JP6913965B2 - Fbn1t7498c突然変異を修復するキット、fbn1t7498c突然変異の作製及び修復方法、塩基編集によるfbn1t7498c突然変異の修復方法 - Google Patents
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Description
前記4種類のBE3は、ただrAPOBEC1のコーディングフレームに差異があり、YE1-rAPOBEC1(SEQ ID NO.4)、YE2-rAPOBEC1(SEQ ID NO.5)、YEE-rAPOBEC1(SEQ ID NO.6)は、その配列がそれぞれ生工生物(http://www.sangon.com/)により合成された。合成された断片の両端にそれぞれNotIとSmaIの酵素切断部位が付加された。合成された断片を通常のpmd19tベクター(TAKARA:6013)にクローニングした。
酵素切断システムは、バッファー(NEB:R0189L)6μL、プラスミド2μg、NotI 1μL、SmaI 1μL、残部ddH2Oで60μLとし、BE3と前記合成された3種類のベクターを混合した後、NotI(NEB:R0189L)、SmaI(NEB:R0141L)により、37℃で一晩酵素切断した。
ライゲーションシステムは、T4ライゲーションバッファー(NEB:M0202L)1μL、骨格ベクター20ng、APOBEC1断片50ng、T4リガーゼ(NEB:M0202L)0.5μL、残部ddH2Oで10μLとし、回収された骨格ベクターとAPOBEC1断片を、16℃で一晩ライゲーションした。変換工程は以下のとおりであった。コンピテントセル(TransGen:CD201)20μLを氷で解凍し、ライゲーション生成物2μLとコンピテントセルを混合し、氷で20分間放置し、42℃で60秒間熱刺激し、氷で2分間放置し、蘇生LB培地(MDBio:L001-1kg)を400μL加え、30分間振とうし、70μLを取りアンピシリンプレート(50μg/ml)に塗布し、37℃のインキュベーターで14時間培養した。
(1)YE1-BE3、SEQ ID NO.7、
(2)YE2-BE3、SEQ ID NO.8、
(3)YEE-BE3、SEQ ID NO.9、
(4)BE3、SEQ ID NO.10。
以下、突然変異部位の修復を行うときに、前記いずれかのBE3を採用してもよいが、好ましくは(1)又は(4)である。
突然変異部位付近で突然変異mt-sgRNA(SEQ ID NO.1)を設計し、オリゴを合成した。上流配列が5’-taggCGCCAATGGTGTTAACACAT-3’(SEQ ID NO.(14))であり、下流配列が5’-aaac ATGTGTTAACACCATTGGCG-3’(SEQ ID NO.(15))であり、上下流配列は、プログラム(95℃で5min、-2℃/sで95℃-85℃、-0.1℃/sで85℃-25℃、4℃で保持)によりアニーリングされ、BsaI(NEB:R0539L)で線状化されたPUC57-T7sgRNAベクター(addgene:51132)にライゲーションされた。線状化システムは、PUC57-T7sgRNA 2μg、バッファー(NEB:R0539L)6μL、BsaI 2μL、残部ddH2Oで、60μLとした。37℃で一晩酵素切断した。用いられた相同テンプレートssODN(SEQ ID NO.2)は、PAGE精製によって生工生物社(http://www.sangon.com/)により合成されたものである。また、突然変異部位付近で、塩基編集作用の特徴に応じ、修復re-sgRNA(SEQ ID NO.3)を設計し、オリゴを合成した。上流配列が5’-accgCTACGTGTTAACACCATTGG-3’(SEQ ID NO.16)であり、下流配列が5’-aaacCCAATGGTGTTAACACGTAG-3’(SEQ ID NO.17)であった。上下流配列は、プログラム(95℃で5min、-2℃/sで95℃-85℃、-0.1℃/sで85℃-25℃、4℃で保持)によりアニーリングされ、BsaI(NEB:R0539L)で線状化されたPGL3-U6sgRNAベクターにライゲーションされた。また、上流プライマー:5’-taggCTACGTGTTAACACCATTGG-3’(SEQ ID NO.18)と下流プライマー:5’-aaacCCAATGGTGTTAACACGTAG-3’(SEQ ID NO.19)を合成し、アニーリングにより、線状化されたPUC57-T7sgRNAベクターにライゲーションした。アニーリングプログラムや、線状化システムとプログラムは以上のとおりであった。ライゲーションシステムは、T4ライゲーションバッファー(NEB:M0202L)1μL、線状化ベクター20ng、アニーリングされたオリゴ断片(10μM)5μL、T4リガーゼ(NEB:M0202L)0.5μL、残部ddH2Oで10μLとし、16℃で一晩ライゲーションした。ライゲーションされたベクターに対して変換、菌体選別、同定を行い、同定プライマーとしては、U6ベクターは、上流配列:5’-TTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO.20)、下流配列が対応するオリゴの下流配列であった。T7ベクターは、上流配列:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO.21)、下流配列が対応するオリゴの下流配列であった。ポジティブクローンに対して菌体を振とうしてプラスミド(Axygene:AP-MN-P-250G)を抽出して濃度を測定しておいた。得られた突然変異プラスミドをmt-T7-sgRNA(SEQ ID NO.11)、re-U6-sgRNA(SEQ ID NO.12)及びre-T7-sgRNA(SEQ ID NO.13)と名付けた。
構築されたPUC57-T7sgRNAをテンプレートとし、sgRNAを含有する断片を増幅させた。用いられたプライマーは、F:5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’(SEQ ID NO.22)、R:5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.23)であった。増幅システムは、2Xバッファー(Vazyme:P505)25μL、dNTP 1μL、F(10pmol/μL)2μL、R(10pmol/μL)2μL、テンプレート1ng、DNAポリメラ−ゼ(Vazyme:P505)0.5μL、残部ddH2Oで50μLとした。増幅されて得られたPCR生成物は、以下の工程で精製された。すなわち、100μLごとにRNAsecure(Life:AM7005)を4μL加え、60℃で15分間保持し、三倍容量のPCR-A(Axygen:AP-PCR-250G)を加えてカラムクロマトグラフィを行い、12000回転/分で1分間遠心し、W2を500μL加えて1分間遠心し、1分間空回りし、RNAaseフリー水を20μL加えて溶離した。
(1)HEK293T細胞(ATCCから購入)を例とし、本発明では、真核生物細胞の培養とトランスフェクションを行った。HEK293T細胞を、10%FBSが添加された、ペニシリン(100U/ml)とストレプトマイシン(100μg/ml)を含むDMEM高グルコース培地(HyClone,SH30022.01B)に接種して培養した。
(2)トランスフェクションより両時間前に、抗生物質なし培地に交換し、LONZAトランスフェクション試薬(SF KIT)により説明書に従ってトランスフェクションし、細胞をカウントしたところ、1×106個であった。Cas9(Sigma:ESPCAS9PRO-50UG)、sgRNA及びssODNを3μg、1.5μg及び3μgの質量で混合した。エレクトロポレーションプログラムとしてDS150を採用し、エレクトロポレーション後の細胞を6cmのプレートで2日間培養した。
(3)細胞をフローサイトメーターにより単核球をソーティングして培養し、2週間後、成分が50mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris pH 8.0、0.5 % Nonidet P-40、0.5 % Tween 20、100 (g/ml protease Kである分解液で分解させることにより遺伝子型を同定した。ホモ変異細胞株を選別して拡大培養した。
(4)突然変異細胞株をhttp://crispr.mit.edu/、https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/により関連するオフターゲット部位を7個同定し、表1に示した。
(5)対応するプライマーを設計することによりオフターゲット部位を同定し、プライマー配列は表3に示した。増幅させたPCR生成物は、T7EN1とシーケンシング同定により、オフターゲットが認められなかった(図3)。
(1)本発明では、突然変異細胞株を培養しトランスフェクションした。HEK293T細胞を、10%FBSが添加された、ペニシリン(100U/ml)とストレプトマイシン(100μg/ml)を含むDMEM高グルコース培地(HyClone,SH30022.01B)に接種して培養した。
(2)トランスフェクションする前に6ウェルプレートに分注し、密度が70%〜80%に達したときにトランスフェクションした。
(3)トランスフェクションは、リポソームトランスフェクションを例とした。LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)の操作マニュアルに従って、2μgのBE3又はYE1-BE3又はYEE-BE3プラスミドと1μgのre-sgRNApGL3-U6-sgRNAプラスミドを均一に混合し、ウェルごとに細胞にコトランスフェクションし、6〜8時間後液を交換し、72時間後細胞を回収した。
(4)回収された細胞に対して、まずPCR生成物のシーケンシングを行ったところ、修復のピーク値が認められた(図3)。さらには、PCR生成物をTAクローニングし、選別されたクローンのうち、修復されたクローンの効率が50%であった。
(5)修復re-sgRNAをオフターゲット分析したところ、表2と図3に示されるように、同様に潜在的オフターゲット部位が8個見付けられた。同様に潜在的オフターゲット部位を分析、検出し(表3、図6)、同様にオフターゲット現象が認められなかった。
突然変異部位付近で、塩基編集作用の特徴に応じ、修復re-sgRNA(SEQ ID NO.3)を設計し、オリゴを合成した。上流配列が5’-taggCTACGTGTTAACACCATTGG-3’(SEQ ID NO.18)であり、下流配列が5’-aaacCCAATGGTGTTAACACGTAG-3’(SEQ ID NO.19)であった。上下流配列は、プログラム(95℃で5min、-2℃/sで95℃-85℃、-0.1℃/sで85℃-25℃、4℃で保持)によりアニーリングされ、BsaI(NEB:R0539L)で線状化されたPUC57-T7sgRNAベクターにライゲーションされた。線状化システムとプログラムは以上のとおりであった。ライゲーションシステムは、T4ライゲーションバッファー(NEB:M0202L)1μL、線状化ベクター20ng、アニーリングされたオリゴ断片(10μM)5μL、T4リガーゼ(NEB:M0202L)0.5μL、残部ddH2Oで10μLとし、16℃で一晩ライゲーションした。ライゲーションされたベクターに対して変換、菌体選別、同定を行い、同定プライマーとしては、上流配列:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO.21)、下流配列が対応するオリゴの下流配列であった。ポジティブクローンに対して菌体を振とうしてプラスミド(Axygene:AP-MN-P-250G)を抽出して濃度を測定しておいた。
構築されたPUC57-T7sgRNAをテンプレートとし、sgRNAを含有する断片を増幅させた。用いられたプライマーは、F:5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’(SEQ ID NO.22)、R:5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.23)であった。増幅システムは、2Xバッファー(Vazyme:P505)25μL、dNTP 1μL、F(10pmol/μL)2μL、R(10pmol/μL)2μL、テンプレート1μg、DNAポリメラ−ゼ(Vazyme:P505)0.5μL、残部ddH2Oで50μLとした。増幅されて得られたPCR生成物は、以下の工程で精製された。すなわち、100μLごとにRNAsecure(Life:AM7005)を4μL加え、60℃で15分間保持し、三倍容量のPCR-A(Axygen:AP-PCR-250G)を加えてカラムクロマトグラフィを行い、12000回転/分で1分間遠心し、W2を500μL加えて1分間遠心し、1分間空回りし、RNAaseフリー水を20μL加えて溶離した。
BE3を酵素切断して回収すること。本工程では、プラスミドBE3を線状化したものである。システムは、BE3/YE1-BE3/YE2-BE3/YEE-BE3 10μg、バッファーI(NEB:R0539L)10μL、BbsI 4μL(NEB:R0539L)、残部H2Oで100μLとした。均一に混合した後、37℃で一晩酵素切断した。
いずれの胚操作も、広州医科大学付属第三病院の生殖医学センターで行われ、本実験は、既に病院の論理委員会による審査を通過しており、卵子と精子を寄付した患者は、既に同意説明文書に署名した。本実験では、FBN1T7498Cのヘテロ突然変異を帯びた患者が得られ、血液と精液により遺伝子型を同定した(図1)。用いられた卵子は、いずれも生殖障害患者の未熟卵であり、インビトロで培養し成熟した。ICSIにより突然変異精子と卵子を結合し、突然変異受精卵を得た。
受精卵が2PN段階であると観察された場合、顕微操作により、容量がおおよそ0.2μLである塩基編集mRNA、本実施例ではBE3、及び修復で用いられたsgRNA細胞質を受精卵に注射し、BE3とsgRNAの濃度は、それぞれ100ng/μLと50ng/μLであった。処理された胚細胞を三ガスインキュベーターで3日間培養し続けた(図7)。
回収された胚を単核球増幅させた。用いられた試薬はVazyme,N601-01であった。増幅させたゲノムを100倍希釈し、目的の断片を増幅させて、突然変異効率を検出することに用いられた(図8)。目的の断片を増幅させるプライマーは、表3に示した。
編集効率をさらに確認するために、PE150ハイスループットシーケンシングにより、目的の断片を検出し、3個の対照胚と全ての7個の修復胚を選択し、コントロールで3個の胚がヘテロ遺伝子型であるが、7個の修復胚がいずれも正常な遺伝子型であることを見出し、塩基編集システムにより標的部位の修復を効率よく実現できることが証明された。
塩基編集システムの安全性を確保するために、3個の対照胚と全ての修復胚をオフターゲット検出したところ、修復胚において明らかなオフターゲット現象が認められなかったことが示された(図9)。
Claims (6)
- 塩基編集システム及びFBN1T7498C部位に対する修復re−sgRNAを含み、
前記塩基編集システムがBE3、YE1−BE3、YE2−BE3又はYEE−BE3のうちの一つであり、
前記FBN1 T7498C 部位に対する修復re−sgRNAの配列がSEQ ID NO.3である、
ことを特徴とする、FBN1T7498C突然変異を効率よく修復するキット。 - FBN1T7498C部位に基づき突然変異mt−sgRNAと、対応する突然変異ssODNとを設計するステップと、
FBN1T7498C部位に対する修復re−sgRNA及び塩基編集システムの少なくとも一つを用いて前記突然変異をインビトロで修復するステップとを含み、
前記mt−sgRNAの配列がSEQ ID NO.1であり、
前記ssODNの配列がSEQ ID NO.2であり、
前記re−sgRNAの配列がSEQ ID NO.3であり、
前記塩基編集システムがBE3、YE1−BE3、YE2−BE3又はYEE−BE3のうちの一つである、
ことを特徴とする、突然変異の作製及び修復方法。 - FBN1T7498Cを含有する突然変異細胞において、インビトロでFBN1T7498C部位に対する修復re−sgRNAにより塩基編集システムを突然変異部位に導入して塩基編集により修復を行い、トランスフェクションされた細胞を回収することを含み、
前記re−sgRNAの配列がSEQ ID NO.3であり、
前記塩基編集システムがBE3、YE1−BE3、YE2−BE3又はYEE−BE3のうちの一つである、
ことを特徴とする、塩基編集による突然変異の修復方法。 - 前記FBN1T7498Cを含有する突然変異細胞がHEK293T細胞であることを特徴とする、請求項3に記載の塩基編集による突然変異の修復方法。
- 前記FBN1T7498Cを含有する突然変異細胞の構築方法としては、FBN1T7498C部位に基づき突然変異mt−sgRNA及び対応する突然変異ssODNを設計し、mt−sgRNAの発現ベクターを構築し、インビトロでCas9タンパクと転写されたmt−sgRNAによりRNPを構成してssODNと結合しHEK293T細胞をエレクトロポレーションし、単核球をフローソーティングしてFBN1T7498Cを含有する突然変異細胞株を同定し、
前記mt−sgRNAの配列がSEQ ID NO.1であり、
前記ssODNの配列がSEQ ID NO.2であることを特徴とする、請求項3に記載の塩基編集による突然変異の修復方法。 - 前記FBN1T7498C部位に対する修復re−sgRNAは、前記FBN1T7498C部位に基づき修復re−sgRNAを設計し、U6プロモーター及び/又はT7プロモーターの発現ベクターを構築することにより得られることを特徴とする、請求項3に記載の塩基編集による突然変異の修復方法。
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