CN111926072A

CN111926072A - 一种眼底血管性疾病诊断环状rna标志物、诊断试剂盒及应用

Info

Publication number: CN111926072A
Application number: CN202010820599.9A
Authority: CN
Inventors: 蒋沁; 颜标; 刘明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2020-11-13

Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、诊断试剂盒及应用。本发明的试剂盒利用荧光定量PCR方法对患者血清中hsa_circ_0002484的表达水平进行检测，提供了一种眼底血管性疾病的检测标记物和预后评估方法，具有深远的临床意义和推广性，同时该方法具有创伤性小，操作方便等特点。

Description

一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、诊断试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、诊断试剂盒及应用。

背景技术

眼底血管性疾病包括增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)和早产儿视网膜病变(ROP)等。此类疾病已经成为从婴幼儿到老年人各个年龄阶段的视力障碍和致盲的最主要原因，严重影响了患者的生活质量。眼底血管新生是该类疾病的最重要的病理表现，其形成多认为是眼组织在缺血缺氧的病理状态下的适代偿性反应。眼底新生血管为异常血管，较正常血管通透性增加，易发生反复的渗液、出血和增殖，多累及黄斑和视盘，造成视力的严重损害甚至失明。目前，眼底血管性疾病的诊断主要依靠病史、形态学和功能学方面的综合检查，现有的检查手段仍具有一定的局限性，无法在疾病发展的早期阶段对该类疾病进行诊断。同时该类疾病相关的生化检查、血清学筛查和检测处于相对空白的状态。因此寻找一种具有高灵敏度和高特异性的标志物对眼底血管性疾病进行诊断和监控尤为重要。

环状RNA(circRNA)是一类具有特殊功能的非编码RNA，具有高稳定性和高保守性等特征。circRNA可以在转录后、翻译和表观遗传等层面发挥调控作用。circRNA参与细胞增殖、细胞分化、细胞周期和基因组印记等生理过程，通过多种分子机制调控基因表达，例如可以作为miRNA分子“海绵”、核转录调控因子和RNA结合蛋白。随着对circRNA结构和功能的认识，发现某些circRNA在肿瘤、心血管和神经系统等疾病中发挥重要的调控作用。鉴于circRNA的特征及其疾病相关性，其有望成为诊断标志物和预后评估的标记。

迄今为止，利用患者血清通过circRNA表达的检测对眼底血管疾病进行诊断的报道目前很少。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、诊断试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物，所述标记物为circ_0002484，所述circ_0002484的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述circ_0002484的检测引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括SYBR Premix Ex Taq 2×(包括Ex Taq酶，dNTP Mixture，Mg2+，TliRNaseH，TB Green)100μL，circ_0002484特异性的qRT-PCR上游引物，circ_0002484特异性的qRT-PCR下游引物，GAPDH定量PCR上游引物，GAPDH定量PCR下游引物；，引物各1管，10μM，100μL/管。

进一步地，所述circ_0002484的特异性qRT-PCR引物序列如上所示；所述GAPDH定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步地，所述试剂盒还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括总RNA反转录引物(包括Oligo dT和Random 6mers)，1管，浓度：50μM，50μL/管，反转录酶(200U/μL)50μL，dNTP Mixture(10mM each)50μL，反转录buffer 50μL。

进一步地，所述试剂盒还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizolreagent，1管，2000μL/管；氯仿，1管，500μL/管；无水乙醇，1管，8000μL/管；DEPC ddH₂O，1管，1000μL/管；ddH₂O，1管，2000μL/管；异丙醇，8000μL/管。

如上述的环状RNA标志物在制备眼底血管性疾病诊断试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术检测眼底血管性疾病诊断试剂中的应用。

如上述的环状RNA标志物在制备眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用。

进一步地，所述眼底血管性疾病包括糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管中的至少一种。

本发明中确定circ_0002484作为眼底血管性疾病的诊断标记物包括如下步骤：

第一步：样本准备：收集正常人血清样本(对照组)、增殖性糖尿病视网膜病变(实验组)、湿性老年黄斑变性(实验组)和白内障病人的血清标本(对照组)，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。

第二步：采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录；

第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果，验证靶点circ_0002484在不同血清样本中的表达差异。

本发明的另一目的在于分析circ_0002484作为眼底血管性疾病的预后效果评估的可行性。实验步骤包括：

第一步：样本准备：收集增殖性糖尿病视网膜病变(实验组，n＝20)和湿性老年黄斑变性(实验组，n＝20)病人治疗前后的血清标本，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。

第二步：采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录；

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供了环状RNA circ_0002484的新用途，可作为诊断试剂用于眼底血管性疾病的诊断，特别是增殖性糖尿病视网膜病变和湿性老年黄斑变性中的诊断和预后评估。

本发明证明通过定量PCR技术，检测患者血清中circ_0002484的表达来实现眼底血管性疾病的诊断是完全可行的。

本发明的试剂盒还适用于：根据患者年龄、病史以及局部体征初步怀疑为眼底血管性疾病的患者。

用本发明的试剂盒分别检测若干已知的眼底血管性疾病患者及若干的正常患者血清中circ_0002484含量，以此作为标准。再用相同的方法测定未知患者血清circ_0002484含量，对照上述标准数据，既可以初步判断患者是否患有眼底血管性疾病，以便进一步确诊。

本发明的试剂盒是首次利用荧光定量PCR方法，通过检测血清中circ_0002484表达水平进行检测，以辅助眼底血管性疾病的诊断和预后评估，具有深远的临床意义和推广性，同时该方法具有创伤性小，操作方便等特点，使得circ_0002484有望成为生物标记物，有助于对眼底血管性疾病发生和患者的预后判断进行科学地判断。

附图说明

图1是实施例1眼底血管性疾病的血清中定量PCR检测结果；横坐标代表不同患者血清标本，纵坐标代表circ_0002484的表达水平；

图2是实施例2眼底血管性疾病的治疗前后，血清标本的定量PCR检测结果，横坐标代表眼底血管性疾病血清标本，纵坐标代表circ_0002484的表达水平。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、诊断试剂盒及应用，具体如下各实施例所示。本发明中的RNA提取及逆转录等过程可参照市场购买的试剂盒操作。

实施例1circ_0002484在眼底血管性疾病诊断中的应用

血样本及处理：收集200例糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者的血清，200例年龄相关性黄斑变性(AMD)伴发脉络膜新生血管(CNV)患者的血清，200例白内障患者的血清，同时收集200例正常人的血清匹配作为对照。

实验过程

步骤一、获得待检血液样本

样本为眼底血管性疾病和正常人的加促凝剂的血液样本。

步骤二、从待检血液样本中提取RNA

a)血清样本或冷冻血清取0.25ml样本移至离心管中，加1ml Trizol，用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。

b)加入氯仿(样品液+Trizol Reagent体积量的1/5体积量)盖紧离心管盖，剧烈振荡15sec，室温静置5min。

c)4℃离心，12,000g×15min，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。

d)向上清液中加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀。

e)4℃离心，12,000g×10min，一般在离心后，试管底部会出现沉淀，弃上清。

f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清。

g)加入1ml无水乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清。

h)室温晾干加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶10-15min)，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀。

i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。

步骤三、将获得的RNA逆转录成cDNA

采用TaKaRa公司PrimeScript^TM RT reagent Kit，按照试剂盒提供的体系(25μL)配置如下：5×PrimeScript^TM Buffer 4μL，PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I 1μL、OligodT Primer(50μM)1μL、Random 6mers(100μM)4μL，total RNA 2μL，RNase free ddH₂O 13μL。按下面程序反转为cDNA：37℃15min，85℃5sec，得到的cDNA放于-20℃中保存。

步骤四、实时荧光定量PCR

取本发明所述试剂盒的PCR反应体系(50μL)，采用TaKaRa公司SYBR Premix ExTaq，按照说明书提供的体系配置如下：SYBR Premix Ex Taq 25μL，特异性的qRT-PCR上游引物、下游引物各1μL(特异性识别hsa_circ_0002484或GAPDH)，待测样品cDNA 2μL，RNasefree ddH₂O补足至50μL。

PCR条件：92℃，5min；(92℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec，38个循环)；72℃，5min。

五、数据分析

对同一样本分别进行目标RNA和内参RNA实时荧光定量PCR检测，以内参的表达量为基准，对目标RNA进行归一化处理，随后对目标RNA的相对表达量采用本领域通用的ΔCt法分析：将所有血清样本的目的基因circ_0002484的Ct值减去自身内参基因GAPDH的Ct值，得到所有血清样本的Delta Ct值(ΔCt)，公式表达为ΔCt＝Ct(目的基因circ_0002484)-Ct(内参基因GAPDH)。实验重复三次，对结果进行统计分析，通过比较糖尿病性视网膜病变患者、年龄相关性黄斑变性伴发脉络膜新生血管患者、白内障患者和正常人的血清样本中的circ_0002484的表达差异，判断待测病人的疾病易感性。

六、结果判读

图1为实时荧光定量PCR分析circ_0002484在糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者、年龄相关性黄斑变性(AMD)伴发脉络膜新生血管(CNV)患者、白内障患者和正常人血清中的相对表达差异(各从每组200例中选取的50例典型病例)。通过实时荧光定量PCR的方法检测靶点circ_0002484的表达水平并得出非眼底血管性疾病患者(白内障和正常人)的ΔCt范围：6.5-8.8，见表1。若待测样本的ΔCt在健康人的ΔCt范围内，或者小于该ΔCt范围，认为待测样本为阴性病人；若ΔCt大于该ΔCt范围，认为其为阳性病人。表2为hsa_circ_0002484作为生物标记物进行眼底血管性疾病诊断的结果，可得出hsa_circ_0002484作为眼底血管性疾病标记物的灵敏度为87.5％，准确度为85％。

表1：各组样本ΔCt范围

根据上述结果，分别收取经临床影像学诊断确诊的200例眼底血管性疾病(包括PDR、AMD伴发CNV)和200例非眼底血管性疾病患者血清样本，分别进行hsa_circ_0002484血清含量分析。评价基于检测hsa_circ_0002484血清含量的准确度和灵敏度，结果如表2所示。表明hsa_circ_0002484可作为眼底血管性疾病诊断的生物学标记物用于眼底血管性疾病的诊断。

表2：hsa_circ_0002484作为生物标记物进行眼底血管性疾病诊断的结果

实施例2circ_0002484作为预后评估标记的可行性应用

步骤一、获得待检血液样本

收集抗新生血管治疗前后的200例糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者的血清和200例年龄相关性黄斑变性(AMD)伴发脉络膜新生血管(CNV)患者的血清。

步骤二、从待检血液样本中提取RNA

d)向上清液中加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀。

i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。

步骤三、将获得的RNA逆转录成cDNA

采用TaKaRa公司PrimeScript^TM RT reagent Kit，按照试剂盒提供的体系(25μL)配置如下：5×PrimeScript^TM Buffer 4μL，PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I 1μL、OligodT Primer(50μM)1μL、Random 6mers(100μM)4μL，total RNA 2μL，RNase free ddH₂O 13μL。按下面程序反转为cDNA：37℃ 15min，85℃ 5sec，得到的cDNA放于-20℃中保存。

步骤四、实时荧光定量PCR

PCR条件：92℃，5min，(92℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec，38个循环)，72℃，5min。

五、数据分析

基因表达值用Delta Ct的方法计算，假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过1Ct；ΔCt＝目的基因Ct均数-参照基因Ct均数，其中参照基因选择GAPDH；分别确定正常人和眼底血管性疾病病人的ΔCt范围。

六、结果判断

计算出待测样本的ΔCt，分析其在抗新生血管治疗前后的变化情况。结果如图2所示：收集抗新生血管治疗前后的糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者和老年黄斑变性(AMD)患者伴发脉络膜新生血(CNV)患者抗新生血管治疗前后的血清标本；采用Trizol试剂提取总RNA，通过反转录PCR的方法得到总RNA的cDNA；通过实时荧光定量PCR的方法分别检测靶点circ_0002484的表达水平(各从200例中选取的50例典型病例，如图2所示)。图2为实时荧光定量PCR分析circ_0002484在抗新生血管治疗前后PDR患者和AMD伴发CNV患者血清中的表达差异，结果表明circ_0002484在接受抗新生血管治疗后的PDR患者和AMD伴发CNV患者血清中表达明显下调，说明circ_0002484有望成为评估抗新生血管治疗疗效及预后情况的靶标。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 蒋沁

<120> 一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物、诊断试剂盒及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1074

<212> DNA

<213> circ_0002484

<400> 1

gacatttctg atttatttgc atccttgaag agcatctgta gaagaggaag taaaagatgg 60

gtgtgaaaac atttactcat agctcctctt cccacagcca ggaaatgctt ggaaagctaa 120

atatgctgcg aaatgatgga catttttgtg atatcactat tcgtgtccag gacaaaatct 180

tccgggcaca taaggtggta ctagcagctt gcagtgattt ctttcgcacc aaacttgtag 240

gccaagccga ggatgagaac aagaatgtgt tggatctgca tcatgttaca gtgactggct 300

ttatacctct tttagaatat gcttacacag ccactctatc aattaacaca gaaaatatta 360

ttgatgttct agcagcagcc agctatatgc aaatgttcag tgttgccagc acctgctcag 420

agttcatgaa atcaagcatt ttatggaata cacccaacag ccaacctgaa aagggtctag 480

atgctggaca agaaaataat tctaactgca attttacttc tcgagatggg agcatttctc 540

ccgtgtcctc agagtgcagt gtggtagaaa gaaccattcc tgtctgccga gaatcccgga 600

gaaagcgcaa aagctacatt gttatgtctc ctgaaagtcc tgtaaagtgt ggcacacaaa 660

caagctcacc ccaggtattg aattcttcag cttcctactc agaaaataga aaccaaccag 720

ttgactcttc cttagctttt ccttggactt ttccttttgg aattgatcga aggattcagc 780

ctgagaaagt taagcaagca gaaaataccc ggactttaga attacctggc ccatctgaga 840

ccggtagaag aatggctgat tatgtgactt gtgagagcac aaaaactacc ttgcctttag 900

gtaccgaaga agatgtccgg gtcaaagtag aaagattaag tgatgaggag gtccatgagg 960

aagtgtccca gcctgtcagt gcatctcaga gttcgctgag tgatcagcag acagttccag 1020

gaagtgaaca agtccaagag gaccttctga ttagtccaca gtcttcctct atag 1074

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaagacccc tggaccacca 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaggggtct acatggcaac t 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagtcttcct ctataggaca tt 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtccatcatt tcgcagcata 20

Claims

1.一种眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物，所述标记物为circ_0002484，所述circ_0002484的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的眼底血管性疾病诊断环状RNA标志物，其特征在于：所述circ_0002484的检测引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

3.一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括SYBR Premix Ex Taq 2×，circ_0002484特异性的qRT-PCR上游引物，circ_0002484特异性的qRT-PCR下游引物，GAPDH定量PCR上游引物，GAPDH定量PCR下游引物。

4.根据权利要求3所述的一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述circ_0002484的特异性qRT-PCR引物序列如权利要求2所示；所述GAPDH定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求3所述的一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括Oligo dT和Random6mers，反转录酶，dNTP Mixture，反转录buffer。

6.根据权利要求5所述的一种眼底血管性疾病诊断实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizol reagent，氯仿，无水乙醇，DEPC ddH₂O，ddH₂O，异丙醇。

7.如权利要求1或2所述的环状RNA标志物在制备眼底血管性疾病诊断试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术检测眼底血管性疾病诊断试剂中的应用。

8.如权利要求1或2所述的环状RNA标志物在制备眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用。