CN113552188A

CN113552188A - 一种基于dna四面体的检测赭曲霉毒素a的电化学生物传感器

Info

Publication number: CN113552188A
Application number: CN202110833708.5A
Authority: CN
Inventors: 张清心; 许伟颖; 黄加栋; 王玉; 张曼茹; 江龙; 王业茹; 孙文玉; 李静静; 徐婉晴; 朱志学; 刘素
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2021-07-23
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2041-07-23
Also published as: CN113552188B

Abstract

本发明属于传感器技术领域，涉及一种基于DNA四面体的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器，具体涉及目标介导DNAzyme催化裂解、链置换(SDA)触发电极表面DNA四面体封闭链释放、电极上的滚环扩增反应(RCA)以AgNC催化过氧化氢反应用于检测赭曲霉毒素A(OTA)的电化学生物传感器。基于OTA及其适配体的特异性识别、DNAzyme的催化裂解反应、SDA反应、RCA反应，以及DNA四面体的特殊性质构建了电化学生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补OTA现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。

Description

一种基于DNA四面体的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器

技术领域

本发明属于传感器技术领域，涉及一种基于DNA四面体的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器，具体涉及目标介导DNAzyme催化裂解、链置换(SDA)触发电极表面DNA四面体封闭链释放、电极上的滚环扩增反应(RCA)以AgNC催化过氧化氢反应用于检测赭曲霉毒素A(OTA)的电化学生物传感器。

背景技术

赭曲霉毒素是一类真菌次生代谢物，是一种典型的生物毒素，其中赭曲霉毒素A（OTA）毒性强、污染广、难降解去除，能侵害人体肝肾，并引发大多数哺乳动物产生癌症、肝肾中毒。OTA广泛产生于食品、饲料加工和储存运输过程，在水体中也会有少量存在。国际癌症研究机构将赭曲霉毒素A列为一种潜在的人类致癌物。我国豆类、谷类食品及其制品中OTA的标准限量为5 μg/kg ，酒类（葡萄酒）中OTA的标准限量为2 μg/kg 。

目前检测OTA的方法有很多，如光学分析法、电泳法、色谱法等。但这些分析方法存在程序繁琐、仪器昂贵、设备复杂等缺点，不适合现场检测。因此，开发快速、痕量、高灵敏度和选择性的检测 OTA的分析方法是十分必要的。

发明内容

为了实现更加灵敏、特异性的检测赭曲霉毒素A OTA，本申请提出了一种目标介导DNAzyme催化裂解，经链置换触发电极表面DNA四面体封闭链释放，进而引发电极上的滚环扩增反应，最终通过AgNC催化过氧化氢反应构建检测OTA的电化学生物传感器。

本发明的技术方案如下：

一种基于DNA四面体的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器，包括赭曲霉毒素A的适配体Apt、DNAzyme发夹H、触发链T、连接探针LP、挂锁探针PP、PBS缓冲液、DNA聚合酶、Mg²⁺，银簇链AgNC以及形成四面体的DNA链S1、S2、S3、S4和封闭链B；

所述赭曲霉毒素A的适配体Apt的序列为SEQ ID No:1；

所述DNAzyme发夹H的序列为SEQ ID No:2；

所述触发链T的序列为SEQ ID No:3；

所述连接探针LP的序列为SEQ ID No:4；

所述挂锁探针PP的序列为SEQ ID No:5；

所述银簇链AgNC的序列为SEQ ID No:6；

所述S1的序列为SEQ ID No:7；

所述S2的序列为SEQ ID No:8；

所述S3的序列为SEQ ID No:9；

所述S4的序列为SEQ ID No:10；

所述封闭链B的序列为SEQ ID No:11；

所述赭曲霉毒素A的适配体Apt的序列为：5’-GATC GGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’；

所述DNAzyme发夹H的序列为：5’- GCCGT TGTCCGATGC GTGGGT rA GTAGTTCAGGTTTTTTTTTT CCTGAACTAT CCGAGCCGGTCGAAA ACCCACACCC -3’；

所述触发链T的序列为：5’- GCCGT TGTCCGATGC GTGGGT-3’；

所述连接探针LP的序列为：5’-CTTCGGTGCTCG CTTGCCTGCTCG-3’；

所述挂锁探针PP的序列为：5’-P-CGAGCACCGAAG GATGAAGCCATA CATCTCGATGAAGCCATA CGAGCAGGCAAG-3’；

所述银簇链AgNC的序列为：5’-GATGAAGCCATA CCCCCCCCCCCC-3’；

所述S1的序列为：5’- G CAG ATG AAT GGC TTT GCG CGT GGA CTCTGG AAG ATTATC CC TTT C GGC ATT ACA CGT ACA TAG AGGTCC G TTT TTTTTTT TTT TTT TTTGCATCGGACAACGGcGCTCG CT-3’；

所述S2的序列为：5’- SH(CH₃)₆- GGC TGCTCG GTG TGG GCC TTG TCG GG TT T CCCG TAA GAT CAA GCGACAGTCGTT C TTT GG GAT AAT CTT CCA GAG TCC ACG CGC -3’；

所述S3的序列为：5’- SH(CH₃)₆- CCC GAC AAG GCC CAC ACC GAG CAG CC TTT GCCA TTC ATC TGC CCT GGTCAA GAG G TTT GG CGT CGC CTC GTC CTC AG G AGC CGG -3’；

所述S4的序列为：5’- SH(CH₃)₆- TTGAT CTT ACGGG TTT C CGG CTC CTG AGG ACGAGGCGA CGC CTTT CG GAC CTC TAT GTA CGT GTA ATG CCG -3’；

所述封闭链B的序列为：5’- CCTCTTGACCAGGCCCCCC GAGCGCCGTACCTTTTTTTTTTTTAACGACTGTCGC -3’；

所述挂锁探针PP的5’ 端磷酸化处理；

所述的S2、S3、S4链的3’ 端修饰有巯基-SH，所述的目标物为赭曲霉毒素A。

DNAzyme发夹H经过催化裂解释放触发链T，在电极上依次进行链置换暴露DNA四面体封闭链B、滚环扩增反应产生大量银簇链AgNC结合区域和银簇催化过氧化氢反应产生电化学信号。

上述检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）环状模板CT的构建与银簇链AgNC的制备；所述环状模板CT通过挂锁式探针PP和连接探针LP在T4 DNA连接酶的辅助下杂交而成；所述银簇链AgNC通过AgNC核酸序列、AgNO3溶液通过NaBH₄还原得到；

（2）对电极进行预处理；

（3）DNA四面体制备及其修饰到电极表面；

（4）均相反应产生电极反应的触发链T；

（5）电极上的链置换、环状模板CT的捕获及滚环扩增反应及其产物对银簇链的捕获。

优选地，所述步骤（2）的过程为：电极在氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；所述步骤（2）的电极为金电极。

优选地，所述步骤（3）的DNA四面体的制备过程为：将等摩尔量的DNA四面体五条链混合在TM缓冲液中，反应，备用。

优选地，所述步骤（3）的修饰到电极表面的过程为：将制备好的DNA四面体与三(2-羧乙基)膦 TCEP注入电极，在室温下反应过夜。

优选地，所述步骤（4）均相反应的过程为：

a.将赭曲霉毒素A的适配体和DNAzyme发夹H，灭菌，振荡，水浴锅中保持，形成H-Apt探针后冷却至室温；

b.取灭菌水，5×PBS缓冲液，步骤a的H-Apt探针，Mg²⁺，5 µL赭曲霉毒素A于灭菌的离心管中，振荡，孵育。

优选地，所述步骤（5）的过程为：取触发链T、DNA聚合酶反应缓冲液、10×RCAbuffer、环状模板CT、dNTP以及银簇链AgNC，滴加到步骤（3）的电极上，然后将电极继续放在37℃的恒温箱中4 h，清洗。

上述制备方法制备的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器在检测食品、环境中赭曲霉毒素A上的应用。

上述应用：以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，检测待测目标物。

上述过程中用到的溶液的制备方法：

a. 5×PBS缓冲液是由以下方法配制：Na₂HPO₄（10 mM）、NaH₂PO₄（10 mM）、NaCl（140mM）、KCl（1 mM）、MgCl₂（1 mM），最终溶液的pH值为7.4和7.0。保存于-20℃冰箱，备用。

b. 10×RCA缓冲液是由以下方法配制：Tris（500 mM）、DTT（10 mM）、MgCl₂（200mM），最终溶液的pH值为7.5。保存于-20℃冰箱，备用。

c. TM缓冲液是由以下方法配制：Tris（20 mM）、MgCl₂（50 mM），最终溶液的pH值为8.0。保存于-20℃冰箱，备用。

c.配置的PBS缓冲液、RCA缓冲液、TM缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。保存于-20℃冰箱，备用。

d.电解液的配置：取4 mL 5×PBS于16 mL灭菌水中，并加入200 µL，100 mM的H₂O₂溶液，充分混匀待用。电解液需现用现配。

该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先进行环状模板CT、银纳米簇、DNA四面体的制备以及均相反应溶液的准备。然后将DNA四面体通过Au-S键固定在电极表面。再将均相反应产物、滚环扩增反应所需溶液、银簇链滴加到电极上，依次进行SDA、RCA和银簇链修饰。最后向反应电极上滴加过氧化氢，继续孵育，用三电极工作体系检测信号峰。电位设置0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安法读取电信号，检测待测目标物。

本发明基于OTA及其适配体的特异性识别、DNAzyme 的催化裂解反应、SDA反应、RCA反应，以及DNA四面体的特殊性质构建了电化学生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补OTA现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、灵敏度高

利用了OTA及其适配体之间特异性结合的特性进行检测；利用了DNAzyme的催化裂解、链置换反应和滚环扩增反应起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度。

2、条件温和，检测快

该传感器的反应条件温和，反应速度快；4、检测原理的主要过程均是在电极上实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

3、方法简单、性能稳定，适用于产业化

制备方法简单，性能稳定，适用于食品和环境中OTA的检测；制备过程的工艺成本低，性能稳定，电极的重复性好，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该发明原理示意图；

图2为实施例1 H-Apt探针浓度优化检测结果图；

图3为实施例2 环状模板CT浓度优化检测结果图；

图4为实施例3 银簇链AgNC浓度优化检测结果图；

图5为实施例4传感器检测OTA的工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1 环形模板、银纳米簇及DNA四面体的制备

（1）将42 μL灭菌水，6 μL挂锁探针（100 μM），6 μL连接探针（100 μM）和6 μL 10×的T4 DNA连接酶缓冲液混匀，95 ℃变性5 min，然后慢慢冷却至室温完成杂交，然后在反应体系里添加3 μL T4 DNA连接酶（60 U/μL），将其在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4 DNA连接酶。

（2）向上述反应体系中加入1 μL核酸外切酶Ⅰ（20 U/μL）和2 μL的核酸外切酶Ⅲ（100 U/μL）37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，获得环状模板CT，4℃条件下保藏备用。

（3）将15 μL，100 μM AgNC核酸序列与73 μL的20 mM PBS缓冲溶液（pH=7.0）混合，然后将6 μL，1.5 mM AgNO3溶液加入体系中，Ag⁺ : DNA=6:1，在4 ℃下冷却15 min 后，加入6 μL，1.5 mM NaBH₄还原，剧烈摇晃1 min，反应在4 ℃黑暗中进行6 h，得到银簇链AgNC。

（4）将5 μL S1、S2、S3、S4和B（终浓度都为100 µM）混合在TM缓冲液中，在95℃反应5 min，放入4℃ 冰箱逐渐冷备用却，使用前需稀释100倍。

如图1所示，目标物OTA与适配体链特异性结合改变了H-Apt的结构，激活H-Apt中DNAzyme的活性，在Mg²⁺的作用下进行切割，释放出触发链T，T经链置换反应将DNA四面体的封闭区域释放。PP与LP部分序列可以特异性结合，在连接酶和外切酶的帮助下形成环状模板CT，CT与DNA四面体封闭区域有部分杂交，在dNTPs和phi29聚合酶的作用下进行电极上的滚环扩增，扩增产物中有部分序列与银簇链杂交，从而使银簇链修饰到电极附近，大量银簇可以催化过氧化氢从而产生强烈的电化学信号。

实施例2 电化学信号随H-Apt探针浓度的变化

一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

a.电极预处理：金电极首先在0.3和0.05 µM的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b.将10 μL 1μM 的DNA四面体溶液（含3mM TCEP）滴加到电极表面，在室温下孵育过夜，以备下一步反应使用。

c.均相反应步骤：

将5 µL Apt（10 µM）和5 µL DNAzyme发夹H（10 µM）加入灭菌的离心管中，振荡30s，放入95℃的水浴锅中保持5 min形成H-Apt探针后，冷却至室温；

取20 µL灭菌水，40 µL 5×PBS缓冲液，10 µL H-Apt探针（0 µM、0.01 µM、0.05 µM、0.1 µM、0.2 µM、0.3 µM、0.4 µM、0.5 µM），10 μL OTA和20 µL Mg²⁺于灭菌离心管中，振荡30 s，在37℃下反应2h后，得到触发链T；

d. 电极反应：取c步中的T溶液5 μL，10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL，10×RCA buffer 10 μL，5 μL环状模板CT（100 nM）和2 μL 银簇链AgNC（500 nM），1.25 μL的phi29 DNA聚合酶（1 U/μL），2 μL的dNTP（1 mM），最后加入64.75 μL超纯水混合，在37 ℃孵育4 h。

e.将修饰好的电极用PBS缓冲液和超纯水清洗三遍，在氮气流下干燥；

f.将制备好的电极在含1 mM过氧化氢的电解液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-1 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安技术读取AgNC电信号的变化，检测待测目标物。

结果见图2，从图中可以看出，检测到的电流信号随着H-Apt探针的浓度在0-0.1 μM区间内增大而增大，当浓度超过0.1 μM后，电流趋于稳定，所以H-Apt探针的最佳浓度为0.1 μM。

实施例3 电化学信号随环状模板CT浓度的变化

c.均相反应步骤：

取20 µL灭菌水，40 µL 5×PBS缓冲液，10 µL H-Apt探针（0.1 µM），10μL OTA和20µL Mg²⁺于灭菌离心管中，振荡30 s，在37℃下反应2h后，得到触发链T；

e. 电极反应：取c步中的T溶液5 μL，10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL，10×RCA buffer 10 μL，5 μL环状模板CT（浓度分别为0 nM、25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、300 nM、400 nM）和2 μL AgNC（500 nM），1.25 μL的phi29 DNA聚合酶（1 U/μL），2 μL的dNTP（1 mM），最后加入64.75 μL超纯水混合，在37 ℃孵育4 h。

结果见图3，从图中可以看出，检测到的电流信号随着环状模板CT的浓度在0-100nM区间内增大而增大，当浓度超过100 nM后，电流趋于稳定，所以环状模板CT的最佳浓度为100 nM。

实施例4 电化学信号随AgNC浓度的变化

b.将10 μL 1 μM 的DNA四面体溶液（含3mM TCEP）滴加到电极表面，在室温下孵育过夜，以备下一步反应使用。

c.均相反应步骤：

取20 µL灭菌水，40 µL 5×PBS缓冲液，10 µL H-Apt探针（0.1 µM），10 μL OTA和20 µL Mg²⁺于灭菌离心管中，振荡30 s，在37℃下反应2h后，得到触发链T；

f. 电极反应：取c步中的T溶液5 μL，10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL，10×RCA buffer 10 μL，5 μL环状模板CT（100 nM）和2 μL AgNC（浓度分别为0 μM、0.25 μM、0.5 μM、1 μM、1.5 μM、2 μM），1.25 μL的phi29 DNA聚合酶（1 U/μL），2 μL的dNTP（1 mM），最后加入64.75 μL超纯水混合，在37 ℃孵育4 h。

结果见图4，从图中可以看出，检测到的电流信号随着银簇链AgNC的浓度在0-0.5μM区间内增大而增大，当浓度超过0.5 μM后，电流趋于稳定，所以银簇链AgNC的最佳浓度为0.5 μM。

实施例5 对OTA的检测

c.均相反应步骤：

取20 µL灭菌水，40 µL 5×PBS缓冲液，10 µL H-Apt探针（0.1 µM），10 μL OTA（浓度为（0 ng·L^-1、1 ng·L^-1、10 ng·L^-1、50 ng·L^-1、100 ng·L^-1、500 ng·L^-1、1 μ g·L^-1）和20 µL Mg²⁺于灭菌离心管中，振荡30 s，在37℃下反应2h后，得到触发链T；

d.电极反应：取c步中的T溶液5 μL，10×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液10 μL，10×RCA buffer 10 μL，5 μL环状模板CT（100 nM）和2 μL AgNC（500 nM），1.25 μL的phi29 DNA聚合酶（1 U/μL），2 μL的dNTP（1 mM），最后加入64.75 μL超纯水混合，在37 ℃孵育4 h。

结果见图5。从图5A中可以看出，检测到的电流信号随着目标物浓度在1 ng·L^-1-1 μ g·L^-1区间内增大而增大，图5B显示OTA浓度的对数与电流峰值大小呈正比关系，拟合曲线：I=0.8287+ 0.5711 lgC （相关系数是0.9809，其中C代表了OTA的浓度），由此计算优化后的生物传感器的检测限为0.712 ng·L^-1。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 济南大学

<120> 一种基于DNA四面体的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 1

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

<210> 2

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 2

gccgttgtcc gatgcgtggg tgtagttcag gttttttttt tcctgaacta tccgagccgg 60

tcgaaaaccc acaccc 76

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 3

gccgttgtcc gatgcgtggg t 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 4

cttcggtgct cgcttgcctg ctcg 24

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 5

cgagcaccga aggatgaagc catacatctc gatgaagcca tacgagcagg caag 54

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 6

gatgaagcca tacccccccc cccc 24

<210> 7

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 7

gcagatgaat ggctttgcgc gtggactctg gaagattatc cctttcggca ttacacgtac 60

atagaggtcc gttttttttt tttttttttt gcatcggaca acggcgctcg ct 112

<210> 8

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 8

ggctgctcgg tgtgggcctt gtcgggtttc ccgtaagatc aagcgacagt cgttctttgg 60

gataatcttc cagagtccac gcgc 84

<210> 9

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 9

cccgacaagg cccacaccga gcagcctttg ccattcatct gccctggtca agaggtttgg 60

cgtcgcctcg tcctcaggag ccgg 84

<210> 10

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 10

ttgatcttac gggtttccgg ctcctgagga cgaggcgacg cctttcggac ctctatgtac 60

gtgtaatgcc g 71

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(artiartificial sequence)

<400> 11

cctcttgacc aggccccccg agcgccgtac cttttttttt tttaacgact gtcgc 55

Claims

1.一种基于DNA四面体的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器，其特征在于，包括赭曲霉毒素A的适配体Apt、DNAzyme发夹H、触发链T、连接探针LP、挂锁探针PP、PBS缓冲液、DNA聚合酶、Mg²⁺，银簇链AgNC以及形成四面体的DNA链S1、S2、S3、S4和封闭链B；

所述赭曲霉毒素A的适配体Apt的序列为SEQ ID No:1；

所述DNAzyme发夹H的序列为SEQ ID No:2；

所述触发链T的序列为SEQ ID No:3；

所述连接探针LP的序列为SEQ ID No:4；

所述挂锁探针PP的序列为SEQ ID No:5；

所述银簇链AgNC的序列为SEQ ID No:6；

所述S1的序列为SEQ ID No:7；

所述S2的序列为SEQ ID No:8；

所述S3的序列为SEQ ID No:9；

所述S4的序列为SEQ ID No:10；

所述封闭链B的序列为SEQ ID No:11；

所述挂锁探针PP的5’ 端磷酸化处理；所述的S2、S3、S4链的3’ 端修饰有巯基-SH，所述的目标物为赭曲霉毒素A。

2.根据权利要求1所述的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器，其特征在于，DNAzyme发夹H经过催化裂解释放触发链T，在电极上依次进行链置换暴露DNA四面体封闭链B、滚环扩增反应产生大量银簇链AgNC结合区域和银簇催化过氧化氢反应产生电化学信号。

3.权利要求1或2所述的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）对电极进行预处理；

（3）DNA四面体制备及其修饰到电极表面；

（4）均相反应产生电极反应的触发链T；

4.根据权利要求3所述的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的过程为：电极在氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；所述步骤（2）的电极为金电极。

5.根据权利要求3所述的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的DNA四面体的制备过程为：将等摩尔量的DNA四面体五条链混合在TM缓冲液中，反应，备用。

6. 根据权利要求3所述的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的修饰到电极表面的过程为：将制备好的DNA四面体与三(2-羧乙基)膦TCEP注入电极，在室温下反应过夜。

7.根据权利要求3所述的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）均相反应的过程为：

8. 根据权利要求3所述的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）的过程为：取触发链T、DNA聚合酶反应缓冲液、10×RCA buffer、环状模板CT、dNTP以及银簇链AgNC，滴加到步骤（3）的电极上，然后将电极继续放在37℃的恒温箱中4 h，清洗。

9.权利要求3所述的制备方法制备的检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器在检测食品、环境中赭曲霉毒素A上的应用。

10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.7 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率为0.05 s，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，检测待测目标物。