ES2336807T3 - Deteccion del tipo y subtipo del vih. - Google Patents
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Abstract
Proceso para la detección de al menos una diana del VIH, que comprende la etapa de producir al menos un amplicón por medio de al menos dos oligonucleótidos, en el que dichos oligonucleótidos son cebadores que son adecuados para usar en la amplificación específica de al menos una secuencia molde de referencia seleccionada del grupo que consiste en: - las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M; y los fragmentos de la SEC ID Nº: 2 seleccionados de las posiciones 4281-4429 (SEC ID Nº: 306), 4283-4429 (SEC ID Nº: 307), 4283-4431 (SEC ID Nº: 308) de dicho aislado VIH1-M; - las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O, y los fragmentos de la SEC ID Nº: 4 seleccionados de las posiciones 4336-4484 (SEC ID Nº: 310), 4338-4484 (SEC ID Nº: 311) de dicho aislado VIH1-O; - las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) de aislado de referencia M30502 VIH2; - las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) de aislado de referencia K03455 VIH1-M y el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 (SEC ID Nº: 305) de dicho aislado VIH1-M; y - las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-y el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que es idéntico a las posiciones 4231-4484 (SEC ID Nº: 309) de dicho aislado VIH1-O; compartiendo dichas secuencias molde de referencia la característica técnica específica de ser referencias adecuadas para construir y producir cebadores que permiten una detección múltiple cuantitativa en tiempo real de al menos uno de los subtipos del VIH1-M, VIH2-O, VIH2-A y VIH2-B; en el que dichos cebadores son adecuados para hibridarse con dicho aislado de referencia del VIH en dichas posiciones que conducen en una secuencia aislada de referencia del VIH que consiste en dicha secuencia molde de referencia; y opcionalmente, comprende la etapa de detectar dicho amplicón por medio de al menos una sonda.
Description
Detección del tipo y subtipo del VIH.
La presente invención se refiere al campo del
VIH y subtipos del VIH. Más precisamente, la invención se refiere a
la detección de los tipos y subtipos del VIH, y especialmente a la
detección múltiple de los tipos y subtipos del VIH.
El VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) es el
virus responsable del síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA) y pertenece a la familia de retrovirus humanos. Actualmente
se considera que el SIDA es una de las mayores amenazas para la
salud en los seres humanos. Un individuo infectado por VIH puede
transmitir la enfermedad, aunque permanezca asintomático durante
años.
Varios grupos de investigación identificaron en
1983-1984, de manera independiente, el supuesto
agente etiológico responsable del SIDA (véase por ejemplo
Barre-Sinoussi et al., Science
220:868-871; Montagnier et al., in Human
T-Cell Leukaemia Viruses (Gallo, Essex & Gross,
eds.); Vilmer et al., The Lancet 1:753), y posteriormente se
unificó la nomenclatura del VIH.
La familia del VIH comprende varios tipos y
subtipos. Los virus VIH1 pueden clasificarse de acuerdo a subtipos.
Los ejemplos de subtipos del VIH1 incluyen VIH1-M y
VIH1-O. De manera similar, los virus del VIH2
incluyen diversos sub-tipos, por ejemplo
VIH2-A y VIH2-B.
Para los ensayos de desarrollo de fármacos,
profilaxis, así como para el tratamiento del SIDA, ha comenzado
ahora a tener gran importancia el ser capaz de identificar y
cuantificar de forma rápida y sencilla el grupo (o grupos), tipo (o
tipos) y subtipo (o subtipos) de virus VIH presente en una muestra
determinada.
En este documento, por grupo de VIH, se entiende
cualquier grupo de VIH, independientemente de lo que se conoce o no
en la fecha de prioridad. Se conocen en la técnica diversos grupos
de VIH y se describen en la bibliografía y en las bases de datos
correspondientes, por ejemplo en ncbi en Internet. Ejemplos de los
mismos incluyen VIH1-M y VIH 1-O.
Por subtipo de VIH, en este documento se entiende cualquier subtipo
de VIH, independientemente de lo que se conoce o no en la fecha de
prioridad. Se conocen en la técnica diversos subtipos de VIH y se
describen en la bibliografía y bases de datos correspondientes, por
ejemplo en ncbi en Internet.
Por aislado del VIH, se entiende en este
documento cualquier aislado o cepa del VIH, independientemente de
lo que se conoce o no en la fecha de prioridad. Se conocen diversos
aislados del VIH en la técnica y se describen en la bibliografía y
en la base de datos correspondiente, por ejemplo en ncbi en
Internet. Algunos aislados se consideran como referencias. Ejemplos
de los mismos incluyen K03455, L20587 y M30502.
Un posible enfoque podría depender del
desarrollo de anticuerpos específicos. Sin embargo, en términos de
sensibilidad y especificidad, un enfoque basado en PCR normalmente
parece muy prometedor. Generalmente, esto también ofrece la
posibilidad de trabajar sobre muestras pequeñas.
En la técnica se conocen métodos de
amplificación, especialmente la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y métodos basados en PCR, por ejemplo PCR de transcriptasa
inversa (RT-PCR) y PCR (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch y Sambrook, CSHL Press;
Molecular Biology of the Cell, Alberts et al.; PCR Primer: A
Laboratory Manual, Dieffenbach y Dveksler, CSHL Press; The
Polymerase Chain Reaction, Mullis, Ferre y Gibbs, Birkhauser Boston
Press; Gene quantification, Ferre, Birkhauser Boston Press).
Generalmente estos métodos son herramientas muy
eficaces para el análisis cualitativo y cuantitativo de muestras
biológicas complejas.
Sin embargo, la eficacia de estas técnicas
depende típicamente de manera crucial del diseño y de la elección
de los cebadores.
Existe una técnica anterior que describe
cebadores específicos del VIH1 (US 5 712 385; EP 1 043 407; WO
03/020878; EP 1 344 837). También existe una técnica anterior que
describe cebadores específicos del VIH2 (US 5 962 665).
\vskip1.000000\baselineskip
Dependiendo de las condiciones de trabajo, al
menos alguno de estos cebadores de la técnica anterior puede
mostrar una especificidad suficiente para VIH1 o VIH2, permitiendo
de esta manera una detección específica del VIH1 y VIH2. Sin
embargo, de acuerdo con el conocimiento de los solicitantes, ninguno
de ellos permite:
- -
- una detección específica cuantitativa en tiempo real de dichos subtipos o
- -
- una detección múltiple de dichos subtipos que seguiría siendo específica o
- -
- una detección múltiple de dichos subtipos que seguiría siendo cuantitativa, incluso cuando se implementa en tiempo real.
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, dicha detección específica múltiple
cuantitativa en tiempo real sería más fiable y daría más
información sobre el estado de infección actual del paciente. Esto
proporcionaría por tanto tener acceso a un diagnostico más preciso,
y como consecuencia, permitiría equilibrar con mayor precisión los
efectos positivos frente a los negativos de un tratamiento
determinado. Permitiría ajustar o elegir el tratamiento que debería
ser más eficaz para el paciente particular que se diagnostica. Dicha
detección específica múltiple cuantitativa en tiempo real tendría
también la ventaja de ser más rápida y más fácil de ejecutar,
especialmente a gran escala.
La presente invención proporciona un proceso
para la detección del VIH.
La presente invención proporciona
oligonucleótidos, que incluyen cebadores y sondas, y conjuntos de
los mismos, que son adecuados para la detección del VIH.
En este sentido, la presente invención también
se refiere al campo de la amplificación, PCR y a métodos basados en
PCR, así como al diagnóstico.
Por PCR o reacción PCR, se entiende en este
documento cualquier método basado en PCR. Esto incluye PCR
convencional, PCR cualitativa, cuantitativa y
semi-cuantitativa, PCR en tiempo real, PCR de
transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR simple y
múltiple y similares.
Por PCR en tiempo real, se entiende en este
documento cualquier método basado en PCR que permite observar la
fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la
producción del amplicón durante cada ciclo de PCR a diferencia de
la detección de punto final por métodos PCR convencionales. Por PCR
cuantitativa se entiende en este documento cualquier método basado
en PCR que permite calcular la cantidad inicial de una determinada
diana de PCR en una muestra determinada.
Por PCR múltiple, se entiende en este documento
cualquier reacción de PCR que tiene por objeto la amplificación de
más que una diana. Por ejemplo, la PCR múltiple incluye PCR doble
(dos dianas), PCR triple (tres dianas) y PCR múltiples superiores.
La PCR múltiple incluye reacciones de PCR con más de un par de
cebadores, por ejemplo dos pares de cebadores. En este caso,
podrían ser cuatro cebadores diferentes, pero también es posible
que los dos pares de cebadores tengan un cebador en común, por
ejemplo, el cebador directo y tener dos cebadores inversos
distintos. La PCR múltiple también incluye reacciones PCR con un
único par de cebadores, pero con más de una sonda.
Por oligonucleótido, se entiende en este
documento cualquier polímero de nucleótidos corto, en el cual los
nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos; di
desoxirribonucleótidos, nucleótidos degenerados y similares. Dichos
oligonucleótidos, son preferiblemente monocatenarios. La longitud de
dichos oligonucleótidos puede variar y habitualmente es menor de
150 nucleótidos (nt), preferiblemente en el intervalo de
10-100 nt, más preferiblemente
15-60 nt, incluso más preferiblemente
18-50 nt. Dichos oligonucleótidos pueden llevar
modificaciones químicas, tales como etiquetado o marcaje, por
ejemplo, radioactivo, fluorescente, biotinilado, o marcado con dig.
De acuerdo con la invención un oligonucléotido puede ser directo
(sentido) o inverso (antisentido). Además, debería destacarse que
aunque puedan mencionarse funciones preferidas con respecto a
algunos oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, es
obvio que un oligonucleótido determinado puede asumir varias
funciones y puede usarse de diferentes maneras de acuerdo con la
presente invención. Por ejemplo, un oligonucleótido puede usarse
como un cebador, o como una sonda. También, cuando se describe que
un oligonucleótido es útil como una sonda de dirección a amplicón,
el especialista en la técnica entiende que la secuencia
complementaria de este oligonucleótido también es útil como una
sonda para dirigir el mismo amplicón. Además, también es obvio, que
cualquier cebador adecuado para un ensayo múltiple, también puede,
dentro del significado de la presente invención, usarse en un
protocolo simple. Lo mismo se aplica a un cebador adecuado para un
protocolo en tiempo real, que también puede usarse en el armazón de
un ensayo de punto final dentro del significado de la presente
invención.
Los oligonucleótidos de acuerdo con la invención
incluyen especialmente cebadores y sondas PCR. A menos que se
indique otra cosa, las secuencias de ácidos nucleicos aparecen en la
dirección 5' a 3'. Dichos oligonucleótidos pueden encontrarse de
muchas formas, por ejemplo, en estado seco, en solución/suspensión
con el disolvente y la concentración deseados. El especialista en
la técnica sabría que disolventes, concentraciones, condiciones de
almacenaje son adecuados para los oligonucleótidos de la invención.
En particular, el especialista en la técnica sabría como preparar
dichos oligonucleótidos como soluciones madre. Los oligonucleótidos
de acuerdo con la invención también pueden adoptar diversos grados
de crudeza, según puedan considerar los especialistas en la
técnica, por ejemplo por HPLC (cromatografía líquida de alto
rendimiento).
Por conjunto de nucleótidos, se entiende en este
documento cualquier combinación que comprende al menos un
oligonucleótido, preferiblemente al menos dos, por ejemplo
2-10 oligonucleótidos. Dicho conjunto puede
comprender por tanto un cebador PCR o un par de cebadores PCR, o
una sonda, o una sonda y un par de cebadores. Dichos
oligonucleótidos pueden mantenerse por separado o mezclarse parcial
o totalmente.
Los especialistas en la técnica conocen el
concepto de cebador o cebador de PCR. Este incluye, por ejemplo,
cualquier oligonucleótido capaz de hibridarse con un molde diana en
condiciones rigurosas adecuadas, y permitir la elongación de la
cadena de la polimerasa. La longitud típica de dicho cebador es
15-30 nt, preferiblemente 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24 ó 25 nt.
Los especialistas en la técnica también conocen
el concepto de sonda. Esta incluye, por ejemplo, cualquier
nucleótido capaz de hibridarse a un molde diana en las condiciones
de hibridación deseadas. La longitud típica de dicha sonda es de
20-55 nt, preferiblemente 15-60 nt,
más preferiblemente 20-55 nt, más preferiblemente
30-50 nt, más preferiblemente 35-45
nt. Preferiblemente, dicha sonda se marca con fluorescencia. Sin
embargo, los especialistas en la técnica tienen claro que en
determinadas condiciones, se puede usar un cebador como una sonda y
viceversa. Además, en este documento se destaca que los productos de
acuerdo con la presente invención, especialmente, entre otros,
oligonucleótidos, no se limitan al uso previsto mencionado en este
documento, sino que se interpretan en general, independientemente
del destino indicado. Por ejemplo, una reivindicación para un
producto (oligonucleótido) para un uso particular debería
interpretarse como un producto (oligonucleótido) que significa que
efectivamente es adecuado para el uso indicado. De esta manera, un
oligonucleótido adecuado para usar como un cebador en un protocolo
múltiple también se adapta claramente a un protocolo simple dentro
del significado de la presente invención.
En la técnica se conocen diversos formatos
(tipos) de sondas, que incluyen sondas Taqman^{TM} (sondas de
hidrólisis), molecular beacons^{TM} (sondas beacon o sondas
fluorescentes) y sondas Scorpion^{TM}.
En una realización preferida, todas las sondas
de acuerdo con la invención pueden sintetizarse y usarse en el
formato molecular beacon.
La estructura de las sondas fluorescentes es la
siguiente. Una secuencia corta de nucleótidos (denominada también
brazo beacon) que no está asociada a la secuencia diana está unida
covalentemente a ambos extremos de la sonda. Un brazo corto no
asociado está unido por tanto al extremo 5' de la sonda, y está
marcado con un resto fluorescente (es decir colorante fluorescente
o marcador fluorescente). Otro brazo pero todavía no asociado está
unido al extremo 3' de la sonda y está marcado con un resto de
extinción de fluorescencia. Por tanto, las sondas fluorescentes
tienen un fluoróforo y un extintor en los extremos opuestos. El
brazo corto en 5' es totalmente complementario al de 3' de manera
que pueden hibridar entre sí, y pueden por tanto adoptar una
estructura en horquilla cuando no está hibridado con la diana en
solución. En esta conformación de horquilla, el extintor y el
colorante fluorescente están lo bastante próximos entre sí para
permitir la extinción eficaz del fluoróforo. Sin embargo, cuando la
sonda encuentra una molécula diana, la hibridación se favorece con
respecto a la conformación de horquilla cuando se eligen
adecuadamente valores de Tm del brazo beacon y Tm de la sonda
(teóricamente; Tm de la sonda > Tm del brazo beacon >Tm del
cebador, donde Tm es la temperatura de fusión de interés). El
fluoróforo y el extintor se alejan uno del otro y el fluoróforo
puede después emitir fluorescencia cuando se ilumina mediante
excitación lumínica adecuada. Según avanza la PCR, el producto de
amplificación se acumula y la cantidad de fluorescencia en cualquier
ciclo determinado depende de la cantidad del producto de
amplificación presente en ese momento. (Véase, por ejemplo, Sanjay
Tyagi and Fred Russell Kramer, Nature Biotechnology 1996, vol.14,
pags. 303-308; Nature Biotechnology 1998, vol.16,
pags. 49-53).
(Observación: También es posible unir el
fluoróforo en el extremo 3', mientras que el extintor se fija al
extremo 5'). Esquemáticamente, dicha sonda puede tener la siguiente
fórmula (formato de sonda fluorescente):
5'
Fluoróforo-(brazo1)-sonda-(brazo2)-Extintor
3'
5'
Extintor-(brazo1)-sonda-(brazo2)-Fluoróforo
3'
en la que el brazo 1 y el brazo 2 puede ser
cualquier secuencia corta de nucleótidos, por ejemplo en el
intervalo de 3-10 nucleótidos, preferiblemente 5, 6,
7 nucleótidos, que permita la formación de la estructura en
horquilla en condiciones rigurosas adecuadas, es decir, el brazo1 y
el brazo2 son totalmente complementarios para hibridarse en las
condiciones rigurosas deseadas (las condiciones rigurosas de la PCR
convencional incluyen, por ejemplo, una temperatura de hibridación
de 55 a 65ºC y una concentración de Mg de 4 a 8 mM). Sin embargo,
el brazol y el brazo2 no están asociados a la secuencia diana de la
sonda, es decir la conformación en horquilla que resulta de la
hibridación entre el brazol y el brazo2 es esencialmente la única
estructura secundaria posible para la sonda cuando no se encuentra
hibridada. El especialista en la técnica sabría como elegir dichos
brazos para una sonda determinada.
\vskip1.000000\baselineskip
Por ejemplo, los formatos posibles de sondas
fluorescentes incluyen:
TGCGC-(secuencia de
sonda)-GCGCA
GCGCA-(secuencia de
sonda)-TGCGC
AGCGC-(secuencia de
sonda)-GCGCT
GCGCT-(secuencia de
sonda)-AGCGC
CGCGA-(secuencia de
sonda)-TCGCG
CGCGC-(secuencia de
sonda)-GCGCG.
\vskip1.000000\baselineskip
Por fluoróforo, se entiende en este documento
cualquier marcador/colorante fluorescente conocido en la técnica.
Los ejemplos de dichos marcadores fluorescentes adecuados incluyen
colorantes Fam, Hex, Tet, Joe, Rox, Tamra, Max, Edans, Cy tales
como Cy5, Fluoresceína, Coumarina, Eosina, Rodamina, Bodipy, Alexa,
Azul Cascade, Amarillo Yakima, Amarillo Lucifer y Rojo Texas (todos
son Marcas Registradas).
Por extintor, se entiende en este documento
cualquier extintor conocido en la técnica. Los ejemplos de dichos
extintores incluyen Dabcyl, Dark Quencher, Eclipse Dark Quencher,
ElleQuencher, Tamra, BHQ y QSY (todos son Marcas Registradas).
El especialista en la técnica sabría que
combinaciones de colorante/extintor son adecuadas cuando se diseña
una sonda.
En una realización preferida de acuerdo con la
invención, pueden seleccionarse propiedades espectrales de dichas
sondas para no interferir una con respecto a la otra. En particular,
cuando las sondas se usan en PCR múltiples, cada sonda única puede
tener su propio fluoróforo siendo significativamente diferentes
entre sí con respecto a las propiedades espectrales, es decir, los
espectros de absorción/emisión son esencialmente
no-solapantes. Esto permite de manera ventajosa la
detección múltiple de baja interferencia para todas las sondas
únicas, asegurando que las señales individuales no interfieran unas
con otras en la detección. Los ejemplos de colorantes que pueden
usarse juntos en PCR múltiples incluyen Fam con Tamra, Fam con Tamra
con Rojo Texas.
De acuerdo con la invención, todos los
oligonucleótidos proporcionados pueden conservarse por separado, o
mezclarse parcial o totalmente.
Dichos oligonucleótidos pueden proporcionarse en
forma seca, o disueltos en un disolvente adecuado, a criterio del
especialista en la técnica. Los disolventes adecuados incluyen TE,
agua de calidad para PCR y similares.
Posteriormente, las secuencias se identifican
mediante una SEC ID Nº:
Las secuencias correspondientes se proporcionan
en las tablas en las figuras adjuntas a ellas. En dichas tablas, se
usa el código convencional para nucleótidos degenerados.
En particular: R es G o A; Y es C o T; W es A o
T.
En las secuencias proporcionadas, donde diversas
posiciones son degeneradas, los especialistas en la técnica tienen
claro que cada posición degenerada se puede elegir de manera
independiente una con respecto a la otra. Por ejemplo, RY puede ser
GC, GT, AC, AT, combinaciones y mezclas de las mismas. Por tanto, la
SEC ID Nº: 52 puede ser una cualquiera de las SEC ID Nº: 25 a 51
(véase tabla) o combinaciones o mezclas de las mismas, etc.
Además, en dichas tablas, d indica un
oligonucleótido degenerado; e indica un oligonucleótido ampliado (es
decir la versión alargada de otro oligonucleótido); y 1 indica un
oligonucleótido en bucle.
Por oligonucleótido en bucle, en este documento
se entiende cualquier oligonucleótido, cuyo extremo 5' se ha
modificado añadiendo algunos nucleótidos (generalmente 3, 4, 5, 6 ó
7 nt) para ser complementario al extremo 3' de dicho cualquier
nucleótido. Por tanto, dicho oligonucleótido en bucle tiene la
característica ventajosa de poder adoptar una conformación en bucle
en determinadas condiciones rigurosas. Esta propiedad es
extremadamente ventajosa aumentando la especificidad y la
sensibilidad en un protocolo de PCR, en particular en un protocolo
múltiple, evitando interacciones entre cebadores, o entre cebadores
sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un proceso
para la detección del VIH como se define en las reivindicaciones.
En un aspecto, la invención proporciona un proceso para la detección
de al menos una diana del VIH, que comprende la etapa de producir
al menos un amplicón mediante al menos dos oligonucleótidos,
en el que dichos oligonucleótidos son adecuados
para usar en la amplificación específica de al menos una secuencia
molde de referencia seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M; y los fragmentos de la SEC ID Nº: 2 seleccionados de las posiciones 4281-4429 (SEC ID Nº: 306), 4283-4429 (SEC ID Nº: 307), 4283-4431 (SEC ID Nº: 308) de dicho aislado VIH1-M;
\newpage
- -
- las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O y los fragmentos de la SEC ID Nº: 4 seleccionados de las posiciones 4336-4484 (SEC ID Nº: 310), 4338-4484 (SEC ID Nº:311) de dicho aislado VIH1-O;
- -
- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) del aislado de referencia M30502 VIH2;
- -
- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) del aislado de referencia K03455 VIH1-M y el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 (SEC ID Nº: 305) de dicho aislado VIH1-M; y
- -
- las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-O y el fragmento de la SEC ID Nº:3 que es idéntico a las posiciones 4231-4484 (SEC ID Nº: 309) de dicho aislado VIH1-O.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, las secuencias molde de referencia
corresponden a fragmentos aislados de un determinado aislado del
VIH (es decir el fragmento que es idéntico a la secuencia que se
amplia a partir de las posiciones indicadas). Los oligonucleótidos
adecuados para usar en la amplificación específica de al menos dicha
secuencia molde de referencia se seleccionan por lo tanto para
conducir esta secuencia molde de referencia, a un emplazamiento tal
que conduciría a la amplificación de esta secuencia molde de
referencia en forma de fragmentos aislados.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, se proporciona un proceso para
la detección de al menos una diana del VIH, que comprende la etapa
de producir al menos un amplicón mediante al menos dos
oligonucleótidos,
en el que dichos oligonucleótidos son cebadores
"compatibles para protocolos cuantitativos" y/o "compatibles
para protocolos múltiples" que son adecuados para usar en la
amplificación específica de al menos una secuencia molde de
referencia seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- las posiciones 4281 -4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M y los fragmentos de la SEC ID Nº: 2 seleccionados de las posiciones 4281-4429, 4283-4429, 4283-4431 de dicho aislado VIH1-M (SEC ID Nº: 306, 307 y 308);
- -
- las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O y los fragmentos de la SEC ID Nº: 4 seleccionados de las posiciones 4336-4484, 4338-4484 de dicho aislado VIH1-O (SEC ID Nº: 310 y 311);
- -
- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) del aislado de referencia M30502 VIH2;
- -
- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) del aislado de referencia K03455 VIH1-M y el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 (SEC ID Nº: 305) de dicho aislado VIH1-M; y
- -
- las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-O, y el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que es idéntico a las posiciones 4231-4484 (SEC ID Nº: 309) de dicho aislado VIH1-O.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento
para detección de al menos una diana del VIH, que comprende la
amplificación de al menos una secuencia molde de referencia
seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M y los fragmentos de la SEC ID Nº: 2 seleccionados de las posiciones 42814429, 4283-4429, 4283-4431 de dicho aislado VIH1-M;
- -
- las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O y los fragmentos de la SEC ID Nº: 4 seleccionado de las posiciones 4336-4484, 4438-4484 de dicho aislado VIH1-O;
- -
- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) del aislado de referencia M30502 VIH2;
- -
- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) del aislado de referencia K03455 VIH1-M y el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 de dicho aislado VIH1-M; y
- -
- las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH-O y el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que es idéntico a las posiciones 4231-4484 de dicho aislado de VIH1-O.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, dicho proceso
comprende la etapa de detectar dicho amplicón mediante al menos una
sonda.
Los especialistas en la técnica conocen el
término amplicón. Por amplicón, se entiende en este documento
cualquier producto de amplificación.
La amplificación se conoce en la técnica, y
puede ser cualquier proceso que implique al menos una etapa de
amplificación, en particular al menos una PCR o una etapa de
amplificación basada en PCR.
Por oligonucleótido "compatible para
protocolos múltiples" se entiende en este documento cualquier
oligonucleótido que puede usarse satisfactoriamente en un protocolo
(PCR) múltiple. En particular, los oligonucleótidos "compatibles
para protocolos múltiples" permiten resultados específicos y
sensibles en un protocolo múltiple.
Por oligonucleótido "compatible para
protocolos cuantitativos", se entiende en este documento
cualquier oligonucleótido que puede usarse satisfactoriamente
protocolo (PCR) cuantitativo. En particular, los oligonucleótidos
"compatibles para protocolos cuantitativos" permiten
resultados específicos, sensibles y cuantitativos.
En este documento, una secuencia complementaria
a otra secuencia, se refiere a una secuencia que es complementaria
a dicha otra secuencia a lo largo de la longitud completa de esa
otra secuencia.
Aunque el proceso de acuerdo con la presente
descripción puede realizarse ventajosamente en el armazón de un
protocolo múltiple, evidentemente también puede realizarse como un
protocolo simple, por ejemplo un protocolo de punto final o
cualitativo simple.
Por secuencia molde de referencia, como se usa
en este documento se entiende cualquier secuencia molde que puede
usarse como una referencia para el alineamiento. Por ejemplo,
algunos genomas se consideran como genomas de referencia. El
alineamiento secuencial se conoce en la técnica. Ventajosamente de
acuerdo con la invención, las SEC ID Nº: 1 a 5 y los fragmentos de
las mismas mencionados anteriormente son secuencias molde de
referencia que comparten la característica técnica específica de
ser referencias adecuadas para construir y producir cebadores que
permiten una detección cuantitativa de al menos uno de los subtipos
del VIH1-M, VIH1-O,
VIH2-A y VIH2-B. Dichas secuencias
molde de referencia son referencias adecuadas para construir y
producir cebadores que permiten:
- -
- una detección cuantitativa en tiempo real de al menos uno de dichos subtipos del VIH,
- -
- una detección múltiple de al menos uno de dichos subtipos del VIH,
- -
- una detección múltiple cuantitativa en tiempo real de al menos uno de dichos subtipos del VIH.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias molde de referencia de dicha
invención comprenden notablemente las secuencias seleccionadas del
grupo que consiste en:
- -
- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) del aislado de referencia K03455 VIH1-M y los fragmentos de la SEC ID Nº: 1 seleccionados de las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2), 4281-4429, 4283-4429, 4283-4431 y 4176-4429 de dicho aislado de referencia K03455 VIH1-M;
- -
- las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-O y los fragmentos de la SEC ID Nº: 3 seleccionados de las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4), 4336-4484, 4338-4484 y 4231- 4484 de dicho aislado de referencia L20587 VIH1-O;
- -
- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) del aislado de referencia M30502 VIH2.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, el proceso de acuerdo con la
descripción permite ventajosamente la detección específica y
sensible de los principales grupos y/o tipos y/o subtipos del VIH y
posiblemente prácticamente cualquiera de los grupos y/o tipos y/o
subtipos del VIH, mediante un protocolo de amplificación
cuantitativo en tiempo real y/o múltiple. Los ejemplos de dichos
grupos y/o tipos y/o subtipos incluidos mediante el proceso de
acuerdo con la presente invención incluyen los subtipos A (A1 y
A2), B, C, D, F (F1 y F2), G, H, J y K del VIH1-M,
pero también las formas recombinantes AE, AG, AB, DF, BC, CD, BF y
BG, y también U (muy divergente). Ejemplos adicionales de los
mismos comprenden los subtipos A, B del VIH2.
La invención por tanto proporciona un proceso de
detección del VIH por amplificación de ácidos nucleicos que:
- -
- puede ser específica de grupo y/o tipo y/o subtipo,
- -
- es cuantitativa y más particularmente permite una detección cuantitativa del VIH en tiempo real,
- -
- puede implementarse en un protocolo múltiple permaneciendo específica e incluso puede implementarse en un protocolo de amplificación múltiple cuantitativa (posiblemente en tiempo real).
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, el proceso de acuerdo con la
invención puede facilitar ventajosamente procedimientos de
diagnóstico diferenciando los grupos VIH1-M y
VIH1-O del grupo VIH2 e incluyendo un espectro muy
amplio de tipos y/o subtipos del VIH usando un sólo
procedimiento.
En un aspecto de la invención, dicha secuencia
molde de referencia es la SEC ID Nº: 2, del aislado de referencia
K03455 VIH1-M o un fragmento de la SEC ID Nº: 2
seleccionado de las posiciones 4281-4429,
4283-4429, 4283-4431.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, dicha secuencia molde de
referencia es la SEC ID Nº: 2, del aislado de referencia K03455
VIH1-M de uno de dichos fragmentos de la SEC ID Nº:
2, y dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido
seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 9, 12, 14, 15, 24, 52, 82, 91, 100, 109, 118, 127, 136, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118; 127, 136 a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
En una realización preferida dicho proceso se
realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 9, 12, 14, 15, 24, 52, 82.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, dicho proceso se realiza
con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida, dicho proceso
se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que
consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 9, 12, 14, 15;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 24, 52, 82.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aún más preferida, dicho
proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 9, 12, 14, 15;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 24, 52, 82;
y, opcionalmente, con al menos una sonda
seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 110, 118, 127, 136, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto las posibles combinaciones de
cebadores (pares de cebadores) son las siguientes:
donde X indica que los cebadores
pueden combinarse entre sí como un par y que cada par de cebadores
puede además usarse en combinación con una cualquiera de las sondas
seleccionadas del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 110, 118, 127, 136, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto de la invención, dicha secuencia
molde de referencia es SEC ID Nº: 4, del aislado de referencia
L20587 VIH-O o un fragmento de la SEC ID Nº: 4
seleccionado de 4336-4484,
4338-4484.
\global\parskip0.900000\baselineskip
En una realización de la invención, dicha
secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 4, del aislado de
referencia L20587 VIH1-O o uno de dichos fragmentos
de la SEC ID Nº: 4 y dicho proceso se realiza con al menos un
oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 148, 157, 167, 170, 179, 189, 190 a 194 y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 190 a 194 a lo largo de la longitud completa de esta SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, dicho proceso
puede realizarse con al menos un cebador seleccionado del grupo que
consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 148, 157, 167, 170, 179, 189.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, dicho proceso se realiza
con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 190 a 194 y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida, dicho proceso
se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que
consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 148, 157, 167;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 170, 179, 189.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aún más preferida, dicho
proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 148, 157, 167;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 170, 179, 189;
y, opcionalmente, con al menos una sonda
seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 190 a 194, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto las posibles combinaciones de
cebadores (pares de cebadores) son las siguientes:
donde X indica que los cebadores
pueden combinarse entre sí como un par y que cada par de cebadores
puede además usarse en combinación con una cualquiera de las sondas
seleccionadas del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 190, 191, 192, 193, 194, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto de la invención, dicha secuencia
molde de referencia es la SEC ID Nº: 5, del aislado de referencia
M30502 VIH2.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización de la invención, dicha
secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 5, del aislado de
referencia M30502 VIH2 y dicho proceso se realiza con al menos un
oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249, 276, 287, 296, 297 a 303, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 297 a 303 a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, dicho proceso se
realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249, 276, 287, 296.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, dicho proceso se realiza
con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 297 a 303, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida, dicho proceso
se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que
consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 276, 287, 296.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aún más preferida, dicho
proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 276, 287, 296;
y, opcionalmente, con al menos una sonda
seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 297 a 303 y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto las posibles combinaciones de
cebadores (pares de cebadores) son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde X indica que los cebadores
pueden combinarse entre sí como un par y que cada par de cebadores
puede además usarse en combinación con una cualquiera de las sondas
seleccionadas del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto de la invención, dicha secuencia
molde de referencia es la SEC ID Nº: 1, del aislado de referencia
K03455 VIH1-M o el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que
es idéntico a las posiciones 4176-4429 de dicho
aislado de referencia K03455 VIH1-M.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización de la invención, dicha
secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 1, del aislado de
referencia K03455 VIH1-M o dicho fragmento de la
misma y dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido
seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 6, 24, 52, 82, 91, 100, 109, 118, 127, 136, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, a lo largo de la longitud completa de esta SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, dicho proceso se
realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 6, 24, 52, 82.
En otra realización, dicho proceso se realiza
con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136 y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida, dicho proceso
se realiza con al menos un cebador seleccionado que es:
- -
- SEC ID Nº: 6;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 24, 52, 82.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aún más preferida, dicho
proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado que es:
- -
- SEC ID Nº: 6;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 24, 52, 82;
y opcionalmente, con al menos una sonda
seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136 y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto las posibles combinaciones de
cebadores (pares de cebadores) son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde X indica que los cebadores
pueden combinarse entre sí como un par y que cada par de cebadores
puede además usarse en combinación con una cualquiera de las sondas
seleccionadas del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto de la invención, dicha secuencia
molde de referencia es la SEC ID Nº:31, del aislado de referencia
L20587 VIH1-O o el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que
es idéntico a las posiciones 4231-4484 de dicho
aislado de referencia L20587 VIH1-O.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización de la invención, dicha
secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 3, del aislado de
referencia L20587 VIH1-O o dicho fragmento de la
misma y dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido
seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 139, 170, 179, 189, 190 a 194, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 190 a 194 a lo largo de la longitud completa de esta SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, dicho proceso se
realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 139, 170, 179, 189.
\newpage
En otra realización, dicho proceso se realiza
con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 190 a 194 y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más preferida, dicho proceso
se realiza con al menos un cebador que es:
- -
- SEC ID Nº: 139;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 170, 179, 189.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización aún más preferida, dicho
proceso se realiza con al menos un cebador que es:
- -
- SEC ID Nº: 139;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo
que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 170, 179, 189;
y, opcionalmente, con al menos una sonda
seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 190 a 194, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto las posibles combinaciones de
cebadores (pares de cebadores) son las siguientes:
donde X indica que los cebadores
pueden combinarse entre sí como un par y que cada par de cebadores
puede además usarse en combinación con una cualquiera de las sondas
seleccionadas del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 190, 191, 192, 193, 194, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto de la invención, dicha etapa de
producir al menos un amplicón comprende al menos una amplificación
PCR cuantitativa y/o cualitativa, múltiple y/o simple.
En otro aspecto de la invención, dichas etapa de
detección incluye preferiblemente detección en tiempo real y/o
cuantitativa y/o de punto final.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un amplicón que puede obtenerse mediante el proceso
descrito anteriormente, es decir realizando el proceso de la
invención en una muestra que contiene el VIH.
En un aspecto adicional, se proporciona una
composición de amplificación que comprende al menos un amplicón de
acuerdo con la invención. Por composición de amplificación, se
entiende en este documento cualquier composición que puede
obtenerse por amplificación, especialmente por PCR.
La invención también se refiere a un
polinucleótido adecuado para el uso como una secuencia molde de
referencia en el diseño de cebadores que pueden usarse en
protocolos múltiples para incluir al menos el
VIH1-M, VIH1-O,
VIH2-A y VIH2-B en un único proceso
de amplificación al mismo tiempo que se ofrece una amplificación
cuantitativa en tiempo real de la misma. Desde luego, los
polinucleótidos de acuerdo con la presente invención también son
adecuados para protocolos adicionales, que incluyen protocolos
simples, protocolos múltiples, protocolos de punto final,
protocolos cualitativos, protocolos cuantitativos, combinaciones de
los mismos y similares.
Por polinucleótido, se entiende en este
documento cualquier polímero de nucleótidos, en el que los
nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos; di
desoxirribonucleótidos, nucleótidos degenerados y similares. Dichos
nucleótidos son preferiblemente monocatenarios, pero también pueden
ser bicatenarios. La longitud de dichos polinucleótidos puede
variar y habitualmente es menor de 500 nucleótidos (nt),
preferiblemente en el intervalo de 50-400 nt, más
preferiblemente 100-300 nt, incluso más
preferiblemente 150-250 nt.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, dicho
polinucleótido molde de referencia es:
- -
- las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M (véase la Figura 7) o un fragmento de la SEC ID Nº: 2 seleccionada de 4281-4429, 4283-4429, 4283-4431.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, dicho polinucleótido molde
de referencia es:
- -
- las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O (véase la Figura 7) o un fragmento de la SEC ID Nº: 4 seleccionado de 4336-4484, 4338-4484.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, dicho polinucleótido molde
de referencia es:
- -
- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) del aislado de referencia M30502 VIH2 (véase la Figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Incluso en otra realización, dicho
polinucleótido molde de referencia es:
- -
- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) del aislado de referencia K03455 VIH1-M (véase la Figura 7) o el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 de dicho aislado K03455 VIH1-M.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización adicional, dicho
polinucleótido molde de referencia es:
- las posiciones 4231-4491 (SEC
ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-O
(véase la Figura 7) o el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que es
idéntico a las posiciones 4231-4484 de dicho aislado
L20587 VIH1-O.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un oligonucleótido adecuado para la detección de VIH:
véanse las Figuras 7 a 21.
En una realización, la invención proporciona un
oligonucleótido que se selecciona del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 6 a 304, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 83-138, 190-194, 297-304 a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida la invención
proporciona un oligonucleótido que se selecciona del grupo que
cosiste en:
- -
- SEC ID Nº: 6, 9, 12, 14, 15,24, 52, 82, 91, 100, 109, 118, 127, 136, 139, 148, 157, 167, 170, 179, 189, 190 a 194, 221, 249, 276, 287, 296, 297 a 303, y
- -
- las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, 190, 191, 192, 193, 194, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
En una aspecto, la invención proporciona un
oligonucleótido que es adecuado para la detección de
VIH1-M y que se selecciona del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 6, 9,12, 14, 15, 24, 52, 82, 91, 100, 109, 118, 127,136 y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136 a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención proporciona un
oligonucleótido que es adecuado para la detección de
VIH1-O y que se selecciona del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 139, 148, 157, 167, 170, 179, 189, 190 a 194, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 190-194, a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
Aun en otro aspecto, la invención proporciona un
oligonucleótido que es adecuado para la detección de
VIH2-A y que se selecciona del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249, 276, 287, 296, 297 a 299, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 297-299, a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto más, la invención proporciona un
oligonucleótido que es adecuado para la detección de
VIH2-B y que se selecciona del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249, 276, 287, 296, 300 a 303, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 300-303, a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
Por favor obsérvese que secuencias tales como la
SEC ID Nº: 9 o la SEC ID N: 12 son secuencias degeneradas. La SEC
ID Nº: 9 con R=A es idéntica a la SEC ID Nº: 8; la SEC ID Nº: 12 con
R=A es idéntica a la SEC ID Nº: 11.
En otro aspecto, la invención proporciona lo
siguientes oligonucleótidos que son adecuados para los usos
indicados:
En un aspecto adicional, la invención
proporciona los siguientes oligonucleótidos, que son adecuados para
los usos indicados:
En una realización preferida, se proporcionan
los siguientes oligonucleótidos:
En una realización preferida, cualquier
nucleótido de acuerdo con la invención puede marcarse con
fluorescencia.
En otro aspecto, la invención proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuados para la detección de VIH.
En una realización, la invención proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuados para la detección de
VIH1-M.
En una realización preferida, la invención
proporciona un conjunto de nucleótidos adecuados para la detección
de VIH1-M que comprende:
- -
- al menos un oligonucleótido (cebador) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 6, 9, 12, 14, 15; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido (cebador) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 24, 52, 82; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido (sonda) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
Por tanto las posibles combinaciones de
oligonucleótidos son las siguientes:
donde X indica que los
oligonucleótidos pueden combinarse entre sí como un par (par de
cebadores) y que cada par de cebadores puede usarse además en
combinación con uno cualquiera de los oligonucleótidos (sondas)
seleccionados del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 110, 118, 127, 136, y las secuencias complementarias de las mismas.
En un aspecto adicional, se proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección de
VIH1-O.
En una realización preferida, se proporciona un
conjunto de nucleótidos adecuados para la detección de
VIH1-O, que comprende:
- -
- al menos un oligonucleótido (cebador) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 139, 148, 157, 167; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido (cebador) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 170, 179, 189; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido (sonda) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 190 a 194, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 190-194, a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
Por tanto las posibles combinaciones de
oligonucleótidos son las siguientes:
donde X indica que los
oligonucleótidos pueden combinarse entre sí como un par (par de
cebadores) y que cada par de cebadores puede usarse además en
combinación con uno cualquiera de los oligonucleótidos (sondas)
seleccionados del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 190, 191, 192, 193, 194, y las secuencias complementarias de las mismas.
En un aspecto adicional, se proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuados para la detección de
VIH2-A.
En una realización preferida, se proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuados para la detección de
VIH2-A, que comprende:
- -
- al menos un oligonucleótido (cebador) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 221, 249; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido (cebador) seleccionado del grupo que consiste las SEC ID Nº: 276, 287, 296; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido (sonda) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 297 a 299 y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 297-299 a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
Por tanto las posibles combinaciones de
oligonucleótidos son las siguientes:
donde X indica que los
oligonucleótidos pueden combinarse entre sí como un par (par de
cebadores) y que cada par de cebadores puede usarse además en
combinación con uno cualquiera de los oligonucleótidos (sondas)
seleccionados del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 297, 298, 299 y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, se proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuados para la detección de
VIH2-B.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, se proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuados para la detección de
VIH2-B, que comprende:
- -
- al menos un oligonucleótido (cebador) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 221, 249; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido (cebador) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 276, 287, 296; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido (sonda) seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 300 a 303, y las secuencias que son complementarias a una de las SEC ID Nº: 300-303, a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº:
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto las posibles combinaciones de
oligonucleótidos son las siguientes:
donde X indica que los
oligonucleótidos pueden combinarse entre sí como un par (par de
cebadores) y que cada par de cebadores puede usarse además en
combinación con uno cualquiera de los oligonucleótidos (sondas)
seleccionados del grupo que consiste
en:
- -
- SEC ID Nº: 300, 301, 302, 303, y las secuencias complementarias de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, se proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuados para la detección múltiple
del VIH.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, se proporciona un
conjunto de oligonucleótidos adecuados para la detección del VIH,
preferiblemente detección múltiple, que comprende:
- -
- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, y las secuencias complementarias de las mismas; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 190 a 194, y las secuencias complementarias de las mismas; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 297 a 299, y las secuencias complementarias de las mismas; y/o
- -
- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 300 a 303, y las secuencias complementarias de las mismas; y/o
- -
- combinaciones de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Dicho conjunto de oligonucleótidos de acuerdo
con la invención puede por tanto comprender cualquier combinación
de las mismos de 2, 3, 4, 5 y más de dichos oligonucleótidos.
En una realización preferida, dicho conjunto de
oligonucleótidos puede ser una combinación de sondas, por ejemplo
una combinación de una sonda VIH1-M y una sonda
VIH1-O:
En otra realización, dicho conjunto de
oligonucleótidos puede ser una combinación de sondas, por ejemplo
una combinación de una sonda VIH2-A y una sonda
VIH2-B:
Otras posibilidades incluyen:
y
En una realización preferida, en cualquier
conjunto de nucleótidos de acuerdo con la invención, al menos uno
de dicho oligonucleótidos está marcado con fluorescencia.
Se proporciona adicionalmente un amplicon que
puede obtenerse mediante al menos un oligonucleótido de acuerdo con
la invención y/o al menos conjunto de nucleótidos de acuerdo con la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona más particularmente un amplicon
que puede obtenerse por amplificación de una muestra que contiene
el VIH con un par de cebadores seleccionados de:
- -
- un cebador de las SEC ID Nº: 9, 12, 14 ó 15, y un cebador de las SEC ID Nº: 24, 52 ó 82; o
- -
- un cebador de las SEC ID Nº: 148, 157 ó 167, y un cebador de las SEC ID Nº: 170, 179 ó 189; o
- -
- un cebador de las SEC ID Nº: 221 ó 249, y un cebador de las SEC ID Nº: 276, 287 ó 296; o
- -
- un cebador de las SEC ID Nº: 6, y un cebador de las SEC ID Nº: 24, 52 ó 82; o
- -
- un cebador de las SEC ID Nº: 139, y un cebador de las SEC ID Nº: 170, 179 ó 189.
\vskip1.000000\baselineskip
También se proporciona un amplicon que tiene un
longitud de nucleótidos idéntica a la longitud de nucleótidos de
una de las secuencias moldes de referencia de la invención (es decir
las SEC ID Nº: 2, 4, 5, 1 ó 3 y los fragmentos de las mismas
mencionados anteriormente) y que comprende una secuencia que tiene
un porcentaje de identidad de nucleótidos de al menos el 90%,
preferiblemente al menos el 91%, más preferiblemente al menos el
92%, más preferiblemente al menos el 93%, más preferiblemente al
menos el 94%, más preferiblemente al menos el 95%, mas
preferiblemente al menos el 96%, más preferiblemente al menos el
97%, más preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al
menos el 99%, más preferiblemente del 100%, con una secuencia sonda,
a lo largo de la longitud completa de esta secuencia sonda, en la
que esta secuencia sonda es una de las siguientes: SEC ID Nº: 91,
100, 109, 118, 127, 136, 190, 191, 192, 193, 194, 297, 298, 299,300,
301, 302, 303, y las secuencias que son complementarias a estas SEC
ID Nº: a lo largo de la longitud completa de estas SEC ID Nº.
En la presente invención también se incluye una
composición de amplificación que comprende un amplicón de este
tipo.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un kit. En una realización preferida, dicho kit
comprende al menos un oligonucleótido (cebador o sonda) de acuerdo
con la invención, como se describe anteriormente.
En otra realización, dicho kit comprende al
menos un par de cebadores de acuerdo con la invención, como se
describe anteriormente.
En otra realización más, dicho kit comprende al
menos un conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con la descripción,
por ejemplo al menos una pluralidad de sondas de acuerdo con la
invención, como se describe anteriormente.
En el kit de acuerdo con la descripción, los
oligonucleótidos (cebadores, sondas) pueden guardarse por separado
o mezclados parcial o totalmente.
Dicho oligonucleótidos pueden proporcionarse en
forma seca o disueltos en un disolvente adecuado, según criterio
del especialista en la técnica.
Los disolventes adecuados incluyen TE, agua de
calidad para PCR y similares.
En una realización preferida, el kit de acuerdo
con la descripción también puede contener otros reactivos adecuados
para una etapa de PCR, posiblemente incluyendo reactivos adecuados
para una etapa RT-PCR.
Los especialistas en la técnica conocen dichos
reactivos e incluyen agua, de tipo agua sin nucleasa, agua sin
RNasa, agua sin ADNasa, agua de calidad para PCR; sales; del tipo
magnesio, potasio; tampones tales como Tris; enzimas, incluyendo
polimerasas, tales como Taq, Vent, Pfu (todas son Marcas
Registradas), polimerasa que puede activarse, transcriptasa inversa
y similares; nucleótidos de tipo desoxinucleótidos,
didesoxinucleótidos, dNTP, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP; otros
reactivos de tipo DTT y/o inhibidores de RNasa y polinucleótidos de
tipo poliT, polidT, y otros oligonucleótidos, por ejemplo
cebadores.
En otra realización preferida, el kit de acuerdo
con la descripción comprende controles de PCR. Dichos controles se
conocen en la técnica e incluyen controles cualitativos, controles
positivos, controles negativos, controles internos, controles
cuantitativos, controles internos cuantitativos, así como intervalos
de graduación. Los controles internos para dicha etapa de PCR
pueden ser un molde que no está asociado al molde diana en la etapa
de PCR. Dichos controles también pueden comprender cebadores de
control y/o sondas de control. Por ejemplo, en el caso de detección
del VIH, es posible usar como un control interno, un polinucleótido
elegido dentro de un gen cuya presencia se excluye en una muestra
originada a partir de un cuerpo humano, (por ejemplo, a partir de
un gen vegetal) y cuyo tamaño y contenido en GC es equivalente a los
de la secuencia diana.
En una realización preferida, el kit de acuerdo
con la descripción contiene medios para extraer y/o purificar
ácidos nucleicos de una muestra biológica, por ejemplo de sangre,
suero, plasma. Los especialistas en la técnica conocen bien dicho
medios. En una realización preferida, el kit de acuerdo con la
invención contiene instrucciones para su uso. Ventajosamente dichas
instrucciones pueden estar en un prospecto, una tarjeta o similar.
Dichas instrucciones también pueden presentarse de dos formas: una
detallada, que recoge información exhaustiva sobre el kit y su uso,
posiblemente incluyendo también datos bibliográficos; y en forma de
guía rápida o una memoria, por ejemplo en forma de una tarjeta, que
recoge la información básica necesaria para su uso.
En una realización preferida, dicho kit es un
kit para realizar diagnósticos, especialmente un kit para
diagnósticos in vitro, es decir un kit para diagnósticos del
VIH.
La presente descripción también se relaciona con
el campo de la diagnosis.
Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente
descripción, y según se describe anteriormente, pueden usarse para
realizar diagnósticos in vitro de los tipos y subtipos del
VIH. En particular, los cebadores y las sondas de acuerdo con la
invención pueden usarse para cuantificar in vitro los ácidos
nucleicos del VIH y los sub-tipos y tipos presentes
en una muestra in vitro, por ejemplo, en sangre, plasma y/o
suero de un paciente o en un sobrenadante de cultivo celular.
Es también un objeto de la presente descripción
proporcionar un método para detectar la presencia de ácido nucleico
del VIH en una muestra.
En una realización, dicho método comprende la
etapa de proporcionar al menos una muestra que se sospecha que
comprende al menos un molde diana de al menos un tipo y/o subtipo
y/o aislado del VIH.
Por ácido nucleico, en este documento se
entiende que es cualquier ácido nucleico: este puede ser sintético
o no, recombinante o de origen natural, lineal o circular. Esto
incluye ADN y ARN. El ácido nucleico puede ser monocatenario o
bicatenario o incluso tricatenario. Puede proceder de diversas
fuentes biológicas, tales como microorganismos (bacterias,
levaduras, y similares) u organismos superiores, como células de
mamíferos. Dicho ácido nucleico también puede ser de naturaleza
viral, por ejemplo de naturaleza retroviral, como los VIH. El ácido
nucleico también puede comprender ADN total, ARN total, ADN
genómico, ADN mitocondrial, ADN plasmídico, ADN BAC (cromosoma
artificial bacteriano) y mezclas de los mismos. Además, el ácido
nucleico puede adoptar diversos estados de pureza.
Por muestra, en este documento se entiende que
es cualquier tipo de muestra, de origen natural o no.
Preferiblemente, dicha muestra es de origen biológico. Dicha
muestra puede proceder también de un sobrenadante de cultivo
celular. En una realización preferida, dicha muestra deriva de
sangre. Más preferiblemente, dicha muestra que contiene ácido
nucleico deriva de suero y/o plasma. También puede que dicha muestra
proceda de una etapa preliminar. Por ejemplo, dicha muestra puede
que se obtenga mediante un procedimiento de purificación y/o
extracción, por ejemplo de una muestra de sangre. En particular,
dicha muestra puede ser el resultado de un proceso de separación
y/o purificación y/o extracción realizado en una muestra biológica.
Dicha muestra también puede ser una muestra de control. Las
muestras de control incluyen muestras como control cualitativo,
control positivo, control negativo, control cuantitativo y control
de graduación. Dicho control puede ser interno así como externo.
Cualquier muestra de acuerdo con la presente invención puede
presentarse varias veces. Por ejemplo, dicha muestra puede
proporcionarse duplicada, triplicada, cuadruplicada...multiplicada,
lo que resulta ventajoso en el caso de experimentos
cuantitativos.
El especialista en la técnica está familiarizado
con el concepto del molde diana. Dicho molde diana puede ser
cualquier ácido nucleico, cuya presencia se ensaya en dicho método.
Dicho molde diana es posiblemente, pero no necesariamente, el ácido
nucleico a amplificar en dicho método (amplicon PCR).
Dicho método puede comprender la etapa de
proporcionar al menos una muestra que contiene ácido nucleico que
se sospecha que comprende al menos un molde diana de al menos un
tipo y/o subtipo del VIH.
En un aspecto de la invención, dicho método
comprende la etapa de proporcionar al menos un nucleótido de acuerdo
con la invención (por ejemplo cebador y/o sonda PCR) y/o al menos
un conjunto de nucleótidos (por ejemplo un par de cebadores) de
acuerdo con la invención.
En una realización, dicho método comprende la
etapa de poner en contacto dicha muestra que contiene ácido
nucleico con al menos un oligonucleótido de acuerdo con la invención
y/o al menos un conjunto de nucleótidos de acuerdo con la
invención, en condiciones que permiten la hibridación de dicho
cebador y/o dicho par de cebadores y/o dicha sonda en dicho molde.
En otro aspecto, dicho método comprende la etapa de observar o
detectar la presencia de un producto hibridado, revelando por lo
tanto la presencia inicial de un ácido nucleico del VIH en dicha
muestra.
Un objeto adicional de la descripción es
proporcionar un método para la detección específica cuantitativa de
los tipos y subtipos del VIH en una muestra, preferiblemente por
análisis PCR múltiple cuantitativo en tiempo real.
En una realización, dicho método comprende la
etapa de proporcionar al menos una muestra que se sospecha que
comprende al menos un molde diana de al menos un tipo y/o subtipo
del VIH.
En otra realización preferida, dicho método
comprende la etapa de proporcionar al menos un oligonucleótido de
acuerdo con la invención (por ejemplo cebador y/o sonda PCR) y/o al
menos un conjunto de nucleótidos de acuerdo con la invención (por
ejemplo par de cebadores).
En una realización preferida, dicha sonda es
adecuada para la detección de un supuesto amplicon del VIH que
puede obtenerse con dicho par de cebadores.
En una realización preferida de acuerdo con la
invención, las propiedades espectrales de dichas sondas pueden
elegirse de manera que no interfieran entre ellas. En particular,
cuando las sondas se usan en protocolos múltiples, cada sonda única
puede tener su propio fluoróforo con propiedades espectrales
significativamente diferentes entre sí, es decir, el espectro de
absorción/emisión es esencialmente no-solapante. De
manera ventajosa, esto permite la detección múltiple con baja
interferencia para todas las sondas únicas, asegurando que en la
detección las señales individuales no interfieren entre ellas. Los
ejemplos de colorantes que pueden usarse juntos en protocolos
múltiples incluyen Fam con Tamra, Fam con Tamra y Rojo Texas.
En otra realización preferida, dicho método
comprende la etapa de poner en contacto dicha muestra, en presencia
de dicho oligonucleótido (u oligonucleótidos) y/o cebador (o
cebadores) y/o par (o pares) de cebadores y/o sonda (o sondas) y/o
conjunto (o conjuntos) de oligonucleótidos y posiblemente en
presencia de reactivos adecuados, en las condiciones adecuadas para
realizar la amplificación PCR de dicho molde diana con dicho par (o
pares) de cebadores y/o conjunto (o conjuntos).
Dicha amplificación PCR puede ser cualquier
reacción PCR, incluyendo RT-PCR.
Dichos reactivos adecuados se conocen en la
técnica, y ejemplos de los mismos incluyen agua, como agua sin
nucleasa, agua sin RNasa, agua sin ADNasa, agua de calidad para PCR;
sales, como magnesio, potasio; tampones tales como Tris; enzimas,
que incluyen polimerasas, tales como Taq, Vent, Pfu (todas ellas
Marcas Registradas), polimerasa que puede activarse, transcriptasa
inversa, y similares; nucleótidos como desoxinucleótidos,
didesoxinucleótidos, dNTP, dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP; otros
reactivos, como DTT y/o inhibidores de RNasa; y polinucleótidos
como poliT, polidT. Ventajosamente de acuerdo con la invención, al
menos parte de estos reactivos pueden usarse como una
pre-mezcla. Los especialistas en la técnica conocen
que cantidades de estos reactivos deben usarse.
En una realización preferida, los cebadores de
acuerdo con la descripción se usan en un intervalo de concentración
final de 100-2000 nM. Típicamente, dichos cebadores
pueden usarse a un intervalo de concentración final de
200-1500 nM, preferiblemente
250-1000 nM, más preferiblemente
500-1000 nM, incluso más preferiblemente
600-1000 nM.
La concentración de la sonda en una reacción PCR
puede optimizarse, típicamente variando la concentración final de
50 nM a 1000 nM. En una realización preferida, las sondas de acuerdo
con la invención se usan a un intervalo de concentración final de
50-1000 nM, preferiblemente 100-800
nM, más preferiblemente 100-600 nM, incluso más
preferiblemente 200-600 nM.
Los especialistas en la técnica conocen bien
dichas condiciones. Estas incluyen condiciones de temperatura, en
particular condiciones de ciclo térmico, por ejemplo, temperatura,
duración, número, tasa de calentamiento de los ciclos. En una
realización preferida, dichas condiciones de temperatura incluyen
condiciones adecuadas para una RT-PCR. En otra
realización preferida, dichas condiciones incluyen condiciones
adecuadas para una QPCR (PCR cuantitativa).
En otra realización preferida, dichas condiciones incluyen condiciones adecuadas para una RT-PCR cuantitativa.
En otra realización preferida, dichas condiciones incluyen condiciones adecuadas para una RT-PCR cuantitativa.
En otra realización, dicho método comprende la
etapa de llevar dicha muestra, en presencia de dicha sonda (o
sondas) a condiciones adecuadas para realizar la hibridación de
dicha sonda con dicho supuesto amplicon.
Aun en otra realización preferida, dicho método
comprende la etapa de detectar al menos una vez, preferiblemente el
tiempo real, posibles productos de amplificación, es decir, si dicha
sonda (o sondas) encuentra (o encuentran) a dicho amplicon para
hibridarse con él, preferiblemente para cada muestra. Esto permite
ventajosamente evaluar la presencia de dicho tipo y/o subtipo de
VIH. Esto puede conseguirse ventajosamente por mediciones de
intensidad de fluorescencia. En la técnica se conocen los
procedimientos de medición de fluorescencia. En resumen, la muestra
se ilumina a aproximadamente la longitud de onda de excitación del
fluoróforo y se mide la intensidad de la emisión.
En otra realización, dicho método comprende la
etapa de medir al menos una vez, preferiblemente en tiempo real, la
cantidad de dicha sonda hibridada con dicho amplicon. Esto puede
conseguirse de manera ventajosa por mediciones de intensidad de
fluorescencia. En la técnica se conocen los procedimientos de
medición de fluorescencia. En resumen, la muestra se ilumina a
aproximadamente la longitud de onda de excitación del fluoróforo y
se mide la intensidad de la emisión.
En otra realización preferida, dicho método
comprende la etapa de calcular al menos una vez el numero de copias
del molde de diana inicialmente presentes en dicha muestra. El
especialista en la técnica sabría como realizar dicha etapa. Por
ejemplo, esto puede realizarse ventajosamente usando controles de
calibrado convencionales y/o internos. Preferiblemente, esta etapa
incluye la determinación del llamado ciclo de umbral (CT), para
cada muestra, que se correlaciona con el numero de copias del molde
diana inicialmente presentes en dicha muestra.
En una realización preferida, al menos una
etapa, preferiblemente varias etapas, mas preferiblemente la mayoría
de las etapas de dicho método puede realizarse en una placa de PCR.
En la técnica se conocen dichas placas de PCR adecuadas. Estas
incluyen placas de 24 pocillos, placas de 48 pocillos, placas de 96
pocillos y placas de 284 pocillos. De manera ventajosa esto asegura
que en dichas etapas las muestras puedan procesarse en paralelo.
Además, esto permite la selección de alto rendimiento, lo cual
ventajosamente ahorra tiempo.
En otra realización preferida, al menos una
etapa, preferiblemente varias etapas, mas preferiblemente la mayoría
de las etapas de dicho método puede realizarse en un termociclador.
Dicho termociclador puede equiparse para realizar mediciones de
intensidad de fluorescencia en tiempo real, en cuyo caso dichas
placas ventajosamente pueden ser de calidad óptica.
Esta solicitud también se refiere a la
amplificación de ácidos nucleicos del VIH con al menos un
oligonucleótido y/o cebador PCR y/o al menos un par de cebadores
PCR y/o al menos una sonda y/o al menos un conjunto de nucleótidos
de acuerdo con la invención.
El especialista en la técnica puede apreciar que
la presente invención puede incorporar cualquier cantidad de
características preferidas descritas anteriormente.
Otras realizaciones de la presente invención no
se presentan en este documento, lo cual resulta obvio para los
especialistas en la técnica y por tanto están dentro del alcance y
el espíritu de la presente invención. En particular, a pesar de ser
adecuados para la detección mediante protocolos múltiples y/o en
tiempo real, los métodos, procedimientos, polinucleótidos,
oligonucleótidos, conjuntos de polinucleótidos, amplicones y kits
de la presente invención obviamente también son adecuados para
protocolos simples, protocolos cualitativos, protocolos
cuantitativos, protocolos de detección de punto final y
combinaciones de los mismos.
Las ventajas de los productos, procesos y
métodos de acuerdo con la invención se pondrán de manifiesto a
partir de los siguientes ejemplos, proporcionados a continuación de
forma meramente ilustrativa, y que no son limitativos.
Las Figuras 1A, 1B, 2A, 2B y 3 ilustran la
detección del VIH2-A y VIH2-B de
acuerdo con la presente invención (véase el ejemplo 1 a
continuación).
Las Figuras 4A y 4B ilustran la detección del
VIH1-M y VIH1-O de acuerdo con la
presente invención (véase el ejemplo 2 a continuación).
Las Figuras 5A y 5B ilustran la detección
múltiple del VIH1/VIH2 de acuerdo con la presente invención (véase
el ejemplo 4 a continuación).
Las Figuras 6A, 6B y 6C ilustran un ensayo de
control interno (CI) para el VIH-2 de acuerdo con la
presente invención (véase el ejemplo 5 a continuación).
Las Figuras 7 a 21 ilustran secuencias de
acuerdo con la presente invención.
Este ejemplo ilustra que los cebadores y sondas
del VIH2 de la invención permiten la detección específica en tiempo
real por RT-PCR de los subtipos A y B del VIH2.
Este ejemplo implica el uso de un par de
cebadores del VIH2, y dos sondas del VIH2 diferentes. Una sonda es
una sonda del VIH2-A (sonda de subtipo A), y la otra
es una sonda del VIH2-B (sonda del subtipo B). Estos
cebadores y sondas dirigen una secuencia de 147 pb en aislados del
VIH2.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos tienen las siguientes secuencias:
Cebador directo del VIH2 (H2A3f, SEC ID Nº:
195):
AGGAAGRCARACAGCACTCTTC con R=A/G (Tm = 66ºC)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso del VIH2 (H2A3r, SEC ID Nº:
250):
GGTACTCCRAAGGGGTTTGTTCTAT con R=A/G (Tm =
65ºC)
\vskip1.000000\baselineskip
Como ya se ha mencionado, R corresponde a una A
o G, de manera que hay 4 formas para el cebador directo (AA, AG, GA
y GG) y 2 formas para el cebador inverso (AG o GA).
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda del VIH2-A (sonda del
VIH2-A, SEC ID Nº: 297):
GGCCAATAACACACTTGCACACA
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda del VIH2-B (sonda del
VIH2-B, SEC ID Nº: 300):
GCCTATCACACACCTGCACACA.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo cada una de estas sondas se usa
como una sonda fluorescente. Los brazos beacon no asociados a la
diana que se han añadido a cada extremo de cada sonda se muestran
subrayados (FAM = fluoróforo; DQ = Extintor Dark).
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda del VIH2-A en formato de
sonda fluorescente (sonda beacon del VIH2-A, SH2A9a,
SEC ID Nº: 298):
FAM-AGCGCGGCCAATAACACACTTGCACACAGCGCT-DQ
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda del VIH2-B en formato de
sonda fluorescente (sonda beacon del VIH2-B,
SH2A1b, SEC ID Nº: 301):
FAM-AGCGCGCCTATCACACACCTGCACACAGCGCT-DQ
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron tres series de experimentos de
amplificación cuantitativa en tiempo real en un panel de muestras
de plasma positivas para VIH2 (muestras positivas
VIH2-A negativas VIH2-B y muestras
positivas VIH2-B negativas
VIH2-A):
- a)
- par de cebadores del VIH2 + sonda beacon del VIH2-A (H2A3f, H2A3r, SH2A9a, SEC ID Nº: 195, 250, 298),
- b)
- par cebadores del VIH2 + sonda beacon del VIH2-B (H2A3f, H2A3r, SH2A1b, SEC ID Nº: 195, 250, 301),
- c)
- par de cebadores del VIH2 + sonda beacon del VIH2-A + sonda beacon del VIH2-B (H2A3f, H2A3r, SH2A9a, SH2A1b, SEC ID Nº: 195, 250, 298, 301).
\vskip1.000000\baselineskip
Los detalles del procedimiento son los
siguientes:
- -
- Panel de muestras positivas VIH2: se obtuvieron muestras de plasma positivas VIH2-A negativas VIH2-B (muestras del subtipo A) y muestras de plasma positivas VIH2-B negativas VIH2-A (muestras del subtipo B) de pacientes infectados (Centro Hospitalario Bichat, Laboratorio de Virología de Asistencia Pública - Hospital de París, Francia);
- -
- Controles negativos: plasma negativo VIH2;
- -
- Extracción de ácido nucleico: ARN Viral Kit Qiagen QiaAmp (referencia 52904) usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (volumen de muestra por extracción = 140 microlitros);
- -
- Par de cebadores: 1 microM por cada reacción (SEC ID Nº: 11, 12);
- -
- Sondas: sondas beacon con FAM-DQ como se ha descrito anteriormente (SEC ID Nº: 298; 301); cada una a 0,2 microM por reacción;
- -
- Reactivos para RT-PCR: agua sin ARNasa y kit de RT-PCR Qiagen QuantiTect Probe (referencia Qiagen: 204443) usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, [MgCl_{2}] = 4 mM;
- -
- Aparato: Ciclador IQ de Bio-Rad;
- -
- Ciclado térmico:
- 30' a 42ºC (etapa de RT),
- 15' a 95ºC (etapa de activación de la polimerasa),
- (30'' a 94ºC - 30'' a 55ºC - 30'' a 72ºC) x 50,
- +4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió el panel de muestras del subtipo A y
muestras del subtipo B a extracción de ácido nucleico y
amplificación por RT-PCR usando el par de cebadores
VIH2 junto con únicamente una de las sondas (experimentos a) y b)) o
ambas sondas (experimento c)).
Interpretación de los resultados: para cada
ensayo, se determina un ciclo de umbral (Ct) que es el nivel de
fluorescencia que se considera que está significativamente por
encima del nivel de fondo de fluorescencia medida en los primeros
ciclos de amplificación. El valor Ct es inversamente proporcional a
la concentración de la diana: a menor Ct, mayor concentración de la
diana.
En las siguientes tablas, CT = Ciclo de Umbral;
UFR máx = Unidades de Fluorescencia Relativa Máxima observadas al
final del proceso de la PCR; CTL - = control negativo; N/A =
muestras cuyo nivel de fluorescencia está por debajo del nivel de
fondo.
Las figuras 1A y 1B ilustran estos
resultados.
Ventajosamente de acuerdo con la invención, la
sonda del VIH2-A (SH2A9a, SEC ID Nº: 298) permite la
detección dirigida de muestras positivas del subtipo A en
combinación con los cebadores del VIH2 de acuerdo con la invención
(H2A3f, H2A3r, SEC ID Nº: 195, 250), sin detección cruzada de
muestras positivas del subtipo B (véase la Tabla 1 y las Figuras 1A
y 1B).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 2A y 2B ilustran estos
resultados.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ventajosamente de acuerdo con la invención, la
sonda del VIH2-B (SH2A1b, SEC ID Nº: 301) permite la
detección dirigida de muestras positivas del subtipo B en
combinación con los cebadores del VIH2 (H2A3r, H2A3f, SEC ID Nº:
195, 250) de la invención, sin detección cruzada de muestras
positivas del subtipo A (véase la Tabla 2 y las Figuras 2A y
2B).
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 3 se ilustran estos resultados.
Como una característica destacable de la
invención, la sonda del VIH2-A (SH2A9a, SEC ID Nº:
298) y la sonda del VIH2-B (SH2A1b, SEC ID Nº: 301)
pueden usarse simultáneamente (véase la Tabla 3 y la Figura 3) y
permiten la detección de ambos subtipos en un procedimiento
múltiple (en este caso doble) de una tapa.
Como una característica sorprendente, se observó
un efecto sinérgico para el uso simultáneo de ambas sondas A y B
(sonda del sub-tipo A y sonda del
sub-tipo B) (protocolo doble), en comparación con el
uso de una sonda en solitario (sonda del sub-tipo A
o sonda del sub-tipo B). La señal de detección
obtenida con una sola sonda es ligeramente más precisa que la
obtenida con ambas sondas respectivamente, como puede juzgarse a
partir de la comparación de los resultados obtenidos en el
experimento a) con los obtenidos en el experimento c) en las
muestras del sub-tipo A y a partir de la comparación
de los resultados obtenidos en el experimento b) con los obtenidos
en las muestras del sub-tipo B en el experimento
c).
Como un efecto sinérgico, sorprendente e
inesperado, los conjuntos de oligonucleótidos (cebadores y sondas)
de acuerdo con la invención prueban de esta manera una especificidad
aumentada cuando las sondas se usan de manera simultánea (protocolo
doble, múltiple).
\vskip1.000000\baselineskip
En un proceso, se sometieron paneles de
referencia representativos de muestras de suero positivas
VIH1-M negativas VIH1-O (muestras
de panel VIH1-M) y paneles de referencia
representativos de muestras de suero positivas
VIH1-O negativas VIH1-M (muestras
de panel VIH1-O) a amplificación
RT-PCR cuantitativa en tiempo real con los cebadores
VIH1-M (H1B4f, H1B10r, SEC ID Nº: 7, 16) y una
sonda VIH1-M (SH1BM5, SEC ID Nº: 119) de la
invención.
En otro proceso, los mismos paneles se
sometieron a amplificación RT-PCR cuantitativa en
tiempo real con los cebadores VIH1-O (H1B5f,
H1B13r, SEC ID Nº: 140, 168) y una sonda VIH1-O
(SH1BO2 SEC ID Nº: 191 o SH1B010 SEC ID Nº:194) de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores y las sondas del VIH1 tienen las
siguientes secuencias:
Cebadores VIH1-M:
Directo: TTGGAGAGCAATGGCTAGTGA (H1B4f, SEC ID
Nº: 7)
Inverso: TGTGTGCAATCTAGTTGCCATA (H1B10r, SEC ID
Nº: 16)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH1-M:
ATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTC (SEC ID Nº: 110)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores VIH1-O:
Directo: TTGGAGAGCACTAGCTAGTGA (H1B5f, SEC ID
Nº: 140)
Inverso: TGTGTGCAATCTATTTGCCATA (H1B13r, SEC ID
Nº: 168)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH1-O:
GAAATCATTGCTAGTTGTCCTAAATGTCATAT (SEC ID Nº:
190)
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la invención, cada sonda se
produce en este caso como una sonda fluorescente, con "TGCGC"
como brazo no asociado a la diana en 5' y con "GCGCA" como
brazo no asociado a la diana en 3' (ambos brazos subrayados). El
brazo 5' se marcó con un fluoróforo FAM y el brazo 3' con un
Extintor Dark (DQ).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de las sondas son las
siguientes:
Sonda VIH1-M en un formato de
sonda fluorescente:
FAM-TGCGCATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCGCGCA-DQ
(SH1BM5, SEC ID Nº: 119)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH1-O en un formato de
sonda fluorescente:
FAM-TGCGCGAAATCATTGCTAGTTGTCCTAAATGTCATATGCGCA-DQ
(SH1BO2, SEC ID Nº: 191)
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se indican los detalles del
procedimiento RT-PCR:
- -
- Paneles: La referencia del Panel de Realización BBI PRD301 (cultivos del VIH1-O diluidos en plasma humano a aproximadamente 10^{5} copias por ml; los números de las muestras tienen el formato 301-xx, donde xx es el número de muestra) se usa como panel representativo del VIH1-O;
- -
- La referencia del Panel de Realización BBI PRD201 (cultivos del VIH1-M diluidos en plasma humano a aproximadamente 10^{5} copias por ml; los números de las muestras tienen el formato 201-yy, donde yy es el número de muestra) se usa como panel representativo del VIH1-M;
- -
- Controles negativos: plasma negativo para VIH1;
- -
- Extracción: ARN viral Kit Qiagen QiaAmp Viral ARN (referencia 52904) usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (volumen de muestra por extracción: 140 microlitros);
- -
- Pares de cebadores: par de cebadores del VIH1-O (H1B5f, H1B13r, SEC ID Nº: 140, 168) y par de cebadores del VIH1-M (H1B4f, H1B10r, SEC ID Nº: 7, 16) cada par de cebadores se ha usado a 0,6 \muM por reacción;
- -
- Sondas: sondas con FAM-DQ (SH1BM5, SH1BO2, SEC ID Nº: 119, 191) cada una a 0,6 \muM por reacción;
\global\parskip1.000000\baselineskip
- -
- Reactivos RT-PCR: agua sin ARNasa y kit de RT-PCT Qiagen QuantiTect Probe (referencia Qiagen: 204443), usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, [MgCl_{2}] = 4 mM;
- -
- Aparato: Ciclador IQ de Bio-Rad;
- -
- Ciclado Térmico:
- 30' a 42ºC,
- 15' a 95ºC,
- (15'' a 94ºC - 30'' a 55ºC - 30'' a 72ºC) x 50,
- +4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se siguió el mismo procedimiento
RT-PCR para ambos tipos de experimentos de
amplificación.
Interpretación de los resultados: para cada
ensayo, se determina un ciclo de umbral (Ct) que es el nivel de
fluorescencia que se considera que está significativamente por
encima del nivel de fondo o de fluorescencia medida en los ciclos
iniciales de amplificación. El valor Ct es inversamente proporcional
a la concentración de diana: a menor Ct, mayor concentración de
diana.
\vskip1.000000\baselineskip
En las siguientes tablas:
CT = Ciclo de Umbral;
UFR máx = Unidades de Fluorescencia Relativa
Máxima observadas al final del proceso de la PCR;
CTL - = control negativo;
N/A = muestras cuyo nivel de fluorescencia está
por debajo del nivel de fondo;
Med: media.
A continuación se proporcionan los resultados
experimentales ilustrativos:
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 4A y 4B ilustran los resultados.
En la Figura 4A, se muestran los resultados
obtenidos con los cebadores del VIH1-M (H1B4f,
H1B10r, SEC ID Nº: 7, 16) y las sondas del VIH1-M
(SH1BM5, SEC ID Nº: 119) de la invención en el panel
VIH1-M (BBI PRD201), en el panel
VIH1-O (BBI PRD301) y en los controles.
En la Figura 4B, se muestran los resultados
obtenidos con los cebadores del VIH1-O (H1B5f,
H1B13r, SEC ID Nº: 140,168) y las sondas del VIH1-O
(SH1BO2, SEC ID Nº: 191) de la invención en el panel
VIH1-O, en el panel VIH1-M y en los
controles.
En ambos casos, no se detectó amplificación
RT-PCR cuantitativa en tiempo real cuando los
cebadores y las sondas del VIH1-M de la invención
se usan en muestras con VIH1-O y a la inversa.
Ventajosamente de acuerdo con la invención, no
se produce hibridación cruzada entre el amplicón del
VIH1-M y las sondas del VIH1-O, ni
entre el amplicón del VIH1-O y las sondas del
VIH1-M. Los cebadores y las sondas del
VIH1-M y VIH1-O de acuerdo con la
invención demuestran por tanto que permiten una detección muy
específica en condiciones de RT-PCR cuantitativa en
tiempo real.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra que los cebadores y las
sondas de la invención permiten la cuantificación de la carga viral
del VIH mediante RT-PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores y las sondas tienen las siguientes
secuencias:
Cebadores VIH1-M:
Directo: TTGGAGAGCAATGGCTAGTGA (H1B4f, SEC ID
Nº: 7)
Inverso: TGTGTGCAATCTAGTTGCCATA (H1B10r, SEC ID
Nº: 16)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH1-M:
ATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTC (SEC ID Nº: 110)
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Cebadores VIH1-O:
Directo: TTGGAGAGCACTAGCTAGTGA (H1B5f, SEC ID
Nº: 140)
Inverso: TGTGTGCAATCTATTTGCCATA (H1B13r, SEC ID
Nº: 168)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH1-O:
GAAATCATTGCTAGTTGTCCTAAATGTCATAT (SEC ID Nº:
190)
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la invención, en este caso cada
sonda se produce como una sonda fluorescente (molecular beacon),
con "TGCGC" como brazo no asociado a la diana en 5' y con
"GCGCA" como brazo no asociado a la diana en 3' (ambos brazos
se subrayan). El brazo 5' se marca con un fluoróforo FAM y el brazo
3' con un Extintor Dark (QD).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de las sondas son por tanto las
siguientes: (los brazos de las sondas se muestran subrayados):
Sonda del VIH1-M en un formato
de sonda fluorescente:
FAM-TGCGCATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCGCGCA-DQ
(SH1BM5, SEC ID Nº: 119)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda del VIH1-O en un formato
de sonda fluorescente:
FAM-TGCGCGAAATCATTGCTAGTTGTCCTAAATGTCATATGCGCA-DQ
(SH1BO2, SEC ID Nº: 191)
\vskip1.000000\baselineskip
Los detalles del procedimiento
RT-PCR se indican a continuación:
- Paneles:
- -
- La referencia del Panel de Realización BBI PRD301 (cultivos del VIH1-O diluidos en plasma humano a aproximadamente 10^{5} copias por ml; los números de las muestras tienen el formato 301-xx, donde xx es el número de muestra) se usa como panel representativo del VIH1-O;
- -
- La referencia del Panel de Realización BBI PRD201 (cultivos del VIH1-M diluidos en plasma humano a aproximadamente 10^{5} copias por ml; los números de las muestras tienen el formato 201-yy, donde yy es el número de muestra) se usa como panel representativo del VIH1-M;
- -
- La serie de panel 500 Accurum 315 (sub-tipo B) se usa como un panel de referencia para producir la curva patrón de referencia, construida por la representación del logaritmo de concentraciones diana conocidas frente al valor Ct correspondiente. La concentración de una muestra desconocida se define por tanto cartografiando el valor Ct correspondiente con respecto a la curva convencional;
- Controles negativos: plasma negativo para
VIH1;
- Extracción: ARN Viral Kit Qiagen QiaAmp
(referencia 52904) usado de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante (volumen de la muestra para la extracción: 140
microlitros);
- Par de cebadores: par de cebadores
VIH1-O (SEC ID Nº: 7, 8) y par de cebadores
VIH1-M (SEC ID Nº: 1, 2) cada uno usado a 0,6
microM por reacción;
- Sondas: sondas con FAM-DQ (SEC
ID Nº: 4, 10), 0,2 microM cada una por reacción;
- Reactivos para RT-PCR: agua
sin ARNasa y kit para RT-PCR Qiagen QuantiTect Probe
(referencia Qiagen: 204443), de acuerdo con las instrucciones del
fabricante, [MgCl_{2}] = 4 mM;
- Aparato: Ciclador IQ de
Bio-Rad;
- Ciclado Térmico:
- 30' a 42ºC (etapa de la RT),
- 15' a 95ºC (etapa de activación de la polimerasa),
- (15'' a 94ºC - 30'' a 55ºC - 30'' a 72ºC) x 50,
- +4ºC.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron dos series de experimentos de
amplificación con los cebadores y sondas de la invención:
- a)
- RT-PCR con un solo par de cebadores y sondas (par de cebadores del VIH1-M (H1B4f, H1B10r, SEC ID Nº: 7, 16) y sonda del VIH1-M (SH1BM5, SEC ID Nº: 119);
- b)
- RT-PCR con ambos pares de cebadores y ambas sondas (par de cebadores del VIH1-M (H1B4f, H1B10r, SEC ID Nº: 7, 16) + par de cebadores del VIH1-O (H1B5f, H1B13r, SEC ID Nº: 140,168) y sonda del VIH1-M (SH1BM5, SEC ID Nº: 119) + sonda del VIH1-O (SH1BO2, SEC ID Nº: 191)).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del valor Ct de cada ensayo se
usaron para la cuantificación de paneles PRD201 y PRD301
cartografiando el valor Ct correspondiente con respecto a la curva
convencional. Los valores de cuantificación que corresponden al
número de copias de ARN/ml en cada muestra pura se compararon con
kits disponibles en el mercado usados de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante: kit Amplicor VIH1 Monitor Versión
1.5 de Roche (ref. 87674), kit Quantiplex ARN VIH1 3.0 ADNb de
Bayer (ref. 6147) y kit Nuclisens VIH-1 QT de
Organon Teknika (ref. 84152).
Los resultados representativos se muestran en
las Tablas 5 y 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de estos resultados es evidente que los
cebadores y las sondas del VIH1-M de la invención
permiten una detección cuantitativa precisa en tiempo real de todos
los genotipos del VIH1-M y una buena correlación
con los kits disponibles en el mercado.
De la Tabla 6 puede observarse que el nivel de
cuantificación más elevado en el panel VIH1-0 se
obtiene con ambos cebadores y sondas VIH-1 y
VIH1-O de la invención (<LDL = menor que el
límite de detección más bajo).
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra que los cebadores y las
sondas de VIH1 y VIH2 de la invención pueden usarse en un ensayo
múltiple para la señal de VIH1 o VIH2. También demuestra la
posibilidad de seguir la fluorescencia de dos dianas en el mismo
tubo mediante el uso de fluoróforos diferentes (FAM y ROX).
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores y las sondas tienen las siguientes
secuencias:
Cebadores VIH1-M:
Directo: TTGGAGAGCAATGGCTAGTGA (H1B4f, SEC ID
Nº: 7)
Inverso: TGTGTGCAATCTAGTTGCCATA (H1B10r, SEC ID
Nº: 16)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH1-M:
ATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTC (SEC ID Nº: 110)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo VIH2 (H2A3f, SEC ID Nº:
195):
AGGAAGRCARACAGCACTCTTC con R=A/G (Tm = 66ºC)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso VIH2 (H2A3r, SEC ID Nº:
250):
GGTACTCCRAAGGGGTTTGTTCTAT con R=A/G (Tm =
65º)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH2-A (sonda
VIH2-A, SEC ID Nº: 297):
GGCCAATAACACACTTGCACACA
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la invención, en este caso cada
sonda se produce como una sonda fluorescente con "CGCGC" como
brazo no asociado a la diana en 5' y con "GCGCG" como brazo no
asociado a la diana en 3' (ambos brazos se subrayan). El brazo 5'
está marcado con un fluoróforo FAM o ROX, y el brazo 3' con un resto
Dabcyl.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, las secuencias sonda son las
siguientes (los brazos beacon se muestran subrayados):
Sonda VIH1-M en un formato de
sonda fluorescente:
FAM-CGCGCATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCGCGCG-Dabcyl
(SH1BM10, SEC ID Nº: 128)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH2-A en un formato de
sonda fluorescente:
ROX-CGCGCGGCCAATAACACACTTGCACACAGCGCG-Dabcyl
(sonda beacon VIH2-A, SH2A14a, SEC ID Nº: 299)
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se indican los detalles del
procedimiento RT-PCR
- -
- Muestra positiva del VIH2-A: obtenida del paciente infectado (Centro Hospitalario Bichat, Laboratorio de Virología, Asistencia Pública - Hospital de París, Francia);
- -
- Serie panel 500 BBI Accurun 315 (sub-tipo B);
- -
- Controles negativos: muestra negativa VIH1 y VIH2;
- -
- Extracción: ARN Viral kit Qiagen QiaAmp (referencia 52904) usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (volumen de la muestra por extracción = 140 microlitros);
- -
- Pares de cebadores: se han usado el par de cebadores de VIH1-M (SEC ID Nº: 7, 16) y el par de cebadores de VIH2 (SEC ID Nº: 195, 250) respectivamente a 0,5 microM cada uno por reacción para el VIH1-M y 0,3 microM cada uno por reacción para el VIH2;
- -
- Sondas: sonda VIH1-M FAM-Dabcyl (SEC ID Nº: 128) y sonda VIH2-A ROX Dabcyl (SEC ID Nº: 296), 0,4 microM cada una por reacción;
- -
- Reactivos para la RT-PCR: agua sin ARNasa y kit para RT-PCR Qiagen QuantiTect Probe (referencia Qiagen: 204443) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, [MgCl_{2}] = 4 mM;
- -
- Aparato: Ciclador IQ de Bio-Rad;
- -
- Ciclado térmico:
- 30' a 42ºC (etapa de la RT),
- 15' a 95ºC (etapa de activación de la polimerasa),
- (30'' a 94ºC - 30'' a 55ºC - 30'' a 72ºC) x 50,
- +4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron dos series de experimentos de
amplificación con los cebadores y las sondas de la invención:
- a)
- RT-PCR con un único par de cebadores y sonda VIH1-M (H1B4f, H1B10r, SH1BM10, SEC ID Nº: 7, 16, 119), un único par de cebadores y sonda VIH2 (H2A3f, H2A3r, SH2A14a, SEC ID Nº: 195, 250, 299) con un intervalo de concentraciones de la diana de VIH1-M.
- b)
- RT-PCR con único par de cebadores y sonda VIH1-M (H1B4f, H1B10r, SH1BM10, SEC ID Nº: 7, 16, 119), un único par de cebadores y sonda VIH2 (H2A3f, H2A3r, SH2A14a, SEC ID Nº: 195, 250, 299) con un intervalo de diluciones de la diana de VIH2.
\vskip1.000000\baselineskip
Interpretación de los resultados: para cada
ensayo, se determina un ciclo de umbral (Ct) que es el nivel de
fluorescencia que se considera que está significativamente por
encima del nivel de fondo de fluorescencia medido en los ciclos
iniciales de la amplificación. El valor Ct es inversamente
proporcional a la concentración de diana: a menor Ct, mayor
concentración de diana.
En las siguientes tablas, CT = Ciclo de Umbral;
UFR máx = Unidades de Fluorescencia Relativa máxima observadas al
final del proceso de la PCR; CTL - = control negativo; N/A = muestra
cuyo nivel de fluorescencia está por debajo del nivel de fondo;
Med.= media; cop = copias.
En la Tabla 7 se muestran los resultados Ct
ilustrativos:
A partir de estos resultados es evidente que los
cebadores y sondas VIH1 y VIH2 de la invención pueden usarse en un
ensayo múltiple para la detección de la diana de
VIH1-M o VIH2.
Los resultados se ilustran en las Figuras 5A y
5B (para cada dilución, hay 2 curvas ya que los experimentos, en
este caso, se han realizado por duplicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra que la diana VIH2 y el
control interno (CI) pueden co-amplificarse usando
los cebadores y las sondas del VIH2 de la invención y seleccionarse
los cebadores y sonda CI sin ninguna perturbación de la señal del
VIH2. Esto también demuestra la posibilidad de seguir la
fluorescencia de dos dianas en el mismo tubo mediante el uso de dos
fluoróforos diferentes (ROX y TAMRA).
Este ejemplo implica el uso de un par de
cebadores VIH2 y una sonda VIH2. Estos cebadores y sondas dirigen
una secuencia de 147 pb en aislados VIH2. Tienen las siguientes
secuencias:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador directo VIH2 (H2A3f, SEC ID Nº:
195):
AGGAAGRCARACAGCACTCTTC con R=A/G (Tm = 66ºC)
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso VIH2 (H2A3r, SEC ID Nº:
250):
GGTACTCCRAAGGGGTTTGTTCTAT con R=A/G (Tm =
65º)
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH2-A (sonda
VIH2-A, SEC ID Nº: 297):
GGCCAATAACACACTTGCACACA
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo también implica el uso de un par de
cebadores de CI y una sonda de CI, seleccionados para conseguir el
mismo tamaño de fragmento amplificado y % de GC% que la diana
VIH.
En este ejemplo, cada una de estas sondas se usa
como una sonda fluorescente. Los brazos beacon no asociados a la
diana que se han añadido a cada extremo de la sonda VIH2 se muestran
subrayados (ROX = fluoróforo; Dabcyl = extintor).
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda VIH2-A en formato de sonda
fluorescente (sonda beacon VIH2-A, SH2A14a, SEC ID
Nº: 299):
ROX-CGCGCGGCCAATAACACACTTGCACACAGCGCG-Dabcyl
\vskip1.000000\baselineskip
Para la sonda de CI, se ha elegido TAMRA como
fluoróforo y Dabcyl como extintor.
Se realizaron dos series de experimentos de
amplificación cuantitativa en tiempo real:
- a)
- Par de cebadores VIH2 + sonda beacon VIH2-A (H2A3f, H2A3r, SH2A9a, SEC ID Nº: 195, 250, 299) + par de cebadores de CI + sonda beacon de CI con adición de diana VIH2 en solitario;
- b)
- Par de cebadores VIH2 + sonda beacon VIH2-A (H2A3f, H2A3r, SH2A9a, SEC ID Nº: 195, 250, 299) + par de cebadores de CI + sonda beacon de CI con adición de diana VIH2 y CI.
\vskip1.000000\baselineskip
Los detalles del procedimiento son los
siguientes:
- -
- Muestra positiva VIH2-A: obtenida del paciente infectado (Centro Hospitalario Bichat, Laboratorio de Virología, Asistencia Publica - Hospital de París, Francia);
- -
- Dilución del CI: El CI se diluye para obtener 10^{6} cop/PCR;
- -
- Controles negativos: plasma negativo VIH2;
- -
- Extracción de ácido nucleico: ARN Viral kit Qiagen QiaAmp (referencia 52904) usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (volumen de muestra por extracción = 140 microlitros);
- -
- Par de cebadores: 0,3 microM cada uno por reacción (SEC ID Nº: 11, 12 y cebadores de CI);
- -
- Sondas: sonda beacon VIH2-A ROX Dabcyl como se ha descrito anteriormente (SEC ID Nº: 229) y sonda beacon de CI Tamra-Dabcyl, 0,4 microM por cada reacción;
- -
- Reactivos para la RT-PCR: agua sin ARNasa y kit para RT-PCR Qiagen QuantiTect Probe (referencia Qiagen: 204443) usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, [MgCl_{2}] = 4 mM;
- -
- Aparato: Ciclador IQ de Bio-Rad;
- -
- Ciclado térmico:
- 30' a 42ºC (etapa de la RT),
- 15' a 95ºC (etapa de activación de la polimerasa),
- (30'' a 94ºC - 30'' a 55ºC - 30'' a 72ºC) x 50,
- +4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió una muestra positiva
VIH2-A a extracción de ácido nucleico y después a
dilución a 1/300, 1/3000 y 1/30000 en agua para amplificación RT-
PCR como se describe en los experimentos a) y b).
La dilución del CI se sometió a amplificación
RT-PCR (aproximadamente 10^{6} cop./PCR) como se
describe en el experimento b). (cop = copias).
Interpretación de los resultados: para cada
ensayo se determinó un ciclo de umbral (Ct) que es el nivel de
fluorescencia que se considera que está significativamente por
encima del nivel de fondo de la fluorescencia medida en los ciclos
iniciales de la amplificación. El valor Ct es inversamente
proporcional a la concentración de diana: a menor Ct, mayor
concentración de diana.
En las siguientes tablas, CT = Ciclo de Umbral;
UFR máx = Unidades de Fluorescencia Relativas máxima observadas al
final del proceso de la PCR; CTL - = control negativo; N/A = muestra
cuyo nivel de fluorescencia está por debajo del nivel de fondo.
A partir de esta tabla puede observarse que los
valores Ct de VIH2 no cambian con la adición del CI, independiente
de la dilución de la muestra extraída del VIH2-A
ensayada (1/300, 1/3000, 1/30000).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de esta tabla puede observarse que los
valores Ct para el CI son muy reproducibles independientemente de
la dilución de la muestra extraída VIH2-A
añadida.
Estos resultados se ilustran en las Figuras 6A,
6B y 6C (para cada dilución de VIH2-A, hay 3 curvas
ya que los experimentos, en este caso, se realizaron por triplicado
en las Figuras 6A y 6B; hay 6 curvas para el control negativo y hay
9 curvas para el CI, todas con la misma concentración en la Figura
6C).
Claims (43)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Proceso para la detección de al menos una diana del VIH,que comprende la etapa de producir al menos un amplicón por medio de al menos dos oligonucleótidos,en el que dichos oligonucleótidos son cebadores que son adecuados para usar en la amplificación específica de al menos una secuencia molde de referencia seleccionada del grupo que consiste en:- -
- las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M; y los fragmentos de la SEC ID Nº: 2 seleccionados de las posiciones 4281-4429 (SEC ID Nº: 306), 4283-4429 (SEC ID Nº: 307), 4283-4431 (SEC ID Nº: 308) de dicho aislado VIH1-M;
- -
- las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O, y los fragmentos de la SEC ID Nº: 4 seleccionados de las posiciones 4336-4484 (SEC ID Nº: 310), 4338-4484 (SEC ID Nº: 311) de dicho aislado VIH1-O;
- -
- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) de aislado de referencia M30502 VIH2;
- -
- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) de aislado de referencia K03455 VIH1-M y el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 (SEC ID Nº: 305) de dicho aislado VIH1-M; y
- -
- las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-y el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que es idéntico a las posiciones 4231-4484 (SEC ID Nº: 309) de dicho aislado VIH1-O;
- compartiendo dichas secuencias molde de referencia la característica técnica específica de ser referencias adecuadas para construir y producir cebadores que permiten una detección múltiple cuantitativa en tiempo real de al menos uno de los subtipos del VIH1-M, VIH2-O, VIH2-A y VIH2-B;
- en el que dichos cebadores son adecuados para hibridarse con dicho aislado de referencia del VIH en dichas posiciones que conducen en una secuencia aislada de referencia del VIH que consiste en dicha secuencia molde de referencia;
y opcionalmente, comprende la etapa de detectar dicho amplicón por medio de al menos una sonda. - 2. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 2 o uno de dichos fragmentos de la misma y donde dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 9, 12, 14, 15, 24, 52, 82, 91, 100, 109, 127, 136.
- 3. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 9, 12, 14, 15, 24, 52, 82.
- 4. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 2-3, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 127, 136.
- 5. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 2-4, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 9, 12, 14, 15;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 24, 52, 82;
y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136.
- 6. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 4, o uno de dichos fragmentos de la misma y en el que dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 148, 157, 167, 170, 179, 189, 190 a 194.
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 7. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 6, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 148,157, 167, 170, 179, 189.
- 8. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 6-7, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 190 a 194.
- 9. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 6-8, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 148, 157, 167;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 170, 179, 189;
y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 190 a 194.
- 10. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 5 y en el que dicho proceso se realiza con al menos un oligonucléotido seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249, 276, 287, 296, 297 a 303.
- 11. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 10, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 221; 249, 276, 287, 296.
- 12. Proceso de acuerdo una cualquiera de las Reivindicaciones 10-11, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 297 a 303.
- 13. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 10-12, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 276, 287, 296;
y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 297 a 303.
- 14. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 1 o dicho fragmento de la misma y en el que dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 6, 24, 52, 82, 91, 100, 109, 127, 136.
- 15. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 14, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 6, 24, 52, 82.
- 16. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 14-15, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 127, 136.
\newpage
- 17. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 14-16, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado que es:
- -
- SEC ID Nº: 6;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 24, 52, 82;
y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136.
\vskip1.000000\baselineskip
- 18. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que dicha secuencia molde de referencia es la SEC ID Nº: 3, o dicho fragmento de la misma, y en el que dicho proceso se realiza con al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 139, 170, 179, 189, 190 a 194.
- 19. Proceso de acuerdo con la Reivindicación 18, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 139, 170, 179, 189.
- 20. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 18-19, en el que dicho proceso se realiza con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 190 a 194.
- 21. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 18-20, en el que dicho proceso se realiza con al menos un cebador que es:
- -
- SEC ID Nº: 139;
y con al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 170, 179, 189;
y, opcionalmente, con al menos una sonda seleccionada del grupo que consiste en:- -
- SEC ID Nº: 190 a 194.
\vskip1.000000\baselineskip
- 22. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-21, el que dicha etapa de producir al menos un amplicón comprende al menos una amplificación PCR simple y/o múltiple cualitativa y/o cuantitativa.
- 23. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-22, en el que dichos oligonucleótidos son cebadores en bucle.
- 24. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-23, en el que dichos oligonucleótidos son cebadores en bucle, que comprenden un extremo terminal 5' de 3 a 7 nucleótidos que es complementario a su extremo 3'.
- 25. Amplicón que puede obtenerse implementando el proceso de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1-24 en una muestra que contiene el VIH.
- 26. Composición de amplificación que comprende al menos un amplicón de acuerdo con la Reivindicación 25.
- 27. Polinucleótido adecuado para usar como una secuencia molde de referencia en el diseño de cebadores que pueden usarse en protocolos múltiples para incluir al menos VIH1-M, VIH1-O, VIH2-A y VIH2-B en un solo proceso de amplificación ofreciendo al mismo tiempo una amplificación cuantitativa en tiempo real de la misma, seleccionándose dicho polinucleótido molde de referencia del grupo que consiste en:- las posiciones 4281-4436 (SEC ID Nº: 2) del aislado de referencia K03455 VIH1-M; y los fragmentos de la SEC ID Nº: 2 seleccionados de las posiciones 4281-4429 (SEC ID Nº: 306), 4283-4429 (SEC ID Nº: 307), 4283- 4431 (SEC ID Nº: 308) de dicho aislado VIH1-M;- las posiciones 4336-4491 (SEC ID Nº: 4) del aislado de referencia L20587 VIH1-O, y los fragmentos de la SEC ID Nº: 4 seleccionados de las posiciones 4336-4484 (SEC ID Nº: 310), 4338-4484 (SEC ID Nº: 311) de dicho aislado VIH1-O;- las posiciones 4889-5036 (SEC ID Nº: 5) de aislado de referencia M30502 VIH2;- las posiciones 4176-4436 (SEC ID Nº: 1) de aislado de referencia K03455 VIH1-M y el fragmento de la SEC ID Nº: 1 que es idéntico a las posiciones 4176-4429 (SEC ID Nº: 305) de dicho aislado VIH1-M; y- las posiciones 4231-4491 (SEC ID Nº: 3) del aislado de referencia L20587 VIH1-y el fragmento de la SEC ID Nº: 3 que es idéntico a las posiciones 4231-4484 (SEC ID Nº: 309) de dicho aislado VIH1-O.
\vskip1.000000\baselineskip
- 28. Oligonucleótido adecuado para detección del VIH, seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 6, 8, 11, 14, 15, 24, 52, 82, 91, 100, 109, 127, 136, 139, 148, 157, 167, 170, 179, 189, 190 a 194, 221, 249, 276, 287, 296, 297 a 303.
- 29. Oligonucleótido de acuerdo con la Reivindicación 28, seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 6, 8, 11, 14, 15, 24, 52, 82, 91, 100, 109, 127, 136; en el que dicho oligonucleótido es adecuado para la detección del VIH1-M.
- 30. Oligonucleótido de acuerdo con la Reivindicación 28, seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 139, 148, 157, 167, 170, 179, 189, 190 a 194; el que dicho oligonucleótido es adecuado para detección del VIH1-O.
- 31. Oligonucleótido de acuerdo con la Reivindicación 28, seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249, 276, 287, 296, 297 a 299;
en el que dicho oligonucleótido es adecuado para detección del VIH2-A. - 32. Oligonucleótido de acuerdo con la Reivindicación 28, seleccionado del grupo que consiste en:
- -
- SEC ID Nº: 221, 249, 276, 287, 296, 300 a 303;
en el que dicho oligonucleótido es adecuado para la detección del VIH2-B. - 33. Oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 28-32, en el que dicho oligonucleótido está marcado con fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
- 34. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende al menos dos oligonucleótidos seleccionados de dos grupos diferentes entre los siguientes grupos:
- -
- el grupo que consiste en: SEC ID Nº: 6, 9, 12, 14, 15;
- -
- el grupo que consiste en: SEC ID Nº: 24, 52, 82;
- -
- el grupo que consiste en: SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136;
en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección del VIH1-M.\vskip1.000000\baselineskip
- 35. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende:- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 139, 148, 157,167; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 170, 179, 189; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 190 a 194;en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección del VIH1-O.
\newpage
- 36. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende:- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 221, 249; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 276, 287, 296; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 297 a 299;en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección del VIH2-A.
\vskip1.000000\baselineskip
- 37. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende:- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 221, 249; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 276, 287, 296; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 300 a 303;en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección del VIH2-B.
\vskip1.000000\baselineskip
- 38. Conjunto de oligonucleótidos adecuado para la detección del VIH, que comprende:- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 190 a 194; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 297 a 299; y/o- al menos un oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 300 a 303;en el que dicho conjunto de oligonucleótidos es adecuado para detección múltiple del VIH.
\vskip1.000000\baselineskip
- 39. Conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 34-38, en el que al menos uno de dichos oligonucleótidos está marcado con fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
- 40. Amplicón que puede obtenerse por amplificación de una muestra que contiene el VIH con un par de cebadores seleccionados de:- un cebador de las SEC ID Nº: 9, 12, 14 ó 15 y un cebador de las SEC ID Nº: 24, 52 ó 82; o- un cebador de las SEC ID Nº: 148, 157 ó 167 y un cebador de las SEC ID Nº: 170, 179 ó 189; o- un cebador de las SEC ID Nº: 221 ó 249 y un cebador de las SEC ID Nº: 276, 287 ó 296; o- un cebador de las SEC ID Nº: 6 y un cebador de las SEC ID Nº: 24, 52 ó 82; o- un cebador de las SEC ID Nº: 139 y un cebador de las SEC ID Nº: 170, 179 ó 189.
\vskip1.000000\baselineskip
- 41. Amplicón que tiene una longitud de nucleótidos idéntica a la longitud de nucleótidos de un polinucleótido de la reivindicación 27 y que comprende una secuencia que tiene un porcentaje de identidad de nucleótidos de al menos el 90% con una secuencia de sonda, a lo largo de la longitud completa de esta secuencia de sonda, en el que dicha secuencia sonda es una de las siguientes: SEC ID Nº: 91, 100, 109, 118, 127, 136, 190, 191, 192, 193, 194, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, o una secuencia que es complementaria a una de estas secuencias de sondas SEC ID Nº: a lo largo de la longitud completa de esta secuencia SEC ID Nº: de sonda.
- 42. Composición de amplificación que comprende un amplicón de acuerdo con la Reivindicación 40 ó 41.
\vskip1.000000\baselineskip
- 43. Kit para el diagnóstico del VIH, que comprende:a) al menos un oligonucleótido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 28-33; y/ob) al menos un conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 34-39; yc) opcionalmente, instrucciones para su uso.
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