CN105925699A - 一种检测卡那霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测卡那霉素的方法，本发明采用双限制性内切酶切割位点及基于G‑四连体引发的颜色变化来检测卡那霉素，具体制备方法：将发夹和卡那霉素特异性结合；将均相反应混合液加入显色剂显示检测。本发明利用了G‑四联体的氧化性，实现了对目标物卡那霉素的高特异性检测；利用核酸工具酶，起到了信号放大的作用。
Description
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测卡那霉素的比色传感器。
背景技术
卡那霉素是一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30S核糖体结合从而致使MRNA密码误读。若细菌中产生一种破坏卡那霉素的酶，则可变为抗性株。卡那霉素抗性的质粒经常被作为选择基因或标记基因用于分子克隆中。卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素。对多数肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、普罗菲登菌属、耶尔森菌属等均有良好抗菌作用；流感嗜血杆菌、布鲁菌属、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等对本品也大多敏感。卡那霉素对葡萄球菌属(甲氧西林敏感株)和结核分枝杆菌亦有一定作用，对铜绿假单胞菌无效。其他革兰阳性细菌如溶血性链球菌、肺炎链球菌、肠球菌属和厌氧菌等对本品多数耐药。近年来耐药菌株显著增多，由于某些细菌产生氨基糖苷类钝化酶，使之失去抗菌活性。卡那霉素与链霉素、新霉素有完全交叉耐药，与其他氨基糖苷类可有部分交叉耐药。卡那霉素使用不当会引起神经和皮肤过敏反应，所以检测卡那霉素是很重要的。
检测卡那霉素的方法有分光光度法，酶联免疫法，胶体金免疫层析法及电化学检测方法等，这些方法有仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点。
发明内容
本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺点，提供了一种检测卡那霉素的比色传感器。
本发明是通过以下步骤得到的：
本发明中一共用到以下几条链，其序列分别是：
PP：5~ GGG TTG GGC GGG ATG GGT TT AA T CAC ~3 （SEQ:ID:NO:1）；
AP：5~ GGT TGA GGA AAC TAG CTT ATT AAA TTT AGT GAT TAAA CCCAT C ~3（SEQ:ID:NO:2）；
HAP（发卡）:：5~TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA TTGATCC T GGATCTTTT AAT CAC TAAATTTAA TA AGC T AGT TT CCT CAA CC~3 （SEQ:ID:NO:3）；
Primer（引物）： 5~ GGTT GAG GAA A ~3 （SEQ:ID:NO:4）。
本发明中用到了两种酶：phi29 DNA聚合酶和Nt.Alwi内切酶。phi29 DNA聚合酶在引物与模板的作用下，沿着模板链从5’端向3’端生长，聚合出与模板链碱基完全互补的序列。Nt.ALwi内切酶可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是，切割位点是在N4和N之间。
本发明中卡那霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过循环和链的重复利用的方式来实现信号的放大，从而实现卡那霉素的高灵敏，特异性的检测，并获得较低的检测下限。
均相中发生的反应主要有：HAP由四部分组成：卡那霉素的aptamer，内切酶 的识别序列，内切酶的互补序列和Primer的互补序列。当有卡那霉素存在时，由于卡那霉素的aptamer与目标物之间的特异性识别与结合，可以将发卡打开，使HAP上内切酶的识别序列和引物（primer）的互补序列以单链的形式暴露在外面。随后均相中的primer可以通过碱基互补配对与打开的HAP杂交成一定的双链。在phi29DNA聚合酶的作用下，primer以打开的HAP为模板生长成完全互补的杂交双链，限制性内切酶在相应的切割位点进行切割，因为HAP有限制性内切酶的切割位点和其切割位点的互补序列，限制性内切酶在双链上进行切割，切下来的链既是引物又是模板，切下来的P1 与aptamer互补，这样又可以打开发夹，然后重复上述过程。此为第一步循环放大（目标物诱导的循环放大）。
第二步放大仍是在均相中产生的，上述循环放大的结果是产生大量的被切割的链T1，在T1中加入PP和AP的杂交链，AP和T1的结合能力强于AP和PP 的结合，所以，T1与AP结合，只剩下PP这个单链，PP富含G碱基，加入血红素形成G四联体，加入双氧水和ABTS有明显的颜色变化。
在均相反应中，反应条件为37℃，反应时间是2个小时。
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）使用目标物打开发夹；
（2）切割下的序列与AP结合，使含有大量G碱基的链呈单链；
（3）对序列进行比色检测。
所述的制备方法，检测物卡那霉素打开发夹的操作步骤如下：将2μL的发夹与2μL的卡那霉素混合，在37℃下孵育0.5h。
所述的制备方法，优选将均相反应产物进行信号放大操作步骤如下：
（1）将灭菌水，10×的buffer缓冲液、发夹及目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育0.5h；
（2）将（1）中孵育好的混合溶液取出，在这混合溶液中加入引物DNTPs,phi29DNA聚合酶与Nt.Alwi内切酶，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；
其中因为被打开的发夹上有限制性内切酶的切割位点和其切割位点的互补序列，当加入聚合酶和引物时，被打开的发夹形成双链，并且在限制性内切酶的作用下，在其切割位点进行切割。这时的切割下来的DNA链既是引物又是模板。
所述的制备方法，对酶添加在低温下进行，确保酶的活性。
该发明的检测方式是比色检测，利用紫外光谱仪进行检测。在检测之前，将步骤（2）中产生的大量的TI与PP和AP形成的双链混合，然后在37℃孵育0.5小时，使产生的大量的T1与PP和AP形成的双链进行链置换反应，由于T1和AP的结合能力远大于AP和PP的结合能力，所以T1和AP形成了双链结构，而PP变成了富含G碱基的单链，最后加入ABTS和双氧水使信号进行显色，用紫外光谱仪来检测待测目标物。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的phi29DNA聚合酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及底物显色剂。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补检测卡那霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的检测。
本发明的有益效果：
1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用核酸适配体和目标物卡那霉素可以进行特异性结合来检测；
2、利用具有链置换功能的phi29 DNA聚合酶，实现了目标物的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；
3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，结合聚合酶，其中对DNA链独特的设计了双切割位点，使被切割下来的DNA链既是引物又是模板，从而生成了大量可作为二级目标物的T1和能继续打开发夹的AP1，实现了第二步循环放大，进一步提高了检测的灵敏度；
4、 该传感器的反应条件温和，反应速度快；
5、 检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
6、制备方法简单，性能稳定，重复性好，适用于食品，水中卡那霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；
7、制作的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）目标物与发夹的特异性结合；
（2）对检测的特异性序列进行信号的放大；
（3）对序列进行比色检测。
所述的制备方法，优选将目标物与发夹进行反应，操作步骤如下：将2μL目标物卡那霉素与2μL发夹混合，在37℃下孵育0.5h。
所述的制备方法，优选将检测的信号进行特异性放大的过程如下：
（2）将（1）中孵育好的混合溶液取出，在这混合溶液中加入引物，dNTPs,phi29DNA聚合酶与Nt.Alwi内切酶，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；
所述的制备方法，对酶添加在低温下进行，确保酶的活性。
（3）将（2）中的混合溶液与PP和AP杂交链一同混合，并继续放在37℃的恒温箱中孵育0.5h。
该发明的检测方式是比色检测，利用紫外光谱仪进行检测。
在检测之前，将步骤（2）中产生的大量的T1和AP1，AP1可以继续循环使用，打开发夹，T1可以与AP结合，是PP中12G碱基暴露出来，加入血红素后，可以形成G四联体的结构。最后加入ABTS和双氧水使信号进行显色，用紫外光谱仪来检测待测目标物。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的phi29DNA聚合酶，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用，链置换等温放大以及底物显色剂。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的检测。
实施例1
探针杂交的主要步骤如下：
a、在离心管中加入2μL的PHI29的buffer（buffer为购买PHI29DNA聚合酶的配套缓冲液）；
b、将8μL的灭菌水加入离心管中，并振荡均匀；
这个时候，我们再进行溶链：
a、根据HAP链上对应的溶解一O.D所需的灭菌水数，依次加入；
b、将加入灭菌水的probe链放入离心机中，设定3000r/min，离心30秒；
c、将离心好的HAP链取出，在每个离心管中分别加入2μL卡那霉素，四环素，链霉素于离心管中，并振荡均匀。
d、在依次向各个离心管中加入2μL的引物，2μL dNTPs, 2μL phi29DNA聚合酶与2μL Nt.Alwi内切酶，在37度恒温箱中孵育一小时；
e、再将2μL AP和2μL PP混合后加入各个离心管中，加入血红素和ABTS，37度恒温箱中孵育0.5小时，通过变化来检测目标物。
检测结果为只有加入了卡那霉素的离心管中有颜色变化，其余的离心管与空白对照几乎一致，所以说此生物传感器对卡那霉素具有特异性识别。
实施例2
限制性内切酶优化的主要步骤如下：
a、在加入目标物的离心管中加入2μL的DNTP，2μLPhi29DNA聚合酶后分别在各个离心管中加入1μLNt.Alwi内切酶,1.5μLNt.Alwi内切酶,2μLNt.Alwi内切酶和2.5μLNt.Alwi内切酶，3μLNt.Alwi内切酶；
b、振荡均匀后，在37℃孵育1h；
下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：
c、将灭菌水，10×的buffer缓冲液、HAP（2μL）, 卡那霉素(2μL)，phi29 DNA聚合酶（2 μL），dNTPs（2 μL），加入离心管中，震荡30s。
d、将离心管中混合溶液依次加入不同浓度的Nt.Alwi内切酶；
e、将（d）中的混合溶液放在37℃的恒温箱中孵育1h。
f、将e中孵育好的混合溶液都加入PP和AP的杂交链，血红素及ABTS和双氧水。充分反应后紫外光谱仪进行检测。
加入2μLNt.Alwi内切酶的样品中吸光度的峰值最大，加入2.5μLNt.Alwi内切酶和3μLNt.Alwi内切酶样品的吸光度的峰值跟加入2μLNt.Alwi内切酶的样品中吸光度的峰值相差不多，而加入其他限制性内切酶浓度的样品中吸光度的峰值与2μLNt.Alwi内切酶的样品的吸光度的峰值有比较明显的差距。所以最佳的限制性内切酶的浓度为2μL。
实施例3
ABTS浓度的优化主要步骤如下：
a、在离心管中加入2μL的PHI29的buffer（buffer为购买PHI29DNA聚合酶的配套缓冲液）；
b、将8μL的灭菌水，2μL HAP和2μL浓度分别为10 nM、25 nM、50 nM、75 nM、100 nM目标物加入离心管中，并振荡均匀，在37度的恒温箱中水浴0.5小时；
c、在b中水浴好的离心管中加入2μL的DNTP，引物，2μLPhi29DNA聚合酶，2μLNt.Alwi内切酶，在37度的水浴箱中水浴一小时；
d、在c中水浴好的离心管中加入AP和PP的杂交链，再加入1μL的血红素，在37度的恒温箱中水浴0.5小时；
e、将水浴好的离心管分别加入0.75μLμLABTS，1μLABTS和1.5μLABTS，再加入3μL的双氧水开始检测。通过样品吸光度的峰值，可以看出在目标物浓度为10 nM-75 nM之间，数据呈线性关系，说明在此范围内检测结果有效。具体结果如下表。
。
<110>济南大学
<120>一种检测卡那霉素的方法
<160>2
<210>1
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<212>DNA
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<222>(1)..(26)
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<400>1
GGG TTG GGC GGG ATG GGT TTA ATC AC 26
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<212>DNA
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(43)
<223>引物
<400>2
GGT TGA GGA AAC TAG CTT ATT AAA TTT AGT 30
GAT TAA ACC CAT C 43
<210>3
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(72)
<223>引物
<400>3
TGG GGG TTG AGG CTA AGC CGA TTG ATC CTG 30
GAT CTT TTA ATC ACT AAA TTT AAT AAG CTA 60
GTT TCC TCA ACC 72
<210>4
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(11)
<223>引物
<400>4
GGT TGA GGA AA 11
Claims (3)
1.一种检测卡那霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）目标物与发夹的特异性结合；
（2）对检测的特异性序列进行信号的放大；
（3）对序列用紫外光谱仪进行比色检测。
2.根据权利要求1所述的检测卡那霉素的方法，其特征在于，步骤1）的具体检测方法为：将2μL 目标物卡那霉素与2μL发夹混合，在37℃下孵育0.5h。
3.根据权利要求1所述的检测卡那霉素的方法，其特征在于，步骤2）中，将1）中孵育好的混合溶液取出，加入2μL引物，2μL dNTPs，2μL phi29DNA聚合酶与2μL Nt.Alwi内切酶，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育1h；将孵育液与PP和AP杂交链一同混合，并继续放在37℃的恒温箱中孵育0.5h。
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20191001 Termination date: 20200607 |