CN109762846A - 利用碱基编辑修复与克拉伯病相关的galcc1586t突变的试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用碱基编辑修复与克拉伯病相关的GALC^C1586T突变的试剂和方法。高效修复GALC^C1586T突变的试剂盒包括碱基编辑系统以及针对GALC^C1586T位点的修复re‑sgRNA。本发明利用碱基编辑技术，通过精准的AG单碱基突变，从而可以修复GALC^C1586T的突变，从而为治疗该类突变引起的克拉伯病提供了高效安全的方法。

Description

利用碱基编辑修复与克拉伯病相关的GALCC1586T突变的试剂和 方法

技术领域

本发明涉及基因修复领域，更具体来说，利用碱基编辑修复与克拉伯病相关的GALC^C1586T(Krabbe Disease)相关突变的试剂和方法。

背景技术

克拉伯病(Krabbe Disease)也称为球形细胞脑白质营养不良症(Globoidleukodystrophy)， 是由编码水解酶半乳糖神经酰胺酶(Galactocerebrosidase,GALC)的基因缺陷引起的常染色 体隐性遗传、神经退行性的溶酶体贮积病(Suzuki and Suzuki,1970)。GALC基因由位于14q31 染色体上的基因GALC编码，其包含由17个外显子，编码669个氨基酸。KD致病突变在 整个蛋白都有发生。迄今为止，在人类基因突变数据库中有报道超过200个突变，包括错义、 无义、缺失和插入(Tappino et al.,2010)。GALC其负责重要髓磷脂(包含半乳糖苷神经酰胺) 的溶酶体降解，其活性的缺陷还导致半乳糖鞘氨醇(心肌素)积聚，进而对少突胶质细胞 (oligodendrocytes)和许旺细胞(schwann cell)产生细胞毒性，并引起弥漫性中枢神经系统 和周围神经系统脱髓鞘(Duffner et al.,2011)。迄今，对于KD儿童唯一可用的治疗是来自脐 带血或骨髓中的造血干细胞移植(HSCT)。然而，造血干细胞移植疗法不是完全无风险且 有并发症，并且不能长期解决所有的神经功能缺损问题(Musolino et al.,2014；Wright et al., 2017)。克拉伯病多是由GALC基因突变引起的单基因疾病，因此基因治疗是该病的最有效 治疗方案。

基于位点特异性核酸酶的编辑技术的聚集规则间隔短回文重复序列系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)(Gaj etal.,2013)，鉴于其简便、高 效、价廉等特点，成为基因编辑领域发展最快、应用最广的技术，引发了基因编辑领域的革 命。目前，CRISPR/Cas9系统已经被成功地用于DNA的敲除、敲入、替代、修饰、标记， RNA修饰和基因转录调节等研究(Hsu et al.,2014；Komor et al.,2017)。并已经成功应用于多 个物种的基因编辑(Barrangou and Doudna,2016；Komor etal.,2017)。CRISPR/Cas9介导的基 因编辑是在sgRNA(single guided RNA)通过靶序列互补引导Cas9蛋白定位剪切双链DNA， 造成双链DNA断裂(double-strand breaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源末端 连接修复，造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除(knockout)；在有模板的 条件下，通过同源重组进行修复，实现基因敲入(knockin)，由于HDR效率低(整合很少 发生)，而且非同源性末端接合机制容易产生随机插入和删除(indel)，使得在断裂点附近 可能随机引入新的碱基，从而导致不精确的基因编辑。此外，CRISPR/Cas9介导的基因编辑 总有一些脱靶效应[Gorski et al.,2017]。

基于CRISPR/Cas9技术所构建的碱基编辑技术(Base editing)。目前有胞嘧啶碱基编辑 器(CBEs，cytosine base editors)和鸟嘌呤碱基编辑器(ABEs，Adenine baseeditors)。其能 够在目标基因中精确而有效地引入点突变，而不需要双链DNA断裂或任何供体模板,展现 出很大的基因编辑潜力(Komor et al.,2016)。利用碱基编辑，在酵母、植物、哺乳动物和人 类细胞中进行了修正和遗传多样性研究(Nishida et al.,2016；Ren etal.,2018)。本发明将在人 的细胞中利用碱基编辑技术实现安全高效的修复已有报道过的GALC^C1586T突变(de Carvalho et al.,2015；Tappino et al.,2010)，为临床上治疗相应突变引起的克拉伯病提供可靠的试剂和 方法。

参考文献

Barrangou,R.,and Doudna,J.A.(2016).Applications of CRISPRtechnologies in research and beyond.Nature Biotechnology 34,933.

de Carvalho,T.G.,da Silveira Matte,U.,Giugliani,R.,and Baldo,G.(2015).Genome Editing: Potential Treatment for Lysosomal StorageDiseases.Current Stem Cell Reports 1,9-15. Duffner,P.K.,Barczykowski,A.,Jalal,K.,Yan,L.,Kay,D.M.,and Carter,R.L.(2011).Early Infantile KrabbeDisease:Results of the World-Wide Krabbe Registry.Pediatric Neurology 45,141-148.

Gaj,T.,Gersbach,C.A.,and Barbas,C.F.(2013).ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.Trends in Biotechnology 31,397-405.

Hsu,Patrick D.,Lander,Eric S.,and Zhang,F.(2014).Development andApplications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering.Cell 157,1262-1278.

Komor,A.C.,Badran,A.H.,and Liu,D.R.(2017).CRISPR-Based Technologiesfor the Manipulation of Eukaryotic Genomes.Cell 168,20-36.

Komor,A.C.,Kim,Y.B.,Packer,M.S.,Zuris,J.A.,and Liu,D.R.(2016).Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage.Nature 533,420.

Musolino,P.L.,Lund,T.C.,Pan,J.,Escolar,M.L.,Paker,A.M.,Duncan,C.N.,and Eichler,F.S. (2014).Hematopoietic stem cell transplantation in theleukodystrophies:a systematic review of the literature.Neuropediatrics 45,169-174.

Nishida,K.,Arazoe,T.,Yachie,N.,Banno,S.,Kakimoto,M.,Tabata,M.,Mochizuki,M.,Miyabe, A.,Araki,M.,Hara,K.Y.,et al.(2016).Targeted nucleotideediting using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immunesystems.Science 353.

Ren,B.,Yan,F.,Kuang,Y.,Li,N.,Zhang,D.,Zhou,X.,Lin,H.,and Zhou,H.(2018).Improved Base Editor for Efficiently Inducing Genetic Variations inRice with CRISPR/Cas9-Guided Hyperactive hAID Mutant.Molecular Plant 11,623-626.

Suzuki,K.,and Suzuki,Y.(1970).Globoid Cell Leucodystrophy(Krabbe'sDisease):Deficiency of Galactocerebrosideβ-Galactosidase.Proceedings of theNational Academy of Sciences 66, 302-309.

Tappino,B.,Biancheri,R.,Mort,M.,Regis,S.,Corsolini,F.,Rossi,A.,Stroppiano,M.,Lualdi,S., Fiumara,A.,Bembi,B.,et al.(2010).Identification andcharacterization of 15novel GALC gene mutations causing Krabbe disease.Humanmutation 31,E1894-1914.

Wright,M.D.,Poe,M.D.,DeRenzo,A.,Haldal,S.,and Escolar,M.L.(2017).Developmental outcomes of cord blood transplantation for Krabbe disease.A15-year study 89,1365-1372.

发明内容

本发明的目的是提供一种高效修复GALC^C1586T突变的试剂盒和方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种高效修复GALC^C1586T突变的试剂盒，其特征在 于，包括碱基编辑系统(base editor)以及针对GALC^C1586TC位点的修复re-sgRNA。

优选地，所述的碱基编辑系统为spCas9-ABE，KKH SaCas9-ABE,优先KKH SaCas9-ABE。

优选地，所述的碱基编辑系统可以是质粒，mRNA或蛋白形式，优先选择蛋白形式。

优选地，所述的针对GALC^C1586T位点的修复re-sgRNA的序列，若使用spCas9-ABE，其对应sgRNA为SEQ ID NO.1，若使用KKH SaCas9-ABE，其对应的sgRNA为SEQ ID NO.2。

优选地，所使用的sgRNA可以是质粒形式，也可以是RNA形式，优先选择RNA形式。

本发明提供了一种在人细胞中制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据GALC^C1586T位点设计突变mt-sgRNA(SEQ ID NO.3)和相应的突变ssODN(SEQ ID NO.4)、 针对GALC^C1586T位点的修复re-sgRNA以及碱基编辑系统中的至少一种。

本发明提供了一种碱基编辑修复克拉伯疾病GALC^C1586T突变的方法，其特征在于，包 括：在含有GALC^C1586T的突变细胞中，利用针对GALC^C1586T位点的修复re-sgRNA引导碱基编辑系统到突变位点进行碱基编辑修复，收集转染后的细胞，鉴定修复率。

优选地，所述的含有GALC^C1586T的突变细胞为HEK293T细胞或人的造血干细胞(HSC)。

优选地，所述的含有GALC^C1586T的突变细胞的构建方法为：根据GALC^C1586T位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN；构建mt-sgRNA的表达载体，体外将spCas9蛋白或 xCas9蛋白和转录出来的mt-sgRNA组成RNP结合ssODN的方式并电转HEK293T细胞或 HSC，流式分选单细胞鉴定出含有GALC^C1586T的突变细胞株，优先选择xCas9蛋白。

优选地，根据GALC^C1586T位点设计修复re-sgRNA，并构建U6启动和/或T7启动的表达载体得到。

优选地，所述的碱基编辑修复克拉伯疾病突变方法还包括：Sanger测序检测编辑效率； 高通量测序on-target，indel和off-target的效率。

优选地，所述的mt-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3，ssODN的序列为SEQ ID NO.4，re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

GALC的突变是造成克拉伯疾病的主要成因，从遗传上彻底修复此突变，将是治疗该疾 病最有效的措施。碱基编辑系统提供了一种精确改变DNA，即将A变为G的方法。

发明人将利用基于CRISPR/Cas9和ssODN的同源重组方法制作含有GALC^C1586T突变的 细胞株，其后利用base editor结合合适的sgRNA修复此位点的突变，利用深度测序的方式 检测修复效率和脱靶情况。而为治疗该类突变引起的克拉伯疾病提供了高效安全的方法。

附图说明

图1A-1E为在HEK293T细胞系中制作GALC^C1586T突变的方法：图1A是相应突变在染色体上的位置，致病突变将引起氨基酸的改变，使Thr变成Met；图1B为利用CRISPR/Cas9 结合ssODN的方式可以制作相应突变的细胞株，ssODN长为107nt，使用的突变mt-sgRNA 用下划线表示，黑色斜体是所用的PAM序列；图1C为根据突变的PAM序列TGA，我们 利用spCas9和xCas9检测了相应突变效率，发现xCas9对靶位点具有更高的切割效率；图 1D为利用xCas9的蛋白和mt-sgRNA结合ssODN的方式电转HEK293T细胞，通过流式分 选单细胞，对单克隆细胞进行基因型鉴定；图1E为获得的纯合子突变的细胞株测序峰图。

图2A-2E为利用碱基编辑系统对突变细胞株进行修复：图2A为利用不同形式的Cas9 对靶位点进行修复的模式图，因为所使用的PAM序列不同，所用到的修复sgRNA亦不同； 图2B为利用spCas9-ABE对突变位点进行修复，通过测序发现在修复sgRNA上有三个位点 均有不同效率的改变；图2C为将突变Cas9换成KKH SaCas9对突变位点进行编辑，发现其对突变位点的效率最高，其他位点突变效率较低；图2D为对通过HHK SaCas9编辑过的 细胞株进行深度测序检测具体的突变效率；图2E为对修复过的细胞株进行测序，证明了修 复的特异性。

图3A和图3B为突变细胞株进行脱靶分析：图3A为对修复细胞株通过高通量测序方法检测indel；图3B为对KKH SaCas9-ABE所使用的修复sgRNA潜在的14个脱靶位点进 行高通量测序检测off-target。

图4A和图4B为利用碱基编辑系统对患有GALC^C1586T病人的HSC细胞进行的修复： 图4A为获得的HSC细胞的比例；图4B为对获得的HSC进行编辑的效率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例 仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条 件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可 以通过市售购买获得的常规产品。

以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则 之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

首先纯化不同类型的蛋白,所用原始载体序列为spCas9(SEQ ID NO.5)，xCas9(SEQ ID NO.6)，spCas9-ABE(SEQ ID NO.7)和KKH SaCas9-ABE(SEQ ID NO.8)。

1、将上述四种质粒的编码区分别构建到载体pET28a(SEQ ID NO.9优宝生物，VT1207) 中。

2、摇菌，8L LB，Kana，大约摇菌4小时(OD＝0.8)后，加入IPTG1Mm，，16度摇 菌48h。

3、沉菌，离心5000g，20min。

4、重悬，将所有沉菌用bufferA重悬，菌必须完全打散，防止后面破碎的时候堵塞仪 器。

5、破碎，将菌液过仪器破碎，直到溶液清亮，一般至少破碎两次。仪器准备，需要清洗3-4遍，高压力部分金属管需要冰浴，仪器使用完毕后需要清洗3-4次。

6、收取10μL全细胞裂解产物，后续western检测。

7、将裂解产物置于50ml离心管中，80000g，40min。

8、收集上清，重复7，直到颗粒杂质去除干净。

9、0.45um滤器过滤上清，取10μL用于后续western检测，准备开始固相金属亲和层析 (Immobilized Metal Affinity Chromatography(IMAC)(钴柱)。

10、钴柱需要用ddH2O洗一遍后，用bufferA润洗几遍。

11、将蛋白样品过钴柱(此次用两个柱子)，并收集流出液。

12、重复步骤11，并取10μL样品用于后续western。

13、去杂质，用40mL添加有5mM咪唑的bufferA过柱子，以去除亲和力较低的杂质。收集流出液，并取10μL样品用于后续western。

14、洗脱，用30ml添加有500mM咪唑的bufferA过柱子，置换出目的蛋白。收集目 的蛋白，并取10μL样品用于后续western。洗脱后的钴柱需要用ddH2O清洗，以除去咪唑， 之后再用bufferA平衡。

15、western，目的蛋白约160KD，根据蛋白大小配置合适的SDS-PAGE胶，210V电泳。电泳结束后，将胶割下，置于考马斯亮蓝中，微波炉高温加热1min。之后，用ddH2O清洗， 微波炉加热20min。用水冲洗后，拍照。

16、蛋白浓缩：将洗脱下来的目的蛋白加入到蛋白浓缩柱中，3900rpm，20min。

17、浓缩后的蛋白进行离子交换层析(Ion exchange chromatography(IEC))，以除去与 蛋白结合的核酸。离子交换层析的原理即高盐溶液下，这种离子键就会被破坏，从而释放出 目的蛋白。

18、层析收集的目的蛋白，经浓缩后进行酶切，以除去His-tag。

实施例1

本实施例中，在细胞株上利用Cas9/sgRNA结合ssODN制作突变GALC^C1586T突变细胞株，本方法将利用Cas9mRNA和sgRNA的RNA结合ssODN形式实现，参见图1A-图1E。

1.1质粒构建

在突变位点附近，设计突变mt-sgRNA(SEQ ID NO.3)，合成oligos，上游序列为：5’-taggGTTGAGAACTTGGCGTAGCG-3’(SEQ ID NO.(10))，下游序列为： 5’-aaacCGCTACGCCAAGTTCTCAAC-3’(SEQ ID NO.(11))，上下游序列通过程序(95℃， 5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)退火，连接到经过BsaI(NEB：R0539L)线性化的PUC57-T7sgRNA载体上(addgene：51132)上。线性化体系如下所示：PUC57-T7sgRNA 2μg；buffer(NEB：R0539L)6μL；BsaI 2μL；ddH₂O补齐到60μL。37℃ 酶切过夜。所使用的同源模板ssODN(SEQ ID NO.4)，利用PAGE纯化的方式由生工生物 公司(http://www.sangon.com/)合成。连接体系如下：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL， 线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL， ddH₂O补齐到10μL.16℃连接过夜。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定，鉴定引物上游序 列：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO.12)，下游序列为相应oligo 的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得 的突变质粒命名为mt-T7-sgRNA。

1.2sgRNA的体外转录

以构建的mt-T7sgRNA为模板，扩增含有sgRNA的片段，所用引物为：F: 5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’,(SEQ ID NO.13)R: 5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.14)。扩增体系如下： 2Xbuffer(诺唯赞：P505)25μL；dNTP 1μL；F(10pmol/μL)2μL；R(10pmol/μL)2μL； 模板1ng；DNA聚合酶(诺唯赞：P505)0.5μL；ddH₂O补齐到50μL。扩增出来的PCR 产物经过下述步骤纯化：每100μL体积加4μL RNAsecure(Life：AM7005)；60℃15分钟； 加入三倍体积的PCR-A(Axygen：AP-PCR-250G)过柱，离心，12000转/分钟离心1分钟； 加入500μL W2，离心1分钟；空转1分钟；加入20μL无RNAase水洗脱。

利用体外转录试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1354)转录，步骤如下：

反应体系为：reaction buffer 1μL；enzyme mix 1μL；A 1μL；T 1μL；G1μL；C 1μL；模板800ng； H₂O补齐到10μL。上述体系混匀后37℃反应5个小时。加入1μL DNase，37℃反应15分 钟。利用回收试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1908)回收转录的sgRNA，步骤如下： 上步反应体积加入90μL Elution solution移植1.5mlEP管；加入350μL Bindingsolution混匀； 加入250μL无水乙醇混匀；上柱；10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；加入500μL Washing solution，10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；空转1分钟；换收集管，加入100μL Elution solution洗脱；加入10μL醋酸铵(Ambion,Life Technologies,AM1908)混匀；加入275μL无 水乙醇混匀；-20℃放置30分钟，同时准备70％乙醇放置-20℃；4℃环境下13000转/分钟离 心15分钟。弃上清，加入500μL 70％乙醇；离心5分钟，吸走废液，晾干5分钟；加入20μL 的水溶解；取1μL测浓度。

1.3Cas9的体外转录

spCas9或者xCas9酶切回收。本步骤是将质粒Cas9进行线性化。体系如下：Cas9 10μg； buffer I(NEB：R0539L)10μL；BbsI 4μL(NEB：R0539L)；H₂O补齐到100μL。混匀 之后，37℃酶切过夜。

线性化质粒的回收。酶切产物中加入4μL RNAsecure(Life：AM7005),60℃反应10分 钟；利用回收试剂盒(QIAGEN：28004)进行操作其余步骤，加入5倍体积buffer PB，过柱；加入750μL buffer PE离心；空转1分钟；用10μL水洗脱，测定浓度。

体外转录。按照试剂盒(Invitrogen：AM1345)的要求依次加入体系：1入g线性化载体；10μL2XNTP/ARCA；补齐到20μL水；2μL T7ezyme mix；2μL 10xreaction buffer。混合 之后37℃反应2小时。加入1μL DNasea反应15分钟。

加尾。转录产物进行加尾处理保证转录mRNA的稳定性。具体体系如下：20μL反应产物；36μL H₂O；20μL 5xE-PAP buffer；10μL 25mM MnCl₂；10μL ATP solution；4μL PEP。 反应体系混匀后37℃反应30分钟。

回收。利用回收试剂盒进行(QIAGEN：74104)。步骤如下：上步反应产物加入350μLbuffer RLT；加入250μL无水乙醇，过柱，离心；加入500μL RPE，离心，加入500μL RPE， 离心；空转；加入30μL水洗脱。测定浓度后-80℃保存。

1.4细胞的培养与电转

(1)以HEK293T细胞(购自ATCC)为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：HEK293T细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B), 其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用LONZA转染试剂(SF KIT)按照说明书转染，细胞通过计数得1X10⁶个。将Cas9的mRNA，sgRNA和ssODN按照3μg，1.5μg 和3μg的质量混合。电转程序采用DS150，电转后的细胞在6cm的平皿中培养两天。

(3)细胞通过流式分选仪，分选单细胞培养，等两周以后，通过裂解鉴定基因型，裂解 液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl₂,10mM Tris pH 8.0,0.5％Nonidet P-40,0.5％Tween 20,100μg/ml protease K。挑选纯合突变的细胞株扩大培养。

1.5突变效率的检测 鉴于所使用的PAM序列是TGA，并不是SpCas9最适合的，因此spCas9与xCas9进行了突 变效率的比较，通过TIDE(http://tide.nki.nl/)对突变模板的PCR测序分析，发现xCas9对 靶位点的切割效率显著高于spCas9(图1C)，因此制作突变细胞株优选xCas9相关的mRNA 或者蛋白。

1.6突变细胞株的筛选与鉴定 通过对分选的单克隆细胞进行鉴定，在选择的13个克隆里，#9克隆是个纯合子突变(图1D， 1E)，将此细胞株扩大培养进行后续的应用。

实施例2

本实施例中，在细胞株上利用Cas9/sgRNA结合ssODN制作突变GALC^C1586T突变细胞株，本方法将利用Cas9蛋白和sgRNA的RNA形成RNP结合ssODN形式实现。

1.1质粒构建

在突变位点附近，设计突变mt-sgRNA(SEQ ID NO.3)，合成oligos，上游序列为：5’-taggGTTGAGAACTTGGCGTAGCG-3’(SEQ ID NO.(10))，下游序列为： 5’-aaaccGCTACGCCAAGTTCTCAAC-3’(SEQ ID NO.(11))，上下游序列通过程序(95℃， 5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)退火，连接到经过BsaI(NEB：R0539L)线性化的PUC57-T7sgRNA载体上(addgene：51132)上。线性化体系如下所示：PUC57-T7sgRNA 2μg；buffer(NEB：R0539L)6μL；BsaI 2μL；ddH₂O补齐到60μL。37℃ 酶切过夜。所使用的同源模板ssODN(SEQ ID NO.4)，利用PAGE纯化的方式由生工生物 公司(http://www.sangon.com/)合成。连接体系如下：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL， 线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL， ddH₂O补齐到10μL.16℃连接过夜。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定，鉴定引物上游序 列：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO.12)，下游序列为相应oligo 的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得 的突变质粒命名为mt-T7-sgRNA。

1.2sgRNA的体外转录

以构建的mt-T7sgRNA为模板，扩增含有sgRNA的片段，所用引物为：F: 5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’,(SEQ ID NO.13)R: 5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.14)。扩增体系如下： 2Xbuffer(诺唯赞：P505)25μL；dNTP 1μL；F(10pmol/μL)2μL；R(10pmol/μL)2μL； 模板1ng；DNA聚合酶(诺唯赞：P505)0.5μL；ddH₂O补齐到50μL。扩增出来的PCR 产物经过下述步骤纯化：每100μL体积加4μL RNAsecure(Life：AM7005)；60℃15分钟； 加入三倍体积的PCR-A(Axygen：AP-PCR-250G)过柱，离心，12000转/分钟离心1分钟； 加入500μL W2，离心1分钟；空转1分钟；加入20μL无RNAase水洗脱。

利用体外转录试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1354)转录，步骤如下：

反应体系为：reaction buffer 1μL；enzyme mix 1μL；A 1μL；T 1μL；G1μL；C 1μL；模 板800ng；H₂O补齐到10μL。上述体系混匀后37℃反应5个小时。加入1μL DNase，37℃ 反应15分钟。利用回收试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1908)回收转录的sgRNA，步 骤如下：上步反应体积加入90μL Elution solution移植1.5mlEP管；加入350μL Bindingsolution 混匀；加入250μL无水乙醇混匀；上柱；10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；加入500μL Washing solution，10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；空转1分钟；换收集管，加入100μL Elution solution洗脱；加入10μL醋酸铵(Ambion,Life Technologies,AM1908)混匀；加入275μL 无水乙醇混匀；-20℃放置30分钟，同时准备70％乙醇放置-20℃；4℃环境下13000转/分钟 离心15分钟。弃上清，加入500μL 70％乙醇；离心5分钟，吸走废液，晾干5分钟；加入 20μL的水溶解；取1μL测浓度。

1.3细胞的培养与电转

(1)以HEK293T细胞(购自ATCC)为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：HEK293T细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B), 其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用LONZA转染试剂(SF KIT)按照说明书转染，细胞通过计数得1X10⁶个。将Cas9蛋白，sgRNA提前在37℃孵育10分钟形 成RNP，再和ssODN混合。三种成分的质量分别为3μg，1.5μg和3μg。电转程序采用DS150， 电转后的细胞在6cm的平皿中培养两天。

(3)细胞通过流式分选仪，分选单细胞培养，等两周以后，通过裂解鉴定基因型，裂解液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl₂,10mM Tris pH 8.0,0.5％Nonidet P-40,0.5％Tween 20,100μg/ml protease K。挑选纯合突变的细胞株扩大培养。

实施例3

本实施例中，对获得的纯合突变细胞株，利用碱基编辑系统对GALC^C1586T实现修复。本实施例将利用spCas9-ABE和KKH SaCas9-ABE两种的mRNA结合相应的修复sgRNA进 行突变位点的修复，参见图2A-2E以及图3A和图3B。

1.1质粒构建

在突变位点附近，设计修复re-sgRNA，合成oligos，如果使用spCas9-ABE上游序列为： 5’-taggAGCATGAAGTGATGCTCGCC-3’(SEQ ID NO.(15))，下游序列为： 5’-aaacGGCGAGCATCACTTCAtGCT-3’(SEQ ID NO.(16))，如果使用KKH SaCas9-ABE 上游序列为：5’-taggTAGCATGAAGTGATGCTCGC-3’(SEQ ID NO.(17))，下游序列 为：5’-aaacGCGAGCATCACTTCAtGCTA-3’(SEQ ID NO.(18))。上下游序列 通过程序(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)退火，连 接到经过BsaI(NEB：R0539L)线性化的PUC57-T7sgRNA载体上(addgene：51132)上。 线性化体系如下所示：PUC57-T7sgRNA 2μg；buffer(NEB：R0539L)6μL；BsaI 2μL；ddH₂O 补齐到60μL。37℃酶切过夜。连接体系如下：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL，线 性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL， ddH₂O补齐到10μL.16℃连接过夜。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定，鉴定引物上游序 列：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ IDNO.12)，下游序列为相应oligo 的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得 的突变质粒命名为re-T7-sgRNA。

1.2sgRNA的体外转录

以构建的re-T7sgRNA为模板，扩增含有sgRNA的片段，所用引物为：F: 5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’,(SEQ ID NO.13)R: 5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.14)。扩增体系如下： 2Xbuffer(诺唯赞：P505)25μL；dNTP 1μL；F(10pmol/μL)2μL；R(10pmol/μL)2μL； 模板1ng；DNA聚合酶(诺唯赞：P505)0.5μL；ddH₂O补齐到50μL。扩增出来的PCR 产物经过下述步骤纯化：每100μL体积加4μL RNAsecure(Life：AM7005)；60℃15分钟； 加入三倍体积的PCR-A(Axygen：AP-PCR-250G)过柱，离心，12000转/分钟离心1分钟； 加入500μL W2，离心1分钟；空转1分钟；加入20μL无RNAase水洗脱。

利用体外转录试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1354)转录，步骤如下：

反应体系为：reaction buffer 1μL；enzyme mix 1μL；A 1μL；T 1μL；G1μL；C 1μL；模 板800ng；H₂O补齐到10μL。上述体系混匀后37℃反应5个小时。加入1μL DNase，37℃ 反应15分钟。利用回收试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1908)回收转录的sgRNA，步 骤如下：上步反应体积加入90μL Elution solution移植1.5mlEP管；加入350μL Bindingsolution 混匀；加入250μL无水乙醇混匀；上柱；10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；加入500μL Washing solution，10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；空转1分钟；换收集管，加入100μL Elution solution洗脱；加入10μL醋酸铵(Ambion,Life Technologies,AM1908)混匀；加入275μL 无水乙醇混匀；-20℃放置30分钟，同时准备70％乙醇放置-20℃；4℃环境下13000转/分钟 离心15分钟。弃上清，加入500μL 70％乙醇；离心5分钟，吸走废液，晾干5分钟；加入 20μL的水溶解；取1μL测浓度。

1.3ABE的体外转录

spCas9-ABE或者KKH SaCas9-ABE酶切回收。本步骤是将质粒ABE进行线性化。体系如下：ABE 10μg；buffer I(NEB：R0539L)10μL；BbsI 4μL(NEB：R0539L)；H₂O补 齐到100μL。混匀之后，37℃酶切过夜。

线性化质粒的回收。酶切产物中加入4μL RNAsecure(Life：AM7005),60℃反应10分 钟；利用回收试剂盒(QIAGEN：28004)进行操作其余步骤，加入5倍体积buffer PB，过柱；加入750μL buffer PE离心；空转1分钟；用10μL水洗脱，测定浓度。

体外转录。按照试剂盒(Invitrogen：AM1345)的要求依次加入体系：1入g线性化载体；10μL2XNTP/ARCA；补齐到20μL水；2μL T7ezyme mix；2μL 10xreaction buffer。混合 之后37℃反应2小时。加入1μL DNasea反应15分钟。

加尾。转录产物进行加尾处理保证转录mRNA的稳定性。具体体系如下：20μL反应产物；36μL H₂O；20μL 5xE-PAP buffer；10μL 25mM MnCl₂；10μL ATP solution；4μL PEP。 反应体系混匀后37℃反应30分钟。

回收。利用回收试剂盒进行(QIAGEN：74104)。步骤如下：上步反应产物加入350μLbuffer RLT；加入250μL无水乙醇，过柱，离心；加入500μL RPE，离心，加入500μL RPE， 离心；空转；加入30μL水洗脱。测定浓度后-80℃保存。

1.4细胞的培养与电转

(1)获得的纯合突变细胞株接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B),其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用LONZA转染试剂(SF KIT)按照说明书转染，细胞通过计数得1X10⁶个。将Cas9，sgRNA和ssODN按照3μg，1.5μg和3μg 的质量混合。电转程序采用DS150，电转后的细胞在6cm的平皿中培养两天。

(3)细胞通过流式分选仪，一部分分选为单细胞培养，等两周以后，通过裂解鉴定基 因型，裂解液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl₂,10mM Tris pH 8.0,0.5％Nonidet P-40, 0.5％Tween 20,100μg/ml protease K。挑选纯合突变的细胞株扩大培养。另一部分用来鉴定 修复效率。

1.5突变细胞的修复

通过对转染后的细胞进行高通量测序，分析碱基编辑的修复效率。如图2B，2C所示， spCas9-ABE因为对应的sgRNA自身的特点，其编辑在T₄，T₇和T₈位点均有发生。而我们所选用的KKH SaCas9-ABE因为改变了sgRNA，使致病位点在sgRNA上的位置发生了变化， 可以看出，编辑主要发生在了致病位点上。此证明了对不同种类编辑系统的选择，其编辑的结果将有所不同，针对GALC^C1586T突变，推荐使用KKH SaCas9-ABE。同时我们对挑选出 来的单克隆进行鉴定，发现了完全正常基因型的克隆，证明了方法的可靠性。

1.6脱靶检测

进一步地，我们对获得的修复克隆进行了KKH SaCas9-ABE所使用的sgRNA潜在的脱 靶位点的检测，通过高通量测序发现，在靶位点中没有发现indel，在潜在的脱靶位点中没 有发现明显的脱靶(图3A和图3B)。上述结果证明利用碱基编辑系统可以安全高效的实现克拉伯并相关的GALC^C1586T突变的修复。

实施例4

本实施例中，对获得的纯合突变细胞株，利用碱基编辑系统对GALC^C1586T实现修复。本实施例将利用spCas9-ABE和KKH SaCas9-ABE两种的蛋白结合相应的修复sgRNA进行 突变位点的修复。

1.1质粒构建

在突变位点附近，设计修复re-sgRNA，合成oligos，如果使用spCas9-ABE上游序列为：5’-taggAGCATGAAGTGATGCTCGCC-3’(SEQ ID NO.(15))，下游序列为： 5’-aaacGGCGAGCATCACTTCAtGCT-3’(SEQ ID NO.(16))，如果使用KKH SaCas9-ABE 上游序列为：5’-taggTAGCATGAAGTGATGCTCGC-3’(SEQ ID NO.(17))，下游序列 为：5’-aaacGCGAGCATCACTTCAtGCTA-3’(SEQ ID NO.(18))。上下游序列 通过程序(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)退火，连 接到经过BsaI(NEB：R0539L)线性化的PUC57-T7sgRNA载体上(addgene：51132)上。 线性化体系如下所示：PUC57-T7sgRNA 2μg；buffer(NEB：R0539L)6μL；BsaI 2μL；ddH₂O 补齐到60μL。37℃酶切过夜。连接体系如下：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL，线 性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL， ddH₂O补齐到10μL.16℃连接过夜。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定，鉴定引物上游序 列：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ IDNO.12)，下游序列为相应oligo 的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得 的突变质粒命名为re-T7-sgRNA。

1.2sgRNA的体外转录

以构建的re-T7sgRNA为模板，扩增含有sgRNA的片段，所用引物为：F: 5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’,(SEQ ID NO.13)R: 5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.14)。扩增体系如下：2Xbuffer(诺唯赞：P505)25μL；dNTP 1μL；F(10pmol/μL)2μL；R(10pmol/μL)2μL； 模板1ng；DNA聚合酶(诺唯赞：P505)0.5μL；ddH₂O补齐到50μL。扩增出来的PCR 产物经过下述步骤纯化：每100μL体积加4μL RNAsecure(Life：AM7005)；60℃15分钟； 加入三倍体积的PCR-A(Axygen：AP-PCR-250G)过柱，离心，12000转/分钟离心1分钟； 加入500μL W2，离心1分钟；空转1分钟；加入20μL无RNAase水洗脱。

利用体外转录试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1354)转录，步骤如下：

反应体系为：reaction buffer 1μL；enzyme mix 1μL；A 1μL；T 1μL；G1μL；C 1μL；模板800ng；H₂O补齐到10μL。上述体系混匀后37℃反应5个小时。加入1μL DNase，37℃ 反应15分钟。利用回收试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1908)回收转录的sgRNA，步 骤如下：上步反应体积加入90μL Elution solution移植1.5mlEP管；加入350μL Bindingsolution 混匀；加入250μL无水乙醇混匀；上柱；10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；加入500μL Washing solution，10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；空转1分钟；换收集管，加入100μL Elution solution洗脱；加入10μL醋酸铵(Ambion,Life Technologies,AM1908)混匀；加入275μL 无水乙醇混匀；-20℃放置30分钟，同时准备70％乙醇放置-20℃；4℃环境下13000转/分钟 离心15分钟。弃上清，加入500μL 70％乙醇；离心5分钟，吸走废液，晾干5分钟；加入 20μL的水溶解；取1μL测浓度。

1.3细胞的培养与电转

(1)获得的纯合突变细胞株接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B),其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用LONZA转染试剂(SF KIT)按 照说明书转染，细胞通过计数得1X10⁶个。将Cas9蛋白，sgRNA提前在37℃孵育10分钟 形成RNP，再和ssODN混合。三种成分的质量分别为3μg，1.5μg和3μg。电转程序采用 DS150，电转后的细胞在6cm的平皿中培养两天。

(3)收集细胞，直接对细胞进行裂解鉴定突变效率。裂解液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl₂,10mM Tris pH 8.0,0.5％Nonidet P-40,0.5％Tween 20,100μg/ml proteaseK。

1.4突变细胞的修复

突变的细胞通过高通量测序分析其修复效率。发现同使用mRNA的结果类似，KKHSaCas9-ABE对靶位点的修复更具有特异性。

实施例5

本实施例中，将对从具有GALC^C1586T的患者提取的骨髓造血干细胞(HSC)进行修复。本实施例将利用KKH SaCas9-ABE蛋白结合相应的修复sgRNA进行突变位点的修复。

1.1质粒构建

在突变位点附近，设计修复re-sgRNA，合成oligos，如果使用spCas9-ABE上游序列为：5’-taggAGCATGAAGTGATGCTCGCC-3’(SEQ ID NO.(15))，下游序列为： 5’-aaacGGCGAGCATCACTTCAtGCT-3’(SEQ ID NO.(16))，如果使用KKH SaCas9-ABE 上游序列为：5’-taggTAGCATGAAGTGATGCTCGC-3’(SEQ ID NO.(17))，下游序列 为：5’-aaacGCGAGCATCACTTCAtGCTA-3’(SEQ ID NO.(18))。上下游序列 通过程序(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)退火，连 接到经过BsaI(NEB：R0539L)线性化的PUC57-T7sgRNA载体上(addgene：51132)上。 线性化体系如下所示：PUC57-T7sgRNA 2μg；buffer(NEB：R0539L)6μL；BsaI 2μL；ddH₂O 补齐到60μL。37℃酶切过夜。连接体系如下：T4连接buffer(NEB：M0202L)1μL，线 性化载体20ng，退火的oligo片段(10μM)5μL，T4连接酶(NEB：M0202L)0.5μL， ddH₂O补齐到10μL.16℃连接过夜。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定，鉴定引物上游序 列：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ IDNO.12)，下游序列为相应oligo 的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(Axygene：AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得 的突变质粒命名为re-T7-sgRNA。

1.2sgRNA的体外转录

以构建的re-T7sgRNA为模板，扩增含有sgRNA的片段，所用引物为：F: 5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’,(SEQ ID NO.13)R: 5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’(SEQ ID NO.14)。扩增体系如下：

2Xbuffer(诺唯赞：P505)25μL；dNTP 1μL；F(10pmol/μL)2μL；R(10pmol/μL)2μL；模板1ng；DNA聚合酶(诺唯赞：P505)0.5μL；ddH₂O补齐到50μL。扩增出来的PCR 产物经过下述步骤纯化：每100μL体积加4μL RNAsecure(Life：AM7005)；60℃15分钟； 加入三倍体积的PCR-A(Axygen：AP-PCR-250G)过柱，离心，12000转/分钟离心1分钟； 加入500μL W2，离心1分钟；空转1分钟；加入20μL无RNAase水洗脱。

利用体外转录试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1354)转录，步骤如下：

反应体系为：reaction buffer 1μL；enzyme mix 1μL；A 1μL；T 1μL；G1μL；C 1μL；模板800ng；H₂O补齐到10μL。上述体系混匀后37℃反应5个小时。加入1μL DNase，37℃ 反应15分钟。利用回收试剂盒(Ambion,Life Technologies,AM1908)回收转录的sgRNA，步 骤如下：上步反应体积加入90μL Elution solution移植1.5mlEP管；加入350μL Bindingsolution 混匀；加入250μL无水乙醇混匀；上柱；10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；加入500μL Washing solution，10000转/分钟离心30秒，倒掉废液；空转1分钟；换收集管，加入100μL Elution solution洗脱；加入10μL醋酸铵(Ambion,Life Technologies,AM1908)混匀；加入275μL 无水乙醇混匀；-20℃放置30分钟，同时准备70％乙醇放置-20℃；4℃环境下13000转/分钟 离心15分钟。弃上清，加入500μL 70％乙醇；离心5分钟，吸走废液，晾干5分钟；加入 20μL的水溶解；取1μL测浓度。

1.3患者HSC细胞的分离与培养

具有GALC^C1586T的患者在捐献骨髓标本时已经签署知情说明书。

将获得的大约50mL骨髓标本转移到500mL无菌空瓶中，向其中加入PBS稀释至终体积为280ml，混合均匀。用移液管向8支50mL离心管中各加入15mL淋巴细胞分离 液。用移液管向其中每离心管小心、缓慢地加入35mL稀释后的骨髓标本。400g离心30 分钟。用吸痰器吸出第一层液体至略高于淋巴细胞层处，用移液管吸取第二层液体放入新 50mL离心管内并补培养基到50mL。300g离心10分钟，去上清。用5mL0.5％BSA PBS重 悬细胞，再补至50mL。裂解红细胞，加入人红细胞裂解液1x H-Lyse buffer 10mL，震荡、 吹吸混匀室温静置10min。加1x H-wash buffer 10mL颠倒混匀。加0.5％BSA PBS到 50mL，300g离心10分钟，弃上清。对于1x10⁸细胞，将0.3mL 0.5％BSA PBS加入淋巴 细胞沉淀中，吹吸重悬，再分别加入0.1mLFcr Blocking Ab和0.1mLCD34-beads。放置于4℃ 冰箱30分钟，加入20mL0.5％BSA PBS，重悬混匀。300g离心10分钟，去上清。加入0.5％ BSA PBS至终体积为4mL。将柱子放在架子上并加入0.5mL 0.5％BSA PBS将柱子润湿， 在柱子下方放置离心管用于收集流下液体，待液体停止滴落后向柱子中加入0.5mL细胞悬 液。滴完后向柱子中加入0.5mL0.5％BSA PBS清洗被柱子吸附的细胞，重复5次。将柱子 从架子上取下并加入1mL0.5％BSA PBS，用活塞将液体推至50mL离心管中，重复3次。 向离心管中加入0.5％BSA PBS至20mL体积，加到细胞计数器上，显微镜下计数第一遍 过柱子的细胞数。300g离心10分钟。根据计数结果，按1x10⁷细胞重悬于4mL0.5％BSA PBS、 过1个柱子计算，重悬至适当体积的0.5％BSA PBS中并过适当数量的柱子。提高CD34+ 细胞比例，重复分选步骤。计数第二遍过柱子的细胞数。根据计数结果，取5x10⁵CD34+

细胞，0.5％BSA PBS稀释至100μL(实验组)，取流过柱子的废液100μl(对照组)，CD34、CD3抗体各加3μl，4℃放半个小时，200μLPBS洗2遍，3500rpm离心3min。重悬于 200μlPBS，进行流式检测，结果发现我们获得的纯度高达98％的CD34+细胞(图4A)。

1.4造血干细胞的培养与转染 分离得到的CD34+造血干细胞培养在StemSpanSFEM培养基中，培养基中添加如下细胞因 子：100ng/mL的SCF，100ng/mL的Tpo,100ng/mL的Flt3ligand and small molecules,1μM Stem-Regenin 1,和0.5μM MU729。细胞培养在37℃温箱，5％CO2条件，预刺激24小时。 将相应的ABE的蛋白与相应的sgRNA在37℃孵育10分钟，利用LONZA 4D neclefector进行电 转，程序选择EO-100。电转后的细胞继续培养2天。

1.5转染后的细胞收集细胞，鉴定修复率。细胞采用直接裂解方式鉴定，裂解液的成分 为50mM KCl,1.5mM MgCl₂,10mM Tris pH 8.0,0.5％Nonidet P-40,0.5％Tween 20,100 μg/ml protease K。通过对测序结果分析发现，KKH SaCas9-ABE修复的效率达到了48％， spCas9-ABE对致病位点的编辑效率是32％(图4B)。

序列表

<110> 国家卫生计生委科学技术研究所

<120> 利用碱基编辑修复与克拉伯病相关的GALC-C1586T突变的试剂和方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cctggcgagc atcacttcat gct 23

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

accctggcga gcatcacttc acgcta 26

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tcatgctacg ccaagttctc aac 23

<210> 4

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

actggtgtat ttgaatattt tacaaatatt gaagaccctg gcgagcatca cttcatgcta 60

cgccaagttc tcaaccagag acccattaca tgggctgccg atgcatc 107

<210> 5

<211> 9207

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

accatggaca agaaatactc tattggactg gatatcggga caaactccgt tggctgggcc 960

gtcataaccg acgagtataa ggtgccaagc aagaaattca aggtgctggg taatactgac 1020

cgccattcaa tcaagaagaa cctgatcgga gcactcctct tcgactccgg tgaaaccgct 1080

gaagctactc ggctgaagcg gaccgcaagg cggagataca cccgccgcaa gaatcggata 1140

tgttatctgc aagagatctt tagcaacgaa atggctaagg tggacgactc cttctttcac 1200

cgcctggaag agagctttct ggtggaggag gataagaaac acgagaggca ccctatattc 1260

ggaaatatcg tggatgaggt ggcttaccat gaaaagtatc ctacaatcta ccatctgagg 1320

aagaagctgg tggacagcac cgataaagca gacctgaggc tcatctatct ggccctggct 1380

catatgataa agtttagagg acactttctg atcgagggcg acctgaatcc cgataattcc 1440

gatgtggata aactcttcat tcaactggtg cagacatata accaactgtt cgaggagaat 1500

cccataaacg cttctggtgt ggatgccaag gctattctgt ccgctcggct gtccaagtca 1560

cgcagactgg agaatctgat tgcccaactg ccaggagaaa agaagaacgg cctgtttggg 1620

aacctcatcg ccctgagcct gggcctgaca cctaacttca agtccaattt tgatctggcc 1680

gaagatgcta aactccagct ctccaaggac acctatgacg atgatctgga caacctgctc 1740

gcacagatag gcgaccagta cgccgatctc tttctggctg ctaagaatct ctccgacgcc 1800

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<210> 6

<211> 9553

<212> DNA

<213> 人工序列()

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tacgcctaca acgcagacct gtacaacgcc ctgaatgatc tcaacaatct cgtcataact 2400

cgggatgaaa acgagaagct ggaatattat gagaagttcc agattattga aaatgtgttc 2460

aaacagaaga agaaacctac cctgaaacaa attgccaaag agatcctggt gaatgaggag 2520

gatatcaagg gatatcgggt tacttctacc ggcaaaccag agttcacaaa tctgaaagtt 2580

taccatgaca tcaaagatat taccgcaaga aaggagatca tcgagaacgc tgagctcctg 2640

gaccagatcg ctaagattct cactatctat cagtccagcg aggatattca ggaagagctg 2700

accaacctga actcagagct gactcaggaa gaaatcgaac aaatctccaa tctgaaagga 2760

tacactggta cccataatct ctcactcaag gctatcaatc tgatcctgga tgaactgtgg 2820

catactaacg acaatcagat cgccatcttc aatcggctca aactggtgcc caaaaaagtg 2880

gacctgagcc aacagaaaga gattcctaca accctggtgg acgatttcat tctgagccca 2940

gtggttaagc ggagcttcat ccaatccatc aaggtgatca acgctatcat caagaagtat 3000

ggcctgccta atgacataat cattgaactc gcaagggaaa agaatagcaa agatgcccag 3060

aagatgataa acgagatgca gaaacggaac agacagacta acgaaagaat cgaggaaata 3120

atacggacca ctggtaagga gaacgctaag tatctgatcg agaaaatcaa gctgcacgat 3180

atgcaggaag gcaagtgcct gtattctctg gaggctatac ccctggagga tctgctcaat 3240

aatcctttca attacgaggt ggatcacatc ataccaagat ccgtgagctt tgacaatagc 3300

tttaataata aggtgctcgt gaagcaggag gaaaactcaa agaaaggcaa caggacccca 3360

ttccagtacc tgtccagctc tgacagcaag attagctacg aaaccttcaa gaaacacatc 3420

ctgaatctgg ccaagggcaa gggaagaata agcaaaacaa agaaagagta tctcctggag 3480

gaaagggaca tcaacaggtt ttcagtgcag aaagatttta tcaatcggaa tctcgttgac 3540

acaagatatg ctaccagagg gctcatgaat ctgctcaggt catactttag ggtgaacaac 3600

ctggatgtga aggtcaaatc cataaatgga gggttcactt cctttctcag gagaaaatgg 3660

aagtttaaga aagagagaaa taagggttac aaacatcacg ccgaggacgc actgatcatt 3720

gccaacgctg actttatctt taaggaatgg aagaagctgg acaaagcaaa gaaggtgatg 3780

gagaatcaga tgtttgagga aaagcaggcc gagtctatgc ctgagattga aacagagcag 3840

gaatacaaag agatcttcat tactccacat cagattaagc acatcaagga ctttaaggac 3900

tataaatact cacatagggt ggataagaaa cctaatagaa agctgatcaa cgatacactc 3960

tactcaacaa ggaaagacga caaaggaaac accctgattg ttaataatct caatgggctg 4020

tatgacaaag ataatgacaa gctgaagaaa ctcatcaaca agtccccaga aaagctgctg 4080

atgtatcacc acgatcccca aacatatcag aagctgaagc tgattatgga gcagtatggt 4140

gatgagaaga accctctgta caagtactat gaagagacag ggaactacct cactaagtac 4200

agcaagaaag acaacggacc cgttatcaag aagatcaagt actacggcaa taagctgaac 4260

gcccacctgg atatcacaga tgactatcca aactctagga acaaagtggt gaaactgtcc 4320

ctgaagccat acagatttga tgtgtatctg gataacggag tctataagtt cgtcacagtc 4380

aagaacctgg acgtcatcaa gaaggagaat tactatgaag tgaacagcaa atgctacgag 4440

gaagccaaga agctcaagaa gatttctaac caggcagagt ttatcgcctc tttctacaag 4500

aacgatctga tcaagatcaa cggagaactg tacagagtga tcggcgtgaa taatgacctc 4560

ctgaatagga tcgaggttaa catgatcgat atcacatatc gggagtacct ggagaatatg 4620

aatgacaaga ggcctcccca cattatcaag actattgcca gcaaaaccca atctataaaa 4680

aagtactcaa cagatatcct ggggaacctg tatgaggtga agtcaaagaa gcatccccag 4740

attatcaaga aaggctctgg tggttctccc aagaagaaga ggaaagtcta accggtcatc 4800

atcaccatca ccattgagtt taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc 4860

agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 4920

ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 4980

ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 5040

atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcga 5100

taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 5160

attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 5220

agggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 5280

agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 5340

gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 5400

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 5460

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 5520

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 5580

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 5640

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 5700

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 5760

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 5820

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 5880

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 5940

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 6000

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 6060

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 6120

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 6180

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 6240

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 6300

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 6360

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 6420

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 6480

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 6540

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 6600

ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 6660

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 6720

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 6780

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 6840

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 6900

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 6960

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 7020

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 7080

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 7140

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 7200

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 7260

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtcgacgg atcgggagat cgatctcccg 7320

atcccctagg gtcgactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtatc 7380

tgctccctgc ttgtgtgttg gaggtcgctg agtagtgcgc gagcaaaatt taagctacaa 7440

caaggcaagg cttgaccgac aattgcatga agaatctgct tagggttagg cgttttgcgc 7500

tgcttcgcga tgtacgggcc agatatacgc gttgacattg attattgact agttattaat 7560

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 7620

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 7680

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 7740

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tc 7782

<210> 9

<211> 5369

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240

tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300

gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 360

caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 420

ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 480

gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 540

gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 600

ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 660

caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 720

tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 780

agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 840

ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 900

ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 960

gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1020

taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1080

cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1140

cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1200

tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1260

tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1320

gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1380

atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1440

gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1500

ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1560

cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1620

cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1680

cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1740

ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1800

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1860

acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1920

gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 1980

ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2040

ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2100

tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2160

gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc 2220

tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac 2280

cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa 2340

catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct 2400

gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta 2460

catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca 2520

tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag 2580

taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa 2640

atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 2700

gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 2760

aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 2820

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2880

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2940

ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 3000

gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa 3060

ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 3120

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3180

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3240

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3300

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3360

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3420

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3480

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3540

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3600

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3660

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3720

agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3780

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3840

cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3900

tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact 3960

gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 4020

ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 4080

tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 4140

gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 4200

ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 4260

tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt 4320

attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 4380

ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 4440

cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 4500

gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc 4560

accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 4620

gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 4680

tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 4740

aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 4800

gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4860

aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata 4920

ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4980

aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 5040

cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100

ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160

cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220

ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280

gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340

cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tagggttgag aacttggcgt agcg 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aaaccgctac gccaagttct caac 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tctcgcgcgt ttcggtgatg acgg 24

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt c 31

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

taggagcatg aagtgatgct cgcc 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

aaacggcgag catcacttca tgct 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

taggtagcat gaagtgatgc tcgc 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

aaacgcgagc atcacttcat gcta 24

Claims (9)

1.一种高效修复GALC^C1586T突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统ABE以及针对GALC^C1586T位点的修复re-sgRNA。

2.如权利要求1所述的高效修复GALC^C1586T突变的试剂盒，其特征在于，所述的碱基编辑系统为spCas9-ABE或者KKH SaCas9-ABE中的一种。

3.如权利要求1所述的高效修复GALC^C1586T突变的试剂盒，其特征在于，所述的针对GALC^C1586T位点的修复re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2。

4.一种制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据GALC^C1586T位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN、针对GALC^C1586T位点的修复re-sgRNA以及碱基编辑系统中的至少一种。

5.一种碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，包括：在含有GALC^C1586T的突变细胞中，利用针对GALC^C1586T位点的修复re-sgRNA引导碱基编辑系统到突变位点进行碱基编辑修复，收集转染后的细胞。

6.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的含有GALC^C1586T的突变细胞为HEK293T细胞。

7.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的含有GALC^C1586T的突变细胞的构建方法为：根据GALC^C1586T位点设计突变mt-sgRNA和相应的突变ssODN；构建mt-sgRNA的表达载体，体外将Cas9mRNA或蛋白和转录出来的mt-sgRNA结合ssODN的方式并电转HEK293T细胞，流式分选单细胞鉴定出含有GALC^C1586T的突变细胞株。

8.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的针对GALC^C1586T位点的修复re-sgRNA通过根据GALC^C1586T位点设计修复re-sgRNA，并构建U6启动和/或T7启动的表达载体得到。

9.如权利要求7所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的mt-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3，ssODN的序列为SEQ ID NO4，re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2，优选SEQ ID NO.2。