CN111172164B

CN111172164B - 一种用于任意核酸编辑的组合物及方法

Info

Publication number: CN111172164B
Application number: CN202010157724.2A
Authority: CN
Inventors: 徐澍; 周国华; 邹秉杰
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-03-09
Filing date: 2020-03-09
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2040-03-09
Also published as: CN111172164A

Abstract

本发明公开了一种用于任意核酸编辑的组合物及方法。一种对任意核酸实施靶向切割的组合物，包括两个主要组分：组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标底物互补，另一部分具有核酸二级结构；组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子即可以识别所述的寡核苷酸探针的核酸二级结构从而与探针结合，还可以切割DNA或者RNA底物。本发明中，寡核苷酸探针上的二级发卡结构(茎‑环结构)可以直接被核酸内切酶分子识别，形成复合物分子。该复合物分子碰撞靶标的底物的概率将大于探针和酶两个独立扩散的分子同时碰撞靶标底物的概率，从而提高基因编辑效率。

Description

一种用于任意核酸编辑的组合物及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种用于任意核酸编辑的组合物及方法。

背景技术

“人类基因组计划”的完成，为阐明基因组功能以及在遗传变异和生物表型之间建立因果联系提供了可能，而高效、简便和精准的基因编辑系统是将这一可能付诸实现的重要工具。许多以此为目标的基因编辑系统被开发和应用，如锌指核糖核酸酶(ZFN)系统、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统和成簇规律间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas)系统等。

CRISPR-Cas系统作为重要的基因编辑工具具有设计简单、切割效率高等特点，已被广泛用于细胞、动物和植物的基因组DNA编辑，并在临床和农业应用上表现出巨大的潜力，堪称基因编辑技术发展史上伟大的里程碑。但是，CRISPR-Cas系统依旧有待改进的空间。

首先，几乎所有目前文献报导的CRISPR-Cas系统都依赖PAM(protospaceradjacent motif)序列进行定位，而PAM序列有固定的碱基搭配模式，从而限制了CRISPR-Cas系统在人类基因组中的锚定范围。尽管已有研究团队利用扩展Cas蛋白家族谱以及PAM序列种类的策略部分克服了这一限制，但随着对人类基因组30亿个碱基上各种基因功能探索欲望的增强，该不利因素将愈发难以忽略。其次，作为CRISPR-Cas系统中关键的Cas9或Cas12蛋白，二者的体积较大，不利于在体内进行包装和运输，这样就对将来的基因治疗药物设计提出较高的挑战。尽管已有研究团队开发出了更小的Cas蛋白，如CasX和Cas14，但它们仍然由约1000个氨基酸组成，大小在100kDa左右，该体型毫无疑问还需要进一步缩小。另外，文献报道Cas9蛋白可以切割DNA序列，Cas13蛋白可以切割RNA序列，尚没有一种Cas蛋白可以同时很好地切割DNA和RNA，这可能会限制将来病毒击杀等方面的应用。

2016年，本课题组报道了另一种基因编辑工具系统，命名为结构导向核酸酶(structure-guided nuclease，SGN)，后文称之为第一代SGN。当时，本课题组将一种古细菌来源的flap核酸内切酶1(Afu FEN1)用于基因编辑，将Afu FEN1与Fok I的切割域(Fn1)融合构建了SGN，通过Afu FEN1识别靶基因与向导DNA探针(guide DNA，简称gDNA)之间形成的3’flap结构而锚定靶基因，并通过Fn1切割靶基因。SGN具有如下特点，首先，3’flap结构的形成不受靶基因序列的限制，因此理论上SGN可以切割基因组DNA中的任何位点。其次，SGN由约500个氨基酸组成，大小70kDa左右，体积比Cas蛋白小，更适合体内递送。除此之外，在SGN处理的细胞基因组DNA中观察到大片段缺失突变形式，其与个别碱基突变(Cas蛋白产生的突变类型)相比更容易使靶基因编码的蛋白完全沉默。上述特性使得SGN有希望成为一种新的基因组编辑工具或基因治疗工具。

但美中不足的是，第一代SGN的编辑效率较低，在斑马鱼细胞中仅为1-10％，我们研究认为，第一代SGN效率较低的原因是靶标DNA需要先被gDNA结合形成3'flap结构后，才能被SGN结合，这样两步反应大大降低了SGN的编辑效率。并且，SGN中起切割DNA作用的Fn1结构域靶向特异性相对较差，Fn1是一种非特异性内切酶，在细胞中一旦随机碰撞到非靶标区域，就会引发切割反应，是导致基因组DNA中脱靶的关键原因。

发明内容

本发明的目的是针对现有CRISPR-Cas系统和第一代SGN系统技术的上述不足，提供一种无靶基因序列限制、体积小巧、反应效率和特异性更好的组合物及方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现:

一种对任意核酸实施靶向切割的组合物，包括两个主要组分：

组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有核酸二级结构；该探针上的二级结构可以直接被核酸内切酶分子识别形成复合物分子，该复合物分子碰撞靶标核酸底物的概率将大于两个独立扩散的分子同时碰撞靶标核酸底物的概率，从而提高编辑效率。

组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子即可以识别所述的寡核苷酸探针的核酸二级结构从而与探针结合，还可以切割DNA或者RNA底物。

所述的组合物，优选包括两个主要组分：

组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有茎-环核酸二级结构；寡核苷酸探针数量包括但不限于1条；

组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子即可以识别所述的寡核苷酸探针的茎-环核酸二级结构从而与探针结合，还可以切割靶标核酸底物。

所述的组合物，进一步优选包括两个主要组分：

组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有茎-环核酸二级结构；寡核苷酸探针数量为1条或2条；

组分B：AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、Homo SapiensFEN中任意一种的部分功能域或全酶片段。

所述的茎-环核酸二级结构是指核酸分子中存在的反向重复序列，由于互补碱基间的氢键配对，长链区段可以回折形成的一种二级结构，如图1所示。

在一个具体实施例中，所述的靶多核苷酸编辑方法中，所述靶多核苷酸是RNA或DNA,优选是基因组DNA和转录组mRNA，所述的基因组和转录组mRNA优选是哺乳动物基因组和转录组(包括人类基因组和转录组)、大肠杆菌基因组和转录组、斑马鱼基因组和转录组或植物基因组和转录组。

在一个具体实施例中，所述的靶多核苷酸编辑方法中，所述寡核苷酸探针与靶标核酸底物互补部分的长度在11nt以上。

在一个具体实施例中，所述的靶多核苷酸编辑方法中，所述一对核苷酸探针长度方向既可以是3’端与3’端相对，也可以5’端与5’端相对。

在一个具体实施例中，所述的核酸内切酶分子含有核定位信号。

在一个具体实施例中，所述的核酸内切酶分子含有核导出信号。

本发明所述的组合物在核酸编辑中的应用，所述的核酸编辑不包括以疾病诊断和或治疗为目的的核酸编辑。

一种对任意靶多核苷酸编辑方法，根据靶多核苷酸，设计并合成本发明所述的寡核苷酸探针，向含有靶多核苷酸的体系中加入所述的寡核苷酸探针和所述的核酸内切酶分子，所述的核酸内切酶分子识别寡核苷酸探针的二级结构从而与探针结合形成复合物，该复合物识别靶多核苷酸并对其实现切割。

所述的靶多核苷酸为DNA或RNA，优选是基因组DNA和转录组mRNA，所述的基因组和转录组mRNA优选是哺乳动物基因组和转录组(包括人类基因组和转录组)、大肠杆菌基因组和转录组、斑马鱼基因组和转录组或植物基因组和转录组。

当所述的靶多核苷酸为基因组DNA和转录组mRNA时，寡核苷酸探针的条数为1条或以上。

有益结果：

第一，本发明中，寡核苷酸探针上的二级发卡结构(茎-环结构)可以直接被核酸内切酶分子识别，形成复合物分子。该复合物分子碰撞靶标的底物的概率将大于探针和酶两个独立扩散的分子同时碰撞靶标底物的概率，从而与既往SGN系统相比，提高了基因编辑效率。

第二，既往SGN系统中的Fn1是非特异性核酸内切酶，本发明中核酸内切酶是一种特异性核酸内切酶，从而提高基因编辑靶向性。

第三，本发明探针特有的茎-环核酸二级结构，与核酸内切酶分子及靶标核酸底物结合后，使靶标核酸底物发生空间折叠，处于能被核酸内切酶分子切割的空间位置，使核酸内切酶分子同时具备了识别和切割功能。

第四，本发明中核酸内切酶比Cas蛋白小，有利于病毒载体包装和体内递送。

第五，本发明设计的方法不会受到靶标底物的序列或者类型限制。

第六，本发明方法对于不同的目标核酸，只需要更换对应的探针，不需要更换酶，就可以实现对任意核酸进行靶向切割，具有极强的通用性。

附图说明

图1-是关于能被识别的茎-环核酸二级结构的示意图

图2-本发明与最接近现有技术的原理示意图

图3-是关于实施例1的结果图

图4-是关于实施例2的结果图

图5-是关于实施例3的结果图

图6-是关于实施例4的原理图

图7-是关于实施例5的结果图

图8-是关于实施例6的结果图

图9-是关于实施例7的结果图

图10-是关于实施例8的结果图

图11-是关于实施例9的结果图

图12-是关于实施例10的结果图

具体实施方式

参照下列实施例更详细描述本发明。然而，本发明不应解释为限制于此。实施例中的hpDNA探针是本发明所述核酸探针中的一种。实施例中的FEN1是本发明所述核酸内切酶中的一种。

实施例1〈AfuFEN1在hpDNA探针的引导下可以对目标底物进行靶向切割〉

为了验证AfuFEN1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示)究竟能否成功切割序列不同的靶标DNA底物，我们设计了两条序列完全不同的DNA底物S1和S2，所示用荧光Cy5标记目标DNA底物的5′端，每条底物都匹配了对应的普通探针gDNA-1、gDNA-2，以及具有茎-环结构的hpDNA-1(简称Hp-1)和hpDNA-2(简称Hp-2)。反应条件是，将5pmoL hpDNA，5pmoL靶核酸底物以及Mix(10mmol/L MOPS pH 7.5，0.05％Tween-20，0.05％Nonidet P40)充分混匀，用超纯水补足体积10μL。以“95℃5min，55℃10min”程序杂交，加入AfuFEN1后37℃反应2h。如图3所示，当hpDNA和AfuFEN1同时存在时，泳道中有明显的切割条带，说明AfuFEN1在hpDNA介导下，可以成功切割序列不同的DNA靶标。

实施例2〈AfuFEN1和hpDNA可以形成复合物〉

为了证明AfuFEN1和hpDNA可以不依赖目标底物而形成复合物，用荧光基团Cy5标记Hp-Cy5的5'端，和适当数量的AfuFEN1一起，在37℃下孵育0.5h。用12％的非变性电泳分离混合物并用荧光成像。图4中的电泳迁移率测定(EMSA)结果证明AfuFEN1和Hp-Cy5可以在没有靶标DNA存在的情况下形成复合物。

实施例3〈AfuFEN1的切割效率高于SGN〉

我们比较了SGN+gDNA和AfuFEN1+hpDNA的效率(图5-A))。如图5-B所示，1.78和0.89pmol的SGN与gDNA-3只能切割S3的一部分，而0.45、0.22、0.11、0.05和0.02pmol的SGN与gDNA-3几乎没有切割S3。同时，如图5-C所示，1.78、0.89、0.45、0.22pmol的AfuFEN1与Hp-3几乎完全切割S3，而0.11、0.05和0.02pmol的AfuFEN1与Hp-3可以切割一部分S3。结果表明，与SGN+gDNA相比，AfuFEN1+hpDNA切割靶蛋白所需核酸酶的量减少约40倍(图5-D)，证实了切割效率有显著提高。

实施例4〈探针与靶标核酸底物互补部分的长度优选11nt以上〉

探针与靶标核酸底物互补的部分又称为“guide sequence”，我们比较了不同长度guidesequence的反应效率。如图6所示，我们针对靶标核酸底物CCR5设计了hpDNA-CCR5，当guide sequence的长度大于11nt时(Hp-CCR5-20、Hp-CCR5-19、Hp-CCR5-18、Hp-CCR5-17、Hp-CCR5-16、Hp-CCR5-15、Hp-CCR5-14、Hp-CCR5-13、Hp-CCR5-12)，AfuFEN1可以较好地切割靶标核酸底物。但是，当guide sequence的长度为11nt时(Hp-CCR5-11)，AfuFEN1对靶标核酸底物的切割效率开始下降。因此证实了探针与靶标核酸底物互补部分的长度优选11nt以上。

实施例5〈AfuFEN1对探针-靶向双链互补区域的不匹配非常敏感〉

与CRISPR-Cas系统类似，大多数非特异性脱靶的发生是由于探针与基因组DNA中非靶标位点的错误结合导致的。解决办法是找出基因编辑工具对这种错配的容错率。因此，需要研究AfuFEN1对探针与靶标DNA互补区域错配的敏感性。敏感性越高，容错率越小，脱靶的可能性就越小。

以S-CCR5为底物，我们通过将单个碱基突变(A突变为U，U突变为A，G突变为C，C突变为G)，考察了AfuFEN1对Hp-CCR5和靶标DNA之间单碱基错配的容错率。如图7-A所示，对于-m10到-m17位置上的错配，AfuFEN1的容错率较高，几乎无视突变，依然切割非靶标DNA；但对于-m18到-m20位置上的错配，AfuFEN1非常敏感，尤其是-m20位置上的单碱基错配，AfuFEN1几乎不切割底物DNA了。接着，我们又考察了双碱基错配的情况，如图7-B所示，当错配碱基个数由1个上升为2个时，AfuFEN1对错配的敏感度更高了。上述结果表明存在一个对错配敏感的“种子区”，特别是靠近发夹的单个基部(图7-C，位置-1)。即使hpDNA的其余部分错误地结合在一个错误的底物上，只要“种子区”上有一个或两个不匹配的碱基，就能阻止AfuFEN1的非特异性切割。

实施例6〈AfuFEN1反应对靶底物序列没有偏爱性〉

为了确定AfuFEN1对靶标DNA有无序列偏爱性，如图8-A所示，我们设计了一种DNA底物S1-N，在其与探针互补区域的5'端附近合成了一段由7个兼并碱基合成的序列(5'-NNNNNNN)，加入AfuFEN1反应后，产物琼脂糖电泳，回收未被AfuFEN1切割的完整靶标DNA片段，以其为模板PCR扩增，将扩增子克隆到T载体并测序。结果如图8-B，我们分析了4个碱基在1到7位的出现频率，没有观察到明显的序列偏好。可以推断，与CRISPR系统不同，AfuFEN1对靶标DNA的序列没有偏爱性。

实施例7〈AfuFEN1和Homo SapiensFEN1可用于人类细胞基因组编辑〉

在之前SGN的研究中，我们只以斑马鱼为实验对象，检测了SGN对基因组的编辑效率，且效率较低(～1％)。在这里，我们尝试在人类细胞中测试FEN1的基因编辑效率(图9-A)。我们对AfuFEN1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和Homo SapiensFEN1(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示)基因附加细胞核定位信号(NLS)，使其在人类细胞中实现最佳表达(图9-B和D)。为了测试FEN1蛋白是否能实现人类基因组DNA的靶向切割，我们在人胚肾293A细胞(HEK293A)的EMX1和DYRK1A基因中分别设计了一对hpDNAs靶向位点(图9-C和E)，分别是Hp-EMX1-R、Hp-EMX1-L、Hp-DYRK1A-R、Hp-DYRK1A-L。AfuFEN1或Homo SapiensFEN1作用于细胞之后，提取细胞基因组DNA，通过PCR扩增靶标区域。以50ng提取的基因组DNA作为扩增模板，以EMX1-OutF、EMX1-OutR，或DYRK1A-OutF、DYRK1A-OutR为引物进行第一轮扩增，PCR条件为预变性98℃5min，以程序98℃10s，60℃5s，72℃360s循环35次。第一轮扩增产物稀释100倍，作为第二轮扩增的模板，第二轮扩增引物为EMX1-inF、EMX1-inR，或DYRK1A-inF、DYRK1A-inR，PCR条件为预变性98℃ 5min，以程序98℃10s，58℃5s，72℃140s循环35次。第二轮扩增产物通过TA克隆得到单克隆子，通过Sanger测序对单克隆子中靶标基因片段序列进行分析，发现靶基因被AfuFEN1或Homo SapiensFEN1编辑后，出现了一定概率的大片段缺失(图9-C和E)，平均编辑效率约20％(图9-F)。

实施例8〈AfuFEN1系统可以编辑大肠杆菌中的基因组DNA和外源质粒DNA〉

为了研究FEN1是否在原核大肠杆菌细胞中工作，如图10-A所示，我们将表达FEN1(tet诱导)的质粒和hpDNA(Hp-narG-L、Hp-narG-R)转移到大肠杆菌MG1655细胞中，靶向内源性narG(硝酸还原酶G)基因。由于细菌细胞具有很弱的自我修复能力，在没有辅助修复系统的情况下造成的断裂是致命的。因此，如果FEN1能够破坏MG1655细胞的基因组DNA，那么菌体会死亡，从而菌板上的菌体克隆数量将会减少。首先，我们确保在四环素启动子诱导的MG1655细胞中表达AfuFEN1蛋白(图10-B)。然后，我们将不相关的hpDNA作为对照组转移到MG1655细胞中，并在菌板上计数克隆数，以衡量编辑效率。如图10-C所示，对照组有263个克隆，实验组有158个克隆，说明AfuFEN1可以破坏MG1655细胞的基因组DNA。随后，我们在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中测试了AfuFEN1是否能切割外源质粒上GFP基因(探针为Hp-GFP-T7)(图10-D)。与对照组相比，hpDNA-GFP组的相对荧光仅为对照组的15％(图10-E)。我们认为，在BL21(DE3)和MG1655(图10-B)中表达的异源FEN1的量的差异导致解理效率的差异(～40％和～85％)。结果表明，AfuFEN1能够切割靶点使其断裂，说明AfuFEN1具有通过染色体整合编辑大肠杆菌基因组DNA的潜力。

实施例9〈AfuFEN1能在体外切割目标RNA底物〉

为了验证AfuFEN1究竟能否成功切割序列不同的靶标RNA底物，我们设计了两条序列完全不同的RNA底物RNA-S1和RNA-S2，用荧光FAM标记目标RNA底物的5′端，每条底物都匹配了对应的hpDNA(Hp-1和Hp-2)。加入AfuFEN1反应后，如图11所示，当探针和AfuFEN1同时存在时，泳道中有明显的切割条带，说明AfuFEN1在hpDNA介导下可以成功切割序列不同的RNA靶标。

实施例10〈AfuFEN1能在细胞水平介导特异性的mRNA敲除〉

如图12-A所示，为了考察AfuFEN1是否能在细胞水平介导特异性的mRNA敲除，将编码FEN1的质粒转入HepG2细胞，再分别将靶向CDK9(细胞周期蛋白依赖激酶9)基因和AFP(甲胎蛋白)基因的hpDNA转入HepG2细胞(分别为Hp-CDK9和Hp-AFP)。如图12-B此处AfuFEN1含有NES(核导出序列)，因此大部分AfuFEN1蛋白留在细胞核外，不会作用于基因组，而作用于细胞质中的mRNA分子。与对照组相比，我们观察到AfuFEN1和Hp-AFP转化组细胞中的AFP蛋白表达明显降低(约下调22％，图12-C和E)。Hp-AFP的定位跨AFP在基因组DNA中的两个外显子，因此AFP蛋白的敲除不是由DNA断裂引起的。同理，还检测到CDK9蛋白的敲除(约下调24％，图12-D和E)。因此，我们认为FEN1可以在体内介导特异性的mRNA敲除。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 一种用于任意核酸编辑的组合物及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtgcgg atattggtga cctctttgag agggaagagg tcgagcttga gtacttctca 60

ggaaagaaaa ttgccgttga tgctttcaac acgctatacc agttcatctc gataataagg 120

cagcctgacg gtacgccgtt aaaggactca cagggcagaa tcacctctca cctttccgga 180

atcctataca gagtctccaa catggtcgag gtgggaatca ggccggtgtt tgtattcgac 240

ggagagccac cggagttcaa gaaggctgaa attgaggaga ggaaaaagag aagggctgag 300

gcagaggaga tgtggattgc ggctttgcag gcaggagata aggacgcgaa aaagtatgct 360

caggctgcag ggagggttga cgagtacatt gttgactccg caaagacgct tttaagttac 420

atggggattc cctttgtcga tgccccgtct gaaggagagg cgcaggctgc ttacatggca 480

gcaaaaggcg atgtggagta cacaggaagc caggattacg attctctgct cttcggaagc 540

ccgagactcg ccagaaatct cgcaataacg ggaaaaagga agcttcccgg caaaaatgtc 600

tatgtggatg taaagccgga gataataatt ctggaaagca acctcaaaag gctgggtttg 660

acgagggagc agctcatcga catagcgatt ctggtcggga cggactacaa tgagggtgtg 720

aagggtgtcg gcgtcaagaa ggctttgaac tacatcaaga cctacggaga tattttcagg 780

gcactcaagg ctctgaaagt aaatattgac cacgtagagg agataaggaa tttcttcctg 840

aatcctcctg tgactgacga ctacagaata gagttcaggg agcctgactt tgagaaggcc 900

atcgagttcc tgtgcgagga gcacgacttc agcagggaga gggtcgagaa ggccttggag 960

aagctcaaag ctctgaagtc aacccaggcc acgcttgaga ggtggttctg a 1011

<210> 2

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Ala Asp Ile Gly Asp Leu Phe Glu Arg Glu Glu Val Glu Leu

1 5 10 15

Glu Tyr Phe Ser Gly Lys Lys Ile Ala Val Asp Ala Phe Asn Thr Leu

20 25 30

Tyr Gln Phe Ile Ser Ile Ile Arg Gln Pro Asp Gly Thr Pro Leu Lys

35 40 45

Asp Ser Gln Gly Arg Ile Thr Ser His Leu Ser Gly Ile Leu Tyr Arg

50 55 60

Val Ser Asn Met Val Glu Val Gly Ile Arg Pro Val Phe Val Phe Asp

65 70 75 80

Gly Glu Pro Pro Glu Phe Lys Lys Ala Glu Ile Glu Glu Arg Lys Lys

85 90 95

Arg Arg Ala Glu Ala Glu Glu Met Trp Ile Ala Ala Leu Gln Ala Gly

100 105 110

Asp Lys Asp Ala Lys Lys Tyr Ala Gln Ala Ala Gly Arg Val Asp Glu

115 120 125

Tyr Ile Val Asp Ser Ala Lys Thr Leu Leu Ser Tyr Met Gly Ile Pro

130 135 140

Phe Val Asp Ala Pro Ser Glu Gly Glu Ala Gln Ala Ala Tyr Met Ala

145 150 155 160

Ala Lys Gly Asp Val Glu Tyr Thr Gly Ser Gln Asp Tyr Asp Ser Leu

165 170 175

Leu Phe Gly Ser Pro Arg Leu Ala Arg Asn Leu Ala Ile Thr Gly Lys

180 185 190

Arg Lys Leu Pro Gly Lys Asn Val Tyr Val Asp Val Lys Pro Glu Ile

195 200 205

Ile Ile Leu Glu Ser Asn Leu Lys Arg Leu Gly Leu Thr Arg Glu Gln

210 215 220

Leu Ile Asp Ile Ala Ile Leu Val Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Gly Val

225 230 235 240

Lys Gly Val Gly Val Lys Lys Ala Leu Asn Tyr Ile Lys Thr Tyr Gly

245 250 255

Asp Ile Phe Arg Ala Leu Lys Ala Leu Lys Val Asn Ile Asp His Val

260 265 270

Glu Glu Ile Arg Asn Phe Phe Leu Asn Pro Pro Val Thr Asp Asp Tyr

275 280 285

Arg Ile Glu Phe Arg Glu Pro Asp Phe Glu Lys Ala Ile Glu Phe Leu

290 295 300

Cys Glu Glu His Asp Phe Ser Arg Glu Arg Val Glu Lys Ala Leu Glu

305 310 315 320

Lys Leu Lys Ala Leu Lys Ser Thr Gln Ala Thr Leu Glu Arg Trp Phe

325 330 335

<210> 3

<211> 1152

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggaatcc aaggcctggc caaactaatt gctgatgtgg cccccagtgc catccgggag 60

aatgacatca agagctactt tggccgtaag gtggccattg atgcctctat gagcatttat 120

cagttcctga ttgctgttcg ccagggtggg gatgtgctgc agaatgagga gggtgagacc 180

accagccacc tgatgggcat gttctaccgc accattcgca tgatggagaa cggcatcaag 240

cccgtgtatg tctttgatgg caagccgcca cagctcaagt caggcgagct ggccaaacgc 300

agtgagcggc gggctgaggc agagaagcag ctgcagcagg ctcaggctgc tggggccgag 360

caggaggtgg aaaaattcac taagcggctg gtgaaggtca ctaagcagca caatgatgag 420

tgcaaacatc tgctgagcct catgggcatc ccttatcttg atgcacccag tgaggcagag 480

gccagctgtg ctgccctggt gaaggctggc aaagtctatg ctgcggctac cgaggacatg 540

gactgcctca ccttcggcag ccctgtgcta atgcgacacc tgactgccag tgaagccaaa 600

aagctgccaa tccaggagtt ccacctgagc cggattctgc aggagctggg cctgaaccag 660

gaacagtttg tggatctgtg catcctgcta ggcagtgact actgtgagag tatccggggt 720

attgggccca agcgggctgt ggacctcatc cagaagcaca agagcatcga ggagatcgtg 780

cggcgacttg accccaacaa gtaccctgtg ccagaaaatt ggctccacaa ggaggctcac 840

cagctcttct tggaacctga ggtgctggac ccagagtctg tggagctgaa gtggagcgag 900

ccaaatgaag aagagctgat caagttcatg tgtggtgaaa agcagttctc tgaggagcga 960

atccgcagtg gggtcaagag gctgagtaag agccgccaag gcagcaccca gggccgcctg 1020

gatgatttct tcaaggtgac cggctcactc tcttcagcta agcgcaagga gccagaaccc 1080

aagggatcca ctaagaagaa ggcaaagact ggggcagcag ggaagtttaa aaggggaaaa 1140

gaattctaat aa 1152

<210> 4

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ile Gln Gly Leu Ala Lys Leu Ile Ala Asp Val Ala Pro Ser

1 5 10 15

Ala Ile Arg Glu Asn Asp Ile Lys Ser Tyr Phe Gly Arg Lys Val Ala

20 25 30

Ile Asp Ala Ser Met Ser Ile Tyr Gln Phe Leu Ile Ala Val Arg Gln

35 40 45

Gly Gly Asp Val Leu Gln Asn Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ser His Leu

50 55 60

Met Gly Met Phe Tyr Arg Thr Ile Arg Met Met Glu Asn Gly Ile Lys

65 70 75 80

Pro Val Tyr Val Phe Asp Gly Lys Pro Pro Gln Leu Lys Ser Gly Glu

85 90 95

Leu Ala Lys Arg Ser Glu Arg Arg Ala Glu Ala Glu Lys Gln Leu Gln

100 105 110

Gln Ala Gln Ala Ala Gly Ala Glu Gln Glu Val Glu Lys Phe Thr Lys

115 120 125

Arg Leu Val Lys Val Thr Lys Gln His Asn Asp Glu Cys Lys His Leu

130 135 140

Leu Ser Leu Met Gly Ile Pro Tyr Leu Asp Ala Pro Ser Glu Ala Glu

145 150 155 160

Ala Ser Cys Ala Ala Leu Val Lys Ala Gly Lys Val Tyr Ala Ala Ala

165 170 175

Thr Glu Asp Met Asp Cys Leu Thr Phe Gly Ser Pro Val Leu Met Arg

180 185 190

His Leu Thr Ala Ser Glu Ala Lys Lys Leu Pro Ile Gln Glu Phe His

195 200 205

Leu Ser Arg Ile Leu Gln Glu Leu Gly Leu Asn Gln Glu Gln Phe Val

210 215 220

Asp Leu Cys Ile Leu Leu Gly Ser Asp Tyr Cys Glu Ser Ile Arg Gly

225 230 235 240

Ile Gly Pro Lys Arg Ala Val Asp Leu Ile Gln Lys His Lys Ser Ile

245 250 255

Glu Glu Ile Val Arg Arg Leu Asp Pro Asn Lys Tyr Pro Val Pro Glu

260 265 270

Asn Trp Leu His Lys Glu Ala His Gln Leu Phe Leu Glu Pro Glu Val

275 280 285

Leu Asp Pro Glu Ser Val Glu Leu Lys Trp Ser Glu Pro Asn Glu Glu

290 295 300

Glu Leu Ile Lys Phe Met Cys Gly Glu Lys Gln Phe Ser Glu Glu Arg

305 310 315 320

Ile Arg Ser Gly Val Lys Arg Leu Ser Lys Ser Arg Gln Gly Ser Thr

325 330 335

Gln Gly Arg Leu Asp Asp Phe Phe Lys Val Thr Gly Ser Leu Ser Ser

340 345 350

Ala Lys Arg Lys Glu Pro Glu Pro Lys Gly Ser Thr Lys Lys Lys Ala

355 360 365

Lys Thr Gly Ala Ala Gly Lys Phe Lys Arg Gly Lys Glu Phe

370 375 380

Claims

1.对任意核酸实施靶向切割的组合物在制备基因编辑试剂中的应用，所述的基因编辑为针对基因组DNA或转录组mRNA的编辑，其特征在于所述的组合物包括两个主要组分：

组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有茎-环核酸结构；寡核苷酸探针数量为1条或2条；

组分B：核酸内切酶分子：AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、Homo SapiensFEN中任意一种的部分功能域或全酶片段。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述寡核苷酸探针与靶标核酸底物互补部分的长度在11 nt以上。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于当寡核苷酸探针数量为一对时，一对核苷酸探针长度方向为3’端与3’端相对，或者为5’端与5’端相对。

4.对任意核酸实施靶向切割的组合物在基因编辑中的应用，所述的基因编辑为针对基因组DNA或转录组mRNA的编辑，且所述的基因编辑不以疾病诊断和或治疗为目的，其特征在于所述的组合物包括两个主要组分：

5.一种基因编辑方法，所述的基因编辑为针对基因组DNA或转录组mRNA的编辑，所述的基因编辑方法不以疾病治疗为目的，其特征在于根据靶多核苷酸，设计并合成权利要求1-3中任一项所述的寡核苷酸探针，向含有靶多核苷酸的体系中加入所述的寡核苷酸探针和权利要求1-3中任一项所述的核酸内切酶分子，所述的核酸内切酶分子识别寡核苷酸探针的二级结构从而与探针结合形成复合物，该复合物识别靶多核苷酸并对其实现切割。

6.根据权利要求5所述的对任意靶多核苷酸编辑方法，其特征在于所述的基因组DNA或转录组mRNA选自哺乳动物基因组DNA或转录组mRNA、大肠杆菌基因组DNA或转录组mRNA、斑马鱼基因组DNA或转录组mRNA、植物基因组DNA或转录组mRNA。

7.根据权利要求6所述的对任意靶多核苷酸编辑方法，其特征在于所述的寡核苷酸探针的条数为1条或以上。