CN114674899A - 一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,用TAE/Mg2+缓冲液将双足DNA walker与封闭链block退火形成双链DNA walker/block;用TAE/Mg2+缓冲液将DNA‑H1、DNA‑H2、DNA‑H3、DNA‑H4退火形成发夹DNA‑H1,发夹DNA‑H2,发夹DNA‑H3,发夹DNA‑H4;用三(2‑羧乙基)膦)还原巯基修饰的DNA‑H1,然后滴至金电极表面孵育10小时,再用6‑巯基‑1‑己醇处理0.5‑1h;将双链DNA walker/block、不同浓度的APE1酶与发夹DNA‑H2混合滴至金电极表面进行反应;再将发夹DNA‑H3、发夹DNA‑H4混合滴至电极表面进行反应;在室温下将亚甲基蓝滴在电极表面,避光孵育,超纯水冲洗、N2吹干,得到检测APE1酶的超灵敏电极;将上述超灵敏电极置于PBS中,进行方波伏安法信号检测,得出不同浓度的APE1酶对应的SWV信号,并绘制出标准曲线;把待测样品加入到超灵敏电极表面,37℃下孵育,设定一样的检测条件,测得不同待测样品的SWV信号,获得APE1酶的特异性检测结果。
Description
技术领域
本发明属于生物化学分析方法,具体涉及一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法。
背景技术
脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶又称氧化还原效应因子1(即APE1)是一种重要的DNA修复蛋白,在碱基切除修复(BER)过程中,它通过切割无碱基(AP)位点维持基因组稳定性。它还参与调节细胞对氧化应激条件的反应。在肿瘤细胞中发现了APE1的异常表达,癌细胞中APE1的水平通常会升高。迄今为止,已经开发出许多用于检测APE1的方法,例如酶联免疫吸附测定,电化学免疫测定,电化学发光免疫传感器和荧光DNA探针。随着对APE1酶的研究增多,在对追求APE1检测的灵敏度和选择性要求越来越高,因此对其研究的越来越广泛。DNA出色的可编程性使DNA walker的构建成为可能,DNA walker的渐进运动提供了执行多项任务和信号放大的可能性,为分子运输,生物传感器和生物合成提供了有价值的平台。因此,基于DNA walker的有效信号放大,结合灵敏的电化学信号方法,为APE1酶的检测可能提供了一种独特的思路。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法。具体提供了如下的技术方案:
1、一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,步骤为:
1)用TAE/Mg2+缓冲液将双足DNA walker与封闭链block退火形成双链DNA walker/block;
2)用TAE/Mg2+缓冲液将DNA-H1、DNA-H2、DNA-H3、DNA-H4退火形成发夹DNA-H1,发卡DNA-H2,发卡DNA-H3,发卡DNA-H4;
3)用三(2-羧乙基)膦)还原巯基修饰的DNA-H1,然后滴至金电极表面孵育10小时,再用6-巯基-1-己醇处理0.5-1h,以减少非特异性吸附;
4)将步骤1)得到的双链DNA walker/block、不同浓度的APE1酶与步骤2)的发夹DNA-H2混合滴至金电极表面进行反应;
5)再将DNA-H3、DNA-H4混合滴至电极表面进行反应;
6)在室温下将亚甲基蓝滴在电极表面,避光孵育,超纯水冲洗、N2吹干,得到检测APE1酶的超灵敏电极;
7)将步骤6)得到的超灵敏电极置于PBS中,进行方波伏安法信号检测,得出不同浓度的APE1酶对应的SWV信号,并绘制出曲线;
8)把待测样品加入步骤6)得到超灵敏电极表面,37℃下孵育,设定与步骤6)一样的检测条件,测得不同待测样品的SWV信号,获得APE1酶的特异性检测结果。
进一步,步骤4)所述的双链walker/block、APE1酶与DNA-H2反应的时间为1h-3h,步骤5)所述的DNA-H3与DNA-H4反应的时间为1h-3h。
进一步,步骤4)所述的双链walker/block、APE1酶与DNA-H2反应的时间为2.5h,DNA-H3与DNA-H4反应的时间为2h。
进一步,所述的巯基修饰的DNA-H1序列为SEQ ID NO.1;所述的双足DNA walker序列为SEQ ID NO.2;所述的封闭链block序列为SEQ ID NO.3;所述的DNA-H2的序列为SEQ IDNO.4;所述的DNA-H3的序列为SEQ ID NO.5;所述的DNA-H4序列为SEQ ID NO.6。
进一步,步骤1)所述的TAE/Mg2+缓冲液组成为40mM Tris,20mM醋酸,1mM EDTA,10mM Mg2+,pH=8。
进一步,所述的双足DNA walker与封闭链block等摩尔量,所述的DNA-H2、DNA-H3和DNA-H4等摩尔量。
进一步,步骤4)所述的APE1酶范围为0.001-1000U/ml。
进一步,步骤3)所述的6-巯基-1-己醇的用量为1-5mM。
进一步,步骤7)所述的亚甲基蓝的用量为1-5mM。
进一步,步骤8)所述的方波伏安法的参数设置为Init E:-0.5V,Final E:0.1V,Quite Time:2s,其余参数使用默认设置。
本发明的有益效果在于:DNA walker作为一种动态纳米器件常被用做检测靶标的信号放大装置,其具有高效、稳定等优良的特性。我们将DNA walker与杂交链式反应(HCR)双放大信号结合,并利用电化学的高灵敏度和快速响应的特点,设计了超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法。我们将发夹H1通过Au-S键固定在金电极表面,随后加入被封闭的双足DNA walker。第一个信号放大方式是DNAwalker的渐进运动,其由三部分组成,包括轨道链、步行链、驱动力,即电极表面修饰的DNA-H1、产生的双足DNA walker链、辅助发夹DNA-H2发生的链置换作用力。第二个信号放大方式是杂交链式反应(HCR)的引入,HCR产生的长链可以吸附多个电化学信号分子,产生强烈的电化学方波伏安电流信号(SWV)。当靶标APE1酶存在时,APE1识别双足DNA walker/block双链处的AP位点,切割AP位点后,block由于碱基互补能力减弱,从而脱离,产生双足DNA walker单链。DNA walker通过发夹DNA-H1的脚趾域引发DNA-H1,在辅助发夹DNA-H2存在下,发生链置换反应以提供DNA walker渐进运动的动力,驱动DNA walker的下一个循环,产生的H1/H2双链进一步引发发夹DNA-H3与发夹DNA-H4的HCR反应,由于DNA单链可以通过静电作用吸附亚甲基蓝活性分子(MB)或者DNA双链通过π-π叠加作用插入大量的MB分子,通过将MB分子整合到HCR产生的长DNA链中,获得强烈的电流信号,提高了传感器对APE1酶的检测灵敏度,在疾病的临床诊断中具有潜在的应用价值。当靶标APE1酶不存在的时候,无法释放DNA walker单链,即无法引发后续反应,则不会产生电化学信号。本发明将DNA walker与电化学结合,为了提高电流信号并加入了HCR的放大策略,过程简单易行、响应迅速、灵敏度高、检测限低,成功的用于APE1的检测,在疾病的临床诊断中具有潜在的应用价值。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
图1为本发明的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法检测原理示意图;
图2为APE1酶切双链双足DNA walker/block的聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
图3为验证实验原理可行性的聚丙烯酰胺凝胶电泳图;
图4为电极表面实验可行性表征的循环伏安CV图;
图5为电极表面实验可行性表征的电化学阻抗EIS图;
图6为HCR反应过程的时间优化;
图7为不同HCR反应时间与SWV电流信号对应关系绘制的拟合图;
图8为DNA walker步行反应过程的时间优化;
图9为不同DNA walker的步行反应时间与SWV电流信号对应关系绘制的拟合图;
图10为不同APE1酶浓度引发体系测得的SWV测量值;
图11为不同APE1酶浓度与SWV电流信号对应关系绘制的拟合图;
图12为不同APE1酶浓度与SWV电流信号的线性关系图;
图13为不同酶靶标的选择性分析图。
具体实施方式
一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法如图1所示,双足DNA walker最初由两条序列相同的block链封闭,在无靶标时无法触发block链断裂及后续反应,在靶标APE1酶存在时,可以切割DNA双链的AP位点,封闭链断裂并由于结合力不足而脱落,产生单链双足walker;在金电极表面修饰发夹DNA-H1,释放的双足walker可以打开H1,在H2链置换作用下,双足walker再次被释放并产生H1/H2双链,链置换反应起到驱动双足walker行走的作用。产生的H1/H2双链可以进一步引发HCR反应生成长的双链DNA,亚甲基蓝分子MB通过静电吸附与ssDNA结合,或通过π-π叠加作用与dsDNA结合,以产生强烈的电化学信号,获得了对APE1酶检测的灵敏度。
下面结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1对探针DNA进行预处理
首先,从上海生工订购的粉末状引物DNA使用前离心4000rpm/min,1min,用超纯水按要求溶解,形成100μM DNA溶液。使用时用TAE/Mg2+缓冲液配制,缓冲液组成为40mM Tris,20mM醋酸,1mM EDTA,10mM Mg2+,pH=8。
DNA-H1序列为5’-SH-TTT TTT TTC GAT CCA ATC ATC AGC CTA GCT CCG AAT TCCGCT GAT GAT TGG ATC GAG TGC CT-3’(SEQ ID NO.1);
双足DNA walker序列为5’-AGG CAC TCG ATC CAA TCA TCA GCA CCA CAC ATTATC TGG CAC TCC AAC AGT GCC TAG GCA CTC GAT CCA ATC ATC AGC-3’(SEQ ID NO.2);
封闭链block序列为5’-CAT CAG CXA ACC TGG G-3’(SEQ ID NO.3);
DNA-H2序列为5’-TCT ACC TAC CTA GCT CCG AAT TCC GAT CCA ATC ATC AGCGGA ATT CGG AGC TAG GCT GAT GAT-3’(SEQ ID NO.4);
DNA-H3序列为5’-GGA ATT CGG AGC TAG GTA GGT AGA GTA ATG CCG TCT ACCTAC CTA GCT CCG-3’(SEQ ID NO.5);
DNA-H4序列为5’-CCG TCT ACC TAC CTA GCT CCG AAT TCC CGG AGC TAG GTAGGT AGA CGG CAT TAC-3’(SEQ ID NO.6)。
实施例2聚丙烯酰胺凝胶电泳进行方案可行性验证
各个发夹DNA首先退火形成发夹,双足DNA walker与封闭链退火杂交形成双链,按照对应条带的条件在37℃反应。配制10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,在100V电压下实行。然后将其置于凝胶成像仪上成像。结果如图2、图3所示,图2表示酶切双足DNA walker的过程,条带1与条带2分别对应封闭链block与walker链;条带3表示被封闭的双链-双足DNA walker/block;条带4表示的是无AP位点的双链-双足DNA walker/block,其位置与带有AP位点的条带位置一样;条带5表示的是在条带4的基础上加APE1酶,由于双链中不含AP位点,因此APE1不能切割双链,无法产生其它条带;条带6表示在条带3的基础上加APE1酶,由PAGE图可以看到walker链的位置,并且双链消失,这是由于APE1切割双链中的AP位点,封闭链裂解,碱基互补配对的结合力无法使封闭链稳定的与walker链结合,从而产生单链DNA walker;条带7表示在不存在APE1酶的基础上加H1,walker无法被释放进而不能引发H1,仍存在大量双链DNA walker与H1;条带8表示在存在APE1酶的基础上加H1,walker被释放打开H1,可以看出walker链与两个H1结合的条带,双链DNA walker与H1条带逐渐消失。这表明我们的靶标APE1可以识别双链中AP位点,并合理的引发H1反应。后续电极表面的反应的PAGE结果如图3所示,条带1、2、3、4、5分别代表双链DNA walker/block、H1、H2、H3、H4;条带6表示APE1存在时,walker引发H1、H2发生链置换反应,得到H1/H2双链的条带;条带7表示APE1存在时,并且walker引发H1、H2发生链置换反应后,继续发生HCR的反应,产生长链HCR产物;条带8表示靶标APE1不存在时,无法引起整个反应链的发生。聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果验证了我们方案的可行性。
实施例3金电极的处理
首先,将金电极依次用1.0、0.3和0.05μm Al2O3粉末抛光成镜面,每一步金电极均用超纯水冲洗干净;然后用乙醇和超纯水超声清洗。超声清洗、在氮气流下干燥后,在0.1M的新配硫酸溶液中反复扫循环伏安直至图形稳定。最后,对金电极进行超纯水冲洗、N2吹干,将预处理的金电极用于制造电化学生物传感器。
实施例4金电极表面DNA的修饰及其表征
首先,1μM的发夹H1用TCEP避光处理1h。取上述溶液滴加到处理过的电极上室温孵育,超纯水冲洗并用N2干燥后,将发夹H1修饰的金电极置于6-巯基-1-己醇(MCH)中处理0.5-1h,以减少非特异性吸附。此时,获得已经修饰好的H1/GE。接下来将双链walker/block、一定量APE1酶、H2滴至电极表面37℃反应2.5h,之后将H3、H4混合滴至电极表面反应2h。以上步骤每一步修饰完均用超纯水冲洗并用N2吹干。
为了验证电极表面DNA的修饰及实验反应的可行性,我们用电化学阻抗谱(EIS)以及循环伏安法(CV)进行了表征。EIS与CV均在铁氰化钾电解液中进行。电化学阻抗谱对电极表面修饰是一种有效的方法,通常由半圆和线性部分组成。半圆部分在高频区,用来反映界面电荷转移电阻的大小,线性部分则在低频区,用来反应界面电荷的扩散过程。结合循环伏安法的电流表征,我们证实了实验方案在电极表面的可行性,结果如图4、图5所示,曲线a显示裸金电极的圆弧半径很小,且CV图的峰电流最高,表明界面电荷转移电阻很小;当金电极表面修饰上H1之后,DNA显示负电性,阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的电子传递,使得曲线b显示电荷转移阻抗增大,且CV图峰电流降低;随着MCH封闭电极以及杂交链式反应(HCR)产生长链DNA后,曲线c、d显示电荷转移阻抗持续增大,且CV图峰电流持续降低,这表明酶切walker后步行触发了后续HCR的进行。实验结果与电极表面实验方案的设计一致。
实施例5实验条件的优化
本发明分别对DNA walker的步行过程和HCR引发过程的时间进行了优化,在各个DNA探针浓度一致,反应温度固定时,分别对DNA walker步行过程进行了1h、2h、2.5h、3h的分析,对HCR发生过程进行了0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h的分析。实验结果如图6、7、8、9所示,图6与图7分析得到HCR反应过程最佳时间为2h,图8与图9分析得到了DNA walker步行最佳时间为2.5h。本实验选择DNA walker步行2h,HCR触发2.5h。
实施例6 DNA walker纳米器件的性能分析
1μM的发夹H1用标准方法在电极表面室温孵育过夜,并通过MCH处理以减少非特异性吸附后,获得已经修饰好的H1/GE。接下来将双链walker/block、不同浓度的APE1酶(浓度分别为0.001U/ml、0.01U/ml、0.1U/ml、1U/ml、10U/ml、100U/ml、200U/ml、1000U/ml)、H2滴至电极表面37℃反应2.5h,之后将H3、H4混合滴至电极表面反应2h。反应完成后,在室温下将MB滴在电极表面,避光孵育。以上步骤每一步修饰完均用超纯水冲洗并用N2吹干。方波伏安法在PBS电解液中进行,在进行电化学测量之前,应使用高纯度氮气彻底吹扫电解液约15-30分钟,以避免受到氧气还原的干扰。
DNA walker纳米器件的性能分析实验结果如图10所示,在相同条件下,0-1000U/ml靶标范围内,随待测物APE1酶浓度的增加,电流信号强度逐渐增加。图11直观的显示了不同浓度APE1对应的电流信号。图12表面,我们的实验在0.001U/ml到1U/ml有良好的线性关系,检测限为0.001U/ml。
实施例7实验选择性分析
在实验的反应过程中,将APE1酶换成10U/ml的UDG酶、T5 Exo酶、Lambda Exo、ExoⅠ,其余在相同条件下进行反应,测其方波伏安电流强度,结果如图13所示,所获得的电流信号均比APE1酶存在时得到的电流信号低,证实了本发明有良好的特异性。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,步骤为:
1)用TAE/Mg2+缓冲液将双足DNA walker与封闭链block退火形成双链DNA walker/block;
2)用TAE/Mg2+缓冲液将DNA-H1、DNA-H2、DNA-H3、DNA-H4退火形成发夹DNA-H1,发夹DNA-H2,发夹DNA-H3,发夹DNA-H4;
3)用三(2-羧乙基)膦)还原巯基修饰的DNA-H1,然后滴至金电极表面孵育10小时,再用6-巯基-1-己醇处理0.5-1h;
4)将步骤1)得到的双链DNA walker/block、不同浓度的APE1酶与步骤2)的发夹DNA-H2混合滴至金电极表面进行反应;
5)再将发夹DNA-H3、发夹DNA-H4混合滴至电极表面进行反应;
6)在室温下将亚甲基蓝滴在电极表面,避光孵育,超纯水冲洗、N2吹干,得到检测APE1酶的超灵敏电极;
7)将步骤6)得到的超灵敏电极置于PBS中,进行方波伏安法信号检测,得出不同浓度的APE1酶对应的SWV信号,并绘制出标准曲线;
8)把待测样品加入步骤6)得到超灵敏电极表面,37℃下孵育,设定与步骤6)一样的检测条件,测得不同待测样品的SWV信号,获得APE1酶的特异性检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,步骤4)所述的双链walker/block、APE1酶与DNA-H2反应的时间为1h-3h,步骤5)所述的DNA-H3与DNA-H4反应的时间为1h-3h。
3.根据权利要求2所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,步骤4)所述的双链walker/block、APE1酶与DNA-H2反应的时间为2.5h,DNA-H3与DNA-H4反应的时间为2h。
4.根据权利要求1所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,所述的巯基修饰的DNA-H1序列为SEQ ID NO.1;所述的双足DNA walker序列为SEQ IDNO.2;所述的封闭链block序列为SEQ ID NO.3;所述的DNA-H2的序列为SEQ ID NO.4;所述的DNA-H3的序列为SEQ ID NO.5;所述的DNA-H4序列为SEQ ID NO.6。
5.根据权利要求1所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,步骤1)所述的TAE/Mg2+缓冲液组成为40mM Tris,20mM醋酸,1mM EDTA,10mM Mg2+,pH=8。
6.根据权利要求1所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,所述的双足DNA walker与封闭链block等摩尔量,所述的DNA-H2、DNA-H3和DNA-H4等摩尔量。
7.根据权利要求1所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,步骤4)所述的APE1酶范围为0.001-1000U/ml。
8.根据权利要求1所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,步骤3)所述的6-巯基-1-己醇的用量为1-5mM。
9.根据权利要求1所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,步骤7)所述的亚甲基蓝的用量为1-5mM。
10.根据权利要求1所述的一种超灵敏检测APE1的DNA walker分析检测方法,其特征在于,步骤8)所述的方波伏安法的参数设置为Init E:-0.5V,Final E:0.1V,Quite Time:2s,其余参数使用默认设置。
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JIE JIANG ET AL.: "Electrochemiluminescence biosensor based on a 3D DNA walking nanomachine with a powerful payload capacity", 《SENSORS AND ACTUATORS: B. CHEMICAL》 * |
MENG-MEI LV ET AL.: "A bipedal DNA nanowalker fueled by catalytic assembly for imaging of base-excision repairing in living cells", 《CHEMICAL SCIENCE》 * |
MENGRU ZHOU ET AL.: "An electrochemical biosensor integrating immunoassay and enzyme activity analysis for accurate detection of active human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 * |
XINGCONG WANG ET AL.: "Electrochemical biosensor based on bipedal DNA walker for highly sensitive amplification detection of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1" * |
王嘉禹 等: "荧光分析法测定人体血液样品中脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)的活性", 《北京大学学报(医学版)》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN114674899B (zh) | 2023-04-21 |
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