CN108753778A - 利用碱基编辑修复fbn1t7498c突变的试剂和方法 - Google Patents

利用碱基编辑修复fbn1t7498c突变的试剂和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用碱基编辑修复FBN1T7498C突变的试剂和方法。所述的高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统以及针对FBN1T7498C位点的修复re‑sgRNA。本发明利用碱基编辑技术，通过精准的CT单碱基突变，从而可以修复FBN1T7498C的突变，从而为治疗该类突变引起的马凡氏综合征提供了高效安全的方法。

Description

利用碱基编辑修复FBN1T7498C突变的试剂和方法
技术领域
本发明涉及基因修复领域，更具体来说，利用碱基编辑修复马凡氏综合征相关的FBN1T7498C突变的方法。
背景技术
目前为止医学上已经鉴定出了接近一万种遗传病，对家庭和社会造成了巨大的负担，然而只有大约6％的遗传病目前可以治疗(Austin and Dawkins，2017)。诊断和治疗遗传病已经是医学上的重要研究内容。高通量测序技术的发展已经使得遗传病的诊断变得较为容易。虽然附植前遗传学诊断(PGD)可以阻断部分遗传病的发生，然而对一些诸如纯合突变等遗传病，尚需要开发更有效的遗传学治疗手段(Dunbar et al.，2018)。
基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9，已经广泛应用于基因操作，并且可以应用于精准修复致病突变(Komor et al.，2017)。同时目前该技术在人胚胎上的基因编辑也展示出了巨大的优势，提示其在人遗传病治疗中的临床价值(Kang et al.，2016)。然而限于伦理和治疗的效率及脱靶的存在，基因编辑在人胚胎中的应用还有巨大的提升空间(Ruzoand Brivanlou，2017)。CRISPR/Cas9介导的基因编辑是在sgRNA(single guided RNA)通过靶序列互补引导Cas9蛋白定位剪切双链DNA，造成双链DNA断裂(double-strand breaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)修复，造成移码突变(ffameshift mutation)，导致基因敲除(knockout)；在有模板的条件下，通过同源重组进行修复(homology-directed repair，HDR)，实现基因敲入(knockin)，由于HDR效率低(整合很少发生)，而且非同源性末端接合机制容易产生随机插入和删除(indel)，使得在断裂点附近可能随机引入新的碱基，从而导致不精确的基因编辑(Hsu etal.，2014)。此外，CRISPR/Cas9介导的基因编辑总有一些脱靶效应[Gorski et al.，2017]。
最近开发出来的碱基编辑系统，base editor，是在切口酶nCas9的基础上加上了大鼠的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1，碱基编辑系统可以在不切割DNA双链的情况下，实现靶位点上C转化为尿嘧啶(Komor et al.，2016)。之后，通过DNA复制或修复，尿嘧啶被转化成胸腺嘧啶(T)，进而实现C到T的转换，类似地，其也能将单碱基G转化成A。由于不切割DNA造成DSB，形成的indel低于1％，实现的基因编辑更精确。碱基编辑系统已经被成功应用于体内碱基编辑，实现了小鼠的CT突变。我们利用BE3在人的废弃胚胎中也实现了靶位点的高效编辑。
马凡氏综合征是一种常染色体显性遗传病，占世界人口的0.2‰，其主要造成人结缔组织的发育异常，目前已有多名知名运动员的猝死和马凡氏综合征有关(Arbustini etal.，2005)。虽然部分患者可以通过手术治疗，但对于后代仍然具有患病的风险，从遗传上治疗引起该病的突变将是根本的方法。前期已有表明FBN1基因的突变是造成马凡氏综合征的主因。因此能否找到高效同时安全性的治疗方法是我们追求的方向。本发明就是寻找一种更加高效和安全的修复马凡氏综合征相关的突变，达到在人胚胎阶段修复该突变的方法，降低此病的发病比例和巨大的社会负担。
参考文献
Arbustini，E.，Grasso，M.，Ansaldi，S.，Malattia，C.，Pilotto，A.，Porcu，E.，Disabella，E.，Marziliano，N.，Pisani，A.，Lanzarini，L.，et al.(2005).Identificationof sixty-two novel and twelve known FBN1 mutations in eighty-one unrelatedprobands with Marfan syndrome and other fibrillinopathies.Human mutation 26，494.
Austin，C.P.，and Dawkins，H.J.S.(2017).Medical research：Next decade′sgoals for rare diseases.Nature 548，158.
Dunbar，C.E.，High，K.A.，Joung，J.K.，Kohn，D.B.，Ozawa，K.，and Sadelain，M.(2018).Gene therapy comes of age.Science 359.
Hsu，P.D.，Lander，E.S.，and Zhang，F.(2014).Development and applicationsof CRISPR-Cas9 for genome engineering.Cell 157.1262-1278.
Kang，X.，He，W.，Huang，Y.，Yu，Q.，Chen，Y.，Gao，X.，Sun，X.，and Fan，Y.(2016).Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.Journal of assisted reproduction and genetics 33，581-588.
Komor，A.C.，Badran，A.H.，and Liu，D.R.(2017).CRISPR-Based Technologiesfor the Manipulation of Eukaryotic Genomes.Cell 168，20-36.
Komor，A.C.，Kim，Y.B.，Packer，M.S.，Zuris，J.A.，and Liu，D.R.(2016).Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage.Nature 533，420-424.
Ruzo，A.，and Brivanlou，A.H.(2017).At Last：Gene Editing in HumanEmbryos to Understand Human Development.Cell Stem Cell 21，564-565.
发明内容
本发明的目的是提供一种高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒和方法。
为了达到上述目的，本发明提供了一种高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统(base editor)以及针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA。
优选地，所述的碱基编辑系统为BE3，YE1-BE3，YE2-BE3或者YEE-BE3中的一种。
优选地，所述的针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3。
本发明还提供了一种制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据FBN1T7498C位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN、针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA以及碱基编辑系统中的至少一种。
本发明还提供了一种碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，包括：在含有FBN1T7498C的突变细胞中，利用针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA引导碱基编辑系统到突变位点进行碱基编辑修复，收集转染后的细胞。
优选地，所述的含有FBN1T7498C的突变细胞为HEK293T细胞或胚胎细胞。
优选地，所述的含有FBN1T7498C的突变细胞的构建方法为：根据FBN1T7498C位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN；构建mt-sgRNA的表达载体，体外将Cas9蛋白和转录出来的mt-sgRNA组成RNP结合ssODN的方式并电转HEK293T细胞，流式分选单细胞鉴定出含有FBN1T7498C的突变细胞株。
优选地，所述的针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA通过根据FBN1T7498C位点设计修复re-sgRNA，并构建U6启动和/或T7启动的表达载体得到。
优选地，所述的碱基编辑修复马凡氏疾病突变方法还包括：Sanger测序检测修复效率；在含有FBN1T7498C的突变的人胚胎细胞中注射碱基编辑系统的mRNA和re-sgRNA，检测胚胎中的修复效率，并高通量测序on-target和off-target的效率。
优选地，所述的mt-sgRNA的序列为SEQ ID NO.1，ssODN的序列为SEQ ID NO.2，re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3。
优选地，获得胚胎的方法是通过ICSI将含有FBN1T7498C位点突变的精子注射到正常的卵母细胞中，或通过ICSI将正常精子注射到含有FBN1T7498C突变位点的卵子中，或者将含有FBN1T7498C位点突变的精子注射到含有FBN1T7498C突变位点的卵子中获得含有此位点的杂合或纯合的突变胚胎。
本发明还提供了一种碱基编辑修复马凡氏疾病突变方法，包括：根据FBN1T7498C位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN；构建mt-sgRNA的T7启动的表达载体，体外将Cas9蛋白和转录出来的mt-sgRNA组成RNP结合ssODN的方式电转293T细胞，流式分选单细胞鉴定出含有FBN1T7498C的纯合突变细胞株；根据FBN1T7498C位点设计修复re-sgRNA，并分别构建U6启动和T7启动的表达载体；在制作的纯合突变细胞株中，利用U6启动的re-sgRNA引导baseeditor到突变位点，3天之后收集转染后的细胞，Sanger测序检测修复效率；在含有此位点突变的人胚胎细胞中注射BE3的mRNA和re-sgRNA，检测胚胎中的修复效率，并高通量测序on-target和off-target的效率。
本发明利用碱基编辑技术在细胞和胚胎两个不同层面进行方法的高效性和安全性证明。
FBN1的突变是造成马凡氏综合征的主要成因，它的发病率在0.2‰左右，从遗传上彻底修复此突变，将是治疗该疾病最有效的措施。碱基编辑系统提供了一种精确改变DNA，即将C变为T的方法。
本发明利用新型碱基编辑工具base editor修复突变的人胚胎。首先将在细胞和胚胎两个水平验证方法的安全性和有效性。在细胞方面，发明人将利用基于CRISPR/Cas9和ssODN的同源重组方法制作含有FBN1T7498C突变的细胞株，其后利用base editor结合合适的sgRNA修复此位点的突变。验证了系统的安全性和有效性之后，将转录出来的mRNA和sgRNA注射到含有FBN1T7498C突变的人胚胎中，三天之后收集胚胎，利用深度测序的方式检测修复效率和脱靶情况。
本发明利用碱基编辑技术，通过精准的CT单碱基突变，从而可以修复FBN1T7498C的突变，从而为治疗该类突变引起的马凡氏综合征提供了高效安全的方法。
附图说明
图1为对患有马凡氏综合征病人的样本进行突变位点的确认。(A)来自血液的样本，(B)来自精液的样本。
图2为利用Cas9/sgRNA结合ssODN的方式在293T细胞中制作突变细胞株。(A)在细胞中制作突变和修复突变的模式图。(B)对FBN1基因设计突变型的sgRNA和ssODN来制作相应突变。(C)转染细胞后对转染效率进行T7EN1酶切鉴定。(D)通过流式分选出22个单细胞克隆，sanger测序确认细胞的突变类型。(E)纯合突变的sanger测序峰图。
图3为对突变的sgRNA进行脱靶检测分选。(A)通过软件分析出突变sgRNA的潜在脱靶位点，对纯合突变细胞株，检测相应的脱靶位点，T7EN1检测脱靶。(B)Sanger测序检测突变。
图4为对突变的细胞株利用碱基编辑进行修复。(A)在突变位点设计相应的修复sgRNA，利用碱基编辑将其修复。(B)细胞转染后的测序检测突变情况。(C)对图B进行TA克隆鉴定修复类型。(D)完全修复后的sanger测序峰图。
图5利用YE1-BE3，YEE-BE3和BE3对突变细胞株修复。
图6为对修复sgRNA进行脱靶检测。(A)利用T7EN1酶切检测脱靶。(B)利用sanger测序确认脱靶情况。
图7为对人突变胚胎进行修复。(A)利用碱基编辑对人胚胎修复示意图。(B)含有突变的胚胎注射相关RNA后的胚胎状态。(C)注射修复sgRNA的代表性胚胎的基因型。(D)注射随机sgRNA的代表性胚胎的基因型。(E)高通量测序对修复胚胎和对照胚胎进行基因型分析。
图8为所使用的修复胚胎和对照胚胎检测的基因型。(A)修复胚胎的基因型。(B)对照胚胎的基因型。
图9为在修复胚胎中利用高通量测序检测修复sgRNA的脱靶。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。
以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
首先，构建不同版本的BE3，即YE1-BE3、YE2-BE3、YEE-BE3和BE3。原始版本BE3购自Addgene(73021)。
1、不同类型APOBEC1的合成。
上述四种BE3只是在rAPOBEC1的编码框上有所差异，YE1-rAPOBEC1(SEQ IDNO.4)、YE2-rAPOBEC1(SEQ ID NO.5)、YEE-rAPOBEC1(SEQ ID NO.6)，其序列分别由生工生物(http：//www.sangon.com/)合成。所合成片段的两端分别加有NotI和SmaI的酶切位点。合成的片段克隆到常用的pmd19t载体(TAKARA：6013)上。
2、载体的酶切与纯化
BE3和上述三种合成的载体经过NotI(NEB：R0189L)、SmaI(NEB：R0141L)酶切，体系如下：Buffer(NEB：R0189L)6uL；质粒2ug；NotI 1μL；SmaI 1μL；ddH2O补齐到60μL。混样后于37℃过夜酶切。
酶切产物经过1％的琼脂糖凝胶，进行回收(Axygen：AP-GX-250G)。其中BE3回收大片段的骨架载体，合成载体回收APOBEC1的小片段载体。回收按照试剂盒的使用说明进行(Axygen：AP-PCR-250G)。回收后的片段经过Nanodrop 2000检测浓度。
3、载体的连接、转化与质粒提取。
回收的骨架载体和APOBEC1片段经过连接，连接体系如下：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL，骨架载体20ng，APOBEC1片段50ng，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL，ddH2O补齐到10μL，16℃连接过夜。转化步骤如下：取20μL感受态细胞(TransGen：CD201)在冰上解冻；2μL的连接产物与感受态细胞混合，冰上放置20分钟；42℃热激60秒；冰上放置2分钟，加入400μL复苏LB培养基(MDBio：L001-1kg)，摇床30分钟；取70μL涂氨苄平板(50μg/ml，37℃培养箱，培养14个小时。
挑选单克隆菌，在4ml液体LB培养基中扩大培养，14小时后提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)。步骤如下：菌液经过4000转/分钟离心10分钟，倒掉上清培养基；加入350μL的buffer S1，将菌体吹散，转移到2ml离心管中；加入250μL的buffer S2，上下颠倒8次；加入250μL的buffer S3，颠倒混匀6次，产生沉淀；12000转/分钟离心10分钟，取上清过柱；离心1分钟，倒掉废液，加入500μL的W1，离心一分钟，倒掉废液；加入750μL的W2，离心，倒掉上清；加入500μL的W2，离心，倒掉上清；空转1分钟；加入50μL的洗脱液，静置2分钟，离心。获得质粒经过浓度检测，取10μL送测序，阳性质粒保存在-20℃。
最终构建成如下四种BE3：
(1)YE1-BE3，SEQ ID NO.7；
(2)YE2-BE3，SEQ ID NO.8；
(3)YEE-BE3，SEQ ID NO.9；
(4)BE3，SEQ ID NO.10。
在下面进行突变位点修复时，可以采用上述任一种BE3，优选为(1)或(4)。
实施例1
本实施例中，在细胞株上利用Cas9/sgRNA结合ssODN制作突变FBN1T7498C突变细胞株，并利用碱基编辑系统对突变株进行修复(图2)。
1.1质粒构建
在突变位点附近，设计突变mt-sgRNA(SEQ ID NO.1)，合成oligos，上游序列为：5’-taggCGCCAATGGTGTTAACACAT-3’(SEQ ID NO.(14))，下游序列为：5’-aaacATGTGTTAACACCATTGGCG-3’(SEQ ID NO.(15))，上下游序列通过程序(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)退火，连接到经过BsaI(NEB：R0539L)线性化的PUC57-T7sgRNA载体(addgene：51132)上。线性化体系如下所示：PUC57-T7sgRNA 2μg；buffer(NEB：R0539L)6μL；BsaI 2μL；ddH2O补齐到60μL。37℃酶切过夜。所使用的同源模板ssODN(SEQ ID NO.2)，利用PAGE纯化的方式由生工生物公司(http：//www.sangon.com/)合成。同时在突变位点附近，依据碱基编辑作用的特点，设计修复re-sgRNA(SEQ ID NO.3)，合成oligos，上游序列为5’-accgCTACGTGTTAACACCATTGG-3’(SEQ ID NO.16)，下游序列为5’-aaacCCAATGGTGTTAACACGTAG-3’(SEQ ID NO.17)。上下游序列通过程序(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)退火，连接到经过BsaI(NEB：R0539L)线性化的PGL3-U6sgRNA载体上。同时合成上游引物：5’-taggCTACGTGTTAACACCATTGG-3”(SEQ ID NO.18)和下游引物：5’-aaacCCAATGGTGTTAACACGTAG-3’(SEQ ID NO.19)，经过退火连接到线性化的PUC57-T7sgRNA载体上。退火程序、线性化体系与程序如上。连接体系如下：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL，线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL，ddH2O补齐到10μL.16℃连接过夜。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定，鉴定引物为U6载体为上游序列：5’-TTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO.20)，下游序列为相应oligo的下游序列。T7载体为上游序列：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO.21)，下游序列为相应oligo的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得的突变质粒命名为mt-T7-sgRNA(SEQ ID NO.11)、re-U6-sgRNA(SEQ ID NO.12)和re-T7-sgRNA(SEQ ID NO.13)。
1.2 sgRNA的体外转录
以构建的PUC57-T7sgRNA为模板，扩增含有sgRNA的片段，所用引物为：F：5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’，(SEQ ID NO.22)R：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.23)。扩增体系如下：2Xbuffer(诺唯赞：P505)25μL；dNTP 1μL；F(10pmol/μL)2μL；R(10pmol/μL)2μL；模板1ng；DNA聚合酶(诺唯赞：P505)0.5μL；ddH2O补齐到50μL。扩增出来的PCR产物经过下述步骤纯化：每100μL体积加4μL RNAsecure(Life：AM7005)；60℃15分钟；加入三倍体积的PCR-A(Axygen：AP-PCR-250G)过柱，离心，12000转/分钟离心1分钟；加入500μL W2，离心1分钟；空转1分钟；加入20μL无RNAase水洗脱。
利用体外转录试剂盒(Ambion，Life Technologies，AM1354)转录，步骤如下：反应体系为：reaction buffer 1μL；enzyme mix 1μL；A 1μL；T 1μL；G 1μL；C 1μL；模板800ng；H2O补齐到10μL。上述体系混匀后37℃反应5个小时。加入1μL DNase，37℃反应15分钟。利用回收试剂盒(Ambion，Life Technologies，AM1908)回收转录的sgRNA，步骤如下：上步反应体积加入90μL Elution solution移植1.5mlEP管；加入350μL Binding solution混匀；加入250μL无水乙醇混匀；上柱；10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；加入500μL Washingsolution，10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；空转1分钟；换收集管，加入100μL Elutionsolution洗脱；加入10μL醋酸铵(Ambion，Life Technologies，AM1908)混匀；加入275μL无水乙醇混匀；-20℃放置30分钟，同时准备70％乙醇放置-20℃；4℃环境下13000转/分钟离心15分钟。弃上清，加入500μL 70％乙醇；离心5分钟，吸走废液，晾干5分钟；加入20μL的水溶解；取1μL测浓度。
1.3细胞的培养与电转
(1)以HEK293T细胞(购自ATCC)为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：HEK293T细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone，SH30022.01B)，其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。
(2)转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用LONZA转染试剂(SF KIT)按照说明书转染，细胞通过计数得1X106个。将Cas9(Sigma：ESPCAS9PRO-50UG)，sgRNA和ssODN按照3μg，1.5μg和3μg的质量混合。电转程序采用DS150，电转后的细胞在6cm的平皿中培养两天。
(3)细胞通过流式分选仪，分选单细胞培养，等两周以后，通过裂解鉴定基因型，裂解液的成分为50mM KCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris pH8.0，0.5％Nonidet P-40，0.5％Tween20，100μg/ml protease K。挑选纯合突变的细胞株扩大培养。
(4)对突变的细胞株，通过http：//crispr.mit.edu/，https：//crispr.cos.uni-heidelberg.de/鉴定出7个相关的脱靶位点，如表1所示。
(5)通过设计相应的引物对脱靶位点进行鉴定，引物序列如表3所示。扩增的PCR产物经过T7EN1和测序鉴定，并没有发现脱靶(图3)。
1.4突变细胞株的修复(图4，图5)
(1)本发明对突变细胞株进行培养与转染：HEK293T细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone，SH30022.01B)，其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。
(2)在转染前分至6孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。
(3)转染以脂质体转染为例。按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen，11668-019)的操作手册，将2μgBE3或YE1-BE3或YEE-BE3质粒与1μg re-sgRNApGL3-U6-sgRNA质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，72小时后收取细胞。
(4)对收集到的细胞首先进行PCR产物测序，发现存在修复的峰值(图3)。进一步得，对PCR产物进行TA克隆，在挑选出来的克隆里面，修复的克隆效率有50％。
(5)我们对修复的re-sgRNA进行脱靶分析，同样，我们找到了8个潜在的脱靶位点，如表2和图3所示，同样，我们对潜在脱靶位点进行了分析和检测(表3，图6)，同样，没有发现脱靶现象。
表1 mt-sgRNA潜在的脱靶位点
表2 re-sgRNA潜在的脱靶位点
表3本项目所使用的引物序列
实施例2
本实施例中，在人胚胎中利用碱基编辑系统对突变进行修复(图7)。
2.1质粒构建
在突变位点附近，依据碱基编辑作用的特点，设计修复re-sgRNA(SEQ ID NO.3)，合成oligos，上游序列为5’-taggCTACGTGTTAACACCATTGG-3’(SEQ ID NO.18)，下游序列为5’-aaacCCAATGGTGTTAACACGTAG-3’(SEQ ID NO.19)。上下游序列通过程序(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)退火，连接到经过BsaI(NEB：R0539L)线性化的PUC57-T7sgRNA载体上。线性化体系与程序如上。连接体系如下：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL，线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL，ddH2O补齐到10μL.16℃连接过夜。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定，鉴定引物为上游序列：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO.21)，下游序列为相应oligo的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)测定浓度备用。
2.2 sgRNA的体外转录
以构建的PUC57-T7sgRNA为模板，扩增含有sgRNA的片段，所用引物为：F：5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’(SEQ ID NO.22)，，R：5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.23)，。扩增体系如下：2Xbuffer(诺唯赞：P505)25μL；dNTP 1μL；F(10pmol/μL)2μL；R(10pmol/μL)2μL；模板1μg；DNA聚合酶(诺唯赞：P505)0.5μL；ddH2O补齐到50μL。扩增出来的PCR产物经过下述步骤纯化：每100μL体积加4μL RNAsecure(Life：AM7005)；60℃15分钟；加入三倍体积的PCR-A(Axygen：AP-PCR-250G)过柱，离心，12000转/分钟离心1分钟；加入500μL W2，离心1分钟；空转1分钟；加入20μL无RNAase水洗脱。
利用体外转录试剂盒(Ambion，Life Technologies，AM1354)转录，步骤如下：反应体系为：reaction buffer 1μL；enzyme mix 1μL；A 1μL；T 1μL；G 1μL；C 1μL；模板800ng；H2O补齐到10μL。上述体系混匀后37℃反应5个小时。加入1μLDNase，37℃反应15分钟。利用回收试剂盒(Ambion，Life Technologies，AM1908)回收转录的sgRNA，步骤如下：上步反应体积加入90μL Elution solution移植1.5mlEP管；加入350μLBinding solution混匀；加入250μL无水乙醇混匀；上柱；10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；加入500μL Washingsolution，10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；空转1分钟；换收集管，加入100μLElutionsolution洗脱；加入10μL醋酸铵(Ambion，Life Technologies，AM1908)混匀；加入275μL无水乙醇混匀；-20℃放置30分钟，同时准备70％乙醇放置-20℃；4℃环境下13000转/分钟离心15分钟。弃上清，加入500μL的70％乙醇；离心5分钟，吸走废液，晾干5分钟；加入20μL的水溶解；取1μL测浓度。
2.3 BE3的体外转录
BE3酶切回收。本步骤是将质粒BE3进行线性化。体系如下：BE3/YE1-BE3/YE2-BE3/YEE-BE3 10μg；buffer I(NEB：R0539L)10μL；BbsI4μL(NEB：R0539L)；H2O补齐到100μL。混匀之后，37℃酶切过夜。
线性化质粒的回收。酶切产物中加入4μL RNAsecure(Life：AM7005)，60℃反应10分钟；利用回收试剂盒(QIAGEN：28004)进行操作其余步骤，加入5倍体积buffer PB，过柱；加入750μL buffer PE离心；空转1分钟；用10μL水洗脱，测定浓度。
体外转录。按照试剂盒(Invitrogen：AM1345)的要求依次加入体系：1入g线性化载体；10μL2XNTP/ARCA；补齐到20μL水；2μL T7 ezyme mix；2μL10xreaction buffer。混合之后37℃反应2小时。加入1μL DNasea反应15分钟。
加尾。转录产物进行加尾处理保证转录mRNA的稳定性。具体体系如下：20μL反应产物；36μL H2O；20μL 5xE-PAP buffer；10μL 25mM MnCl2；10μL ATP solution；4μL PEP。反应体系混匀后37℃反应30分钟。
回收。利用回收试剂盒进行(QIAGEN：74104)。步骤如下：上步反应产物加入350μLbuffer RLT；加入250μL无水乙醇，过柱，离心；加入500μL RPE，离心，加入500μL RPE，离心；空转；加入30μL水洗脱。测定浓度后-80℃保存。
2.4突变胚胎的获得
所有的胚胎操作均在广州医科大学附属第三医院的生殖医学中心进行，本实验已经通过了医院的伦理委员会的审核，捐献卵子和精子的患者已经签署了知情同意书。本实验获得了带有FBN1T7498C的杂合突变患者，并通过血液和精液对其基因型进行了鉴定(图1)。所使用的卵子均是生殖障碍患者不成熟卵，经过体外培养成熟。通过ICSI将突变精子与卵子结合，获得了突变的受精卵。
2.5胚胎的修复操作
当观察受精卵是2PN阶段时，通过显微操作，将体积大概为0.2μL的碱基编辑mRNA，本实施中使用的是BE3，和修复所用的sgRNA胞浆注射到受精卵中，BE3和sgRNA的浓度分别是100ng/μL和50ng/μL。处理过的胚胎细胞在三气培养箱中继续培养三天(图7)。
2.6胚胎的扩增与鉴定
对收集到的胚胎进行单细胞扩增，所用试剂为Vazyme，N601-01。扩增后的基因组经过100倍稀释，用来扩增目的片段，以检测突变的效率(图8)。扩增目的片段引物见表3。
2.7深度测序确定编辑效率
为了更进一步确认编辑的效率，采用PE150高通量测序的方式，对目的片段进行检测，选择了三个对照胚胎和所有的7个修复胚胎，发现对照组有3个胚胎是杂合子基因型，而7个修复胚胎都是正常基因型，证明了碱基编辑系统可以高效的实现靶位点的修复。
2.8对胚胎脱靶位点的检测
为确保碱基编辑系统的安全性。我们将三个对照胚胎和所有的修复胚胎进行了脱靶检测，结果显示(图9)，在修复胚胎中并没有发现明显的脱靶现象。
序列表
<110> 上海科技大学
<120> 利用碱基编辑修复FBN1T7498C突变的试剂和方法
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cgccaatggt gttaacacat agg 23
<210> 2
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gacgtatggt gttgggtaaa tccgggagga catttgcatg tgaagccgcc aatggtgtta 60
acacgtagga actggcagtt gtgttgcttg gttgcacact catcaagatc 110
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccgccaatgg tgttaacacg tag 23
<210> 4
<211> 687
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgagctcag agactggccc agtggctgtg gaccccacat tgagacggcg gatcgagccc 60
catgagtttg aggtattctt cgatccgaga gagctccgca aggagacctg cctgctttac 120
gaaattaatt gggggggccg gcactccatt tggcgacata catcacagaa cactaacaag 180
cacgtcgaag tcaacttcat cgagaagttc acgacagaaa gatatttctg tccgaacaca 240
aggtgcagca ttacctggtt tctcagctac agcccatgcg gcgaatgtag tagggccatc 300
actgaattcc tgtcaaggta tccccacgtc actctgttta tttacatcgc aaggctgtac 360
caccacgctg accccgagaa tcgacaaggc ctgcgggatt tgatctcttc aggtgtgact 420
atccaaatta tgactgagca ggagtcagga tactgctgga gaaactttgt gaattatagc 480
ccgagtaatg aagcccactg gcctaggtat ccccatctgt gggtacgact gtacgttctt 540
gaactgtact gcatcatact gggcctgcct ccttgtctca acattctgag aaggaagcag 600
ccacagctga cattctttac catcgctctt cagtcttgtc attaccagcg actgccccca 660
cacattctct gggccaccgg gttgaaa 687
<210> 5
<211> 687
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgagctcag agactggccc agtggctgtg gaccccacat tgagacggcg gatcgagccc 60
catgagtttg aggtattctt cgatccgaga gagctccgca aggagacctg cctgctttac 120
gaaattaatt gggggggccg gcactccatt tggcgacata catcacagaa cactaacaag 180
cacgtcgaag tcaacttcat cgagaagttc acgacagaaa gatatttctg tccgaacaca 240
aggtgcagca ttacctggtt tctcagctat agcccatgcg gcgaatgtag tagggccatc 300
actgaattcc tgtcaaggta tccccacgtc actctgttta tttacatcgc aaggctgtac 360
caccacgctg acccccgcaa tcgacaaggc ctggaagatt tgatctcttc aggtgtgact 420
atccaaatta tgactgagca ggagtcagga tactgctgga gaaactttgt gaattatagc 480
ccgagtaatg aagcccactg gcctaggtat ccccatctgt gggtacgact gtacgttctt 540
gaactgtact gcatcatact gggcctgcct ccttgtctca acattctgag aaggaagcag 600
ccacagctga cattctttac catcgctctt cagtcttgtc attaccagcg actgccccca 660
cacattctct gggccaccgg gttgaaa 687
<210> 6
<211> 687
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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gaaattaatt gggggggccg gcactccatt tggcgacata catcacagaa cactaacaag 180
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aggtgcagca ttacctggtt tctcagctac agcccatgcg gcgaatgtag tagggccatc 300
actgaattcc tgtcaaggta tccccacgtc actctgttta tttacatcgc aaggctgtac 360
caccacgctg accccgagaa tcgacaaggc ctggaggatt tgatctcttc aggtgtgact 420
atccaaatta tgactgagca ggagtcagga tactgctgga gaaactttgt gaattatagc 480
ccgagtaatg aagcccactg gcctaggtat ccccatctgt gggtacgact gtacgttctt 540
gaactgtact gcatcatact gggcctgcct ccttgtctca acattctgag aaggaagcag 600
ccacagctga cattctttac catcgctctt cagtcttgtc attaccagcg actgccccca 660
cacattctct gggccaccgg gttgaaa 687
<210> 7
<211> 8532
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 60
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 120
ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact 180
cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa 240
atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta 300
ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctggttt agtgaaccgt cagatccgct 360
agagatccgc ggccgctaat acgactcact atagggagag ccgccaccat gagctcagag 420
actggcccag tggctgtgga ccccacattg agacggcgga tcgagcccca tgagtttgag 480
gtattcttcg atccgagaga gctccgcaag gagacctgcc tgctttacga aattaattgg 540
gggggccggc actccatttg gcgacataca tcacagaaca ctaacaagca cgtcgaagtc 600
aacttcatcg agaagttcac gacagaaaga tatttctgtc cgaacacaag gtgcagcatt 660
acctggtttc tcagctacag cccatgcggc gaatgtagta gggccatcac tgaattcctg 720
tcaaggtatc cccacgtcac tctgtttatt tacatcgcaa ggctgtacca ccacgctgac 780
cccgagaatc gacaaggcct gcgggatttg atctcttcag gtgtgactat ccaaattatg 840
actgagcagg agtcaggata ctgctggaga aactttgtga attatagccc gagtaatgaa 900
gcccactggc ctaggtatcc ccatctgtgg gtacgactgt acgttcttga actgtactgc 960
atcatactgg gcctgcctcc ttgtctcaac attctgagaa ggaagcagcc acagctgaca 1020
ttctttacca tcgctcttca gtcttgtcat taccagcgac tgcccccaca cattctctgg 1080
gccaccgggt tgaaaagcgg cagcgagact cccgggacct cagagtccgc cacacccgaa 1140
agtgataaaa agtattctat tggtttagcc atcggcacta attccgttgg atgggctgtc 1200
ataaccgatg aatacaaagt accttcaaag aaatttaagg tgttggggaa cacagaccgt 1260
cattcgatta aaaagaatct tatcggtgcc ctcctattcg atagtggcga aacggcagag 1320
gcgactcgcc tgaaacgaac cgctcggaga aggtatacac gtcgcaagaa ccgaatatgt 1380
tacttacaag aaatttttag caatgagatg gccaaagttg acgattcttt ctttcaccgt 1440
ttggaagagt ccttccttgt cgaagaggac aagaaacatg aacggcaccc catctttgga 1500
aacatagtag atgaggtggc atatcatgaa aagtacccaa cgatttatca cctcagaaaa 1560
aagctagttg actcaactga taaagcggac ctgaggttaa tctacttggc tcttgcccat 1620
atgataaagt tccgtgggca ctttctcatt gagggtgatc taaatccgga caactcggat 1680
gtcgacaaac tgttcatcca gttagtacaa acctataatc agttgtttga agagaaccct 1740
ataaatgcaa gtggcgtgga tgcgaaggct attcttagcg cccgcctctc taaatcccga 1800
cggctagaaa acctgatcgc acaattaccc ggagagaaga aaaatgggtt gttcggtaac 1860
cttatagcgc tctcactagg cctgacacca aattttaagt cgaacttcga cttagctgaa 1920
gatgccaaat tgcagcttag taaggacacg tacgatgacg atctcgacaa tctactggca 1980
caaattggag atcagtatgc ggacttattt ttggctgcca aaaaccttag cgatgcaatc 2040
ctcctatctg acatactgag agttaatact gagattacca aggcgccgtt atccgcttca 2100
atgatcaaaa ggtacgatga acatcaccaa gacttgacac ttctcaaggc cctagtccgt 2160
cagcaactgc ctgagaaata taaggaaata ttctttgatc agtcgaaaaa cgggtacgca 2220
ggttatattg acggcggagc gagtcaagag gaattctaca agtttatcaa acccatatta 2280
gagaagatgg atgggacgga agagttgctt gtaaaactca atcgcgaaga tctactgcga 2340
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gctatactta gaaggcagga ggatttttat ccgttcctca aagacaatcg tgaaaagatt 2460
gagaaaatcc taacctttcg cataccttac tatgtgggac ccctggcccg agggaactct 2520
cggttcgcat ggatgacaag aaagtccgaa gaaacgatta ctccatggaa ttttgaggaa 2580
gttgtcgata aaggtgcgtc agctcaatcg ttcatcgaga ggatgaccaa ctttgacaag 2640
aatttaccga acgaaaaagt attgcctaag cacagtttac tttacgagta tttcacagtg 2700
tacaatgaac tcacgaaagt taagtatgtc actgagggca tgcgtaaacc cgcctttcta 2760
agcggagaac agaagaaagc aatagtagat ctgttattca agaccaaccg caaagtgaca 2820
gttaagcaat tgaaagagga ctactttaag aaaattgaat gcttcgattc tgtcgagatc 2880
tccggggtag aagatcgatt taatgcgtca cttggtacgt atcatgacct cctaaagata 2940
attaaagata aggacttcct ggataacgaa gagaatgaag atatcttaga agatatagtg 3000
ttgactctta ccctctttga agatcgggaa atgattgagg aaagactaaa aacatacgct 3060
cacctgttcg acgataaggt tatgaaacag ttaaagaggc gtcgctatac gggctgggga 3120
cgattgtcgc ggaaacttat caacgggata agagacaagc aaagtggtaa aactattctc 3180
gattttctaa agagcgacgg cttcgccaat aggaacttta tgcagctgat ccatgatgac 3240
tctttaacct tcaaagagga tatacaaaag gcacaggttt ccggacaagg ggactcattg 3300
cacgaacata ttgcgaatct tgctggttcg ccagccatca aaaagggcat actccagaca 3360
gtcaaagtag tggatgagct agttaaggtc atgggacgtc acaaaccgga aaacattgta 3420
atcgagatgg cacgcgaaaa tcaaacgact cagaaggggc aaaaaaacag tcgagagcgg 3480
atgaagagaa tagaagaggg tattaaagaa ctgggcagcc agatcttaaa ggagcatcct 3540
gtggaaaata cccaattgca gaacgagaaa ctttacctct attacctaca aaatggaagg 3600
gacatgtatg ttgatcagga actggacata aaccgtttat ctgattacga cgtcgatcac 3660
attgtacccc aatccttttt gaaggacgat tcaatcgaca ataaagtgct tacacgctcg 3720
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atccaaatta tgactgagca ggagtcagga tactgctgga gaaactttgt gaattatagc 960
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<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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actcaccaat gcaggacgta 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
agctgcttca tagggtcagc 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
gctgaagtct ccacccacc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
tgtctctcct tgccttttg 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
tcaagggaca ggagtaggca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
ttggggcagg aggttttgtt 20
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
atcttaatca gggccttga 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gccttcattc catcaactg 19
<210> 32
<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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caggttcgtg tcgcagtagc 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
ctgtgttgcc agcacgaaa 19
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<400> 34
tggtagtggt tggtgacact 20
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<213> Artificial Sequence
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cgttacattg ggaagcggaa 20
<210> 36
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<213> Artificial Sequence
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ggattcaaca tagattggaa 20
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<213> Artificial Sequence
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cccgtttaca cattgcta 18
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ttctagtagg tgaaaaaggg 20
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<400> 39
ttggacacca catagacag 19
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tattattgct aaaccgaaac ca 22
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<211> 18
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agcccctcac ccactcat 18
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agaggcttgc gaaggacatc 20
<210> 43
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atttggtcta gggcagaggc 20
<210> 44
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attattcaca agttatggta 20
<210> 45
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<400> 45
taaccctctt ctttgtaa 18
<210> 46
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aagggactgt ttttgtcctg tca 23
<210> 47
<211> 23
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<213> Artificial Sequence
<400> 47
gtgaaaccac catgacatga agt 23
<210> 48
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gtcatacttg gccagggtcc 20
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cccacgtgag ctggctaaaa 20
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tgatcagcat gtggagcctg 20
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gaagtcagcc aggagccatt 20
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gagttaggag tgggaagg 18
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acaaaggaca gtaatgaaga g 21
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tttgcctcct tgattccccc 20
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gtggatggtg tggaggtgag 20
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cgataaaggg atcagtcact aa 22
<210> 57
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<212> DNA
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<400> 57
gctccaggtc cacaaacac 19

Claims (9)

1.一种高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统以及针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA。
2.如权利要求1所述的高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，所述的碱基编辑系统为BE3，YE1-BE3，YE2-BE3或者YEE-BE3中的一种。
3.如权利要求1所述的高效修复FBN1T7498C突变的试剂盒，其特征在于，所述的针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3。
4.一种制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据FBN1T7498C位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN、针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA以及碱基编辑系统中的至少一种。
5.一种碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，包括：在含有FBN1T7498C的突变细胞中，利用针对FBN1T7498C位点的修复re-sgRNA引导碱基编辑系统到突变位点进行碱基编辑修复，收集转染后的细胞。
6.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的含有FBN1T7498C的突变细胞为HEK293T细胞。
7.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的含有FBN1T7498C的突变细胞的构建方法为：根据FBN1T7498C位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN；构建mt-sgRNA的表达载体，体外将Cas9蛋白和转录出来的mt-sgRNA组成RNP结合ssODN的方式并电转HEK293T细胞，流式分选单细胞鉴定出含有FBN1T7498C的突变细胞株。
8.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的针对FBNlT7498C位点的修复re-sgRNA通过根据FBN1T7498C位点设计修复re-sgRNA，并构建U6启动和/或T7启动的表达载体得到。
9.如权利要求7所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的mt-sgRNA的序列为SEQ ID NO.1，ssODN的序列为SEQ ID NO.2，re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3。
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EP18889963.7A EP3816296A4 (en) 2018-06-01 2018-07-25 REAGENT AND METHOD FOR REPAIRING THE FBN1T7498C MUTATION USING BASE EDIT
US16/470,247 US20210198699A1 (en) 2018-06-01 2018-07-25 Kit for reparing fbn1t7498c mutation, combination for making and repairing mutation, and method of repairing thereof
JP2019528851A JP6913965B2 (ja) 2018-06-01 2018-07-25 Ｆｂｎ１ｔ７４９８ｃ突然変異を修復するキット、ｆｂｎ１ｔ７４９８ｃ突然変異の作製及び修復方法、塩基編集によるｆｂｎ１ｔ７４９８ｃ突然変異の修復方法

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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666676A (zh) * 2019-01-29 2019-04-23 四川省人民医院 筛查马凡综合征的试剂盒
CN109666678A (zh) * 2019-01-29 2019-04-23 四川省人民医院 检测马凡综合征的试剂盒
CN109666673A (zh) * 2019-02-01 2019-04-23 国家卫生计生委科学技术研究所 利用碱基编辑修复与胆固醇酯贮积症相关的e8sjm-1g>a突变的试剂和方法
CN109666729A (zh) * 2019-01-29 2019-04-23 四川省人民医院 一种马凡综合征筛查试剂盒
CN109762846A (zh) * 2019-02-01 2019-05-17 国家卫生计生委科学技术研究所 利用碱基编辑修复与克拉伯病相关的galcc1586t突变的试剂和方法
CN114107452A (zh) * 2021-12-07 2022-03-01 深圳市眼科医院 一种基于fbn1基因插入突变的马凡综合征检测试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120132A (zh) * 2013-04-28 2014-10-29 福建省立医院 Fbn1基因突变体及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3310932B1 (en) * 2015-06-17 2023-08-30 The UAB Research Foundation Crispr/cas9 complex for genomic editing
CN108070611B (zh) * 2016-11-14 2021-06-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物碱基编辑方法
CN106916852B (zh) * 2017-04-13 2020-12-04 上海科技大学 一种碱基编辑系统及其构建和应用方法
CN107384920B (zh) * 2017-05-10 2020-07-14 中山大学 一套基于化脓性链球菌的碱基编辑系统及其在基因编辑中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104120132A (zh) * 2013-04-28 2014-10-29 福建省立医院 Fbn1基因突变体及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASSIMO CAPUTI ET AL: "A nonsense mutation in the fibrillin-1 gene of a Marfan syndrome patient induces NMD and disrupts an exonic splicing enhancer", 《GENES & DEVELOPMENT》 *
YANTING ZENG ET AL: "Correction of the Marfan Syndrome Pathogenic FBN1 Mutation by Base Editing in Human Cells and Heterozygous Embryos", 《MOLECULAR THERAPY》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109666676A (zh) * 2019-01-29 2019-04-23 四川省人民医院 筛查马凡综合征的试剂盒
CN109666678A (zh) * 2019-01-29 2019-04-23 四川省人民医院 检测马凡综合征的试剂盒
CN109666729A (zh) * 2019-01-29 2019-04-23 四川省人民医院 一种马凡综合征筛查试剂盒
CN109666673A (zh) * 2019-02-01 2019-04-23 国家卫生计生委科学技术研究所 利用碱基编辑修复与胆固醇酯贮积症相关的e8sjm-1g>a突变的试剂和方法
CN109762846A (zh) * 2019-02-01 2019-05-17 国家卫生计生委科学技术研究所 利用碱基编辑修复与克拉伯病相关的galcc1586t突变的试剂和方法
CN109666673B (zh) * 2019-02-01 2022-04-08 国家卫生计生委科学技术研究所 利用碱基编辑修复与胆固醇酯贮积症相关的e8sjm-1g>a突变的试剂和方法
CN114107452A (zh) * 2021-12-07 2022-03-01 深圳市眼科医院 一种基于fbn1基因插入突变的马凡综合征检测试剂盒

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