ES2537625T3 - Método para hibridar ácidos nucleicos - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar un ácido nucleico diana en una muestra, mediante hibridación con un conjugado de oligonucleótido-oligocatión, que comprende permitir que dicho ácido nucleico reaccione con un conjugado de oligonucleótido-oligocatión que comprende al menos restos Ai y Bj enlazados juntos directamente o vía un ligador, en el que · Ai es un oligonucleótido i-mero, con i >= 3 a 50, en el que Ai es un oligómero con nucleobases de origen natural o no natural y/o grupos pentafuranosilo y/o enlaces de fosfodiéster nativos, que comprende opcionalmente un grupo marcador, · Bj es un resto oligocatiónico orgánico j-mero, con j >= 1 a 50, en el que B es HPO3-R1-(NH-R2)n-NH-R3-O-, en el que R1, R2 y R3, idénticos o diferentes, son un radical alquileno de C1-C6, lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente sustituido, siendo los restos NH-R2 idénticos o diferentes cuando n es >1; HPO3-R1-CH(X)-R3-O-, en el que R1 y R3, idénticos o diferentes, son un radical alquileno de C1-C6, lineal, ramificado o cíclico, opcionalmente sustituido, y X es putrescina, espermidina o un resto de espermina, en el que la estructura de dicho conjugado es la estructura IV R4-Bj-3'Ai 5'-R6 en la que - R4 y R6, idénticos o diferentes, son H o un ligador, un desactivador, un marcador, un grupo cromóforo o fluoróforo, biotina, cadena hidrófoba, derivado de colesterol, antígeno, proteína, péptido, azúcar, o grupo fosfato; en el que dicho ácido nucleico diana es una secuencia específica en un genoma completo; y en el que dicho método comprende - usar dicho conjugado como una sonda de hibridación o sonda marcada dualmente en un ensayo de PCR en tiempo real que comprende una ADN o ARN polimerasa en presencia de dicho genoma completo.
Description
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oligonucleótidos.
La química clásica de alargamiento mediante DMT y fosforamidito se implementa ventajosamente junto con grupos protectores de TFA lábiles a bases. Otras características y ventajas de la solicitud o invención se dan en los siguientes ejemplos, en los que se hace
referencia a las Figuras 1 a 9, que representan, respectivamente: -Figura 1, la estructura de un conjugado de oligonucleótido-oligocatión; -Figura 2, resultados obtenidos con cebadores de la solicitud en PCR de gradiente convencional; -Figura 3, resultados obtenidos con cebadores de la solicitud a temperatura de hibridación elevada y baja
concentración de sal (MgCl2) en experimentos de PCR en tiempo real; -Figura 4, resultados obtenidos con dichos cebadores a baja concentración en experimentos de PCR en tiempo real; -Figura 5, resultados obtenidos con dichos cebadores en un contexto rico en AT en experimentos de PCR en
tiempo real; -Figura 6, resultados obtenidos en RT-qPCR sobre ADNc cebado con un cebador de la solicitud; -Figura 7, características de la fluorescencia y resultados obtenidos con sondas fluorógenas marcadas de
forma dual de la invención en un ensayo de nucleasa de 5’; -Figura 8, resultados obtenidos con sondas de hibridación fluorescentes de la solicitud en PCR en tiempo real; -Figura 9, resultados obtenidos con una sonda fluorescente de la solicitud usada para detectar un ácido
nucleico diana inmovilizado sobre un soporte sólido. En los siguientes ejemplos, “S” designa un resto de espermina de estructura: -HPO3-(CH2)4-NH2+-(CH2)3-NH2+-(CH2)4-NH2+-(CH2)3-NH2+-(CH2)4-O-, y Sn indica el número de restos de
espermina, con n = 1 a 50. -“Nm” designa un oligonucleótido m-mero.
Ejemplo 1: Estructura de un conjugado de oligonucleótido-oligocatión de la solicitud
La síntesis se lleva a cabo según el documento WO 2007/069092, y la estructura del conjugado de oligonucleótidooligocatión se ilustra en la Figura 1.
Ejemplo 2: Uso de conjugados de oligonucleótido-oligocatión como cebadores de PCR
Dos parejas de cebadores de oligonucleótido-oligocatión específicos para los genes E7 y L1 del virus del papiloma humano tipo 16 (HPV16) se compararon con sus equivalentes estándar (oligonucleótidos no conjugados). Las moléculas de la solicitud también se compararon con cebadores modificados con ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
Las secuencias de los cebadores de E7 proceden de Hesselink et al., 2005. Las secuencias de los cebadores de L1
se adaptan de de Roda Husman et al., 1995. El par de cebadores de E7 (46% y 48% de GC) y el par de cebadores de L1 (30% y 20% de GC) ilustran dos contenidos de GC diferentes.
Como ADN genómico diana, se usó ADN genómico de células SiHa (carcinoma cervical, ATCC HTB35) que contiene 1 a 2 copias de HPV16 integrado. El ADN genómico de células A549 (carcinoma de pulmón, ATCC CCL185), que no contiene el virus, se usó como control negativo.
Los cebadores de la solicitud son ejemplos de estructura I.
Secuencias de los oligonucleótidos estándar (cebadores de E7) Cebador directo de SEC ID Nº1 (E7F): 5’-GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT-3’ Cebador inverso de SEC ID Nº2 (E7R): 5’-GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA-3’
Secuencias de los conjugados de oligonucleótido-oligocatión según la solicitud (cebadores de S4-E7) Cebador directo de SEC ID Nº3 (S4-E7F): 5’-S4 – GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT-3’
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Los resultados dados en la Figura 2c muestran que la ganancia en temperatura se puede modular con el número de esperminas conjugadas al oligonucleótido.
Las moléculas de la solicitud se evaluaron para determinar su uso como cebadores en experimentos de PCR en tiempo real. Los conjugados de los cebadores se han comparado con sus equivalentes estándar sin modificar, así como con cebadores que contienen LNA.
Todas las reacciones se han llevado a cabo en un instrumento Rotor-gene 6000 (Corbett) en un volumen final de 10 l. Las reacciones se llevaron a cabo usando el kit de ADN Sensimix NoRef (Quantace) a una concentración final de 0,5X.
La eficiencia y sensibilidad se evaluaron amplificando diluciones en serie de ADN genómico de células diana positivas para HPV16 (células SiHa) aplicadas en 10 ng de ADN genómico de control, es decir, 3000 genomas de células negativas para HPV (células A549).
Las muestras se amplificaron en diversas condiciones de temperatura de hibridación, concentración de MgCl2 o concentración de cebadores, usando SYBR Green I para la detección.
Figura 3: Efectos de la concentración de MgCl2 y de la temperatura de hibridación sobre la amplificación en tiempo real.
Las reacciones se llevaron a cabo en 10 ng de ADN genómico diana y con 100 nM de cada cebador. La concentración final de MgCl2 fue 1,5 mM o 3 mM, según se indicó. Un comienzo caliente de 10 min. a 95ºC fue seguido de 45 ciclos de 94ºC durante 20 s, 63ºC (a) o 66ºC (b) durante 20 s y 72ºC durante 15 s.
Como se muestra en la Figura 3a, las moléculas de la solicitud (S4-E7) son óptimas cuando se hibridan a 63ºC en 1,5 mM de MgCl2. De forma comparativa, los cebadores estándar y los cebadores que contienen LNA son ineficaces, como se muestra mediante el incremento en el umbral de ciclo (16 para conjugados de la solicitud), 33 para cebadores estándar y 24 para cebadores que contienen LNA). El incremento de la concentración de MgCl2 mejora los comportamientos de los cebadores estándar y cebadores que contienen LNA. También resulta de dicha Figura 3 que es necesaria una menor temperatura de hibridación con cebadores estándar y con cebadores que contienen LNA, mientras que dichos conjugados de S4-E7 se comportan eficientemente a 63ºC.
Como se muestra en las Figuras 3b y 3c, a concentraciones fijas de cebadores (100 nM) y concentraciones bajas de MgCl2 (1,5 mM), se pueden detectar hasta 3 copias de la diana con dichos conjugados de S4-E7, con una reproducibilidad, especificidad y eficiencia elevadas a una temperatura de hibridación de 66ºC.
Las amplificaciones específicas, eficientes y sensibles se obtienen con los conjugados de cebadores de la solicitud, a una temperatura o condiciones de MgCl2 generalmente subóptimas para los cebadores estándar y cebadores que contienen LNA.
El efecto de la concentración de cebador se ilustra mediante la Figura 4.
Figura 4a: Se amplificaron diluciones en serie de 10 veces de ADN genómico diana con 10 nM de conjugados de cebadores de la solicitud en 1,5 mM de MgCl2.
Figura 4b: Se amplificaron 2 ng de ADN genómico diana aplicado en 10 ng de ADN genómico de control, usando cantidades variables de cebadores: 10, 20 y 30 nM de conjugados de cebadores de la solicitud (panel superior); 10, 25 y 50 nM para cebadores estándar (panel central) y cebadores que contienen LNA (panel inferior). La concentración de MgCl2 fue 1,5 mM para conjugados de la solicitud, y 3 mM para cebadores estándar y cebadores que contienen LNA.
Las amplificaciones se llevaron a cabo según lo siguiente: 95ºC durante 10 min., seguido de 45 ciclos de 95ºC durante 10 s, 60ºC durante 1 min.
La Figura 4a muestra que 10 nM de moléculas cebadoras de la solicitud realizan amplificaciones eficientes y sensibles en reacciones de PCR de dos etapas. De hecho, se detectan cuantitativamente 3 copias de la diana. Como se muestra en la Figura 4b, la reducción en la concentración de cebadores no induce un incremento en el valor de Ct. Solamente se disminuye la cantidad final de amplicón en el punto final de la reacción. De forma comparativa, 50 nM de oligonucleótidos estándar o de cebadores que contienen LNA, en 3 mM de MgCl2, no es suficiente para amplificar la diana de forma óptima como lo hacen los cebadores conjugados.
Ventajosamente, los conjugados de los cebadores de la solicitud muestran una mayor afinidad por su diana, permitiendo su uso a una concentración baja de MgCl2 en comparación con oligonucleótidos estándar y cebadores que contienen LNA. Dichas moléculas permiten una reducción de la concentración de cebadores hasta 10 veces en comparación con oligonucleótidos estándar y cebadores que contienen LNA, sin pérdida de sensibilidad, eficiencia, especificidad o reproducibilidad.
Como se muestra en la Figura 5, las moléculas cebadoras de la solicitud mejoran la PCR en secuencias ricas en AT.
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al., 1995). Si ambos marcadores están suficientemente próximos en disolución, la energía emitida por el fluoróforo excitado es absorbida por el desactivador a través del proceso de FRET (transferencia de energía de fluorescencia), conduciendo a una señal de fluorescencia baja. Durante la reacción de PCR basada en el método de nucleasa de 5’ (Holland et al., 1991), la sonda se une al amplicón en cada etapa de hibridación. Cuando uno de los cebadores se alarga mediante la Taq ADN polimerasa, la sonda se desplaza desde la hebra del molde y es hidrolizada por la actividad de polimerasa 5’-3’ exonucleasa. La escisión conduce a la liberación del informador fluorescente y provoca el incremento en la intensidad de fluorescencia, proporcional a la cantidad de producto de PCR generado.
Los conjugados de oligonucleótido-oligocatión de la invención se evaluaron para determinar su uso como sondas de detección de PCR en tiempo real en un ensayo de nucleasa de 5’ diseñado para amplificar el gen del Factor V humano. Como modelo para evaluar la capacidad de dichas sondas para el genotipado de SNP (polimorfismo de un solo nucleótido), se usó la mutación G1691A de Leiden en el gen del Factor V humano.
Las secuencias de las sondas y de los cebadores se adaptaron de Luderer et al., 2004.
Dos oligonucleótidos que contienen 17 y 22 restos nucleotídicos se conjugaron con 4 restos de espermina en su extremo 3’. Dichos conjugados se marcaron en 5’ con una 6 carboxifluoresceína (6-FAM, Sigma) y con un Black Hole Quencher™ (BHQ-1™, Glen Research) ligados al oligocatión. Esta sonda fluorógena marcada dualmente de la invención se comparó con sus equivalentes no conjugados a oligocatión.
Todas las sondas se diseñaron para detectar el alelo de tipo salvaje. Se extrajo ADN de tipo salvaje y de Leiden del Factor V a partir de las estirpes celulares A549 (ATCC CCL-185) y GM14899 (Coriell Institute), respectivamente.
Las sondas marcadas dualmente de la invención son ejemplos de estructura IV.
Secuencias de los cebadores
Cebador directo de SEC ID Nº15: 5’-GCC TCT GGG CTA ATA GGA CTA CTT-3’
Cebador inverso de SEC ID Nº16: 5’-TT CTG AAA GGT TAC TTC AAG GAC AA-3’
Secuencias de las sondas
-Secuencia de la sonda según la invención:
SEC ID Nº15 (F-N17S4): 5’ 6-FAM -ACC TGT ATT CCT CGC CT -S4 BHQ-1
S4 = 4 restos de espermina
-Secuencia de las sondas estándar
SEC ID Nº17 (F-N17): 5’ 6-FAM -ACC TGT ATT CCT CGC CT -BHQ-1
SEC ID Nº18 (F-N22): 5’6-FAM -ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCC A-BHQ-1
El sitio de SNP está subrayado.
Se realizaron reacciones de PCR en un instrumento Rotor-gene 6000 (Corbett) en un volumen final de 10 l. Como molde, se usaron 10 ng de ADN genómico de tipo salvaje (b), diluciones en serie de 10 veces de ADN genómico de tipo salvaje aplicado en 10 ng de ADN de control (c), y 10 ng de ADN genómico de tipo salvaje o mutante (d). Las mezclas de reacción finales contenían 2,5 l del kit de PCR Sensimix NoRef (Quantace), 200 nM de cada cebador y 200 nM de sonda. La concentración final de MgCl2 fue 3 mM. Como control negativo (ADN no diana), se usó ADN de esperma de salmón.
La fluorescencia de fondo pura medida al comienzo de la reacción de PCR por el instrumento es una indicación de la eficiencia autodesactivante de la sonda marcada dualmente. Como se muestra en la Figura 7a, la sonda conjugada de la invención (F-N22S4) muestra una mejor desactivación de la fluorescencia que su equivalente estándar (F-N22) (valores de la fluorescencia de fondo: 4,8 frente a 24 unidades). La desactivación depende de la proximidad física de los dos colorantes. Al plegar el polinucleótido debido a interacciones electrostáticas, el policatión se aproxima al par fluoróforo/desactivador unido terminalmente. Las moléculas de la invención son sondas valiosas marcadas dualmente con características desactivantes mejoradas.
La Figura 7b muestra los comportamientos comparados de la sonda según la invención y su equivalente estándar en ensayo de nucleasa de 5’. La sonda conjugada muestra una mayor relación señal a ruido, conduciendo a una detección más temprana (2,5 ciclos) y a una mayor fluorescencia de punto final.
De este modo, las sondas según la invención muestran una mayor sensibilidad para detectar sus dianas.
Se comparó entonces una sonda conjugada corta (17-mero, F-N17) con una sonda estándar larga (22-mero, F-N22).
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