CN114540484A

CN114540484A - 一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN114540484A
Application number: CN202210220381.9A
Authority: CN
Inventors: 郭万亮; 黄顺根; 汪健; 赵廉; 贾慧惠
Original assignee: Affiliated Childrens Hospital of Soochow University
Current assignee: Affiliated Childrens Hospital of Soochow University
Priority date: 2022-03-08
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2022-05-27

Abstract

本发明涉及一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物及其应用。所述与儿童急性肠套叠相关的生物标志物包括tRF‑Leu‑TAA‑006、tRF‑Gln‑TTG‑033和tRF‑Lys‑TTT‑028。本发明利用分子诊断技术，首次采用高特异性的tRF‑Leu‑TAA‑006、tRF‑Gln‑TTG‑033和tRF‑Lys‑TTT‑028作为儿童急性肠套叠的生物标志物，所采用的检测产品，不仅能够使得儿童急性肠套叠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高以及成本低等众多综合优势。

Description

一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物及其应用，尤其涉及tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028作为儿童急性肠套叠生物标志物。

背景技术

肠套叠是指肠管的一部分及其相应的肠系膜套入邻近肠腔内的一种肠梗阻，分为原发性和继发性两种。婴幼儿肠套叠95％以上属于原发性肠套叠，发生肠套叠的肠管没有明显的器质性病变，与婴幼儿时期回盲部系膜固定性差且活动度大等因素有关。继发性肠套叠多见于Meckel憩室、肠息肉、肠道重复畸形、淋巴瘤等。原发性急性肠套叠多见于2岁以下婴幼儿，男女之比约为2～3:1，常突然发病，典型临床表现有阵发性哭闹、渐进性腹痛、呕吐、粘液血便和腹部包块等，严重者可导致高热、脱水、休克。因此，对于儿童急性肠套叠应该早诊早治，以防不良事件发生。

目前，PBM的主要诊断方法包括腹部B超、钡灌肠X线检查、腹部立位片等影像学手段，但由于肠道部位结构复杂性，一旦临床确诊，由肠套叠所致的肠管淤血、缺血等病理改变，对肠管黏膜造成一定损伤，因此需要寻求早期筛查的分子标记物，以便对临床前期肠套叠高危患者进行早期诊断，降低肠管及相关并发症。

分子诊断技术是指以DNA或RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术，具有特异性高、检测周期短、成本低、准确度高等特点，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。

转运RNA(tRNA)是一种参与解码mRNA、翻译蛋白质的接头分子，近年来的研究表明tRNA还能作为小非编码RNA(sncRNA)的主要来源之一，具有独特且多样的功能。这些tRNA来源的ncRNA并非随机降解的产物，而是通过精确的生物发生过程产生的。源自tRNA的ncRNA大致分为两大类：tiRNA(或者tRNAhalves)和tRFs(tRNA衍生片段)

tRFs长度约16～28nt，来源于成熟tRNA或前体tRNA，tRFs作为sncRNA执行多种生物学功能包括能够作为miRNA行使RNA干扰；替换与mRNA结合的翻译起始因子eIF4G，直接抑制蛋白的翻译过程；结合某些蛋白因子，例如YBX1，影响mRNA的稳定性；与细胞色素C相互作用，调控细胞凋亡；在应激条件下促进应激颗粒的组装；敏化细胞氧化应激诱导的p53激活以及p53依赖的细胞死亡；作为父代表观遗传因子，改变子代基因转录级联过程等。

然而，现有技术中尚未有记载tRFs与儿童急性肠套叠的发生相关。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物及其应用，本发明首次发现tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028与儿童急性肠套叠的发生相关，其在儿童急性肠套叠中表达明显高于正常对照组(P-0.05)，因此，可通过分析tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028的表达辅助诊断或监测儿童急性肠套叠症。

为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物，所述与儿童急性肠套叠相关的生物标志物包括tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028。

本发明使用的术语“生物标志物”指用作分析样本的靶标分子。

根据本发明，本发明首次发现tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028与儿童急性肠套叠的发生相关，其在儿童急性肠套叠患者的外周血中呈高表达，因此，分析tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028的表达水平，可辅助无创诊断和/或监测儿童急性肠套叠症。

根据本发明，所述tRF-Leu-TAA-006包括SEQ ID NO.1所示的核酸序列，tRF-Gln-TTG-033包括SEQ ID NO.2所示的核酸序列，tRF-Lys-TTT-028包括SEQ ID NO.3所示的核酸序列。

SEQ ID NO.1：ACCCCACTCCTGGTACCA。

SEQ ID NO.2：GGTCCCATGGTGTAATGGTTAGCACTCTGGA。

SEQ ID NO.3：CACTGTAAAGCTAACTTAGCATTAACCT。

第二方面，本发明提供如第一方面所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物，所述引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9所示的序列。

所述tRF-Leu-TAA-006的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列。

所述tRF-Gln-TTG-033的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的序列。

所述tRF-Lys-TTT-028的引物的核酸序列包括SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的序列。

SEQ ID NO.4：TACAGTCCGACGATCACCCC。

SEQ ID NO.5：GTGTGCTCTTCCGATCTTGGTA。

SEQ ID NO.6：ACGATCGGTCCCATGGTGTA。

SEQ ID NO.7：TCCGATCTTCCAGAGTGCTAAC。

SEQ ID NO.8：CCACTGTAAAGCTAACTTAGCATTA。

SEQ ID NO.9：ACGTGTGCTCTTCCGATCTAG。

第三方面，本发明提供如第一方面所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物或第二方面所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物在制备儿童急性肠套叠诊断和/或监测产品中的应用。

第四方面，本发明提供一种儿童急性肠套叠的诊断和/或监测试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物。

优选地，所述试剂盒还包括管家基因的引物。

优选地，所述管家基因包括U6。

优选地，所述U6的引物包括SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核酸序列。

SEQ ID NO.10：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT。

SEQ ID NO.11：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。

优选地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂或PCR Mix中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，市售常规RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR Mix均能应用于本发明。

优选地，所述RNA提取试剂包括Trizol、氯仿、异丙醇和乙醇。

优选地，所述逆转录试剂包括逆转录反应液、逆转录酶、RNA酶抑制剂和dNTPs。

优选地，所述PCR Mix包括2×PCR mastermix。

第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的儿童急性肠套叠的诊断和/或监测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：

以样本中RNA为模板进行逆转录反应，以所述逆转录反应的产物为模板，利用第二方面所述儿童急性肠套叠的生物标志物的引物进行实时荧光定量PCR，判读结果。

本发明中，仅仅检测tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028的表达水平并不能直接100％诊断是否具有儿童急性肠套叠症，还需要和其他手段辅助诊断，才能最终确定是否带具有儿童急性肠套叠症。

优选地，所述使用方法还包括制备梯度稀释DNA模板的步骤。

优选地，所述梯度稀释DNA模板的制备方法包括：

以所述逆转录反应的产物为模板，利用第二方面所述与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物进行PCR反应，将所述PCR反应产物进行梯度稀释，得到所述梯度稀释DNA模板。

优选地，所述梯度稀释分别稀释1×10^-1倍、1×10^-2倍、1×10^-3倍、1×10^-4倍、1×10^-5倍、1×10^-6倍、1×10^-7倍、1×10^-8倍和1×10^-9倍。

优选地，实时荧光定量PCR的反应程序包括：

预变性：94～96℃，8～11min；

循环延伸：94～96℃变性9～11秒、58～62℃延伸55～65秒并收集荧光，35～45个循环。

优选为，预变性：95℃，10min；循环延伸：95℃变性10秒、60℃延伸60秒并收集荧光，40个循环。

本发明中，建立PCR产物的熔解曲线以检测扩增的特异性，扩增反应结束后，按程序(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)进行，并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.075℃/秒)。

本发明中，控制实时荧光定量PCR的反应程序可高特异性扩增目的基因。

作为优选的技术方案，所述儿童急性肠套叠诊断和/或监测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法包括以下步骤：

(1)提取样本中RNA，并以所述RNA为模板进行逆转录反应，得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，制备梯度稀释DNA模板；

(3)分别以所述cDNA和梯度稀释DNA模板为模板，利用第二方面所述与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物进行实时荧光定量PCR，所述实时荧光定量PCR反应程序包括：预变性：94～96℃，8～11min；循环延伸：94～96℃变性9～11秒、58～62℃延伸55～65秒并收集荧光，35～45个循环，判读结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用分子诊断技术、首次采用高特异性的tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028作为儿童急性肠套叠的生物标志物，所采用的检测产品，不仅能够使得儿童急性肠套叠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势。

附图说明

图1为tRF-Leu-TAA-006在儿童急性肠套叠组织和正常组织中的表达水平图；

图2为tRF-Gln-TTG-033在儿童急性肠套叠组织和正常组织中的表达水平图；

图3为tRF-Lys-TTT-028在儿童急性肠套叠组织和正常组织中的表达水平图；

图4为ROC曲线图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例筛选儿童急性肠套叠症相关基因生物标志物，包括以下步骤：

(1)样本收集：遵循知情同意原则，并在伦理委员会同意的前提下，收集儿童急性肠套叠患者的外周血，并从外周血中分离单个核细胞，保存于-80℃；

(2)RNA样品制备：使用TRIZOL试剂(Invitrogen，Carls-bad，CA，USA)按说明书提取步骤(1)收集的单个核细胞中总RNA，利用超微量分光光度计(NanoDrop ND-2000，ThermoScientific)进行总RNA定量；

(3)对总RNA进行预处理：将3-氨基酰基(带电)脱酰为3-OH，用于3-接头连接；3-cP(2,3-环磷酸酯)去除为3-OH，用于3-接头连接；5-OH(羟基)磷酸化为5-P，用于5-接头连接；将m1A和m3C去甲基化以实现有效的逆转录；

(4)构建tRFs测序文库制备，包括构建tRFs测序文库制备：总NA样品经oligo dT富集(rRNA去除)处理后再选用KAPA Stranded RNA-Seg Library Prep Kit(Illumina)构建文库，文库构建流程中双链cDNA合成使用dUTP方法结合后续高保真PCR聚合酶作用，使得最终生成的RNA测序文库具有链特异性；

(5)使用NextSeq 500/550V2试剂盒(#FC-404-2005；Illumina,Inc.,San Diego,California,USA)，根据制造商的说明，在NextSeq系统上对tRFs测序文库进行测；

(6)利用Solexa pipeline version 1.8(Off-Line Base Caller software,version1.8)软件进行图像处理和碱基识别。FastQC软件对去接头后的reads进行测序质量评估(采用cutadapt去3’和5’接头)。通过Hisat2软件比对到参考基因组。使用StringTie软件参考官方数据库注释信息进行转录丰度估计。使用R软件Ballgown进行基因水平和转录本水平的FPKM')计算，并分别计算基因水平和转录本水平表达差异情况，筛选出的样品间或组间差异表达基因。新基因/转录本预测由StringTie分别对每个样本进行组装，合并，并和官方注释信息进行对比，通过Ballgown计算获取，并对新转录本用CPAT进行编码能力预测。使用rMATS进行可变剪接事件检测、差异计算和作图。基于基因表达水平进行的PCA分析、相关性分析，对差异表达基因进行聚类、GO功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析等进一步的数据挖掘分析是通过自定义程序(python/R/shell)完成。

发现儿童急性肠套叠组织中tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028表达水平显著提高。

实施例2

本实施例提取样品中RNA，包括以下步骤：

(1)样本：遵循知情同意原则，并在伦理委员会同意的前提下，分别收集儿童急性肠套叠患者和正常志愿者的外周血，并从外周血中分离单个核细胞，保存于-80℃；

(2)RNA样品提取：

1)试剂包括TRIZOL试剂(Invitrogen life technologies)、氯仿(上海化学试剂有限公司)、异丙醇(上海化学试剂有限公司)、100％乙醇(上海化学试剂有限公司)、75％乙醇(以DEPC处理的水配制)、无RNA酶的水和无RNA酶的糖原(Invitrogen lifetechnologies)；

2)取外周血个核细胞，加入1mL的TRIZOL试剂，用电动匀浆器进行匀浆；

3)将匀浆后样品于20℃孵育5min，每1mL的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖，手动剧烈振荡管体15秒后，20℃孵育3min，4℃下12,000×g离心15min，RNA全部被分配于水相中；

4)将水相转移到新离心管中，加入异丙醇混合，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mL TRIZOL试剂此时加0.5mL的异丙醇，混匀后20℃孵育10min，于4℃、12,000×g离心10min，移去上清液；

5)每1mL TRIZOL试剂匀浆的样品中加入1mL的75％乙醇，清洗RNA沉淀，振荡后，于4℃、7,500×g离心5min，得到RNA；

(3)干燥所述RNA 10min，加入无RNA酶的水用枪反复吹打，然后55℃孵育10min，获得的RNA溶液保存于-70℃。

实施例3

本实施例利用实施例2制备的RNA进行cDNA合成。

试剂：RNA酶抑制剂(Epicentre)、SuperScript^TM III Reverse Transcriptase(Invitrogen)、5×RT缓冲液(Invitrogen)、2.5mM dNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTest Ltd)和Primer(英骏生物技术有限公司)。

仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)和GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)。

操作过程包括以下步骤：

(1)配制退火混合液：

(2)将混合液置于65℃水浴5min，冰上放置2min，离心后，在离心管中依次加入RT反应液：

(3)混合后37℃恒温1min，移液枪轻轻吸打混合均匀，50℃温育60min，70℃温育15min使酶失活，得到cDNA，置于-20℃保存。

实施例4

本实施例通过qPCR验证实施例1分析的表达水平上调tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028在儿童急性肠套叠患者外周血和正常志愿者外周血的表达差异。

试剂：2X PCRmastermix(Superarray)。

仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)和QuantStudio5Real-time PCR System(AppliedBiosystems)。

引物设计软件：Primer 5.0。

操作过程包括以下步骤：

(1)制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板

1)利用tRFs的引物(SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9)和U6的引物(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)，分别以实施例3制备的cDNA为模板进行PCR反应，反应体系为：

2)轻弹管底将溶液混合，5000rpm离心，PCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃预变性10秒，60℃延伸60秒，进行40个循环；

3)将PCR产物与100bp DNALadder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物为单一特异性扩增条带；

4)将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8和1×10^-9梯度浓度的DNA，得到梯度稀释DNA；

(2)利用tRFs的引物(SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9)和U6的引物(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)，分别以实施例3制备的cDNA为模板和所述梯度稀释DNA进行qPCR，体系配制如下：

轻弹管底将溶液混合，5000rpm离心，将8μL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2μL cDNA，离心混合，将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行反应，反应程序为：95℃预变性10min；95℃预变性10秒，60℃延伸60秒(收集荧光)，进行40个循环；

为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)进行反应，并从60℃缓慢加热到95℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.075℃/秒)；

(3)结果与计算，分别对各儿童急性肠套叠患者和正常志愿者样品的tRFs和U6进行qPCR反应，并利用梯度稀释DNA进行qPCR反应绘制标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成，每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量，基因表达水平以β-actin进行标准化，使用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量，结果如图1-图3所示，使用student ttest对儿童急性肠套叠组织(T)与正常组织(C)之间基因表达量进行比较，统计分析使用GraphPadPrism软件(GraphPadSoftware Inc.)，双侧P值小于0.05认为具有统计显著性。

结果表明于与正常志愿者相比，儿童急性肠套叠外周血中tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028呈高表达，与实施例1分析结果一致，如图1-图3所示的q-PCR结果，tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028呈高表达，与芯片结果表达一致。

为了进一步确定儿童急性肠套叠生物标志物，分析tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028的ROC曲线，分析AUC结果，如图4所示，结果表明(tRF-Leu-TAA-006,tRF-Gln-TTG-033，tRF-Lys-TTT-028分别为0.984(95％可信区间，0.952–1.000；P<0.05)，0.970(95％可信区间，0.933～1.000；P<0.05)和0.837(95％可信区间，0.722–0.951；P<0.05)，表明tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028能够作为儿童急性肠套叠症的生物标志物。

综上所述，本发明利用分子诊断技术、首次采用高特异性的tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028作为儿童急性肠套叠的生物标志物，所采用的检测产品，不仅能够使得儿童急性肠套叠的诊断符合特异性强、灵敏度高的要求，还具有操作简单快速、无介入、通量高、成本低等众多综合优势。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 苏州大学附属儿童医院

<120> 一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物及其应用

<130> 2022-03-08

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accccactcc tggtacca 18

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtcccatgg tgtaatggtt agcactctgg a 31

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cactgtaaag ctaacttagc attaacct 28

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tacagtccga cgatcacccc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgtgctctt ccgatcttgg ta 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgatcggtc ccatggtgta 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccgatcttc cagagtgcta ac 22

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccactgtaaa gctaacttag catta 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgtgtgctc ttccgatcta g 21

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcttcggcag cacatatact aaaat 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgcttcacga atttgcgtgt cat 23

Claims

1.一种与儿童急性肠套叠相关的生物标志物，其特征在于，所述与儿童急性肠套叠相关的生物标志物包括tRF-Leu-TAA-006、tRF-Gln-TTG-033和tRF-Lys-TTT-028。

2.如权利要求1所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物，其特征在于，所述引物包括SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.9所示的核酸序列。

3.如权利要求1所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物或权利要求2所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物在制备儿童急性肠套叠的诊断和/或监测产品中的应用。

4.一种儿童急性肠套叠诊断和/或监测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、逆转录试剂或PCR Mix中的任意一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA提取试剂包括Trizol、氯仿、异丙醇和乙醇；

7.一种如权利要求4-6任一项所述的儿童急性肠套叠诊断和/或监测试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：

以样本中RNA为模板进行逆转录反应，以所述逆转录反应的产物为模板，利用权利要求2所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物进行实时荧光定量PCR，判读结果。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述使用方法还包括制备梯度稀释DNA模板的步骤；

优选地，所述梯度稀释DNA模板的制备方法包括：

以所述逆转录反应的产物为模板，利用权利要求2所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物进行PCR反应，将所述PCR反应产物进行梯度稀释，得到所述梯度稀释DNA模板。

9.根据权利要求7或8所述的使用方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应程序包括：

预变性：94～96℃，8～11min；

10.根据权利要求7-9任一项所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：

(2)以所述cDNA为模板，制备梯度稀释DNA模板；

(3)分别以所述cDNA和梯度稀释DNA模板为模板，利用权利要求2所述的与儿童急性肠套叠相关的生物标志物的引物进行实时荧光定量PCR，所述实时荧光定量PCR反应程序包括：预变性：94～96℃，8～11min；循环延伸：94～96℃变性9～11秒、58～62℃延伸55～65秒并收集荧光，35～45个循环，判读结果。