ES2946232A1 - SISTEMA DE DETECCION DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR - Google Patents

SISTEMA DE DETECCION DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR Download PDF

Info

Publication number
ES2946232A1
ES2946232A1 ES202230021A ES202230021A ES2946232A1 ES 2946232 A1 ES2946232 A1 ES 2946232A1 ES 202230021 A ES202230021 A ES 202230021A ES 202230021 A ES202230021 A ES 202230021A ES 2946232 A1 ES2946232 A1 ES 2946232A1
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
preferably consisting
probe
mutations
cov
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
ES202230021A
Other languages
English (en)
Inventor
García Santiago Melón
Argüelles Marta Elena Alvarez
Alba Susana Rojo
Torrientes Marta Sandoval
Riveiro José Antonio Boga
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fundacion Para La Investig E Innovacion Biosanitaria En El Principado De Asturias
Original Assignee
Fundacion Para La Investig E Innovacion Biosanitaria En El Principado De Asturias
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundacion Para La Investig E Innovacion Biosanitaria En El Principado De Asturias filed Critical Fundacion Para La Investig E Innovacion Biosanitaria En El Principado De Asturias
Priority to ES202230021A priority Critical patent/ES2946232A1/es
Priority to PCT/ES2023/070010 priority patent/WO2023135350A1/es
Publication of ES2946232A1 publication Critical patent/ES2946232A1/es
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701Specific hybridization probes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Radio Relay Systems (AREA)
  • Radar Systems Or Details Thereof (AREA)

Abstract

Sistema de detección de variantes de SARS-CoV-2 mediante RT-qPCR La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología, en particular dentro del campo de detección rápida de virus patógenos, más concretamente del virus SARS-CoV-2 y sus variantes. La presente invención se refiere a un kit que comprende un conjunto de sondas y cebadores para la detección de mutaciones en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S del virus. La presente invención también se refiere al uso de estas sondas y cebadores para la detección y/o cuantificación in vitro de variantes de SARS-CoV-2 portadoras de estas mutaciones en muestras biológicas, así como a un método in vitro para la detección de estas variantes.

Description

DESCRIPCIÓN
SISTEMA DE DETECCIÓN DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología, en particular dentro del campo de detección rápida de virus patógenos, más concretamente del virus SARS-CoV-2 y sus variantes. La presente invención se refiere a un kit que comprende un conjunto de sondas y cebadores para la detección de mutaciones en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S del virus. La presente invención también se refiere al uso de estas sondas y cebadores para la detección y/o cuantificación in vitro de variantes de SARS-CoV-2 portadoras de estas mutaciones en muestras biológicas, así como a un método in vitro para la detección de estas variantes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El coronavirus de tipo 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) pertenecen al género de los beta coronavirus. En particular, el SARS-CoV-2 puede causar infecciones del tracto respiratorio humano e inflamación pulmonar, conocida como neumonía por nuevo coronavirus (COVID-19). COVID-19 es una nueva enfermedad infecciosa respiratoria aguda, altamente contagiosa en la población. Se transmite principalmente a través de gotitas respiratorias, secreciones y contacto directo.
El genoma del SARS-CoV-2 comprende los siguientes marcos de lectura abiertos u ORF, desde su extremo 5 'hasta su extremo 3': ORF1a y ORFlab correspondientes a las proteínas no estructurales que forman el complejo transcripción-replicación, y ORF-S, ORF-E, ORF-M y ORF-N correspondientes a las cuatro proteínas principales, la glicoproteína de pico (S), la proteína de envoltura (E), la glicoproteína de membrana (M) y la proteína de la nucleocápside (N).
El genoma del ARN del SARS-CoV-2 tiene un casquete metilado en 5' y una cola poliadenilada en 3', lo que permite que el ARN se una al ribosoma de la célula huésped para su traducción. ORFlab codifica una proteína llamada ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp o nsp12), que permite que el genoma viral se transcriba en nuevas copias de ARN utilizando la maquinaria de la célula huésped.
La proteína S se une a receptores específicos en la superficie de la célula diana y entra en ella para replicarse, causando así la infección. Algunos estudios han demostrado que el SARS-CoV-2 usa la proteína S para unirse a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) del receptor humano para invadir las células huésped.
Los coronavirus son virus de ARN monocatenario positivo con envoltura. Los virus de ARN son extremadamente susceptibles a las mutaciones, que pueden estar relacionadas con su propagación y toxicidad. Desde mediados de 2020 han surgido algunas variantes de SARS-CoV-2 que presentan mutaciones en la proteína S y que han tenido un gran impacto en la epidemiología de la enfermedad COVID-19 que actualmente se están extendiendo por todo el mundo. Algunas de estas variantes son la variante Alfa o de Reino Unido (UK) (linaje B.1.1.7; mutaciones notables N501Y, 69-70del y P681H); la variante Beta o de Sudáfrica (SA) (linaje B.1.351; mutaciones notables N501Y, E484K, K417N) y la variante Gamma o de Brasil (BR) (linaje P.1; mutaciones notables N501Y, E484K, K417T).
Todas estas nuevas variantes de SARS-CoV-2 se caracterizan por una mayor transmisibilidad de persona a persona en comparación con variantes anteriores del virus. Las variantes UK, SA y BR comparten la mutación N501Y en la región de unión al receptor (RBD). Se piensa que esta mutación aumenta la afinidad de unión de la proteína S hacia el receptor ACE2 humano (hACE). Las variantes SA y BR comparten una mutación adicional en esta región (K417T / N) que se sospecha contribuye a una mayor afinidad de unión a hACE2.
Se ha visto que la mutación E484K mejora la capacidad del SARS-CoV-2 para escapar de la respuesta inmune, tanto la natural como la inducida por la vacuna. Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales derivados del suero son de 10 a 60 veces menos efectivos para neutralizar el virus que porta la mutación E484K.
En consecuencia, estas variantes emergentes de SARS-CoV-2 son motivo de preocupación debido a su mayor transmisibilidad (Reino Unido, BR y SA). La sensibilidad reducida a los anticuerpos neutralizantes de las variantes que portan la mutación E484K (SA y BR) puede comprometer la eficacia de la vacuna. Además, la evolución convergente parece indicar que las cepas que albergan N501Y o E484K, o ambas, están evolucionando y extendiéndose rápidamente con un número creciente de mutaciones fuertemente asociadas y coexistentes en diferentes regiones de genes del SARS-CoV-2.
Sin duda, el análisis del genoma a través de la tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS) comprende el enfoque más preciso para la caracterización molecular del SARS-CoV-2. Sin embargo, esta técnica es lenta, cara y laboriosa, exigiendo una infraestructura no existente en muchos laboratorios de diagnóstico microbiológico, lo que desde un punto de vista práctico restringe la caracterización a un pequeño número de muestras de pacientes infectados con SARS-CoV-2. También se pueden utilizar métodos alternativos, como los ensayos de detección diagnóstica basados en PCR, para la detección temprana y el cálculo de la prevalencia de las variantes del virus. Dentro de los métodos basados en PCR destaca la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
La detección por RT-PCR es el método más utilizado para el diagnóstico de la infección por SARS-CoV-2. La especificidad y tolerancia de la detección por RT-PCR dependen principalmente de la especificidad y tolerancia de los cebadores y las secuencias de sonda empleados en la reacción. Las secuencias de cebador y sonda con buena tolerancia deben seleccionarse en una posición altamente conservada en el genoma del SARS-CoV-2 para evitar perder la detección de ciertas cepas del virus del SARS-CoV-2 debido a diferencias en el genoma en esta posición. También se emplea la PCR multiplex que permite la detección de múltiples patógenos en una muestra, lo que puede mejorar la eficiencia de la detección y reducir los costes.
Por otra parte, se han realizado estudios recientes para tratar de mejorar la detección de mutaciones en la proteína S del virus SARS-CoV-2. Algunos de estos ensayos son los basados en la detección de polimorfismos de nucleótidos único (SNPs), por ejemplo, un ensayo basado en la curva de fusión (Durner et al. Dent. Mater. 2021; 37: e95-e97) o un ensayo basado en la sonda TaqMan (Sandoval Torrientes et al. J Virol Methods.
2021 Aug; 294:114143), ambos dirigidos a una sola mutación que resulta en la sustitución de aminoácidos en la posición 501. En el estudio de Serafeim C. et al. J Virol Methods. 2021 Oct; 296:114242 se diseñó un ensayo RT-PCR en tiempo real de un solo paso para la tipificación simultánea, rápida y precisa de mutaciones del gen SARS-CoV2, asociadas con las sustituciones en las posiciones 484 y 501 de la proteína S (E484K y N501Y). Con este fin, se diseñaron cuatro sondas TaqMan con química de ácido nucleico bloqueado (ANB). Dos de ellas se utilizaron para la diferenciación entre la secuencia de tipo salvaje y la secuencia con la mutación en la posición 484 y las otras dos se utilizaron para el mismo propósito en la posición 501. Se conjugaron diferentes fluoróforos en el extremo 5'de cada sonda Taqman para facilitar la diferenciación de las respectivas señales de fluorescencia.
Las pruebas de detección actuales pueden fallar en la detección de todos los pacientes positivos para COVID-19 y, además, la detección específica de cepas que albergan mutaciones en el gen S solo es válida durante un corto período de tiempo. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar pruebas basadas en PCR que sean robustas y estables en el tiempo para detectar SARS-CoV-2 y que además permitan la tipificación simultánea, rápida y precisa de las mutaciones en la proteína S del virus SARS-CoV-2.
En el estado de la técnica existen divulgaciones relacionadas con diferentes métodos y tecnologías para la detección de distintas variantes del virus SARS-CoV-2.
El documento de patente WO2021176099A1 divulga un método para la detección de la presencia y / o ausencia de SARS-CoV-2 en una muestra basado en el análisis de los genes RdRP (nsp12) y nsp9 del virus SARS-CoV-2 y de algunas de sus variantes. Los genes de la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP o nsp12) y la proteína de unión a ARN monocatenario (nsp9) del virus se encuentran entre las regiones más conservadas. En este documento también se han identificado dos dianas adicionales, en los genes nsp6 y N. La diana en el gen nsp6 es específica para las variantes del SARS-CoV-2 UK, SA y BR y, por lo tanto, permite la detección de la presencia o ausencia de una variante preocupante del SARS-CoV-2 en una muestra. La diana en el gen N es específica para la variante del SARS-CoV-2 del Reino Unido y, por lo tanto, permite la detección de la presencia de la variante SARS-CoV-2 del Reino Unido cuando se usa solo, y la detección de la presencia de la variante SARS-CoV-2 del Reino Unido, SA o BR, cuando se usa en combinación con el gen diana nsp6. El método descrito en este documento del estado del arte es una RT-PCR que se basa en la utilización de sondas y cebadores específicos para la detección de la presencia o ausencia de la variante de Reino Unido (B.1 .1 .7), la de Sudáfrica (B.1 .351) y la de Brasil (P.1). Las sondas y cebadores empleados en este documento de patente del estado de la técnica son distintas a las descritas en la presente invención.
El documento de patente CN111961762A divulga un cebador de RT-PCR fluorescente, una sonda, un reactivo y un método para detectar el coronavirus SARS-CoV-2. El fragmento Orflab en el genoma del SARS-CoV-2 se utiliza como diana para llevar a cabo la detección cualitativa del SARS-CoV-2. El reactivo de detección de RT-PCR de fluorescencia de SARS-CoV-2 se prepara mediante una tecnología de liofilización. Por otra parte, CN112063764A divulga una composición de sondas y cebadores de RT-PCR fluorescente en tiempo real múltiple para la detección de ácidos nucleicos de coronavirus. El kit incluye cebadores y sondas de RT-PCR de fluorescencia para detectar el gen ORFlab y el gen N del SARS-CoV-2.
El documento de patente CN113249522A divulga un método que permite detectar cepas variantes del virus SARS-CoV-2 mediante PCR. Gracias al método descrito se rompe el cuello de botella técnico existente en la tecnología de PCR de fluorescencia. En la PCR de fluorescencia es complicado realizar una identificación de base única. En este documento del estado del arte se diseñan dos sondas para que puedan detectar el cambio en una sola base G-C. Mediante estas sondas se pueden detectar variaciones en la posición 484 de la proteína S.
CN112575120A divulga un método que permite la detección de la mutación D614G en la proteína S del virus SARS-CoV-2. Para ello se diseñan una serie de sondas y cebadores específicos y se emplea el método RT-PCR. Este método tiene las ventajas de que es sencillo, presenta un período de detección corto y tiene una alta sensibilidad.
A pesar de que hay una pluralidad de documentos que describen distintas formas de detección del virus SARS-CoV-2, existe una necesidad de nuevos métodos y reactivos para identificar con especificidad y sensibilidad mejorada la presencia y/o ausencia de variantes de SARS-CoV-2 en las muestras, preferentemente de manera simultánea (en una única reacción de amplificación).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención está dirigida a resolver la necesidad de proporcionar métodos basados en PCR que sean robustos y estables en el tiempo para detectar SARS-CoV2 y sus variantes, que permitan la tipificación simultánea, rápida y precisa de las distintas mutaciones en la proteína S del virus SARS-CoV-2.
Los autores de la presente invención han desarrollado un conjunto de sondas y cebadores que permiten una caracterización rápida, sencilla y relativamente barata de mutaciones presentes en las posiciones 417, 452, 478 y/o 484 de la proteína S del virus SARS-CoV-2. En la presente invención también se describe un kit para la detección de estas mutaciones que comprende, al menos, un conjunto de estas sondas y cebadores. En base a estas sondas y cebadores, los inventores también han desarrollado un método in vitro para la detección de las variantes portadoras de estas mutaciones. Estas variantes son la variante Alfa (linaje B.1.1.7), la variante Beta (linaje B.1.351), la variante Gamma (linaje P.1), la variante Kappa (linaje B.1.617.1), la variante Delta (B.1.617.2) y la variante Lambda (linaje C.37).
El método descrito en la presente invención permite la detección de variantes portadoras de mutaciones en estas posiciones en apenas una hora. Además, permite analizar todas las muestras de pacientes infectados con SARS-CoV-2 identificadas, mientras que otros métodos como la secuenciación solo permiten el análisis de un pequeño número de muestras.
Así un aspecto de la invención se refiere a un conjunto de sondas y cebadores específicos, de ahora en adelante “sondas y cebadores de la invención”, para la detección de mutaciones en las posiciones 417, 452, 478 y/o 484 de la proteína S del virus SARS-CoV-2. El conjunto de sondas y cebadores de la invención es seleccionado de la lista que consiste en:
a) Cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:1, cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:2, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:3, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:4, y sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:5;
b) Cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:6, cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:7, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:8, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:9, y sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:10;
c) Cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:11, cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:12, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO: 13, y sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:14; y
d) Cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:15, cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:16, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO: 17, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:18, y sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:19.
En la presente invención se entiende por “detectar” o “detección” a reportar o identificar las secuencias de las variantes del virus SARS-CoV-2 que presentan mutaciones en las posiciones 417, 452, 478 y/o 484 de la proteína S.
El término “cebador” (también denominado “oligo”), se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ADN cuando híbrida con el ácido nucleico molde. Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de nucleótidos en el ácido nucleico molde (cebadores específicos), como en la invención, o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios).
El término “sonda” se refiere a un fragmento de ADN utilizado para detectar la presencia de un fragmento de ADN específico dentro de una muestra a través de la hibridación con un ADN bicatenario. Las sondas de la invención se pueden producir por los métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, pueden producirse a partir de síntesis química.
Las sondas y cebadores de (a) detectan las mutaciones K417T y K417N, las de (b) detectan las mutaciones L452R y L452Q, las de (c) detectan la mutación T478K y las de (d) detectan las mutaciones E484K y E484Q. Estas mutaciones son polimorfismos de un solo nucleótido o SNP. Los “SNP” se definen como una variación en la secuencia de ADN que afecta a una sola base (adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G)) de una secuencia del genoma.
La proteína S del virus SARS-CoV-2 es la procedente del aislado Wuhan-Hu-1 [número de referencia en NCBI: YP_009724390.1], Su secuencia aminoacídica es la definida en la SEQ ID NO: 24. Su secuencia nucleotídica [número de referencia en NCBI: NC_045512.2] es la definida en la SEQ ID NO: 25.
SEQ ID NO: 24 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPF FSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSL LIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQP FLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGIN ITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCA LDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVY AWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVR QIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFER DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV CGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQT LEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGS NVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSL GAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSF CTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFI EDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALL AGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQD SLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDR LITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFP QSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFY EPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDIS GINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVT IMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO:25
ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACT AGTCTCTAGTCAGTGTGTT AATCTTACAA CCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTAC CCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACT CAGGACTT GTTCTTACCT TTCTTTTCCAAT GTTACTTGGTTCCATGCTAT ACAT GTCT CTGGGACCAATGGTACT AAGAGGTTT GATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGT GTTTATTTTGCTTCCACT GAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGAC CCAGTCCCTACTTATT GTTAATAACGCTACT AATGTT GTTATTAAAGTCTGT GAATT TCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTG GATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATG TCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTA GGGAATTT GTGTTTAAGAATATT GATGGTT ATTTTAAAAT ATATTCTAAGCACACGC CTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTA GATTTGCCAATAGGTATTAACAT CACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA AGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTA TTATGTGGGTTATCTT CAACCTAGGACTTTT CTATTAAAATATAATGAAAATGGAAC CATTACAGATGCT GTAGACT GTGCACTT GACCCTCT CTCAGAAACAAAGTGT ACGT TGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAAC CAACAGAATCTATTGTT AGATTTCCTAATATT ACAAACTT GTGCCCTTTTGGT GAAG TTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGC AACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAG TGTTATGGAGTGT CTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAAT GTCTATGCA GATTCATTTGTAATTAGAGGT GATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTG GAAAGATTGCT GATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAG CTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATA GATTGTTT AGGAAGTCTAATCT CAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACT GAAATCT ATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCT TTACAAT CATATGGTTTCCAACCCACTAAT GGTGTTGGTT ACCAACCATACAGAGT AGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCT ACAT GCACCAGCAACT GTTTGT GGACCTAAAAA GTCTACTAATTTGGTT AAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGG CACAGGTGTTCTTACTGAGT CTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCA GAGACATTGCT GACACTACT GATGCT GTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTT GACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATAC TTCTAACCAGGTT GCTGTTCTTTATCAGGAT GTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTG CTATTCAT GCAGAT CAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTT ATTCTACAGGTT CTAATG TTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATAT GAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTA ATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTAT GTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATT GCCATACCCA CAAATTTT ACTATTAGTGTTACCACAGAAATT CTACCAGT GTCTAT GACCAAGACAT CAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGT TGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTT GAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTT GCACAAGTCAAACAAATTTACAAAAC ACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATC AAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTG CAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGA GACCTCATTTGTGCACAAAAGTTT AACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCAC AGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTG GTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCT TATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTG ATTGCCAACCAATTT AATAGTGCT ATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTT CTTCCACA GCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGAT GTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAA CACGCTT GTTAAACAACTTAGCT CCAATTTTGGTGCAATTTCAAGT GTTTTAAATGA TATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCA CAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCA GAAAT CAGAGCTT CTGCTAATCTTGCT GCTACTAAAAT GTCAGAGT GTGTACTTGG ACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTC AGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTT ATGTCCCTGCACAAGAA AAGAACTT CACAACTGCTCCTGCCATTTGT CATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCG TGAAGGT GTCTTT GTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTT ATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTT GTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCT GAATTAGACTC ATTCAAGGAGGAGTT AGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTT AGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACC GCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTT GGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGC TGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCT GTAGTT GTCTCAAGGGCT GTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTT GATGAAGAC GACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAA
La mutación “K417T” se refiere a una mutación en el aminoácido 417 de la proteína S del virus en la que se produce un cambio de Usina (K) por treonina (T), provocado por una sustitución de una (A) por una (C). De esta forma, el codón AAG (que codifica para la lisina) pasa a ser ACG (que codifica para la treonina). La mutación “K417N” se refiere a una mutación en el aminoácido 417 de la proteína S del virus en la que se produce un cambio de Usina (K) por asparagina (N), provocado por una sustitución de una (G) por una (T). De esta forma, el codón AAG (que codifica para la lisina) pasa a ser AAT (que codifica para la asparagina). Estas dos mutaciones aparecen representadas en la invención como “K417T/N”.
La mutación “L452R” se refiere a una mutación en el aminoácido 452 de la proteína S del virus en la que se produce un cambio de leucina (L) por arginina (R), provocado por una sustitución de una (T) por una (G). De esta forma, el codón CTG (que codifica para la leucina) pasa a ser CGG (que codifica para la arginina). La mutación “L452Q” se refiere a una mutación en el aminoácido 452 de la proteína S del virus en la que se produce un cambio de leucina (L) por glutamina (Q), provocado por una sustitución de una (T) por una (A). De esta forma, el codón CTG (que codifica para la leucina) pasa a ser CAG (que codifica para la glutamina). Estas dos mutaciones aparecen representadas en la invención como “L452R/Q”.
La mutación “T478K” se refiere a una mutación en el aminoácido 478 de la proteína S del virus en la que se produce un cambio de treonina (T) por lisina (K), provocado por una sustitución de una (G) por una (T). De esta forma, el codón TGT (que codifica para la treonina) pasa a ser TTT (que codifica para la lisina).
La mutación “E484K” se refiere a una mutación en el aminoácido 484 de la proteína S del virus en la que se produce un cambio de ácido glutámico (E) por lisina (K), provocado por una sustitución de una (G) por una (A). De esta forma, el codón GAA (que codifica para el ácido glutámico) pasa a ser AAA (que codifica para la lisina). La mutación “E484Q” se refiere a una mutación en el aminoácido 484 de la proteína S del virus en la que se produce un cambio de ácido glutámico (E) por glutamina (Q), provocado por una sustitución de una (G) por una (C). De esta forma, el codón GAA (que codifica para el ácido glutámico) pasa a ser CAA (que codifica para la glutamina). Estas dos mutaciones aparecen representadas en la invención como “E484K/Q”.
En otra realización preferida, las sondas de la invención están marcadas con al menos un fluoróforo, preferiblemente VIC, NED o FAM, más preferiblemente en cualquiera de sus extremos, 5'o 3', aún más preferiblemente en su extremo 3'.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un kit, de ahora en adelante “kit de la invención”, que comprende al menos un conjunto de sondas y cebadores de la invención.
En una realización preferida, el kit de la invención comprende todos los conjuntos de sondas y cebadores de la invención.
Además de las sondas y cebadores de la invención, el kit puede comprender otros componentes útiles en la puesta en práctica de la presente invención, tales como, buffers, soportes del material, componentes de controles positivos y/o negativos, etc. Además de los componentes mencionados, los kits podrán incluir también instrucciones para practicar el objeto de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja u hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
En otra realización preferida, el kit de la invención comprende, además, sondas y cebadores específicos para la detección de mutaciones en la posición 501 de la proteína S del virus SARS-CoV-2, preferiblemente la mutación N501Y.
El término “detectar” o “detección” ha sido definido o explicado en párrafos anteriores, y dicha definición es aplicable al presente aspecto inventivo, que en este caso se refiere a reportar o identificar las secuencias de las variantes del virus SARS-CoV-2 que presentan mutaciones en la posición 501 de la proteína S.
La mutación “N501Y” se refiere a una mutación en el aminoácido 501 de la proteína S del virus en la que se produce un cambio de asparagina (N) por tirosina (Y), provocado por una sustitución de una (A) por una (T). De esta forma, el codón AAT (que codifica para la asparagina) pasa a serTAT (que codifica para la tirosina).
En una realización más preferida, las sondas y cebadores que detectan la mutación en la posición 501 de la proteína S son un cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO:20, un cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:21, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:22 y una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:23.
De esta forma, el kit de la invención puede comprender uno o más conjuntos de las sondas y cebadores de la invención que comprenden, preferiblemente consisten en, las secuencias SEQ ID NO: 1-23.
En otra realización preferida, las sondas del kit de la invención están marcadas con al menos un fluoróforo, preferiblemente VIC, NED o FAM, más preferiblemente en cualquiera de sus extremos, 5 'o3 ', aún más preferiblemente en su extremo 3'.
A lo largo de los párrafos anteriores se ha puesto de manifiesto la utilidad de las sondas y cebadores de la invención en la detección de las mutaciones en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S del virus SARS-CoV-2.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso del conjunto de sondas y cebadores de la invención, o del kit de la invención, para la detección y/o cuantificación in vitro de variantes de SARS-CoV-2 portadoras de mutaciones (SNP) en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S, donde las mutaciones son seleccionadas del grupo que consiste en: K417T/N, L452R/Q, T478K, E484K/Q y N501Y.
El término “detectar” o “detección” ha sido definido o explicado en párrafos anteriores, y dicha definición es aplicable al presente aspecto inventivo.
El término “cuantificar” o “cuantificación” se refiere a determinar, en una muestra, la cantidad de moléculas molde de DNA o RNA (determinar la carga vírica) de las variantes del virus SARS-CoV-2 que presentan mutaciones en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S.
El término “in vitro” se refiere a que la detección y/o cuantificación de las variantes del SARS-CoV-2 se realiza fuera del cuerpo del sujeto. El término “sujeto”, tal como se utiliza en la presente invención, hace referencia a cualquier animal, preferiblemente un mamífero. En una realización más preferida, el sujeto es un ser humano de cualquier sexo, edad o raza.
De forma análoga al uso de las sondas y cebadores de la invención, así como al uso del kit de la invención, descrito en párrafos anteriores, en la presente invención también se contemplan los métodos dirigidos a la detección y/o cuantificación de las variantes del SARS-CoV-2 portadoras de mutaciones en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S.
De esta forma, otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro, de ahora en adelante “método de la invención” para la detección y/o cuantificación de variantes de SARS-CoV-2 portadoras de mutaciones en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S, en una muestra aislada de un sujeto que comprende:
a. extraer el ARN viral de la muestra,
b. someter al ARN extraído en (a) a una reacción de transcripción inversa seguida de una reacción de amplificación utilizando el conjunto de sondas y cebadores de la invención o el kit de la invención, y
c. detectar la presencia de dichas mutaciones en la muestra amplificada.
Los términos “in vitro” , “sujeto”, “detectar” o “detección”, “cuantificar” o “cuantificación” han sido definidos o explicados en párrafos anteriores, y dichas definiciones son aplicables al presente aspecto inventivo.
La detección y/o cuantificación de las variantes del SARS-CoV-2 que presentan mutaciones en las posiciones 417, 452, 478 y/o 484 de la proteína S mediante las sondas y cebadores de la invención puede llevarse a cabo en cualquier muestra que sea susceptible de estar contaminada por SARS-CoV-2. Se entiende por “muestra” a una parte o cantidad pequeña de una cosa que se considera representativa del total y que se toma o se separa de ella para someterla a estudio, análisis o experimentación. En la presente invención, dicho estudio, análisis o experimentación hace referencia a la presencia/ausencia del material genético de las variantes de SARS-CoV-2. Dentro del término “muestra” también se incluyen muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de su obtención, por ejemplo, mediante el tratamiento con reactivos, la solubilización o el enriquecimiento de ciertos componentes. En una realización preferida del uso de la invención, la muestra es una muestra biológica.
El término “muestra biológica” incluye, pero sin limitarnos, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica a la que se refiere la invención comprende ácido ribonucleico (ARN). En una realización preferida, la muestra biológica procede del tracto oral o respiratorio y ha sido obtenida, más preferiblemente, mediante un hisopo nasofaríngeo.
En otra realización preferida, la reacción de amplificación del método de la invención es una RT-PCR, más preferiblemente una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR). La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) es una variante de la PCR en la que se retrotranscribe una cadena de ARN en ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa inversa o transcriptasa reversa, y el resultado se amplifica mediante una PCR tradicional.
La extracción del ARN del paso (a) del método de la invención se puede realizar por los métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, pueden emplearse métodos de extracción tanto manuales, basados en el empleo de solventes orgánicos o columnas de centrifugación, como automatizados, por ejemplo, las plataformas Microlab (Hamilton Company, Nevada, EE. UU.) o los sistemas Magnapure (Roche, Basilea, Suiza).
En el paso (b) la reacción de transcripción inversa consta, preferiblemente, de dos pasos. El primer paso de la etapa de retrotranscripción consiste en la síntesis de copias del genoma viral en forma de cDNA. Las condiciones empleadas en este primer paso dependen del reactivo utilizado. Este primer paso es llevado a cabo durante preferiblemente 15 minutos a una temperatura de entre 35 0C - 52 0C, más preferiblemente a 50 0C. Las condiciones del segundo paso de la etapa de retrotranscripción son, preferiblemente, 2 minutos a 95 ° C .
Posteriormente a la retrotranscripción, en el paso (b) del método de la invención se lleva a cabo la amplificación para la detección de la variante de interés usando para cada posición dos cebadores de la invención y dos o tres sondas de la invención (Taqman MGB), preferiblemente marcadas con fluoróforos, más preferiblemente VIC, NED o FAM, que reconocen la secuencia salvaje y las diferentes mutaciones en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 (Tablal).
Tabla 1. Cebadores y sondas para la detección de las mutaciones K417N/T, L452R/Q, T478K, E484K/Q y N501Y.
Figure imgf000017_0001
1EI codón susceptible de mutación aparece sombreado. El nucleótido variable se indica en negrita.
2Secuencia reversa complementaria.
Para llevar a cabo la detección de las variantes del virus SARS-CoV-2 se preparan, preferiblemente, 5 reacciones, una para cada posición. En cada una de ellas se mezcla el ARN viral, previamente extraído de la muestra biológica en el paso (a), con el reactivo A. El reactivo A se prepara mezclando el reactivo comercial Taqman fast virus 1-step master mix (Roche) y los cebadores y las sondas de la invención específicas para cada mutación a analizar o el kit de la invención.
Para la detección de las mutaciones K417T/N se emplea un cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:1, un cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:2, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:3, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:4, y una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:5.
Para la detección de las mutaciones L452R/Q se emplea un cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:6, un cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:7, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:8, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:9, y una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:10.
Para la detección de la mutación T478K se emplea un cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:11, un cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:12, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:13, y una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:14.
Para la detección de las mutaciones E484K/Q se emplea un cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:15, un cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:16, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:17, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:18, y una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:19.
Para la detección de la mutación N501Y se emplea un cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO:20, un cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:21, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:22 y una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:23.
La amplificación del paso (b) del método de la invención y el posterior análisis y detección de las mutaciones se realiza preferiblemente en un sistema de PCR a tiempo real tipo 7500 thermal cycler (ABI), Steponeplus thermal cycler (ABI) o QuantStudio 5 (ABI).
En el paso (c) del método de la invención, la expresión “detectar la presencia de dichas mutaciones en la muestra amplificada” se refiere a detectar si las sondas y cebadores diseñados por los inventores han hibridado, unido o reconocido a los SNPs específicos descritos en la invención. Los diagramas de amplificación (señales de fluorescencia) varían en función del fluoróforo de las sondas. Los tres fluoróforos preferidos con los que se marcan las sondas de la invención pueden ser excitados a una sola longitud de onda (A) de 488 nm, pero emiten a longitudes de onda claramente diferentes. FAM tiene una A máxima de absorción de 494 nm y una A máxima de emisión de 518 nm, NED tiene una A máxima de absorción de 546 nm y una A máxima de emisión de 575 nm y VIC tiene una A máxima de absorción de 538 nm y una A máxima de emisión de 554 nm.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1 muestra la posición de los cebadores de la invención para la detección de las mutaciones K417T/N, L452R/Q, T478K, E484K/Q y N501Y de la proteína S del virus SARS-CoV-2.
Fig. 2 muestra el análisis mediante la técnica desarrollada de muestras positivas para la detección de la mutación T478K de la proteína S del virus SARS-CoV-2 (variante Delta).
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de las sondas y cebadores de la invención, así como del método de la invención.
Ejemplo 1: Preparación del reactivo A
Como se ha comentado en la descripción de la invención, se preparan 5 reacciones, una para cada posición:
(1) Detección de las mutaciones K417T/N. Para preparar 1 mililitro de volumen del reactivo A se añaden 300 μl de Taqman fast virus 1-step master mix (Roche), 4 μl del cebador directo (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO: 1, 4 μl del cebador inverso (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:2, 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:3, 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:4 y 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:5. Se añade agua hasta completar el mililitro de volumen.
(2) Detección de las mutaciones L452R/Q. Para preparar 1 mililitro de volumen del reactivo A se añaden 300 μl de Taqman fast virus 1-step master mix (Roche), 4 μl del cebador directo (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:6, 4 μl del cebador inverso (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:7,1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:8,1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:9 y 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:10. Se añade agua hasta completar el mililitro de volumen.
(3) Detección de la mutación T478K. Para preparar 1 mililitro de volumen del reactivo A se añaden 300 μl de Taqman fast virus 1-step master mix (Roche), 4 μl del cebador directo (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:11, 4 μl del cebador inverso (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:12, 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:13 y 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:14. Se añade agua hasta completar el mililitro de volumen.
(4) Detección de las mutaciones E484K/Q. Para preparar 1 mililitro del reactivo A se añaden 300 μl de Taqman fast virus 1-step master mix (Roche), 4 μl del cebador directo (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:15, 4 μl del cebador inverso (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:16, 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:17, 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:18 y 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:19. Se añade agua hasta completar el mililitro de volumen.
(5) Detección de la mutación N501Y. Para preparar 1 mililitro del reactivo A se añaden 300 μl de Taqman fast virus 1-step master mix (Roche), 4 μl del cebador directo (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:20, 4 μl del cebador inverso (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:21, 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:22 y 1 μl de la sonda (100 μM) que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:23. Se añade agua hasta completar el mililitro de volumen.
Ejemplo 2: Preparación de la mezcla de amplificación
Se preparan 5 reacciones en las que se mezclan 5 μl de ARN viral previamente extraído y 10 μl del reactivo A previamente preparado para cada una de las reacciones según se describe en el ejemplo 1.
Ejemplo 3: Amplificación
El sistema de amplificación empleado es una PCR a tiempo real tipo 7500 thermal cycler (ABI), Steponeplus thermal cycler (ABI) o QuantStudio 5 (ABI).
La etapa de retrotranscripción tiene 2 pasos. El primer paso de la etapa de retrotranscripción (15 minutos a 50 ° C) consiste en la síntesis de cDNA a partir del ARN viral. Las condiciones del segundo paso de la etapa de retrotrancripción son 2 minutos a 95 ° C (Tabla 2).
La etapa de PCR de 40 ciclos consta de 2 pasos, un paso de desnaturalización de 5 segundos a 95 ° C y un paso combinado de hibridación y extensión de 30 segundos a 60 ° C. Durante estos ciclos el producto de PCR es amplificado (Tabla 2).
Tabla 2. Programa de amplificación
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 4: Obtención e interpretación de los resultados
La lectura de los resultados llega por la interpretación (por el sistema) de la intensidad de la señal fluorescente en el momento que se identifique la presencia de la secuencia genética correspondiente al virus. Un ejemplo de la detección de la mutación T478K en la proteína S del virus se muestra en la Fig.2. Se observan variantes portadoras del alelo salvaje T478 (gris claro) y muíante T478K (gris oscuro), que permite identificar la variante Delta. Este análisis se realizó en un sistema StepOnePlus (Thermofisher).
La variante Alfa (B.1.1.7) se caracteriza porque presenta las mutaciones E484K, N501Y, la variante Beta (B.1.351) se caracteriza porque presenta las mutaciones K417N, E484K y N501Y, la variante Gamma (P.1) se caracteriza porque presenta las mutaciones K417N, E484K y N501Y, la variante Kappa (B.1.617.1) se caracteriza porque presenta las mutaciones L452R, T478K y E484Q, la variante Delta (B.1.617.2) se caracteriza porque presenta las mutaciones L452R y T478K y la variante Lambda (C.37) se caracteriza porque presenta la mutación L452Q.
Tal y como se ve en los resultados de detección de la Tabla 3, el método de la invención permite la detección de las variantes Alfa (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1.), Kappa (B.1.617.1), Delta (B.1.617.2) y Lambda (C.37) portadoras de mutaciones en los codones 417, 452, 478, 484 y 501 en apenas una hora.
Tabla 3. Detección de las variantes del virus SAR-CoV-2 mediante las sondas y cebadores de la invención
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Kit para la detección de mutaciones en las posiciones 417, 452, 478 y/o 484 de la proteína S del virus SARS-CoV-2 que comprende todos los conjuntos de sondas y cebadores específicos de la lista que consiste en:
a) Cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:1, cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:2, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:3, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:4, y sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:5;
b) Cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:6, cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:7, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:8, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:9, y sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:10;
c) Cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:11, cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:12, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO: 13, y sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:14; y
d) Cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:15, cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:16, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO: 17, sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:18, y sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:19.
2. Kit según la reivindicación 1 donde las secuencias de (a) detectan las mutaciones K417T y K417N, las secuencias de (b) detectan las mutaciones L452R y L452Q, las secuencias de (c) detectan la mutación T478K y las secuencias de (d) detectan las mutaciones E484K y E484Q.
3. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde las sondas están marcadas con al menos un fluoróforo.
4. Kit según la reivindicación 3, donde el fluoróforo es VIC, NED o FAM.
5. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende sondas y cebadores específicos para la detección de mutaciones en la posición 501 de la proteína S del virus SARS-CoV-2.
6. Kit según la reivindicación 5 donde la mutación en la posición 501 es N501Y.
7. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 donde las sondas y cebadores que detectan la mutación en la posición 501 de la proteína S son un cebador directo que comprende, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO:20, un cebador inverso que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:21, una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:22 y una sonda que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO:23.
8. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 donde las sondas para la detección de mutaciones en la posición 501 de la proteína S del virus SARS-CoV-2 están marcadas con al menos un fluoróforo.
9. Kit según la reivindicación 8, donde el fluoróforo es VIC, NED o FAM.
10. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la detección y/o cuantificación in vitro de variantes del virus SARS-CoV-2 portadoras de mutaciones (SNP) en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S, donde las mutaciones son seleccionadas del grupo que consiste en: K417T, K417N, L452R, L452Q, T478K, E484K, E484Q y N501Y.
11. Método in vitro para la detección y/o cuantificación de variantes del virus SARS-CoV-2 portadoras de mutaciones en las posiciones 417, 452, 478, 484 y/o 501 de la proteína S en una muestra aislada de un sujeto, que comprende:
a. extraer el ARN viral de la muestra,
b. someter al ARN extraído en (a) a una reacción de transcripción inversa seguida de una reacción de amplificación utilizando el kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 , y
c. detectar la presencia de dichas mutaciones en la muestra amplificada.
12. Método según la reivindicación 11, donde la reacción de amplificación es una RT PCR cuantitativa (qRT-PCR).
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, donde la muestra aislada de un sujeto es una muestra biológica procedente de un mamífero, preferiblemente humano.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde la muestra biológica aislada procede del tracto oral o respiratorio.
ES202230021A 2022-01-13 2022-01-13 SISTEMA DE DETECCION DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR Withdrawn ES2946232A1 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202230021A ES2946232A1 (es) 2022-01-13 2022-01-13 SISTEMA DE DETECCION DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR
PCT/ES2023/070010 WO2023135350A1 (es) 2022-01-13 2023-01-11 SISTEMA DE DETECCIÓN DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202230021A ES2946232A1 (es) 2022-01-13 2022-01-13 SISTEMA DE DETECCION DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2946232A1 true ES2946232A1 (es) 2023-07-13

Family

ID=85278387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES202230021A Withdrawn ES2946232A1 (es) 2022-01-13 2022-01-13 SISTEMA DE DETECCION DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2946232A1 (es)
WO (1) WO2023135350A1 (es)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113881812A (zh) * 2021-12-03 2022-01-04 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途
CN113897460A (zh) * 2021-11-02 2022-01-07 深圳市梓健生物科技有限公司 一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3990667B1 (en) 2020-03-05 2024-01-31 Institut Pasteur Methods for the specific and sensitive detection of sars-cov-2
CN111961762A (zh) 2020-09-03 2020-11-20 深圳市赛格诺生物科技有限公司 一种检测冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-PCR引物、探针、试剂及方法
CN112063764A (zh) 2020-10-28 2020-12-11 江苏科德生物医药科技有限公司 一种用于新型冠状病毒核酸检测的多重实时荧光rt-pcr引物探针组合物及试剂盒
CN112575120B (zh) 2020-11-03 2022-10-14 厦门大学 一种SARS-CoV-2 D614G突变检测试剂盒及检测方法
CN113249522B (zh) 2021-06-11 2023-03-14 中国科学院微生物研究所 一种检测SARS-CoV-2变异毒株核酸的方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113897460A (zh) * 2021-11-02 2022-01-07 深圳市梓健生物科技有限公司 一种同时检测新型冠状病毒多种突变株的核酸组合物、试剂盒及方法
CN113881812A (zh) * 2021-12-03 2022-01-04 深圳联合医学科技有限公司 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIANG YUANHAO ET AL. CRISPR-Cas12a-Based Detection for the Major SARS-CoV-2 Variants of Concern. Microbiology Spectrum DEC 2021. , 30/11/2021, Vol. 9, Páginas Article No.: e01017-21 ISSN 2165-0497(print) ISSN 2165-0497(electronic), (DOI: doi:10.1128/Spectrum.01017-21) Especialmente páginas 7-9; tabla 1 *
WANG HANNAH ET AL. Multiplex SARS-CoV-2 Genotyping Reverse Transcriptase PCR for Population-Level Variant Screening and Epidemiologic Surveillance.. Journal of clinical microbiology United States 19 Jul 2021. , 19/07/2021, Vol. 59, Páginas e0085921 ISSN 1098-660X (Electronic), (DOI: doi:10.1128/JCM.00859-21 pubmed:34037430) Especialmente: página 2, primer párrafo; página 4, último párrafo-página 5, segundo párrafo; página 7, página 10, tercer párrafo. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023135350A1 (es) 2023-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Belák Molecular diagnosis of viral diseases, present trends and future aspects: A view from the OIE Collaborating Centre for the Application of Polymerase Chain Reaction Methods for Diagnosis of Viral Diseases in Veterinary Medicine
Leutenegger et al. Rapid feline immunodeficiency virus provirus quantitation by polymerase chain reaction using the TaqMan® fluorogenic real-time detection system
ES2439951T3 (es) Detección y cuantificación multiplex de ácidos nucleicos microbianos controlada de forma interna
JP6329370B2 (ja) 呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キット
ES2970603T3 (es) Métodos para la detección específica y sensible del SARS-CoV-2
Black et al. A rapid RT-PCR method to differentiate six established genotypes of rabies and rabies-related viruses using TaqMan™ technology
US11149320B1 (en) Assays for the detection of SARS-CoV-2
CN111500771A (zh) 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒
EP1761645A1 (en) Diagnostic primers and method for detecting avian influenza virus subtype h5 and h5n1
ES2776427T3 (es) Método de amplificación de ADN basado en invasión de cadena
Teng et al. Specific detection of reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification amplicons for Taura syndrome virus by colorimetric dot–blot hybridization
CN113249522B (zh) 一种检测SARS-CoV-2变异毒株核酸的方法及其应用
Park et al. Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChMVd)
Wang et al. Development of a gold nanoparticle-based oligonucleotide microarray for simultaneous detection of seven swine viruses
US20040265796A1 (en) Methods and kits for detecting SARS-associated coronavirus
ES2336807T3 (es) Deteccion del tipo y subtipo del vih.
ES2425620T3 (es) Método para detectar agentes virales respiratorios en una muestra de ensayo
US20210108253A1 (en) Quantification of ngs dna by adapter sequence
US20060188871A1 (en) Detection of very virulent infectious bursal disease virus
JP5561708B2 (ja) 鳥インフルエンザウイルスのna亜型判定用プライマーセット
ES2622908T3 (es) Ensayo de Neisseria gonorrhoeae
ES2946232A1 (es) SISTEMA DE DETECCION DE VARIANTES DE SARS-CoV-2 MEDIANTE RT-qPCR
JP6592697B2 (ja) 血清型2のデングウイルス検出用キット、血清型3のデングウイルス検出用キット及びデングウイルス検出用キット
EP3885455A1 (en) Method and kit for the detection of sars-cov-2 virus in a sample based on reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp)
TWI531654B (zh) 用於鑑別h5禽流感病毒病原性之寡核酸探針、含其之套組及方法

Legal Events

Date Code Title Description
BA2A Patent application published

Ref document number: 2946232

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: A1

Effective date: 20230713

FA2A Application withdrawn

Effective date: 20231102