸引物( “过量的引物”)，所述其它引物本身以低浓度(至多200 nM)使用，以便在产生荧光可检测的双链扩增产物(双链扩增子)的大致足够的PCR循环中被耗尽。在限制引物耗尽后，继续扩增所需数目的循环，以产生仅使用被我们称为过量的引物链的过量引物的单链扩增子，其。LATE-PCR考虑在扩增开始时限制引物的浓度调节的解链温度Tm_[0] ^L，在扩增开始时过量的引物的浓度调节的解链温度Tm_[0] ^X，和单链扩增产物(“扩增子”)解链温度Tm_A。对于LATE-PCR引物，Tm_[0]可凭经验确定，正如如在使用非天然核苷酸时为必要的，或根据“最近邻”方法(Santa Lucia, J. (1998), PNAS (USA) 95: 1460-1465；和Allawi, H.T.和Santa Lucia, J. (1997), Biochem. 36: 10581-10594)，使用盐浓度调节计算，盐浓度在我们的扩增中通常为0.07 M单价阳离子浓度。对于LATE-PCR，扩增子的解链温度利用公式：Tm = 81.5 + 0.41 (%G+%C) – 500/L + 16.6 log [M]/(1 + 0.7 [M])计算，其中L是核苷酸的长度和[M]是单价阳离子的摩尔浓度。线性的或无规卷曲探针的解链温度可如对引物那样计算，即如上所述的Tm_[0]。结构化探针例如分子信标探针的解链温度可凭经验确定或可以估算为杂交于扩增子的部分(环或环加一部分茎)的Tm_[0]。在LATE-PCR扩增反应中，Tm_[0] ^L优选低于Tm_[0] ^X不超过5℃，更优选至少一样高和甚至更优选高3-10℃，Tm_A优选高于Tm_[0] ^X不超过25℃，并且对一些优选的实施方案，优选高不超过约18℃。

本发明的方法包括获得作为低于任何双链扩增子Tm的温度的函数的染料荧光的步骤。为此目的，染料以或接近其最大吸收波长处的波长激发，和染料发射以或接近染料的最大发射波长处的一个或多个波长检测，我们称所述波长为仪器的“染料通道”。借助许多仪器，这样的温度测量的范围可宽至从约4℃至双链扩增子Tm(通常为约90-100℃)。在大的测量中，各种仪器的温度范围依赖于冷却方法。空气冷却的仪器，无论是被动或强制对流的，通常可只能降到高于室温约7-10℃的温度，而具有人工冷却的仪器，例如珀耳帖装置(Peltier device) (我们称之为“主动冷却”)可降到室温或甚至低于室温。空气冷却的和主动冷却的仪器二者可用于本发明，虽然使用主动冷却的仪器时可能的温度范围更大。仪器可利用用于分析产品的管或芯片或微流体装置。这些仪器的光学系统可利用一个或多个通道检测。在包括扩增例如LATE-PCR和低Tm探针的实施方案中，用于采集有用的信息的温度范围将被80-85℃的探针组的Tm封端。某些实施方案包括在适宜的波长激发dsDNA-染料并在生成荧光轮廓所需的足够温度的温度范围内检测来自染料的发射。我们相信，用结合于靶的探针的非荧光或荧光染料猝灭标记猝灭dsDNA-染料是由于FRET。虽然本发明不限于任何特定的机制，且机制的理解对实施本发明不是必要的，我们推理dsDNA-染料在溶液中首先结合于任何长于探针本身的大量离散的双链DNA分子。随着反应的温度充分降低以使这样的长分子变成双链的，染料发荧光。然而，随着温度的进一步降低，部分已经结合的dsDNA-染料迁移到通过具有染料猝灭标记的探针(“On”探针或“Off”探针)与单链靶的杂交形成的双链DNA的短链段。当这发生时，那部分dsDNA-染料的荧光被结合的探针的猝灭剂部分猝灭，从而减少系统中的总荧光水平至低于在不存在由探针和单链靶形成的杂合体时在相同温度观察到的水平。在某些实施方案中，用于分析的足够的信息可通过检测染料在仅两个或几个温度下的发射而获得。如果探针组中的一个或多个探针含有荧光染料猝灭标记，一个或多个荧光染料猝灭标记在染料通道的采集期间将用作一个或多个另外的染料猝灭标记。如果探针组中的一个或多个探针含有一个或多个荧光染料重合标记，所述一个或多个染料重合标记将在不依赖于染料发射的染料通道中产生荧光。在本发明的方法中，染料发射的采集也可包括在和高于双链扩增子的Tm进行检测。

如果探针组中的至少一个探针包括光谱上(与染料)截然不同的由来自dsDNA-染料的发射间接地激发的荧光标记，当dsDNA-染料被激发时，来自这样的一个或多个标记的荧光可以在或接近该标记的最大发射波长的一个或多个波长下类似但独立地获得，所述波长被我们称为标记的通道。或者，当荧光标记被直接激发时，来自这样的一个或多个标记的荧光可以在标记的通道类似但独立地获得。如果探针组中的至少一个探针包括光谱上截然不同的不被来自dsDNA-染料的发射间接地激发的荧光标记(非重叠标记)，当荧光标记被直接激发时，来自这样的一个或多个标记的荧光可以在或接近该标记的最大发射波长的一个或多个波长下类似地但独立地获得，所述波长被我们称为标记的通道。如果具有光谱上截然不同的荧光标记的探针为分子信标探针，其荧光可被独立地检测和分析，以提供另外的靶序列特异性信息。如果具有光谱上截然不同的荧光部分的探针为Taqman?探针，其荧光可被独立地检测和分析，以提供已在LATE-PCR或不对称的反应中发生的双链DNA扩增的量的测量。如果包括光谱上截然不同的荧光部分的探针为在较短的较低Tm链上具有荧光团的双链探针，其荧光可被独立地检测和分析，以提供在LATE-PCR或不对称的扩增反应中的单链DNA扩增的量的测量。

本发明的方法包括比较作为温度的函数来自dsDNA-染料的发射与标准品或另一个样品例如其序列或性质(例如药物易感性)已知的样品。标准品通常是先前从这样的已知标准品获得的结果。比较可利用荧光轮廓，如于图4D中所示。比较可利用荧光特征，如于图4A中所示。如于实施例4和图4小图A-F中所示，除了荧光轮廓外或代替荧光轮廓，人们还可使用荧光特征。为了比较的目的，可对曲线归一化。例如，荧光特征可通过将荧光特征的所有值除以最低谷或最高正峰值转化为归一化荧光特征，如果存在促成荧光峰的荧光标记的话。在某些实施方案中，可使用选择的温度替代完全的荧光轮廓或荧光特征。参照图1C，人们可以发现曲线104和105在50℃和在62℃下彼此不同。为了分析目的，人们可直接或作为在两个温度的结果的比率(曲线104将具有非常接近于1的比率，而曲线105将具有非常不同于1的比率)利用这样的荧光读数。当将退火荧光轮廓或解链荧光轮廓的数据作为一阶导数(荧光特征)相对于通常可用的全温度范围(约100℃-约25℃)作图时，将任何长于探针本身的大量离散的双链DNA分子例如在LATE-PCR扩增的指数期内产生的双链扩增子，作为高Tm正峰检测。如果来自染料的荧光在接近100℃的高温下检测，因双链扩增子(如果存在)的链解离，会存在解链峰。这样的峰出现在图1C中，例如，在约90℃。那个解链峰指明存在其长度大于探针长度的大量离散的双链DNA。这样的峰通常不是序列特异性的，不被两个互补链内DNA序列中的微小变化可检测地改变。由探针与相同样品中的单链靶的杂交产生的荧光特征通过分析在低于样品中的丰富的离散双链DNA的解链峰的一个或多个温度下的数据来确定。这样的荧光特征可以是低于在单链DNA不存在下样品的背景水平的谷，或它可以是一组谷，或它可以是一组低于和高于样品的背景水平的谷和峰。荧光特征的精确图案将取决于一个或多个单链靶的序列和探针的序列以及用与ds-DNA-染料相同的荧光色彩的染料猝灭标记和荧光团对探针的标记。此外，那些谷和峰的深度和高度将取决于反应的各种组分的丰度。

在本发明的方法中，比较步骤可进一步包括以用于比较染料发射的不同方式中的一种或多种，比较作为温度函数的来自光谱上截然不同的荧光标记的发射与标准品或者另一个样品，以提供关于样品中的靶序列或靶序列变体的另外的信息。见实施例5，其中一个或多个On探针包括Quasar 670荧光团标记，图5小图A、C和E是染料通道中的荧光特征，和图5，小图B、D和F是Quasar通道中的荧光特征。

说明本发明的不同方面的实验在实施例中提出。实施例1描述利用单一仅猝灭剂探针(具有一个非荧光猝灭剂部分的探针，或者具有两个非荧光猝灭剂部分的探针)，分析两个菌株的katG基因的16个碱基对区域的序列的方法。实施例2描述利用一组多个(6个)单独标记的仅猝灭剂杂交探针，分析6个菌株的rpoB基因区域的较长的101个碱基长的单链的序列的方法。实施例3描述利用SYBR?绿dsDNA-染料与也用FAM荧光团标记的猝灭剂标记的探针的组合的方法。实施例5描述利用SYBR?绿dsDNA-染料与3个仅猝灭剂探针和3个也用荧光团Quasar 670标记的猝灭剂标记的探针的组合的方法，其中6个探针杂交于rpoB基因区域的101个碱基长的单链的7个变体，其在扩增之前的初始浓度是不同的。Quasar 670荧光团为红色荧光团，其与SYBR?绿染料是FRET配偶体。实施例6描述利用SYBR?绿dsDNA-染料与也用荧光团Quasar 670标记的猝灭剂标记的探针的组合的方法，荧光团Quasar 670具有在670nm的最大发射，其中探针借助于其发夹形状用作SYBR?绿dsDNA-染料的贮库。

可用于本发明的方法中的探针组可包括用于分析靶序列变体的不同类型的多个探针。例如，可用于在此提供的方法中的探针组可包括“On”探针，其与另一个猝灭剂标记的探针邻近地杂交于靶序列，以致当二者都杂交时，后者的猝灭剂猝灭前者的荧光标记。在实施例3中，在促旋酶B探针组中的“On”探针#2和“Off”探针说明那样的可能性。用于实施例3以分析分枝杆菌属的几个菌种的促旋酶B探针组包括：a) 一个仅猝灭剂(“Off”)探针；b) 用猝灭剂和FAM二者标记的两个“On”探针；c) 一个未标记的探针。用于多个不相关的靶的探针组可在相同的反应混合物中一起使用。实施例3的方法在用于扩增两种基因的序列的反应混合物中包括用于促旋酶B基因的探针组和用于16s核糖体基因的探针组。

在实施例中，扩增和检测使用Stratagene MX3500P热循环仪进行。使用仪器的“FAM通道”检测SYBR?绿荧光，所述通道检测在516 nm的发射。当包括含有FAM标记的一个或多个探针时，检测包括SYBR?绿荧光和FAM荧光两者。

在实施例1中，LATE-PCR扩增使用单一引物对进行，以使用两株结核分枝杆菌的任何一株扩增katG基因的139个碱基对区域。反应中生成的扩增的单链扩增子包括16个碱基长的序列，已知该序列含有负责异烟肼耐药性的突变。菌株25631是药物敏感性的并在图1A-1D中作为曲线100、102、104、106显示。菌株8094 (其在16个碱基长的序列中具有单一碱基变化(G变为C))为耐药性的，并在图1A-1D作为曲线101、103、105、107显示。用与药物敏感菌株25631的16个碱基长的序列互补的序列制备探针。一个探针是无标记的寡核苷酸。第二探针是在其3’末端具有单一黑洞猝灭剂1 (BHQ1)的同一种寡核苷酸。第三探针是在每个末端上具有BHQ1的同一种寡核苷酸。4种扩增反应混合物用各个目标菌株制备。各反应混合物包含0.24x SYBR?绿，其通过稀释由生产商提供的10,000x浓度储备液制备。第一混合物不含探针。第二混合物含有500nM的未标记的探针。第三混合物含有500nM具有3’ BHQ1修饰的探针。第四混合物含有500nM具有5’和3’ BHQ1的探针。在扩增的末端，通过在不同的温度读出来自SYBR?绿的荧光(仪器的FAM通道中的荧光采集)，分析作为温度的函数的探针-靶杂交。

图1A-1D显示在实施例1中获得的荧光特征(作为温度函数(随着温度上升)的荧光轮廓的一阶导数)。在每种情况下，SYBR?绿dsDNA-染料结合于在LATE-PCR的指数期内生成的大量双链分子，以产生约88℃的解链峰。图1A提出不用探针测试的两个菌株的荧光特征结果。圆圈100代表菌株25631，和圆圈101代表菌株8094。两条曲线是不能区别的，从而证实在探针不存在下，累积的单链DNA不结合SYBR?绿。只有扩增子的双链DNA结合SYBR?绿并生成荧光特征中的在约88℃的峰。

比较曲线102 (图1B)和曲线100 (图1A)证实添加未标记的探针至菌株25631中导致形成结合SYBR?绿染料的dsDNA的短区，引起在荧光特征的45-63℃部分中相对于背景的荧光轻微增加。相比之下，比较曲线103 (图1B)和101 (图1A)证实它们是非常相似的。这表明单用未标记的探针对分析正研究的可变单链序列的两个变体而言是不满意的。图1C和1D说明仅使用单一的仅猝灭剂探针(无论是用黑洞猝灭剂单独标记的，还是用两个黑洞猝灭剂双重标记的)的依据本发明的方法，通过dsDNA-染料的荧光特征区别待分析的DNA序列的两种变体的能力。图1C提出用在其3’末端具有单一BHQ1的探针测试的两个菌株的荧光特征的结果。圆圈104代表菌株25631，和圆圈105代表菌株8094。比较曲线104 (图1C)和102 (图1B)显示具有一个BHQ1的探针结合于菌株25631的单链(具有约63℃的Tm)并引起荧光水平的降低，因为BHQ1猝灭结合于dsDNA的这个短区的SYBR?绿。比较曲线105 (图1C)和103 (图1B)显示具有一个BHQ1的探针结合于菌株8094的单链(具有约53℃的Tm)并引起荧光水平的降低，因为BHQ1猝灭结合于dsDNA的这个短区的SYBR?绿。比较曲线106 (图1D)和102 (图1B)显示具有2个BHQ1猝灭剂的探针结合于菌株25631的单链(具有约58℃的Tm)并引起荧光水平的降低，因为两个BHQ1强烈猝灭结合于dsDNA的这个短区的SYBR?绿。比较曲线107 (图1D)和103 (图1B)显示具有2个BHQ1猝灭剂的探针结合于菌株8094的单链(具有约45℃的Tm)并引起荧光水平的降低，因为两个BHQ1强烈猝灭结合于dsDNA的这个短区的SYBR?绿。比较曲线106 (图1D)和104 (图1C)显示具有两个BHQ1的探针的有效Tm比具有一个BHQ1的探针的有效Tm低63-58 = 5℃)，并且比较曲线107 (图1D)和105 (图1C)显示具有两个BHQ1的探针的有效Tm比具有一个BHQ1的探针的有效Tm低53-45 = 8℃。因此，因两个BHQ1对比一个BHQ1所致的平均降低为平均约6.5℃。我们推理，有效的Tm的这种降低是由于这样的事实，即探针两个末端上的两个BHQl稳定其未结合状态的探针，结果是探针与靶的有效Tm降低。因此，在设计探针组时，分离两个探针的Tm的一种方式是通过加入黑洞猝灭剂至具有较低Tm的探针中。

可为实施例1的方法的备选的实施方案是利用用黑洞猝灭剂标记的原位Off探针。在这样一个实施方案中，过量的引物用一个猝灭剂部分(这里是5’ BHQ1)标记和限制引物具有含以下核苷酸序列的5’延伸，所述核苷酸序列不是描述的探针序列(SEQ ID No. 5)(其与药物敏感菌株25631 (一个错配)比与耐药(突变体)菌株8094更互补)，而是这样的探针序列，其经修饰以与耐药菌株更互补(以致原位探针用该菌株形成)且非常等位基因区分性的(例如，在可实行时尽可能的短，以致原位探针不用药物敏感菌株形成)。

在实施例2中，LATE-PCR扩增使用单一引物对进行以扩增几株结核分枝杆菌的每一株的rpoB基因的150个碱基对区域，所述结核分枝杆菌包括药物敏感菌株24609和5株不同的耐药菌株，各菌株因单一碱基对而与药物敏感菌株不同。在LATE-PCR的线性期内扩增的单链DNA产物(过量的引物链)包括101个碱基长的序列，已知其含有负责对利福平的耐药性的突变。对6个不同的结核分枝杆菌菌株(药物敏感菌株24609和耐药菌株18460、8600、13554、14191和17718)的每一菌株按一式三份测试。6个封闭管反应各自的产物在末端点使用SYBR?绿染料和6个探针(其包括在原始扩增反应混合物中)的多探针组分析。该探针跨越单链核酸靶序列的101个碱基对。所有探针仅用单一黑洞猝灭剂2 (BHQ2)标记。在扩增的末端，分析作为温度函数的探针-靶杂交。如在实施例1中，通过使用SYBR?绿通道中的解链曲线分析对杂交进行表征。

在依据本发明的方法的该实施例中，荧光特征，即是说，通过逐步升高温度获得的荧光轮廓的导数，通过将它们绘制在相同图上在视觉上进行相互比较(图2)。发现荧光特征区分所有6个测试菌株。圆圈201代表药物敏感菌株24609。圆圈202显示抗性菌株18460 (D516V，位于氨基酸位置516的天冬氨酸改变为缬氨酸)。圆圈203是菌株8600 (L533P，位于氨基酸位置533的亮氨酸改变为脯氨酸)的3个重复。圆圈204代表耐药菌株13554 (H526Y，位于氨基酸位置526的组氨酸改变为酪氨酸)。圆圈205代表14191 (H526R，位于氨基酸位置526的组氨酸改变为精氨酸)。圆圈206代表菌株17718 (H526L，位于氨基酸位置526的组氨酸改变为亮氨酸)。数据显示用于区分每一菌株与其它5种菌株的荧光特征的清楚分离。图2说明对于每种菌株，探针组中的仅猝灭剂(Off)探针共同起作用，以猝灭结合的SYBR?绿，但是由于在6个靶中存在单一核苷酸变体，6个探针的复合结合以序列特异性的方式可检测地变化。这证实不同的耐药菌株可通过实施例2的方法区分。

在实施例3中，多重LATE-PCR扩增被用来提供多个单链靶核酸序列，以通过使用两个基因(16s核糖体基因和促旋酶B基因)的组合，将结核分枝杆菌与分枝杆菌属的其它成员区分开。来自目标菌种之一的各个基因的靶序列在相同管中利用两对引物扩增。为研究和比较不同的分析方法，测试3种独立的类型的扩增反应混合物：第一种仅含有16s探针组，第二种仅含有促旋酶B探针组，和第三种含有这两种探针组。

实施例3显示依据本发明的方法，所述方法包括与dsDNA-染料组合使用未标记的探针、仅猝灭剂探针和用染料重合荧光团(其激发和发射光谱与染料的激发和发射光谱几乎相同)标记的猝灭剂探针。在实施例3中，dsDNA-染料是SYBR?绿——最常用的染料，和光谱上不易区分的荧光团是FAM。SYBR?绿具有497 nm的最大激发和521 nm的最大发射。FAM是几乎相同的，有493 nm的最大激发和525 nm的最大发射。使FAM包括在3个被我们称为“On”探针的探针中，“On”探针在溶液中时猝灭，但当杂交时发出荧光。这样的“On”探针包括荧光部分(例如荧光团或量子点)，和非荧光猝灭剂部分(例如黑洞猝灭剂或DABCYL)。在这种情况下，促旋酶B探针组包括2个这样的“On”探针(促旋酶B On探针#1, 促旋酶B On探针#2)，一个仅猝灭剂探针(促旋酶B “Off”探针)，和一个既没有猝灭剂部分也没有荧光部分的未标记探针(促旋酶B未标记的探针)。16s探针组包括一个“On”探针(16s On探针)和一个仅猝灭剂探针(16s “Off”探针)。“On”探针是具有两个核苷酸长度的茎的所有分子信标，在一端用FAM标记而在另一端用黑洞猝灭剂标记。

虽然16s和促旋酶B靶序列二者在描述于实施例3中的所有3个反应中扩增，示于图3A的染料通道中的荧光特征通过在反应混合物中仅包括SYBR?绿染料和用于16s靶的探针组获得；图3B的荧光特征通过在反应混合物中仅包括SYBR?绿染料和用于促旋酶B靶的探针组获得；和图3C的荧光特征通过在反应混合物中包括SYBR?绿染料和用于促旋酶B靶的探针组和用于16s靶的探针组获得。这些分析各自提供关于反应混合物中的目标菌种的不同的序列信息。图3C的反应混合物含有SYBR?绿染料和所有6个探针，因此它提供关于样品中的目标菌种的大部分信息。使用双重标记的含有SYBR?绿的染料重合“On”探针提供截然不同的和有差别的荧光特征，其将结核分枝杆菌复合菌组(complex)(MTBC)的成员与分枝杆菌属的其它成员(称为NTM，非结核分枝杆菌)鉴别开。图3A包括用于结核分枝杆菌复合菌组(MTB复合菌组)成员结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、牛分枝杆菌(M. bovis)、田鼠分枝杆菌(M. mircoti)和非洲分枝杆菌(M. africanum)的16s靶序列的解链荧光特征300，所述成员分享单一靶序列。图3A也包括对两个NTM亚洲分枝杆菌(M. asiaticum) (圆圈301)和鸟分枝杆菌(M. avium) (圆圈302)的荧光特征。这些荧光特征清楚地分离NTM菌种与MTB复合菌组。图3B包括对结核分枝杆菌(圆圈310)、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌(圆圈311)、牛分枝杆菌(圆圈312)、鸟分枝杆菌(圆圈313)和亚洲分枝杆菌(圆圈314)的解链荧光特征。如可从图3B中见到的，用于促旋酶B探针组的荧光特征将MTB复合菌组的成员彼此区分以及与NTM菌种的每个成员区分开。结核分枝杆菌(圆圈310)具有在61℃的尖峰和在49℃的负峰。田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌(其促旋酶B靶序列是相同的) (圆圈311)具有在54℃的峰和在49℃的次要峰。牛分枝杆菌(圆圈312)具有在54℃和42℃的正峰以及在49℃的次要负峰。NTM菌种鸟分枝杆菌(圆圈313)显示无正或负峰。实施例3揭示一些关于我们获得的亚洲分枝杆菌样品有趣的事情。在图3B中，亚洲分枝杆菌(圆圈314)样品显示结核分枝杆菌的特征，向我们指明这种样品为混合物。这通过对得自这种样品的16s和促旋酶B序列测序得到证实。16s序列数据显示其为亚洲分枝杆菌而促旋酶B序列数据显示其为结核分枝杆菌。因此，分析了混合的样品。图3C包括对于田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌(共同的靶序列，圆圈320)、牛分枝杆菌(圆圈321)、结核分枝杆菌(圆圈322)、鸟分枝杆菌(圆圈323)和亚洲分枝杆菌(圆圈324)的解链荧光特征。如可在图3C中所见的，对于MTB复合菌组成员，牛分枝杆菌(圆圈321)和结核分枝杆菌(圆圈322)彼此截然不同且与田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌(圆圈320)截然不同。对于NTM菌种，鸟分枝杆菌(圆圈323)不同于所有其它特征，而亚洲分枝杆菌的混合物样品(圆圈324)也是独特的。

关于染料和探针，实施例4的方法类似于实施例3的方法。然而，在这种情况下，引物仅扩增16s靶序列，因此只有16s靶序列产生双链扩增子和单链扩增子。在这个实施例中，我们改变dsDNA-染料浓度，和我们改变Off探针的非荧光猝灭剂(On探针保持用黑洞猝灭剂和FAM (一种染料重合标记)标记的分子信标)。荧光轮廓和荧光特征(一阶导数)在图4小图A-F中呈现。

实施例4显示dsDNA-染料浓度(在这种情况下为SYBR?绿染料浓度)的效果。0.72x的SYBR?绿抑制扩增(结果未示出)。小图D、E和F显示0.48x、0.24x和0.12x的SYBR?绿染料不抑制扩增。事实上，双链扩增子和单链扩增子的总量在所有3组反应中是相同的。然而，如在小图D-F中从约90℃移到约85℃时的荧光增加所示的，当SYBR?绿浓度从0.48x下降至0.24x、至0.12x时，SYBR?绿结合于双链扩增子的量降低。随着温度进一步下降至85-63℃之间，另外的SYBR?绿结合于双链扩增子的比率也降低。这表明0.12x和0.24x SYBR?绿染料不能饱和双链扩增子。相比之下，小图D - F显示在低于约63℃，SYBR?绿结合于单链扩增子和FAM-标记的On探针的杂合体的量在所有的情况下大致相同，在低于约60℃的温度下SYBR?绿结合于单链扩增子和3个类型的OFF探针的杂合体的量亦是如此。这是意料之外的。这表明在探针-靶杂交的温度范围内，与双链扩增子相比，SYBR?绿染料优先地结合于探针-靶杂合体。这与在末端点单链扩增子浓度远高于(10-20倍)双链扩增子的浓度这一事实一致。

实施例4显示在生成解链轮廓和它们的一阶导数中，优化达到最大温度依赖的微妙之处所需的dsDNA-染料水平的一种简单的、直接的经验方法。在这个实施例中，0.12x SYBR?绿被认定是最佳的，因为每一个峰和谷是最大分辨和最可重复的。

实施例4也说明自Off探针与靶序列杂交产生的SYBR?绿染料信号传导的降低幅度。对Off探针测试了几种备选的非荧光猝灭剂标记，Off探针与On探针邻近地杂交。OFF探针的各个变体在邻近于On探针的3’ FAM的5’位置具有至少一个猝灭剂。一个Off探针用单一的5’ DABCYL标记，一个OFF探针用5’ DABCYL和3’ DABCYL两者标记，和一个Off探针用5’ BHQ1标记。如本领域熟练人员理解的，用两个BHQ1猝灭剂或用其它猝灭剂(包括并非BHQ1的黑洞猝灭剂)构建Off探针也是可能的。这样的备选猝灭剂将具有不同的光谱。

图4显示Off探针的所有3个变体具有足够的猝灭能力以沉默来自邻近的On探针的所有或大多数FAM信号。然而，如由曲线411、414、417所示的，仅具有单一3’ DABCYL的探针在宽的温度范围内仅部分地降低SYBR?绿信号传导水平至背景水平。相比之下，具有两个DABCYL (曲线412、415、418)或一个BHQ1 (曲线413、416、419 -)的探针在相对小的温度范围内具有吸收FAM荧光团和结合的SYBR?绿染料两者的能量的能力。具有一个BHQ1的探针比具有两个DABCYL的探针在稍更窄的温度范围内达到猝灭。在最佳条件例如示于图4小图C的那些条件下，荧光特征中“荧光谷”的深度随着探针的猝灭“强度”发展，以逐步方式变得更深：无猝灭剂，一个DABCYL，两个DABCYL，一个BHQ1。如本领域熟练人员理解的，具有两个BHQ1的探针比具有一个BHQ1的探针吸收更多的能量(结果未示出)并可具有比含一个BHQ1的探针甚至更深的“荧光谷”。

图4说明当在靶序列上邻近杂交时，两个探针可相互作用。在图4，小图A-C中，比较圆圈402、405、408与圆圈403、406、409，显示用具有两个DABCYL的探针猝灭的最大比率出现时的温度比具有一个BHQ1的探针猝灭的最大比率出现时的温度持续地高几度。这个结果与同邻近的On探针3’BHQ1和5’ FAM之间的相互作用相比，邻近的On探针的3’ DABCYL和5’ FAM之间更稳定的相互作用一致，如的。探针/探针相互作用的原理可以许多方式扩大，所述方法包括以下方式。1) 邻近的探针可通过在邻近的探针上加入的化学部分或者单链末端的相互作用彼此稳定。当它们结合于靶链并通过增加温度而解链时，邻近的探针的所有这样的“稳定”作用将导致探针的有效Tm的增加。有效Tm的这种增加将与作为单一探针的各个探针的Tm形成对比。2) 邻近的探针可通过加入的化学部分的相互作用或者通过单链末端的重叠以致两个探针的邻近末端竞争相同靶序列而彼此失稳。邻近探针的所有这样的“失稳”作用将导致至少一个邻近探针的有效Tm的降低。有效Tm的这种降低将与作为单一探针的各个探针的Tm形成对比。稳定和失稳作用可涉及在它们的相互作用末端均没有化学部分的邻近探针，在它们的相互作用末端均具有化学部分的邻近探针，或仅其中所述对中仅有一个在相互作用的末端具有化学部分的邻近探针。如探针设计领域熟练人员所容易地理解的那样，稳定和失稳探针-探针相互作用两者对靶的影响会对邻近探针对的整个荧光曲线有微妙的影响。例如，如果两个探针具有类似的Tm和它们与靶的结合通过它们的邻近末端的竞争而失稳，在一个探针下存在突变会显著地降低其Tm，由此降低其相对于另一探针的竞争性。相反地，如果两个邻近的探针以稳定它们的与靶的杂交的方式相互作用，一个探针的存在会减少在另一探针下由突变引起的错配的影响。

可为实施例4的方法的备选的一个实施方案将利用作为Off探针的原位探针。原位Off探针可通过使用黑洞猝灭剂标记的过量的引物用黑洞猝灭剂标记，或它可以是未标记的。限制引物可具有包含核苷酸序列的5’延伸，所述序列是描述的探针序列(SEQ ID No. 34)的互补物，其被修饰为有利于和针对瘰疬分枝杆菌(M. scrofulaceum)序列非常等位基因区分性的。然后可使On探针与瘰疬分枝杆菌互补。然后用于On探针的结合序列将位于最终原位探针的环中，降低其针对结核分枝杆菌复合菌组序列的Tm。

实施例5说明dsDNA-染料(SYBR?绿)和多个(6个)探针的组在测定中区分药物易感的或由于rpoB基因靶的点突变对抗生素利福平耐药的结核分枝杆菌菌株的应用，所述组除了多个(3个) Off探针外，还包括另外(3个)作为具有染料猝灭荧光团的未标记的或者双重标记的On探针的探针，其。

LATE-PCR扩增使用在实施例2中使用的相同单一引物对进行，以扩增两株结核分枝杆菌的每一菌株rpoB基因的150个碱基对区域。扩增提供101个碱基长的单链靶(过量的引物链)，其包括已知含有负责对利福平的耐药性的突变的RRDR区域。每个单链核酸靶序列使用6个探针(其存在于原始扩增反应混合物中)的4个不同组之一探测。在扩增末端分析作为温度的函数的探针-靶杂交。在该实施例中，杂交通过SYBR通道(SYBR?绿荧光的刺激和检测)中的荧光特征和Quasar通道(Quasar 670的直接刺激和检测)中的荧光特征进行表征。其中具有相同核苷酸序列的所有6个探针被标记为Off探针的实施例2，提供对SYBR通道中的读数的另外的比较。来自实施例2的相关特征在图2中，圆圈201 (药物敏感性)和203 (突变菌株8600)。

探针组1：所有探针组包括相同的3个Off探针，每一个用单一黑洞猝灭剂标记。第一探针组另外包括3个On探针。当染料是SYBR?绿时，每个On探针是一端用黑洞猝灭剂标记和另一端用Quasar 670荧光团(一种染料猝灭荧光团)标记的分子信标探针。包括标记的并列的6个探针在靶序列上的对齐描述于实施例5中。所述对齐也示于图5小图A和B上面的图例中。在探针均杂交于靶序列的情况下，3个荧光团的每一个邻近于邻接探针的黑洞猝灭剂：On探针2的3’ Quasar 670位于Off探针1的5’ BHQ2的邻近；On探针4的3’ Quasar 670位于Off探针3的5’ BHQ2的邻近；和On探针5的5’ Quasar 670位于Off探针6的3’ BHQ2的邻近。因此，当在Quasar通道读数时，所述探针表现为依据公布专利申请WO 2011/050173的On/Off探针组。当在SYBR通道读数时，所有标记用作猝灭剂。

参照图5小图A、C、E和G，在约93℃的正峰是双链扩增子的解链峰。小图A和小图B显示各种荧光特征清楚地区分两个菌株。比较SYBR通道中的圆圈501和502(图5小图A)，显示在On探针5下的突变将负峰(谷)向左边移动，即是说，荧光特征的最低点的温度从70℃减少至约66℃。这与图2中圆圈201和圆圈203的比较非常类似。Quasar 670通道中圆圈503和504的比较(图5，小图B)显示在On探针5下的突变使正峰向左边移动，即是说，荧光特征的最高点的温度从70℃减少至约66℃。在两种情况下，主峰温度的减少与On探针5的Tm的降低一致。与圆圈501比较，圆圈502的负峰温度的移动是由于On-探针5在SYBR通道用作Off探针。圆圈504的正峰温度与圆圈503的峰肩温度一致，这是由于On-探针2用作Quasar 670通道中的On探针。

探针组2：第二探针组与第一探针组相同，除了一个变化外：未标记的寡核苷酸取代了On探针2。小图C和小图D显示各个荧光特征清楚地区别两个菌株。比较SYBR通道中的圆圈505和506 (图5，小图C)显示在On探针5下的突变将负峰(谷)向左边移动，从70℃至约66℃。比较Quasar 670通道中的圆圈507和508(图5，小图D)显示在On探针5下的突变将正峰向左边移动，从70℃至约66℃。比较圆圈501 (小图A)与圆圈505 (小图C)显示未标记的探针取代On-探针2增加了约55℃-66℃之间的信号曲率。类似地，比较圆圈503 (小图B)与圆圈507 (小图D)显示未标记的探针取代On-探针2消除了在66℃的肩部，并增加了在其下的谷的温度。比较圆圈507和508 (图5，小图D)显示未标记的探针取代On-探针2引起圆圈507中的峰的幅度高于圆圈508中的峰的幅度。这与图5小图B中的相应峰的相对幅度形成对比。

探针组3：第三探针组与第二探针组相同，除了一个变化外：未标记的寡核苷酸取代On探针4。这使得探针5作为仅有的On探针。小图E和小图F显示各个荧光特征清楚地区别两个菌株。图5小图F中的结果反映这样的事实，即仅有一个Quasar标记的探针存在于该组探针中。随着温度降至低于75℃，探针5的正信号被探针6上的邻近猝灭剂快速地熄灭。这种猝灭作用在圆圈512中甚至更显著(与圆圈511比较)，因为在探针5下的突变降低了其有效的Tm，以致其荧光被探针6的猝灭剂即刻熄灭。图5小图E揭示探针5作为Off探针在SYBR通道中发挥作用。圆圈510的谷(小图E)比圆圈512的峰更显著，因为当探针5作为Off探针在SYBR通道中发挥作用时，其猝灭能力不被探针6的猝灭剂对探针5的Quasar所具有的作用减少。然而，探针5的Tm因在探针5下的突变存在而显著地降低。这由圆圈511的谷向左边移动(与圆圈512比较)而观察到。

探针组4：第四探针组与第三探针组相同，除了一个变化外：未标记的寡核苷酸取代On探针5(突变位于该探针下)。这使得没有On探针。小图G和小图H显示两个荧光特征都不能清楚地区别两个菌株。由于在探针组4中没有用Quasar 670标记的探针，在Quasar通道(图5，小图H)中没有信号。图5小图G中的结果也显示在SYBR通道中没有谷信号，尽管仍有3个用BHQ2标记的Off探针。图2和图5小图A均在6个探针的组中未有未标记的探针，在探针组中具有总共6个强BHQ2猝灭剂，并且它们具有最深的谷。图5小图C至小图E至图G显示随着探针组中强BHQ2猝灭剂的数目从5变为4，再变为3 (未标记的探针从0至1至2至3进行)，谷逐步变浅，当仅有3个BHQ2猝灭剂时特征消失(小图G)。我们认为，总的来看，这些结果显示探针组4以及因此所有的探针组作为整体发挥作用。换言之，与所有邻接探针的总dsDNA-染料结合(在此SYBR?绿结合)由可获得的猝灭剂的总数目平衡。

实施例6说明SYBR?绿dsDNA染料在在微流体装置中进行的PCR扩增中的应用。在那描述的方法使用过量的双链DNA寡核苷酸，其用作试剂结合的染料的贮库，因为它是结合的，所述染料从而被防止粘附到装置壁上并可用来结合，然后解离并结合于从扩增产生的双链扩增子和/或探针/靶杂合体。

在小型化微流体芯片装置(miniaturized microfluidics chip devices)中经由聚合酶链反应(PCR)的基因分析是高度需要的，因为这样的装置是非常快速、便宜并在它们的设计中是高度灵活的。许多用于核酸扩增反应(特别是PCR)的微流体装置已被描述。这样的装置从静室延伸至流过体系，以及热对流驱动的PCR装置，使用Taqman探针检测扩增。制备这些微流体芯片装置所用的材料包括硅、玻璃、塑料和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。用于芯片的PDMS由于其方便性、低成本和对大多数PCR试剂为惰性的表面而备受关注。SYBR?绿——最常用的dsDNA-染料，对用于微流体装置将具有明显的优点，因为其是经充分研究的且便宜。然而，由于微流体通道或室中的高表面/体积比，来自SYBR?绿的信息信号在填充过程中并且还在PCR循环过程中，因染料粘附到表面而容易失去。Cady等人已明确显示信号在PCR期间因PDMS和SYBR?绿I的之间的相互作用而丢失。Cady等人(2005), 使用集成的微流体平台实时PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌(Real-time PCR Detection of Listeria Monocytogenes Using an Integrated Microfluidics Platform), Sensors and Actuators B: Chemical, 107(1), 332-341..Gonzalez等人已表明运行通过全氟烷氧基(PFA) (一种比PDMS更加惰性的聚合物)长管时SYBR?绿几乎完全吸附。Gonzalez等人(2007), 定量PCR组分与聚合物表面的相互作用(Interaction of Quantitative PCR Components with Polymeric Surfaces), Biomed Microdevices, 9(2), 261-266。在PCR之前，已使用不同的添加剂例如BSA和表面活性剂作为壁-表面处理剂，以避免试剂粘附到微流体通道的壁上。

在实施例6中，SYBR?绿粘附到微流体装置(甚至由PDMS制得的装置)表面的问题，通过在扩增反应混合物中包含双链寡核苷酸而得以克服。我们相信，双链寡核苷酸用作容纳和释放SYBR?绿的贮库。寡核苷酸可以是两条互补链，或如我们在实施例6中所用的，形成具有双链茎区域的发夹结构的单链，例如分子信标探针或类似的结构。

如在实施例6中报告的，我们将一系列样品经受LATE-PCR扩增。扩增前的SYBR?绿荧光示于图6小图C中，而扩增反应后的SYBR?绿荧光示于图6小图D中。小图C显示SYBR?绿染料和微流体装置的PDMS表面之间的相互作用。小图D显示在反应混合物中无双链寡核苷酸时，SYBR信号在扩增反应期间实际上降低。相比之下，当反应混合物含有少量双链扩增产物和较大量的双链探针-靶杂合体时，含SYBR?绿、分子信标探针和靶的样品显示到扩增反应结束时荧光的显著增加。因此，分子信标探针(其当装置被填充时在室温下存在(如在实施例中进行的))的发夹结构的双链茎，用作SYBR?绿染料的贮库。结合于茎的SYBR?绿被防止粘附于PDMS室的壁上并可在扩增后用来结合双链用于检测。实施例6显示在扩增反应的条件(特别包括0.96x SYBR?绿和500nM分子信标)下，这导致在反应室中未结合于PDMS的足够量的SYBR?绿用于由反应生成的双链DNA扩增子的SYBR染色。

如本领域熟练人员所理解的，其它双链分子(包括不是分子信标并具有各种长度和组成的茎的发夹寡核苷酸以及由互补或部分地互补单链的杂交生成的双链)，可取代作为SYBR?绿染料的贮库的本文描述的分子信标的茎。此外，已知结合双链DNA的其它染料可替代SYBR?绿使用或与SYBR?绿一起使用。所述染料、发夹和双链的最适浓度可通过本领域熟练人员的实验而容易地确立。

实施例

实施例1

结核分枝杆菌菌株的katG基因的耐药性检测

LATE-PCR扩增使用单一引物对进行，以扩增两株结核分枝杆菌的katG基因的139个碱基对区域。扩增提供该基因的16个碱基对区域作为单链核酸靶序列，已知该区域含有负责异烟肼耐药性的突变。在扩增结束时，分析作为温度的函数的探针-靶杂交。在该实施例中，杂交通过使用解链曲线分析进行表征。反应组分和条件如下：

限制引物：5’AGCGCCCACTCGTAGCCGTACAGGATCTCGAGGAAAC 

　　　　　(SEQ ID No. 1)

过量的引物：5’TCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCAC (SEQ ID No. 2)

无标记探针

5’ CTCGATGCTGCTGGTG-C₃ (SEQ ID No. 5)

具有一个猝灭剂部分的探针

5’ CTCGATGCTGCTGGTG-BHQ1 (SEQ ID No. 5)

具有两个猝灭剂部分的探针

5’BHQ1- CTCGATGCTGCTGGTG-BHQ1 (SEQ ID No. 5)

3个碳的接头由C₃表示，而黑洞猝灭剂1由BHQ1 (Biosearch Technologies, Novato CA)表示。探针中的互补末端核苷酸加下划线。

靶：菌株25631

5’GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGAT CACCAGCGGCATCGAG GTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT (SEQ ID No. 3)

在5’末端的下划线序列是过量引物的序列，除了所述靶具有5’末端G和过量的引物具有5’末端T外。在3’末端的下划线序列是与限制引物互补的序列，除了其中距靶序列3’末端的第四个核苷酸为A外，限制引物的相反的核苷酸是G而不是T。与探针序列互补的序列为斜体字且有下划线的内部序列。探针序列与靶菌株25631完全地互补，但探针序列中部的T-G 错配除外。

靶：菌株8094

5’GCTTGGGCTGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCACCGGCATCGAGGTCGTATGGACGAACACCCCGACGAAATGGGACAACAGTTTCCTCGAGATCCTGTACGGCTACGAGTGGGAGCT (SEQ ID No. 4)

下划线表示从药物敏感菌株的单一核苷酸改变的位置。探针序列以两个错配互补于靶菌株8094。

在25 μl体积中按一式三份进行LATE PCR扩增，所述体积由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、2 mM MgCl₂、200 nM dNTP、50 nM限制引物和1000 nM过量的引物、1.25单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、0.24x SYBR?绿(Invitrogen, Carlsbad, CA)和一个或另一个靶菌株组成。以大约10,000基因组当量的量包含菌株25631。以1,000基因组当量的量包含菌株8094。对于每一个靶，制备4种独立的混合物：第一混合物不含katG探针，第二混合物具有500nM的无修饰的katG探针，第三混合物具有500nM含3’ BHQ修饰的katG探针，和第四混合物具有500nM含5’和3’ BHQ的katG探针。

对在Stratagene MxPro 3500P上针对扩增进行的热分布如下：95℃/3min 1个循环，接着60个循环的98℃/10s - 75℃/40s，在每个循环采集荧光。这之后是一个于75℃10 min和于25℃10 min的循环。这之后接着于25℃开始以30s间隔的1℃增量直至97℃的解链，并在FAM通道(激发，492nm，发射，516nm)于每一度采集荧光。通过解链曲线分析，使用一阶导数分析探针-靶杂交。

图1A-D显示每个混合物组的荧光特征(解链曲线导数)的结果。图1A表示不用探针测试的两个菌株的解链曲线分析结果。圆圈100标明含有菌株25631的重复，和圆圈101标明含有菌株8094的重复。图1B显示用不含猝灭剂部分的探针测试的两个菌株。圆圈102标明含有菌株25631的重复和圆圈103标明含有菌株8094的重复。图1C显示用含单一猝灭剂的探针测试的两个菌株。圆圈104标明含有菌株25631的重复，和圆圈105标明含有菌株8094的重复。图1D显示用含两个猝灭剂部分的探针测试的两个菌株。圆圈106标明含有菌株25631的重复，和圆圈107标明含有菌株8094的重复。

过量的引物在5’末端含有故意的错配(“T”而不是在每个靶中的“G”)，以减少在LATE-PCR扩增的线性期内的潜在引导错误。

实施例2

结核分枝杆菌菌株的rpoB基因的耐药性检测.

LATE-PCR扩增使用单一引物对进行以扩增几株结核分枝杆菌的每一菌株的rpoB基因的150个碱基对区域。扩增提供该基因的101个碱基对区域作为单链核酸靶序列(每个LATE-PCR扩增的过量的引物链)，已知该区域含有负责对利福平的耐药性的突变。扩增后，每个单链核酸靶序列使用6个独立的探针探测，这些探针包含在原始扩增反应混合物中。

所述探针跨越单链核酸靶序列的101个碱基对。所有探针仅用BHQ2标记，没有荧光团。在这个实施例中，荧光特征彼此全都截然不同且相对于药物敏感菌株也不同。在扩增结束时，分析作为温度的函数的探针-靶杂交。在该实施例中，通过使用解链曲线分析表征杂交。反应组分和条件如下：

限制引物：5’-CTCCAGCCAGGCACGCTCACGTGACAGACCG (SEQ ID No. 6)

过量的引物：5’-CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAG (SEQ ID No. 7)

探针1：5’- BHQ2-CTGGTTGGTGCAGAAG-C₃ (SEQ ID No. 14)

探针2：5’- BHQ2-TCAGGTCCATGAATTGGCTCAGA- C₃ (SEQ ID No. 15)

探针3：5’- BHQ2-CAGCGGGTTGTT-C₃ (SEQ ID No. 16)

探针4：5’-BHQ2-ATGCGCTTGTGGATCAACCCCGAT- C₃ (SEQ ID No. 17)

探针5：5’-AAGCCCCAGCGCCGACAGTCGTT-BHQ2 (SEQ ID No. 18)

探针6：5’-ACAGACCGCCGG-BHQ2 (SEQ ID No. 19)

3个碳的接头(其阻断探针的延伸)由C₃表示，而黑洞猝灭剂2用BHQ2 (Biosearch Technologies, Novato CA)表示。探针中的互补末端核苷酸加下划线。

靶：菌株24609

显示相对于菌株24609的引物和探针位置。在5’末端的下划线序列是过量引物的序列。在3’末端的下划线序列是与限制引物互补的序列。探针1-6的结合位点也指出了，其中“-Q”表示具有BHQ2猝灭剂的探针末端。标明了非互补末端核苷酸(例如，探针4的3’末端的“TAQ”表示非互补T和非互补A。这组中的探针彼此紧邻杂交。探针6重叠过量的引物。

靶：菌株18460

5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGTCCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG (SEQ ID No. 9)

靶：菌株8600

5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCCGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG (SEQ ID No. 10)

靶：菌株14191

5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCGCAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG (SEQ ID No. 11)

靶：菌株17718

5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCTCAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG (SEQ ID No. 12)

靶：菌株13554

5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCTACAAGCGCCGACTGTCGGCGCTGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG(SEQ ID No. 13)

并非菌株24609的每一菌株序列的下划线表示从药物敏感菌株24609的核苷酸改变的位置。

LATE PCR扩增在25 μl体积中进行，所述体积由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、2 mM MgCl2、200 nM dNTP、50 nM限制引物、1000 nM过量的引物、1.5单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、0.24X SYBR?绿(Invitrogen, Carlsbad, CA)、500 nM的所有探针和人基因组DNA的10,000个基因组(Promega, Madison, WI)组成。对于测试的各菌株，使用大约10,000个基因组当量。对于每菌株的扩增反应按一式三份进行。

对在Stratagene MxPro 3500P上针对扩增进行的热分布如下：95℃/3min 1个循环，接着60个循环的98℃/10s-75℃/40s，在每个循环，在FAM通道中采集荧光。这之后是一个于75℃10 min和于25℃10 min的循环。这之后是于25℃开始以30s间隔的1℃增量直至97℃的解链，并在每一度采集荧光。通过解链曲线分析，使用FAM荧光强度对于25℃-97℃之间的温度的一阶导数分析扩增后的探针-靶杂交。

图2表示在55℃-80℃的温度范围内来自样品的荧光特征。圆圈201标明含有药物敏感菌株24609的重复。圆圈202标明含有抗性菌株18460 (D516V，位于氨基酸位置516的天冬氨酸改变为缬氨酸)的重复。圆圈203标明含有菌株8600 (L533P，位于氨基酸位置533的亮氨酸改变为脯氨酸)的3个重复。圆圈204标明含有耐药菌株13554 (H526Y，位于氨基酸位置526的组氨酸改变为酪氨酸)的重复。圆圈205标明含有抗性菌株14191 (H526R，位于氨基酸位置526的组氨酸改变为精氨酸)的重复。圆圈206标明含有抗性菌株17718 (H526L，位于氨基酸位置526的组氨酸改变为亮氨酸)的重复。数据显示所有6株菌株的荧光特征的明显分离。

实施例3

分枝杆菌属成员中的菌种鉴别.

多重LATE-PCR测定被用来提供多个单链靶核酸，以通过使用两个基因(16s核糖体和促旋酶B基因)的组合，将结核分枝杆菌与分枝杆菌属的其它成员区分开。使用双重标记的探针和SYBR?绿提供截然不同的和有差别的荧光特征，该特征将结核分枝杆菌复合菌组的成员与分枝杆菌的其它成员区分开。在该实施例中，杂交通过使用解链曲线分析进行表征。反应组分和条件如下：

用于促旋酶B的引物和探针序列：

限制引物：5’-GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACC 

　　　　　(SEQ ID No. 20)

过量的引物：5’-ATACGGGCTTGCGCCGAGGACAC (SEQ ID No. 21)

促旋酶B On探针#1: 5'- FAM-CGTGTAATGAATAGCTGCG-BHQ1

　　　　　　　　　(SEQ ID No. 22)

促旋酶B On探针#2: 5'-BHQ1-AGGACGCGAAAGTCGTTGCT-C₃- FAM

　　　　　　　　　(SEQ ID No. 23)

促旋酶B Off探针: 5'-BHQ1-TGAACAAGGCT-C₃ (SEQ ID No. 24)

促旋酶B未标记的探针: 5’-CCACTGGTTTGAAGCCAACCCCA-C₃ (SEQ ID No.25)

3个碳的接头由C₃表示，而黑洞猝灭剂2用BHQ1 (Biosearch Technologies, Novato CA)表示。On探针中的互补末端核苷酸加下划线。

gyrB靶序列是：

结核分枝杆菌

显示相对于结核分枝杆菌序列的引物和探针位置。在5’末端的下划线序列是限制引物的序列。在3’末端的下划线序列是与过量的引物互补的序列。指明探针的结合序列，其中“F：表示具有FAM荧光团的探针末端。“-Q” 表示具有BHQ1猝灭剂的探针末端；标明了非互补末端核苷酸(例如，On#1序列的在5’末端的“FCG”表示非互补C和非互补G。我们注意到这组中的探针彼此紧邻杂交。但在未标记的探针的序列和On探针2结合序列之间有两个核苷酸(CC)的缺口。对于在这一点具有C-对-G的差异的亚洲分枝杆菌(见下)，缺口仅是单一核苷酸。

牛分枝杆菌

5'GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTGGGCAACACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAATGAACAGCTGACCCACTGGTTTGAAGCCAACCCCACCGACTCGAAAGTCGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGCGCAAGCCCGTAT (SEQ ID No. 27)

田鼠分枝杆菌

5'GTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTGGGCAACACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAACGAACAGCTGACCCACTGGTTTGAAGCCAACCCCACCGACTCGAAAGTCGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGCGCAAGCCCGTAT (SEQ ID No. 28)

非洲分枝杆菌(与田鼠分枝杆菌相同的序列)

鸟分枝杆菌(M. Avium)

5’GTGAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAACTGGGCAACACCGAGGTGAAGTCGTTCGTGCAGAAGGTGTGCAACGAACAGCTCACCCACTGGTTCGAAGCCAACCCCGCAGACGCCAAAGTCATTGTCAACAAGGCGGTTTCGTCAGCGCAGGCGCGCAT(SEQ ID No. 29)

亚洲分枝杆菌(M. Asiaticum)

5’GTCGCCGAACCCCAGTTCGAGGGCCAGACAAAGACCAAGCTGGGCAACACCGAGGTCAAGTCGTTCGTGCAGAAGGTGTGCAACGAACAGCTCACCCACTGGTTCGAGGCCAATCCGTCGGAAGCCAAAACCGTTGTCAACAAGGCGGTTTCGTCCGCACAGGCCCGGAT (SEQ ID No. 30)

并非结核分枝杆菌的每一菌种的靶序列的下划线表示自结核分枝杆菌序列的核苷酸改变的位置。

对于16s的引物和探针序列为：

限制引物：5’-ACACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCG (SEQ ID No. 31)

过量的引物：5’-GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACG (SEQ ID No. 32)

16s On探针：5'-BHQ1-TTGGCTCATCCCACACCGCTAAAGTGCTTTAA-FAM

　　　　　　 (SEQ ID No. 33)

16s Off探针：5'-BHQ1-CCACCACAAGATATGCGTCTCGTGTTCCTAT-C3 

　　　　　　 (SEQ ID No. 34)

3个碳的接头由C₃表示，而黑洞猝灭剂1用BHQ1 (Biosearch Technologies, Novato CA)表示。On探针中的互补末端核苷酸加下划线。

16s靶序列：

结核分枝杆菌复合菌组的成员(包括结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌和田鼠分枝杆菌)

显示相对于MTB-复合菌组序列的引物和探针的位置。在5’末端的下划线序列是过量引物的序列。在3’末端的下划线序列是与限制引物互补的序列。标明探针的结合位点，其中“F-”表示具有FAM荧光团的探针末端和“-Q”表示具有BHQ1猝灭剂的探针末端。标明了非互补末端核苷酸(例如，“On探针序列的5’末端的F-AA”表示两个非互补A。这组中的两个探针彼此紧邻杂交，即是说，既没有重叠也没有缺口。比较On探针的序列与其MTB-复合菌组结合位点，从结合位点的5’末端的第6个核苷酸(G)为错配，且下一个核苷酸(C)在探针序列中没有对应核苷酸(探针序列具有缺失)。

非结核分枝杆菌复合菌组的分枝杆菌：

亚洲分枝杆菌

5’GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCACGGGATGCATGTCCTGTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGT (SEQ ID No. 36)

鸟分枝杆菌

5’GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTCAAGACGCATGTCTTCTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGT (SEQ ID No. 37)

每个非结核分枝杆菌复合菌组的菌种的靶序列中的下划线表示与结核分枝杆菌复合菌组序列的核苷酸改变的位置。

LATE PCR扩增在25 μl体积中按一式三份进行，所述体积由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、0.24x SYBR?绿、2 mM MgCl₂、300 nM dNTP、50 nM限制引物、1000 nM过量的引物、1.5单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)组成。制备3种独立的混合物：第一混合物仅含促旋酶B探针组：200nM促旋酶B On探针#1、200nM促旋酶B On探针#2、500nM促旋酶B Off探针和1uM促旋酶B未标记的探针。第二混合物仅含16s探针组：200nM 16s On探针和500nM 16s Off探针。第三混合物包含两个探针组(6个探针)。

对在Stratagene MxPro 3005P上针对扩增进行的热分布如下：98℃/3min 1个循环，接着98℃/10s-75℃/40s的60个循环，接着于75℃10 min，接着于25℃10 min，解链于25℃开始以30s间隔的1℃增量直至97℃，并在FAM通道(激发，492nm，发射，516nm)于每一度采集荧光。通过解链曲线分析，使用25℃-95℃之间的温度的一阶导数分析探针-靶杂交。

图3A-C显示混合物的解链导数的结果。图3A表示对包含16s探针的混合物的荧光特征。圆圈300标明MTB-复合菌组靶样品的重复。在该测定中，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌具有相同的荧光特征。圆圈301标明亚洲分枝杆菌的重复。圆圈302标明鸟分枝杆菌的重复。图3B表示含有促旋酶B探针的混合物的荧光特征。圆圈310标明结核分枝杆菌的重复。圆圈311标明田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌的重复。圆圈312标明牛分枝杆菌的重复。圆圈313标明鸟分枝杆菌的重复。圆圈314标明亚洲分枝杆菌的重复。图3C表示包含所有探针的混合物的荧光特征。圆圈320标明田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌的重复，它们分享相同的荧光特征。圆圈321标明牛分枝杆菌的重复。圆圈322标明结核分枝杆菌的重复。圆圈323标明鸟分枝杆菌的重复。圆圈324标明亚洲分枝杆菌的重复。

实施例4

SYBR浓度和猝灭剂类型和数目的作用.

LATE-PCR测定被用来提供单链靶核酸。扩增反应混合物含有两个基因——猿猴分枝杆菌(M. simiae)的16s核糖体和促旋酶B基因，但促旋酶B的引物不扩增这个菌种，所以仅得到16s基因的单链扩增产物。使用双重标记的On探针与SYBR?绿提供基于所用猝灭剂的组合和类型的截然不同的和有差别的荧光特征。在该实施例中，通过使用解链曲线分析表征杂交。反应组分和条件如下：

促旋酶B限制引物、过量的引物和探针与实施例3中相同。未从基因库获得猿猴分枝杆菌的促旋酶B靶序列。

16s的引物和探针序列是：

限制引物：与实施例3中的相同

过量的引物：与实施例3中的相同

16s On探针：(与实施例3中的相同)

　　 5'-BHQ1-TTGGCTCATCCCACACCGCTAAAGTGCTTTAA-FAM (SEQ ID No. 33)

含黑洞猝灭剂1的16s Off探针：(与实施例3中的相同)

　　 5'-BHQ1-CCACCACAAGATATGCGTCTCGTGTTCCTAT-C3  (SEQ ID No. 34)

含一个DABCYL (D)的16s Off探针：

　　 5'-DABCYL-CCACCACAAGATATGCGTCTCGTGTTCCTAT-C3 (SEQ ID No. 34)

含两个DABCYL (DD)的16s Off探针：

　　 5'-DABCYL- CCACCACAAGATATGCGTCTCGTGTTCCTAT-DABCYL (SEQ ID No. 34)

3个碳的接头由C₃表示，而黑洞猝灭剂1用BHQ1 (Biosearch Technologies, Novato CA)表示。On探针中的互补末端核苷酸加下划线。

16s靶序列：

猿猴分枝杆菌

显示相对于靶序列的引物和探针的位置。在5’末端的下划线序列是过量引物的序列。在3’末端的下划线序列是与限制引物互补的序列。标明探针的结合位点，其中“F-”表示具有FAM荧光团的探针末端和“-Q”表示具有猝灭剂的探针末端。所示Off探针是具有单一5’猝灭剂的两个变体。标明了非互补末端核苷酸(例如，“On探针序列的3’末端的F-AA”表示两个非互补A。这组中的两个探针彼此紧邻杂交，即是说，既没有重叠也没有缺口。

LATE-PCR扩增在25 μl体积中按一式三份进行，所述体积由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、2 mM MgCl₂、300 nM dNTP、50 nM限制引物、1000 nM过量的引物、1.5单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、得自两个探针组的200nM On探针、500nM gyrB Off探针、500nM的一个版本的16s Off探针、1uM未标记的寡核苷酸(oligo)组成。制备具有最终浓度分别为0.12x、0.24x和0.48x的SYBR?绿的3种独立的混合物。这些混合物的每一种再进一步非细分为一种具有用单一DABCYL (5’末端)标记的16s Off探针的混合物、具有在5’和3’末端用两个DABCYL标记的16s Off探针的第二混合物和具有用单一黑洞猝灭剂(BHQ1)标记的16s Off探针的第三混合物。

对在Stratagene MxPro 3005P上针对扩增进行的热分布如下：98℃/3min 1个循环，接着98℃/10s-75℃/40s的60个循环，接着于75℃ 10 min，接着于25℃ 10 min，解链于25℃开始以30s间隔的1℃增量直至99℃，并于每一度采集荧光(激发，492nm，发射，516nm)。通过解链曲线分析，使用25℃-95℃之间的温度的一阶导数分析探针-靶杂交。

图4A-4F表示在FAM通道的读数获得的结果。荧光轮廓(强度读数)在图4D-4F中呈现。相应的一阶导数曲线在图4A-4C中呈现。如在图中指出的，图4A和4D是含有0.48x SYBR?绿的混合物；图4B和4E是含有0.24x SYBR?绿的混合物；和图4C和4F是含有0.12x SYBR?绿的混合物。曲线401、404、407、411、414和417是含有含单一DABCYL的16s Off探针的混合物。曲线402、405、408、412、415和418是含有含两个DABCYL的16s Off探针的混合物。曲线403、406、409、413、416和419是含有含单一BHQ1的16s Off探针的混合物。

实施例5

含有含染料猝灭荧光标记的On探针和未标记探针以及仅猝灭剂探针的探针组。

该实施例在rpoB基因的药物敏感性和突变体靶菌株、过量的和限制引物、SYBR?绿染料和6个探针的序列方面类似于实施例2，但为了比较的目的，实施例2的6个仅猝灭剂(“Off”)探针中的一些通过添加末端Quasar 670荧光团(当与SYBR?绿染料一起使用时为染料猝灭荧光标记)转化为On探针，或者通过除去猝灭剂部分转化为未标记的探针。对几个修饰的探针组测试了它们将药物敏感的结核分枝杆菌菌株与由于rpoB基因靶序列中的点突变而对抗生素利福平耐药的菌株区分开的能力。

LATE-PCR扩增使用单一引物对进行，以扩增各株结核分枝杆菌的rpoB基因的150个碱基对区域。扩增提供101个碱基长的单链靶(过量的引物链)，其包括已知含有负责对利福平耐药性的突变的RRDR区域。扩增后，每个单链核酸靶序列使用6个探针(其存在于原始扩增反应混合物)的4个不同组之一探测。

所有4个探针组跨越单链核酸靶序列的101个碱基对。使用3类探针的组合：也用荧光标记标记的猝灭剂探针(“On探针”)、仅猝灭剂探针(“Off探针”)和未标记的探针。每个On探针是含有2个核苷酸长的茎的分子信标，并在寡核苷酸的相对两端上用Quasar 670和非荧光猝灭剂部分BHQ2 (Biosearch Technologies, Novato CA)双重标记。每个Off探针仅用BHQ2进行末端标记。每个不具有3’标记的探针具有用碳接头阻断以防止延伸的3’核苷酸。在这个实施例中，不同的探针组被用来检查用On探针取代实施例2中的一些Off探针的影响并检查一个或多个较不昂贵的未标记的探针是否能够取代一个或多个On探针，而不损害探针组区分两株结核分枝杆菌的能力。

在扩增结束时，分析作为温度的函数的探针-靶杂交。在该实施例中，通过使用解链曲线分析表征杂交。反应组分和条件如下：

限制引物：5’ CTCCAGCCAGGCACGCTCACGTGACAGACCG (SEQ ID No. 6)

过量的引物：5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAG (SEQ ID No. 7)

Off探针序列；

探针1

5’- BHQ2-CTGGTTGGTGCAGAAG-C₃ (SEQ ID No. 14 )

探针3

5’- BHQ2-CAGCGGGTTGTT-C₃ (SEQ ID No. 16)探针6

5’- ACAGACCGCCGG- BHQ2 (SEQ ID No. 19)

On探针序列；

探针2

5’-BHQ2 –TCAGGTCCATGAATTGGCTCAGA-Quasar 670 (SEQ ID No. 15)

探针4

5’-BHQ2 –ATGCGCTTGTGGATCAACCCCGAT-Quasar 670 (SEQ ID No. 17)

探针5

5’-Quasar 670 –AAGCCCCAGCGCCGACAGTCGTT-BHQ2 (SEQ ID No. 18)

未标记的探针序列；

探针2-U，探针2的未标记的版本：

5’- TCAGGTCCATGAATTGGCTCAGA- C₃ (SEQ ID No. 15)

探针4-U，探针4的未标记的版本：

5’-ATGCGCTTGTGGATCAACCCCGAT- C₃ (SEQ ID No. 17)

探针5-U，探针5的未标记的版本：

5’-AAGCCCCAGCGCCGACAGTCGTT-C₃ (SEQ ID No. 18)

在探针序列中，3个碳的接头(其阻断探针的延伸)由C₃表示，而黑洞猝灭剂2用BHQ2表示。同样在探针序列中，形成两个碱基对分子信标茎的末端核苷酸加下划线。

靶：菌株8600(L533P)

5’CCGGTGGTCGCCGCGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTCGGCGCCGGGGCCCGGCGGTCTGTCACGTGAGCGTGCCTGGCTGGAG

 (SEQ ID No. 10)

靶：菌株24346 (野生型) (与实施例2中的靶菌株24609相同的序列)

菌株8600的序列中的下划线，出现在探针5 (On #5)结合位点中，表示与药物敏感菌株24346的核苷酸改变的位置。显示相对于菌株24346的引物和探针的结合位点。在5’末端的下划线序列是过量引物的序列。在3’末端的下划线序列是与限制引物互补的序列。6个探针的结合位点在靶序列之上和之下的箭头()之间。对于每个探针，存在猝灭剂(Q)的指示。对于每个On探针，存在荧光团(F)的指示。在探针具有一个或多个连接荧光团或猝灭剂的非互补核苷酸时，那些核苷酸已标示；例如，在On探针#2中，存在连接荧光团的非互补3’-末端核苷酸A，所以有指示“F-A”指明这一点。我们注意到不是所有的探针完全地互补于其靶上(即箭头之间)的结合位点。Off探针#1具有两个错配；On探针#2具有一个错配；和On探针#4具有一个错配。为有助于比较，探针编号与实施例2相同，即是说，此处的探针号1对应于实施例2中的探针号1。

LATE PCR扩增在25 μl体积中进行，所述体积由1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、2 mM MgCl₂、200 nM dNTP、50 nM限制引物、1000 nM过量的引物、1.5单位的Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)、0.24X SYBR?绿(Invitrogen, Carlsbad, CA)，500nM的探针1、3和5和200 nM的探针2、4和6(无论是标记的还是未标记的)组成。对于测试的各菌株，使用大约10,000个基因组当量。对于每菌株的扩增反应按一式三份进行。反应用6个探针的不同组进行。第一探针组包含如上所述的3个Off探针(探针1、3和6)和3个On探针(探针2、4和5)。对于第二探针组，On探针2转化为未标记的寡核苷酸。对于第三探针组，On探针2和4二者均转化为未标记的寡核苷酸。对于第四探针组，所有3个On探针2、4和5均转化为未标记的寡核苷酸。

用于扩增反应的热分布如下：95℃/3min 1个循环，接着98℃/10s-75℃/40s的60个循环，这之后是于75℃10 min和于25℃10 min的一个循环，这之后是于25℃开始以30s间隔的1℃增量直至97℃的解链，并在每一度采集荧光。使用Stratagene Mx3005P进行反应，对于Quasar 670在635-665nm和对于Fam在492-516nm分别地激发和发射。

扩增后的探针靶杂交的分析通过解链曲线分析进行，其结果表示为在图5，小图A-H中的荧光特征(一阶导数)。左栏的小图(图5，小图A、C、E、G)为来自SYBR/FAM通道的读数。右栏的小图(图5，小图B、D、F, H)为来自Quasar 670通道的读数，其中非重叠的Quasar荧光团被直接激发。图5小图A和B是来自含有第一组探针(3个Off探针和3个On探针，如在小图的上部图例中所注明的)的反应。图5小图C和D是来自含有第二组探针(3个Off探针，两个On探针，一个未标记的探针)的反应。图5小图E和F是来自含有第三组探针(3个Off探针，一个On探针，两个未标记的探针)的反应。图5小图G和H是来自含有第四组探针(3个Off探针，0个On探针，3个未标记的探针)的反应。在图5中，圆圈501、503、505、507、509、511鉴定野生型药物敏感菌株的曲线；和圆圈502、504、506、508、510、512鉴定在On探针5下具有L533P突变的菌株的曲线。

实施例6

作为用于芯片上PCR的 SYBR?绿的载体的双链寡核苷酸

该实施例显示SYBR?绿(一种DNA结合染料)在微流体装置中进行的PCR扩增中的应用。在此描述的方法使用过量的双链DNA寡核苷酸，其用作结合的染料的贮库，所述染料从而被防止粘附到装置壁上并可用来结合在扩增和检测期间产生的双链，包括PCR扩增的双链产物和探针-靶杂合体。

我们制作用于该实施例的微流体装置。如于图6中所示，装置包括“芯片” 500加各种可控的入口和出口(I/O)端口。芯片600包含两层聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)，每层约5mm厚，含有各种下述的通道和室。一层为“流动”层；另一层为“控制”层。流动通道611、612和孔613在流动层中并与56个也在该层的反应室613连通。控制通道607、608和610和贮库通道609在控制层中，控制层在图6中在流动层的下面并结合于载玻片。控制通道608控制反应室613是否对流动打开或关闭。两个层被15 μm PDMS可变形膜(未显示)隔开。当正压施加于控制通道时，在其控制通道(在一侧)和流动通道(在另一侧)的交叉处的膜，变形并关闭那个流动通道。当所有的反应室或孔具有相同的反应混合物时，I/O端口601将扩增试剂供给所有流动通道。然而，当孔613的不同的排具有不同的反应混合物时，I/O端口602供应该混合物。I/O端口603允许通过允许或防止经加压的流体停留在控制通道607来调节那个控制供应通道中的压力，从而控制I/O端口602是否打开或关闭。类似地，I/O端口606允许通过允许或防止经加压的流体停留在控制供应通道610来调节那个控制供应通道中的压力，从而控制I/O端口606是否打开或关闭。I/O端口604类似地允许调节控制通道608中的压力以打开和关闭反应室613。I/O端口605控制向贮库通道609的流动。

流动通道611、612的宽度是150μm。流动通道的高度是15-17μm。控制通道607、610的宽度是200μm。在方向上与贮库通道609平行的控制通道608的宽度是200μm。在方向上与贮库通道609垂直的控制通道608的宽度是75μm。控制通道的高度是30μm。贮库通道609的宽度是75μm。贮库通道的功能是将水(H₂O)通过扩散经由PDMS而供应到其上面的层。反应室613的直径是300μm。它们的高度是100 μm。

LATE-PCR扩增在示于图6中的装置中于PCR孔中进行，这通过该装置放置在平坦表面PCR机(Advalytix AmpliSpeed Slide Cycler (Beckman Coulter Biomedical GmbH, Munich, Germany))上进行。示于图6中的装置具有8个反应室一排的排列，所述反应室被用来在下述的3个条件的每一个条件下，进行8个重复反应。

引物、探针和靶序列：

限制引物：5’-CTGTGCCCTTACATAGTCTAACAGT- 3’ (SEQ ID No. 40)

过量的引物：5’-ATCGACTTCTTCCACCT -3’ (SEQ ID No. 41)

分子信标探针: 

　　　　　　　(SEQ ID No. 41)

形成探针茎的互补核苷酸加下划线示出。

靶：

在靶的3’末端的下划线核苷酸与限制引物互补。最接近5’末端的下划线序列是过量引物的序列。探针结合位点也被标明。

一系列样品经受LATE-PCR扩增。第一样品含500nM分子信标探针但不含靶序列，即是说，无模板对照(NTC)。第二样品含有500 nM分子信标探针和1,000个靶拷贝。第三样品含有500 nM分子信标探针和0.96x SYBR?绿，但不含靶序列，即另一个NTC。第四样品含有500nM分子信标探针、0.96x SYBR?绿和1,000个拷贝的靶DNA。第五样品含有0.96x SYBR?绿，但不含靶序列，即另一个NTC。第六样品含有0.96x SYBR?绿和1,000个拷贝的靶DNA，但不含分子信标探针。LATE-PCR扩增使用示于图6中的微流体芯片进行，所述芯片含有1X PCR缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)、3mM MgCl2、200nM dNTP、100nM限制引物、1000nM过量的引物、2mg/ml BSA、150mM海藻糖、0.2% Tween-20和2U Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)以及上述的6个样品之一。

将6种反应混合物中的每一种用10 psi的压力通过试剂入口——I/O端口102填充到芯片的反应室排中。每个样品按一式八份处理。出口阀以25 psi的压力关闭，同时填充样品。一旦所有孔都被完全填满，用25 psi压力加载控制通道608以封闭PCR反应。然后，以10 psi压力给贮库充水，以补尝在PCR循环期间，在PCR室613中经由PDMS耗散的水。扩增反应的热分布是95℃持续5分钟，接着是95℃ 10 sec、58℃ 20 sec和72℃ 30 sec的70个循环。在所有反应室中的荧光水平使用Olympus IX70荧光显微镜同时观察。在荧光通道FITC (激发波长485/20nm和发射波长521/20nm)对SYBR信号和在通道Cy3 (激发波长560/25 nm和发射波长607/25 nm)对Quas670分子信标探针信号拍摄图像。在室温下第一次平衡微流体装置10分钟之后，在扩增反应之前和扩增反应之后拍摄荧光图像。

荧光图像示于图7，小图A-D中。所有图像以相同参数设置拍摄并在图像处理时归一化至相同的范围。小图A显示PCR之前的分子信标探针信号；小图B显示PCR之后的分子信标探针信号：小图C显示PCR之前的SYBR信号；和小图D显示PCR之后的SYBR信号。在图像中，排701是含500nM分子信标探针，但不含靶序列的第一样品(NTC)；排702是含500 nM分子信标探针和靶DNA的1,000个拷贝的第二样品；排703是含500 nM分子信标探针、0.96x SYBR?绿但不含靶的第三样品(另一个NTC)；排704是含500nM分子信标探针、0.96x SYBR和DNA靶序列的1,000个拷贝的第四样品；排705是含0.96x SYBR?绿，但不含靶序列的第五样品(NTC)；排706是含0.96x SYBR?绿和DNA靶序列的1,000个拷贝，但不含分子信标探针的第六样品。

如小图A所示，分子信标探针在任何样品中在PCR之前没有荧光。相比之下，在图2B中，在PCR之后，含分子信标探针和DNA靶序列的两个样品(排702、704)显示荧光，指明PCR对这两个样品起作用。对于SYBR?绿信号，小图C显示所有4个含有SYBR?绿的样品(排703-706)在PCR之前显示或多或少的SYBR信号，即使是NTC样品(排703、705)。这表明SYBR?绿染料和PDMS表面之间的相互作用，其导致产生荧光。在PCR之后，小图D显示，含有SYBR?绿加分子信标以及靶的第四样品(排704)显示处于比在PCR之前的荧光更强的水平的荧光。相比之下，对于第6个含有SYBR?绿和靶但不含分子信标探针的样品，SYBR信号消失，如不含分子信标探针的所有样品所显示的那样。

Claims (25)

1. 一种分析作为温度函数的包含在至少一个核酸靶链的拷贝中的至少一个核酸靶序列的核酸含量的均相方法，其包括

a) 提供含有所述至少一个呈单链形式的核酸靶链的拷贝的样品，所述拷贝具有与它们的互补核酸链有关的解链温度；

b) 使所述单链拷贝与双链DNA结合染料(dsDNA-染料)和探针组接触，所述探针组包括至少一个与所述至少一个靶序列互补并用至少一个非荧光部分标记的杂交探针，所述非荧光部分为dsDNA-染料的猝灭剂；

c) 在低于所述拷贝的解链温度的多个温度，使样品经受在适合于刺激染料的波长下的激发并在适合于检测来自dsDNA-染料的发射的波长下检测发射；和

d) 比较检测的发射与从至少一个其序列或性质已知的靶序列获得的相应的发射。

2. 权利要求1的方法，其中dsDNA-染料是SYBR?绿。

3. 权利要求1的方法，其中探针组包括原位探针。

4. 权利要求1的方法，其中样品在跨越步骤b)中形成的探针-靶杂合体的解链温度的温度范围内经受解链或退火。

5. 权利要求4的方法，其中所述温度范围包括所述拷贝的解链温度。

6. 权利要求4的方法，其中发射作为在解链或退火期间的荧光轮廓检测并且比较包括比较荧光轮廓或其导数(荧光特征)，或二者。

7. 权利要求6的方法，其中用于所述至少一个靶序列的探针组为多探针组，其包括至少一个双重标记的荧光探针，该探针在未杂交时猝灭，但当杂交时发出荧光。

8. 权利要求7的方法，其中所述至少一个双重标记的探针包括其发射不能与染料区分的荧光部分。

9. 权利要求8的方法，其中dsDNA-染料是SYBR?绿和荧光部分是FAM。

10. 权利要求7的方法，其中所述至少一个双重标记的探针包括其发射在光谱上不同于dsDNA-染料的发射的荧光部分，和其中步骤c)包括使样品经受在适合于刺激荧光部分的波长下的激发并检测在适合于检测来自荧光部分的发射的波长下的发射。

11. 权利要求10的方法，其中步骤d)包括比较检测的来自荧光部分的发射与从至少一个其序列或性质已知的靶序列获得的相应的发射。

12. 权利要求1的方法，其中所述至少一个核酸靶序列通过在反应混合物中进行非对称扩增反应来提供，所述反应混合物包含所述至少一个靶序列或其互补序列、用于所述靶序列的过量的引物和限制引物、dNTP、热稳定的DNA聚合酶、dsDNA-染料和用于所述至少一个靶序列的探针组。

13. 权利要求12的方法，其中非对称扩增反应为PCR反应。

14. 权利要求13的方法，其中PCR扩增反应为LATE-PCR反应。

15. 权利要求13的方法，其中dsDNA-染料是SYBR?绿。

16. 权利要求13的方法，其中所述至少一个非荧光猝灭部分是黑洞猝灭剂。

17. 权利要求13的方法，其中用于所述至少一个靶序列的探针组为多探针组，其包括至少一个双重标记的荧光探针，该探针在未杂交时猝灭，但当杂交时发出荧光。

18. 权利要求17的方法，其中所述至少一个双重标记的探针包括其发射不能与染料区分的荧光部分。

19. 权利要求18的方法，其中dsDNA-染料是SYBR?绿和荧光部分是FAM。

20. 权利要求17的方法，其中所述至少一个双重标记的探针包括其发射在光谱上不同于dsDNA-染料的发射的荧光部分，和其中步骤c)包括使样品经受在适合于刺激荧光部分的波长下的激发并在适合于检测来自荧光部分的发射的波长下检测发射。

21. 权利要求20的方法，其中步骤d)包括比较检测的来自荧光部分的发射与从至少一个其序列或性质已知的靶序列获得的相应的发射。

22. 权利要求13的方法，其中所述至少一个靶序列包含至少两个靶序列，扩增反应混合物包括用于各个靶序列的过量的引物、限制引物和探针组。

23. 一种用于依据权利要求12的方法扩增和分析至少一个靶序列的试剂的试剂盒，所述试剂盒包含用于所述至少一个靶序列的过量的引物和限制引物、dNTP、热稳定的DNA聚合酶、dsDNA-染料和多探针组，所述多探针组包括至少一个与所述至少一个靶序列互补并仅用至少一个为用于dsDNA-染料的猝灭剂的非荧光部分标记的杂交探针并且包括至少一个与所述靶序列互补的双重标记的荧光探针杂交探针，所述探针在未杂交时猝灭，但当杂交时发出荧光，并且包括其发射不能与染料区分的荧光部分。

24. 权利要求23的试剂盒，其中dsDNA-染料是SYBR?绿和荧光部分是荧光团FAM。

25. 权利要求23的试剂盒，其中试剂盒包含用于原位探针的成分，所述成分包含限制引物，所述限制引物具有包含与所述至少一个靶序列相同的序列的延伸，其中所述延伸的互补体当杂交于所述至少一个靶序列时，可通过DNA聚合酶延伸。