CN113234722A - 利用碱基编辑修复与板层状鱼鳞病相关的tgm1c607t突变的试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用碱基编辑修复TGM1^C607T突变的试剂和方法。所述的高效修复TGM1^C607T突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统以及针对TGM1^C607T位点的修复re‑sgRNA。本发明利用碱基编辑技术，通过精准的TC单碱基突变，从而可以修复TGM1^C607T的突变，从而为治疗该类突变引起的板层状鱼鳞病提供了高效安全的方法。

Description

利用碱基编辑修复与板层状鱼鳞病相关的TGM1C607T突变的试 剂和方法

技术领域

本发明涉及基因修复领域，更具体来说，利用碱基编辑修复板层状鱼鳞病相关的TGM1^C607T突变的方法。

背景技术

目前，全球范围内已确认的罕见病种类超过7000种，其中约有80％是由遗传缺陷所致，一半的罕见病患者在出生时或者儿童期即发病，社会和家庭承受着巨大的负担。然而，能有效干预或治疗的罕见病种类不足5％，而中国的患者获得药物的机会更少，很多罕见病的治疗药物都没有纳入医保。虽然孕前筛查、产前筛查和产前诊断、新生儿筛查等对降低罕见病患儿的出生至关重要，但仍然需要开发精准的基因治疗策略(Dunbar et al.,2018)。

基因编辑技术正推动着生物医学科学的一场革命，对由遗传因素引起的人类疾病提供潜在的治疗方案(Komor et al.,2017)。CRISPR/Cas9系统为序列特异性的基因编辑提供了强大的平台。在sgRNA(single guide RNA)的指导下，Cas9到达特异的基因位点造成一个双链断裂位点(double-strand breaks,DSB)(Gasiunas et al.,2012；Jinek et al.,2012)，从而触发内在DNA修复机制：非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)或同源定向修复(homology-directed repair,HDR)(Choulika et al.,1995；Rouet etal.,1994)。NHEJ在DSB位点引起随机插入缺失，可能导致基因敲除(Lieber,2010)。利用HDR通过供体DNA模板引导的同源重组在DSB位点产生所需的序列替换，可引起靶向基因缺失、诱变、插入或基因校正。目前，在治疗相关条件下使用HDR纠正点突变的策略的效率仅为0.1-5％(Cong et al.,2013)。同时，对于多种已知的遗传病的研究，需要精确修正目标位点的点突变而不是随机破坏基因。

近期，David R.Liu实验室开发了‘碱基编辑’系统(base editing)，在胞嘧啶编辑器(cytidine base editor,CBE)系统中在他们将CRISPR/Cas9和胞苷脱氨酶融合表达，保留sgRNA指导的编程能力、不诱导dsDNA断裂并介导胞苷直接转化为尿苷，从而实现C·G碱基对转化为T·A碱基对(Komor et al.,2016)。在腺嘌呤编辑器(adenine base editor,ABE)系统中他们将进化的转移RNA腺苷脱氨酶与催化受损的CRISPR-Cas9突变体融合，有效地将靶向的A·T碱基对转化为G·C(Gaudelli et al.,2017)。新开发的两种碱基编辑器可用于有效地纠正与人类疾病相关的碱基突变。

常染色体隐性遗传性鱼鳞病(autosomal recessive congenital ichthyoses,ARCI)是一种具有常染色体隐性遗传模式的遗传性非综合征性鱼鳞病的总称，ARCI是罕见的、异质性的、无大疱的、无证的角化性疾病，其主要特征是全身皮肤出现异常鳞屑，在欧洲人群中该病的发病率为1-1.6/100,000(Eckert et al.,2014)。目前已知的该病致病突变基因有13个，其中30-50％是转谷氨酰胺酶1(transglutaminase 1,TGM1)突变，该基因已报道的突变类型多达140种(Herman et al.,2009)。目前对于该病仍没有有效的治疗方法，利用碱基编辑器对致病突变进行修复将是治疗该疾病的一种潜在策略。

本发明通过优化版本的ABEmax-NG和Sc-ABEmax编辑工具在人的细胞中安全高效地模拟与修复TGM1^C607T致病突变，并在病人来源的T细胞中修复该突变，为临床上治疗由TGM1^C607T突变导致的ARCI提供可靠的方案。

参考文献.

Choulika,A.,Perrin,A.,Dujon,B.,and Nicolas,J.F.(1995).Induction ofHomologous Recombinationin Mammalian Chromosomes by Using the I-Scei Systemof Saccharomyces-Cerevisiae.Molecular and Cellular Biology 15,1968-1973.

Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.L.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.B.,Jiang,W.Y.,Marraffini,L.A.,et al.(2013).Multiplex Genome EngineeringUsing CRISPR/Cas Systems.Science339,819-823.

Dunbar,C.E.,High,K.A.,Joung,J.K.,Kohn,D.B.,Ozawa,K.,and Sadelain,M.(2018).Gene therapycomes of age.Science 359.

Eckert,R.L.,Kaartinen,M.T.,Nurminskaya,M.,Belkin,A.M.,Colak,G.,Johnson,G.V.W.,and Mehta,K.(2014).Transglutaminase regulation of cellfunction.Physiological reviews 94,383-417.

Gasiunas,G.,Barrangou,R.,Horvath,P.,and Siksnys,V.(2012).Cas9-crRNAribonucleoproteincomplex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunityin bacteria.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the UnitedStates of America 109,E2579-2586.

Gaudelli,N.M.,Komor,A.C.,Rees,H.A.,Packer,M.S.,Badran,A.H.,Bryson,D.I.,and Liu,D.R.(2017).Programmable base editing of A*T to G*C in genomicDNA without DNA cleavage.Nature551,464-471.

Herman,M.L.,Farasat,S.,Steinbach,P.J.,Wei,M.H.,Toure,O.,Fleckman,P.,Blake,P.,Bale,S.J.,andToro,J.R.(2009).Transglutaminase-1gene mutations inautosomal recessive congenital ichthyosis:summary of mutations(including23novel)and modeling of TGase-1.Hum Mutat 30,537-547.Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,and Charpentier,E.(2012).Aprogrammable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 337,816-821.

Komor,A.C.,Badran,A.H.,and Liu,D.R.(2017).CRISPR-Based Technologiesfor the Manipulationof Eukaryotic Genomes.Cell 168,20-36.Komor,A.C.,Kim,Y.B.,Packer,M.S.,Zuris,J.A.,and Liu,D.R.(2016).Programmable editing of a

target base in genomic DNA without double-stranded DNAcleavage.Nature 533,420-+.Lieber,M.R.(2010).The mechanism of double-strandDNA break repair by the nonhomologous DNA

end-joining pathway.Annu Rev Biochem 79,181-211.Rouet,P.,Smih,F.,andJasin,M.(1994).Introduction of Double-Strand Breaks into the Genome ofMouseCells by Expression of a Rare-Cutting Endonuclease.Molecular and CellularBiology 14,8096-8106.

发明内容

本发明的目的是提供一种高效修复板层状鱼鳞病相关的TGM1^C607T突变的试剂盒和方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种高效修复TGM1^C607T突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统以及针对TGM1^C607T的修复re-sgRNA。

优选地，所述的碱基编辑系统为ABEmax-NG或Sc-ABEmax中的一种。

优选的，所述的碱基编辑系统可以是质粒，mRNA或蛋白形式，优先选择蛋白形式。

优选地，所述的针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3-10。

本发明还提供了一种制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据TGM1^C607T位点设计突变mt-sgRNA和针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA以及碱基编辑系统中的至少一种。

本发明还提供了一种碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，包括：在含有TGM1^C607T的突变细胞中，利用针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA引导碱基编辑系统到突变位点进行碱基编辑修复，收集转染后的细胞鉴定修复率。

优选地，所述的含有TGM1^C607T的突变细胞为HEK293T细胞或人的T细胞。

优选地，所述的含有TGM1^C607T的突变细胞的构建方法为：根据TGM1^C607T位点设计突变mt-sgRNA；构建mt-sgRNA的表达载体，利用多种CBE表达质粒(BEmax-AID/BEmax-A3A-Y130F/AncBE4max/AncBE4max-NG)和mt-sgRNA质粒转染HEK293T细胞，流式分选单细胞鉴定获得含有TGM1^C607T的突变细胞株。

优选地，所述的针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA通过根据TGM1^C607T位点设计修复re-sgRNA，并构建U6启动子和/或T7启动子的表达载体。

优选地，所述的碱基编辑修复板层状鱼鳞病突变方法还包括：Sanger测序检测修复效率；高通量测序on-target和off-target的效率；全基因组测序验证安全性。

优选地，所述的mt-sgRNA的序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3-10。

本发明还提供了一种碱基编辑修复板层状鱼鳞病突变方法，包括：根据TGM1^C607T位点设计突变mt-sgRNA；构建mt-sgRNA的U6启动的表达载体，将CBE系列表达载体和mt-sgRNA表达载体共转染HEK293T细胞，流式分选单细胞鉴定出含有TGM1^C607T的纯合突变细胞株；根据TGM1^C607T位点设计修复re-sgRNA，并分别构建U6启动和T7启动的表达载体；在获得的纯合突变细胞株中，利用re-sgRNA引导base editor到突变位点，并利用深度测序对修复效率和脱靶情况进行分析。

TGM 1基因突变是造成常染色体隐性鱼鳞病的主要成因，在欧洲国家发病率约1-1.6/100,000，从遗传上彻底修复突变，将是治疗该疾病最有效的措施。碱基编辑系统提供了一种精确改变DNA，即将T变为C的方法。

发明人将利用基于CBE制备含有TGM1^C607T突变的细胞株，其后利用base editor结合合适的sgRNA修复此位点的突变，并利用深度测序对修复效率和脱靶情况进行分析。发明人同时在提取含有TGM1^C607T突变的T细胞中修复该突变。最终本发明将为治疗该类突变引起的板层状鱼鳞病提供了高效安全的方法。

附图说明

图1用于修复实验载体构建示意图。(a)ABEmax-NG构建示意图。(b)Sc-ABEmax构建示意图。

图2为利用多种CBE和mt-sgRNA在HEK293T细胞中制作突变细胞株。(a)在细胞中制作突变和修复突变的模式图。(b)TGM1在基因组中的位置信息及突变位点信息。(c)针对突变位点mt-sgRNA信息。(d)不同碱基编辑器在目标位点的编辑效率。

图3为突变和修复细胞株的Sanger测序峰图。(a)突变细胞株的Sanger测序峰图。(b)修复细胞株的Sanger测序峰图。

图4为利用不同长度的re-sgRNA和ABEmax-NG，Sc-ABEmax对突变细胞株进行修复效率分析。(a,b)不同长度的re-sgRNA序列。(c,d)不同长度的re-sgRNA在突变细胞株中的修复效率。

图5为利用碱基编辑系统对具有TGM1^C607T杂合突变的人T细胞修复效率。

图6为修复后的人T细胞的脱靶分析。(a)WGS结果小结。(b)对照组ABEmax-NG和Sc-ABEmax组中碱基替换分析。(c)潜在的脱靶站点分析。(d)WGS数据小结。(e)sgRNA依赖的潜在脱靶位点深度测序结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买获得的常规产品。

以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

首先，在原始版本的基础上改造ABEmax(Addgene，112095)形成不同形式的ABEmax，即ABEmax-NG和ScCas9-ABEmax(图1)。

1、不同类型Cas酶的合成

上述两种ABEmax中的Cas酶不同，ABEmax-NG(SEQ ID NO.11)和ScCas9-ABEmax(SEQ ID NO.12)，其序列分别由生工生物(http://www.sangon.com/)合成。所合成片段的两端分别加有NotI和SmaI的酶切位点。合成的片段克隆到常用的pMD19T载体(TAKARA,6013)上。

2、载体的酶切与纯化

ABEmax和两种合成的载体经过NotI(NEB,R0189L)、SmaI(NEB,R0141L)酶切，体系如下：Buffer(NEB,R0189L)6μL；质粒2μg；NotI 1μL；SmaI 1μL；ddH₂O补齐到60μL。混匀后于37℃孵育过夜酶切。

酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后进行回收(Axygen，AP-GX-250G)，回收大片段的ABEmax骨架载体和合成载体的Cas9片段。回收后的片段用Nanodrop 2000检测浓度。

3、载体的连接、转化与质粒提取。

对回收的骨架载体和Cas9片段进行连接，体系如下：T4连接buffer(NEB，M0202L)1μL，骨架载体20ng，Cas9片段50ng，T4连接酶(NEB，M0202L)0.5μL，ddH₂O补充体积到10μL，16℃连接过夜。转化步骤如下：取20μL感受态细胞(Takara,9052)在冰上解冻；2μL的连接产物与感受态细胞混合，冰上放置20min；42℃热激60s；冰上放置2min，加入400μL无抗性LB培养基，37℃培养30min；取50μL涂氨苄抗性平板(50μg/ml)，于37℃培养至长出单克隆。

挑选单克隆菌，在5ml氨苄LB培养基中扩大培养14h后提取质粒(Axygene，AP-MN-P-250G)，步骤如下：菌液经过4000转/分钟离心10min，弃上清；加入350μL buffer S1，重悬菌体后转移到2ml离心管；加入250μL buffer S2，颠倒混匀6次；加入250μL buffer S3，颠倒混匀6次，可见白色絮状物；12000转/分钟离心10min，取上清过柱；离心1min后弃流出液，加入500μL W1，离心1min，弃流出液；加入750μL W2，离心1min后弃流出液；加入500μL W2，离心1min后弃流出液；空转2min；加入50μL洗脱液，静置2min后离心。质粒测定浓度，取10μL送测序，阳性质粒保存在-20℃。

最终构建成如下两种ABEmax：

(1)ABEmax-NG，SEQ ID NO.11；

(2)Sc-ABEmax，SEQ ID NO.12；

在下面进行突变位点修复时，可以采用上述任一种ABEmax-NG或Sc-ABEmax。

实施例1

本实施例中，在细胞株上利用BEmax-AID，BEmax-A3A-Y130F(，AncBE4max，和AncBE4max-NG结合突变sgRNA制备TGM1^C607T突变细胞株。

1.1质粒构建

在突变位点附近，设计两对突变mt-sgRNA(SEQ ID NO.1-2)，合成oligos，mt-sgRNA1上游序列为：5’-accgTGGGCAGAATCTGAACCTGC-3’，下游序列为：5’-aaacGCAGGTTCAGATTCTGCCCA-3’；mt-sgRNA2上游序列为：5’-accgGTGGGCAGAATCTGAACCTG-3’，下游序列为：5’-aaacCAGGTTCAGATTCTGCCCAC-3’。上下游序列退火(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)后连接到BsaI(NEB，R0539L)线性化的pGL3-U6-sgRNA-EGFP载体(Addgene，107721)上。线性化体系为：pGL3-U6-sgRNA-EGFP 2μg；buffer(NEB，R0539L)6μL；BsaI 2μL；ddH₂O补齐到60μL，37℃酶切过夜。回收载体，对连接的载体进行转化、挑菌并鉴定，鉴定引物U6载体上游序列：5’-TTTCCCATGATTCCTTCATA-3’，下游序列为相应oligo下游序列。扩大培养阳性克隆并提取质粒(Axygene，AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得的突变质粒命名为mt-sgRNA1和mt-sgRNA2。

1.2细胞的培养转染

(1)以HEK293T细胞(购自ATCC)为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：HEK293T细胞接种培养于含10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B)，其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)转染前一晚铺24孔细胞板，转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用Lipofectamine^TM2000 Transfection Reagent转染试剂(ThermoFisher，11668027)按照说明书转染。将0.6μg的BEmax-AID，BEmax-A3A-Y130F，AncBE4max，AncBE4max-NG质粒和0.3μgsgRNA混合后，再加入2μl的转染试剂，混匀后孵育20min后添加至细胞孔板中。转染后6h换10％FBS/DMEM培养基，继续培养48h。

(3)细胞通过流式分选仪，分选GFP阳性细胞群，扩增目标位点鉴定编辑情况(图2)，同时分选单细胞培养，待单细胞长至2/3孔板时，通过裂解鉴定基因型，裂解液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl₂,10mM Tris pH 8.0,0.5％Nonidet P-40,0.5％Tween 20,100μg/ml protease K。挑选获得纯合突变的细胞株并扩大培养。

实施例2

本实施例中，在TGM1^C607T突变细胞株上，利用碱基编辑系统ABEmax-NG对突变株进行修复。

2.1质粒构建

在模拟致病的TGM1^C607T突变细胞系上，依据ABEmax-NG碱基编辑作用的特点，设计不同长度的修复re-NG-sgRNA(SEQ ID NO.3-6)，合成oligos，re-NG-sg20上游序列为5’-accgCAGATTCTACCCACTGGCCT-3’,下游序列为5’-aaacAGGCCAGTGGGTAGAATCTG-3’；re-NG-sg19上游序列为5’-accgAGATTCTACCCACTGGCCT-3’，下游序列为5’-aaacAGGCCAGTGGGTAGAATCT-3’；re-NG-sg18上游序列为5’-accgGATTCTACCCACTGGCCT-3’，下游序列为5’-aaacAGGCCAGTGGGTAGAATC-3’；re-NG-sg17上游序列为5’-accgATTCTACCCACTGGCCT-3’，下游序列为5’-aaacAGGCCAGTGGGTAGAAT-3’。上下游序列退火(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)后连接到BsaI(NEB，R0539L)线性化的pGL3-U6-EGFP-sgRNA载体上。连接体系如下：Solution I(TaKaRa，6022)5μL，线性化载体20ng，退火oligo片段(10μM)2μL，ddH₂O补齐到10μL，16℃连接过夜。对连接的载体进行转化、挑菌并鉴定，鉴定引物U6载体上游序列：5’-TTTCCCATGATTCCTTCATA-3’，下游序列为相应oligo下游序列。扩大培养阳性克隆并提取质粒(Axygene，AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得的突变质粒命名为re-NG-sg17、re-NG-sg18、re-NG-sg19、re-NG-sg20和re-T7-sg20。

2.2突变细胞株的修复(图3-4)

(1)本发明对突变细胞株进行培养与转染：将突变细胞株接种培养于10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B)，其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)转染前一晚铺24孔细胞板，转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent转染试剂(ThermoFisher，11668027)按照说明书转染。将0.6μg的ABEmax-NG和0.3μg re-sgRNA混合后，再加入2μl的转染试机，混匀后孵育20min后添加至细胞板中。转染后6h换10％FBS/DMEM培养基，继续培养48h。

(3)细胞通过流式分选仪分选GFP阳性的细胞群和单克隆细胞，对收集的细胞群进行PCR产物测序分析突变修复效率(图3b，图4c)。对单克隆细胞进行培养鉴定，获得完全修复的细胞系。

实施例3

本实施例中，在TGM1^C607T突变细胞株上，利用碱基编辑系统Sc-ABEmax对突变株进行修复。

3.1质粒构建

针对TGM1^C607T突变位点，依据Sc-ABEmax碱基编辑作用的特点，设计不同长度的修复re-Sc-sgRNA(SEQ ID NO.7-10)，合成oligos，re-Sc-sg20上游序列为5’-accgTCAGATTCTACCCACTGGCC-3’,下游序列为5’-aaacGGCCAGTGGGTAGAATCTGA-3’；re-Sc-sg19上游序列为5’-accgCAGATTCTACCCACTGGCC-3’，下游序列为5’-aaacGGCCAGTGGGTAGAATCTG-3’；re-Sc-sg18上游序列为5’-accgAGATTCTACCCACTGGCC-3’，下游序列为5’-aaacGGCCAGTGGGTAGAATCT-3’；re-Sc-sg17上游序列为5’-accgGATTCTACCCACTGGCC-3’，下游序列为5’-aaacGGCCAGTGGGTAGAATC-3’。上下游序列退火(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)后连接到BsaI(NEB，R0539L)线性化的pGL3-U6-EGFP-sgRNA载体上。连接体系为Solution I(TaKaRa，6022)5μL，线性化载体20ng，退火oligo片段(10μM)2μL，ddH₂O补齐到10μL，16℃连接过夜。对连接的载体进行转化、挑菌并鉴定，鉴定引物U6载体上游序列：5’-TTTCCCATGATTCCTTCATA-3’，下游序列为相应oligo下游序列。扩大培养阳性克隆并提取质粒(Axygene，AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得的修复质粒命名为re-Sc-sg17、re-Sc-sg18、re-Sc-sg19和re-Sc-sg20。

3.2突变细胞株的修复(图4)

(1)本发明对突变细胞株进行培养与转染：将突变细胞株接种培养于10％FBS的DMEM高糖培养液中(HyClone,SH30022.01B)，其中含penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)转染前一晚铺24孔细胞板，转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent转染试剂(ThermoFisher，11668027)按照说明书转染。将0.6μg的Sc-ABEmax和0.3μg re-Sc-sgRNA混合后，再加入2μl的转染试机，混匀后孵育20min后添加至细胞板中。转染后6h换10％FBS/DMEM培养基，继续培养48h。

(3)细胞通过流式分选仪分选GFP阳性的细胞群和单克隆细胞，对收集的细胞群进行PCR产物测序分析突变修复效率(图4d)。对单克隆细胞进行培养鉴定，获得完全修复的细胞系。

实施例4

本实施例中，将对从具有TGM1^C607T的志愿者(杂合子)血液中提取的T细胞进行修复。本实施例将分别利用ABEmax-NG和Sc-ABEmax蛋白结合相应的修复sgRNA进行突变位点的修复。

4.1质粒构建

在突变位点附近，依据碱基编辑作用的特点，设计用于修复re-NG-sgRNA，同时合成上游引物：5’-taggCAGATTCTACCCACTGGCCT-3’和下游引物：5’-aaacAGGCCAGTGGGTAGAATCTG-3’；re-Sc-sgRNA，上游引物：5’-taggGGCCAGTGGGTAGAATCTG-3’和下游引物：5’-aaac CAGATTCTACCCACTGGCC-3’经过退火(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃)连接到BsaI(NEB，R0539L)线性化的pUC57-T7-sgRNA载体上。连接为Solution I(TaKaRa，6022)5μL，线性化载体20ng，退火oligo片段(10μM)2μL，ddH2O补齐到10μL，16℃连接过夜。连接的载体转化挑菌并鉴定，T7载体序列为上游扩增引物序列：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，下游引物序列为相应oligo的下游序列。扩大培养阳性克隆并提取质粒(Axygene，AP-MN-P-250G)测定浓度备用。获得的修复质粒分别命名为re-NG-T7-sgRNA20，re-Sc-T7-sgRNA19。

4.2sgRNA的体外转录

以构建的pUC57-T7-sgRNA为模板，扩增含有sgRNA的片段，所用引物为：F:5’-TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG-3’,R:5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’。扩增体系为2×

Max Buffer(Vazyme，P505)25μL；dNTP Mix(10mM)1μL；F(10pmol/μL)2μL；R(10pmol/μL)2μL；模板1ng；

Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme，P505)0.5μL；ddH₂O补齐到50μL。对单一条带的PCR产物进行纯化：按照1:25的比例向PCR产物中加入RNAsecure(Life，AM7005)；60℃孵育15min；加入三倍体积的PCR-A(Axygen，AP-PCR-250G)过柱，12000转/分钟离心1min；加入500μL W2，离心1min；空转1min；加入20μL无RNAase水洗脱。

利用体外转录试剂盒(Life Technologies,AM1354)转录，反应体系为：reactionbuffer 1μL；enzyme mix 1μL；A 1μL；T 1μL；G 1μL；C 1μL；模板800ng；H₂O补齐到10μ，混匀后37℃反应5h。加入1μL DNase，37℃反应15min。利用回收试剂盒(Life Technologies,AM1908)回收转录的sgRNA，步骤如下：上步反应体积加入90μL Elution solution转移至1.5ml EP管；加入350μL Binding solution混匀；加入250μL无水乙醇混匀；上柱；10000转/分钟离心30s，弃流出液；加入500μL Washing solution，10000转/分钟离心30s，弃流出液；空转1min；换收集管，加入100μL Elution solution洗脱；加入10μL醋酸铵(LifeTechnologies,AM1908)混匀；加入275μL无水乙醇混匀；-20℃静置30mins；4℃13000转/分钟离心15min；弃上清，加入500μL预冷70％乙醇；离心5min，弃废液，常温干燥5min；加入20μL无酶水溶解；取1μL测浓度。

4.3ABEmax-NG蛋白纯化

对ABEmax-NG和Sc-ABEmax质粒编码区进行扩增并连接到到pET28a载体(Novagen，69864-3)中，确认表达后进行扩大培养。

(1)细菌培养：在卡那抗性培养基中活化细菌至OD₂₆₀约0.6时，加入IPTG使其终浓度为1mM，16度培养48h。5000g离心20min收集菌体。用bufferA充分重悬菌体后进行超声破碎处理，收集10μL全细胞裂解产物，用于western检测。将裂解产物置于50ml离心管中，80000g离心40min。收集上清，重复上述步骤，直到颗粒杂质去除干净。用0.45μm滤器过滤上清，收集10μL用于SDS-PAGE分析。

(2)亲和层析处理：对上清进行固相金属亲和层析处理(Immobilized MetalAffinity Chromatography(IMAC)(钴柱)。钴柱用ddH₂O洗一遍，并用bufferA润洗几遍。将蛋白样品过钴柱，并收集流出液。重复上述步骤并收集10μL样品用于SDS-PAGE分析。去杂质，用40mL含5mM咪唑的bufferA过柱，以去除亲和力较低的杂质。收集流出液，收集10μL样品用于SDS-PAGE分析。

(3)洗脱：用30ml含500mM咪唑的bufferA过柱，置换出目的蛋白。收集目的蛋白，收集10μL样品用于SDS-PAGE分析。洗脱后的钴柱用ddH₂O清洗，以除去咪唑，之后再用bufferA平衡。

(4)SDS-PAGE分析：根据蛋白大小配置合适的SDS-PAGE胶，210V电泳。电泳结束后，置于考马斯亮蓝中，微波炉高温加热1min。之后，用ddH₂O清洗，微波炉加热20min。用水冲洗后，记录蛋白的表达纯化情况。

(5)蛋白浓缩：将洗脱下来的目的蛋白加入到蛋白浓缩柱中，低温环境下3900rpm离心20min。浓缩后的蛋白进行离子交换层析(Ion exchange chromatography(IEC))，以除去与蛋白结合的核酸。离子交换层析的原理即高盐溶液破坏离子键，从而释放出目的蛋白。层析收集的目的蛋白，经浓缩后进行酶切，以除去His-tag。

4.4PBMC细胞的分离纯化：

用抗凝管采集携带者外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；外周血细胞与淋巴细胞分离液(Solarbio，P8610)等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；将得到的白膜层细胞与PBS或者无血清细胞培养基1640(ThermoFisher，61870)混合后离心，沉淀即为所述PBMC细胞。

4.5CD3阳性细胞的富集

调整PBMC细胞浓度至5×10⁷cell/ml。每1ml加入CD3⁺enriched antibodiescocktail 50μL(eBioscience，16-0037-85)，混匀后室温静置5min。每1ml加入magnet 150μL，混匀后室温静置10min，将离心管置于磁力架上静置5min，吸取上层细胞悬液至新的15ml离心管中，重复该操作一次。室温300g离心10min，收集细胞。细胞计数。

4.6CD3阳性细胞的电转

制备电转体系：向1.5ml离心管中分别加入8μg ABEmax-NG蛋白与4μgre-NG-T7-sg20 mRNA，或8μg Sc-ABEmax与4μg re-Sc-T7-sg19 mRNA，并按照Lonza Amaxa电转试剂盒说明书(Lonza，VVPA-1002)要求，加入82μL电转缓冲液和18μL supplement 1，混匀。收取2×10⁷个细胞到15ml离心管中，300g离心10min，弃上清。以配好的质粒电转缓冲液混合物重悬细胞，并转移至电转杯中。使用仪器Lonza 2B,U-014程序进行电转。电转后的细胞迅速转移至提前预热的添加有10％FBS(Gibco，10099141)的AIM-V培养基(Life Techology,0870112D)中，于37℃5％二氧化碳培养箱中培养2小时。电转后的细胞全换液，以1×10⁶个/ml的密度重悬细胞，培养过夜。

4.7鉴定转染细胞修复率(图5-6)

细胞采用直接裂解方式鉴定，裂解液的成分为50mM KCl,1.5mM MgCl₂,10mM TrispH 8.0,0.5％Nonidet P-40,0.5％Tween 20,100μg/ml protease K。扩增靶标片段并通过深度测序分析修复效率，过滤50％背景，ABEmax-NG的修复效率约为73％，Sc-ABEmax的修复效率约为78％(图5)。对修复细胞进行whole-gnome sequencing分析全安全性。与对照组相比，两种编辑器在全基因组范围内没有产生额外的SNPs。同时，针对17的sgRNA依赖的潜在脱靶位点的分析显示，两种编辑器均没有造成显著的碱基替换，上述结果说明对病人T细胞以蛋白和mRNA形式进行修复是安全可行的(图6)。

序列表

<110> 肇庆市瑞思元生物科技有限公司 肇庆市华师大光电产业研究院

<120> 利用碱基编辑修复与板层状鱼鳞病相关的TGM1C607T突变的试剂和方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tgggcagaat ctgaacctgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtgggcagaa tctgaacctg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cagattctac ccactggcct 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

agattctacc cactggcct 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gattctaccc actggcct 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

attctaccca ctggcct 17

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tcagattcta cccactggcc 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cagattctac ccactggc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

agattctacc cactggcc 18

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gattctaccc actggcc 17

<210> 11

<211> 5686

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180

tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta gagatccgcg 240

gccgctaata cgactcacta tagggagagc cgccaccatg aaacggacag ccgacggaag 300

cgagttcgag tcaccaaaga agaagcggaa agtctctgaa gtcgagttta gccacgagta 360

ttggatgagg cacgcactga ccctggcaaa gcgagcatgg gatgaaagag aagtccccgt 420

gggcgccgtg ctggtgcaca acaatagagt gatcggagag ggatggaaca ggccaatcgg 480

ccgccacgac cctaccgcac acgcagagat catggcactg aggcagggag gcctggtcat 540

gcagaattac cgcctgatcg atgccaccct gtatgtgaca ctggagccat gcgtgatgtg 600

cgcaggagca atgatccaca gcaggatcgg aagagtggtg ttcggagcac gggacgccaa 660

gaccggcgca gcaggctccc tgatggatgt gctgcaccac cccggcatga accaccgggt 720

ggagatcaca gagggaatcc tggcagacga gtgcgccgcc ctgctgagcg atttctttag 780

aatgcggaga caggagatca aggcccagaa gaaggcacag agctccaccg actctggagg 840

atctagcgga ggatcctctg gaagcgagac accaggcaca agcgagtccg ccacaccaga 900

gagctccggc ggctcctccg gaggatcctc tgaggtggag ttttcccacg agtactggat 960

gagacatgcc ctgaccctgg ccaagagggc acgcgatgag agggaggtgc ctgtgggagc 1020

cgtgctggtg ctgaacaata gagtgatcgg cgagggctgg aacagagcca tcggcctgca 1080

cgacccaaca gcccatgccg aaattatggc cctgagacag ggcggcctgg tcatgcagaa 1140

ctacagactg attgacgcca ccctgtacgt gacattcgag ccttgcgtga tgtgcgccgg 1200

cgccatgatc cactctagga tcggccgcgt ggtgtttggc gtgaggaacg caaaaaccgg 1260

cgccgcaggc tccctgatgg acgtgctgca ctaccccggc atgaatcacc gcgtcgaaat 1320

taccgaggga atcctggcag atgaatgtgc cgccctgctg tgctatttct ttcggatgcc 1380

tagacaggtg ttcaatgctc agaagaaggc ccagagctcc accgactccg gaggatctag 1440

cggaggctcc tctggctctg agacacctgg cacaagcgag agcgcaacac ctgaaagcag 1500

cgggggcagc agcggggggt cagacaagaa gtacagcatc ggcctggcca tcggcaccaa 1560

ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt 1620

gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga 1680

cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag 1740

acggaagaac cggatctgct atctgcaaga gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga 1800

cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc cttcctggtg gaagaggata agaagcacga 1860

gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac 1920

catctaccac ctgagaaaga aactggtgga cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat 1980

ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct 2040

gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca 2100

gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc 2160

cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa 2220

gaatggcctg ttcggaaacc tgattgccct gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag 2280

caacttcgac ctggccgagg atgccaaact gcagctgagc aaggacacct acgacgacga 2340

cctggacaac ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa 2400

gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa 2460

ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag atacgacgag caccaccagg acctgaccct 2520

gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca 2580

gagcaagaac ggctacgccg gctacattga cggcggagcc agccaggaag agttctacaa 2640

gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa 2700

cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat 2760

ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa 2820

ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct gaccttccgc atcccctact acgtgggccc 2880

tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac 2940

cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg 3000

gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct 3060

gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat 3120

gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa 3180

gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg 3240

cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga agatcggttc aacgcctccc tgggcacata 3300

ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga 3360

cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac actgtttgag gacagagaga tgatcgagga 3420

acggctgaaa acctatgccc acctgttcga cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg 3480

gagatacacc ggctggggca ggctgagccg gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca 3540

gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat 3600

gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc 3660

cggccagggc gatagcctgc acgagcacat tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa 3720

gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca 3780

caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc cagagagaac cagaccaccc agaagggaca 3840

gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca 3900

gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta 3960

ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc 4020

cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa 4080

caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga 4140

ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca 4200

gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc 4260

cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat 4320

cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa 4380

agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa 4440

agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg 4500

aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa 4560

ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc 4620

caagtacttc ttctacagca acatcatgaa ctttttcaag accgagatta ccctggccaa 4680

cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg 4740

ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat 4800

cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg cttcagcaaa gagtctatca gacccaagag 4860

gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa ggactgggac cctaagaagt acggcggctt 4920

cgtgagcccc accgtggcct attctgtgct ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc 4980

caagaaactg aagagtgtga aagagctgct ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt 5040

cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc caagggctac aaagaagtga aaaaggacct 5100

gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt cgagctggaa aacggccgga agagaatgct 5160

ggcctctgcc agattcctgc agaagggaaa cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa 5220

cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca 5280

gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag 5340

cgagttctcc aagagagtga tcctggccga cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta 5400

caacaagcac cgggataagc ccatcagaga gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac 5460

cctgaccaat ctgggagccc ctagagcctt caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa 5520

ggtgtacaga agcaccaaag aggtgctgga cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg 5580

cctgtacgag acacggatcg acctgtctca gctgggaggt gactctggcg gctcaaaaag 5640

aaccgccgac ggcagcgaat tcgagcccaa gaagaagagg aaagtc 5686

<210> 12

<211> 5710

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180

tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta gagatccgcg 240

gccgctaata cgactcacta tagggagagc cgccaccatg aaacggacag ccgacggaag 300

cgagttcgag tcaccaaaga agaagcggaa agtctctgaa gtcgagttta gccacgagta 360

ttggatgagg cacgcactga ccctggcaaa gcgagcatgg gatgaaagag aagtccccgt 420

gggcgccgtg ctggtgcaca acaatagagt gatcggagag ggatggaaca ggccaatcgg 480

ccgccacgac cctaccgcac acgcagagat catggcactg aggcagggag gcctggtcat 540

gcagaattac cgcctgatcg atgccaccct gtatgtgaca ctggagccat gcgtgatgtg 600

cgcaggagca atgatccaca gcaggatcgg aagagtggtg ttcggagcac gggacgccaa 660

gaccggcgca gcaggctccc tgatggatgt gctgcaccac cccggcatga accaccgggt 720

ggagatcaca gagggaatcc tggcagacga gtgcgccgcc ctgctgagcg atttctttag 780

aatgcggaga caggagatca aggcccagaa gaaggcacag agctccaccg actctggagg 840

atctagcgga ggatcctctg gaagcgagac accaggcaca agcgagtccg ccacaccaga 900

gagctccggc ggctcctccg gaggatcctc tgaggtggag ttttcccacg agtactggat 960

gagacatgcc ctgaccctgg ccaagagggc acgcgatgag agggaggtgc ctgtgggagc 1020

cgtgctggtg ctgaacaata gagtgatcgg cgagggctgg aacagagcca tcggcctgca 1080

cgacccaaca gcccatgccg aaattatggc cctgagacag ggcggcctgg tcatgcagaa 1140

ctacagactg attgacgcca ccctgtacgt gacattcgag ccttgcgtga tgtgcgccgg 1200

cgccatgatc cactctagga tcggccgcgt ggtgtttggc gtgaggaacg caaaaaccgg 1260

cgccgcaggc tccctgatgg acgtgctgca ctaccccggc atgaatcacc gcgtcgaaat 1320

taccgaggga atcctggcag atgaatgtgc cgccctgctg tgctatttct ttcggatgcc 1380

tagacaggtg ttcaatgctc agaagaaggc ccagagctcc accgactccg gaggatctag 1440

cggaggctcc tctggctctg agacacctgg cacaagcgag agcgcaacac ctgaaagcag 1500

cgggggcagc agcggggggt cagaaaaaaa atactcaatc ggattggcca tcggcactaa 1560

ctcagttgga tgggctgtaa ttacagacga ttacaaggtc cctagcaaaa agtttaaggt 1620

gctgggtaat acgaatcgca agagtattaa gaagaatctg atgggtgcat tactgtttga 1680

ttctggcgaa acagccgaag ctactcgttt aaagcgcacc gcccgccgtc gttatacacg 1740

ccgcaagaat cgcattcgct atcttcaaga aatcttcgct aatgaaatgg cgaagctgga 1800

cgactctttc ttccagcgtt tggaggaaag ttttcttgtg gaggaggaca aaaaaaatga 1860

acgtcacccc attttcggga acttagcgga cgaggtcgcc tatcaccgta actatcccac 1920

tatttaccac ctgcgcaaaa agcttgcgga ttctccagaa aaggctgacc ttcgcctgat 1980

ttatctggca ttggcacata tcatcaaatt tcgtgggcac ttccttattg aaggaaaatt 2040

gaacgcagaa aattctgatg tcgcaaaact gttctaccag ttgatccaga catataatca 2100

attattcgag gagagtcccc tggatgaaat cgaagtggat gcaaagggta tcctgtccgc 2160

ccgtctgtca aagagtaaac gtcttgaaaa gctgattgcg gtgtttccca atgaaaaaaa 2220

gaacggtttg ttcgggaaca ttatcgctct ggcccttggt ttaaccccta actttaagtc 2280

aaactttgac ctgactgagg acgcgaaatt acagctttct aaagatactt atgacgatga 2340

cttagatgag cttctggggc aaattgggga ccagtacgcc gatcttttca gtgcagccaa 2400

gaatcttagt gacgcgattt tgctttcaga catcttacgt tccaacagcg aagtaacaaa 2460

ggcgccactg agcgcctcta tggttaagcg ttatgacgag caccatcagg accttgcact 2520

tcttaagact ctggtgcgtc aacagtttcc agaaaagtac gcagagatct tcaaggacga 2580

tacaaaaaac ggatacgccg ggtatgtcgg aattggaatt aaacatcgca agcgcacaac 2640

taaactggcg acacaagaag agttctacaa attcattaaa cctattcttg agaaaatgga 2700

cggggccgag gagctgttgg ccaaactgaa ccgtgacgac cttttacgta aacagcgcac 2760

ctttgacaac ggttccattc ctcaccagat ccatcttaaa gaattgcacg caattttgcg 2820

tcgtcaggag gagttttatc catttctgaa agagaatcgt gagaaaattg agaaaatcct 2880

tacgttccgc atcccctact atgttggtcc tctggctcgc ggcaactccc gcttcgcgtg 2940

gttgacacgt aagtctgagg aggctatcac tccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa 3000

aggagccagc gcacagagct ttatcgaacg tatgacaaat ttcgacgaac agcttccgaa 3060

caaaaaagtc ttaccgaagc atagtctttt atatgagtat ttcaccgtct ataatgagtt 3120

aacgaaagtg aagtacgtta ctgagcgcat gcgtaagccc gagtttttaa gtggcgagca 3180

aaaaaaggct attgtcgatc ttctgtttaa gactaaccgc aaagtcaccg tgaaacaact 3240

taaagaagat tattttaaga agatcgaatg tttcgattcg gtagaaatta ttggcgtaga 3300

ggatcgtttc aacgctagtt tggggacata ccatgactta cttaagatca tcaaggacaa 3360

ggattttttg gataatgaag aaaacgagga tattctggag gacattgtat tgaccctgac 3420

actgttcgag gaccgtgaaa tgattgaaga gcgtttaaaa acatatgcgc acctgtttga 3480

cgataaagtg atgaagcaat taaagcgccg tcattacact gggtggggtc gtctttctcg 3540

taaaatgatt aacggtatcc gtgataaaca gtctggtaag acgattctgg acttccttaa 3600

gagcgatggc ttctcgaacc gtaactttat gcaactgatt cacgatgact ccctgacgtt 3660

taaagaagaa attgagaagg ctcaagtctc tgggcaaggg gacagtctgc acgagcaaat 3720

tgctgacctt gccggaagtc ccgcgattaa gaaaggaatc ttgcaaacag taaaaattgt 3780

ggatgaattg gttaaagtga tgggacataa acccgaaaat attgtcatcg agatggcgcg 3840

cgagaaccag accactacca aggggcttca acaatcgcgt gaacgtaaga aacgcatcga 3900

agaaggcatt aaggagttgg agagccaaat tctgaaagaa aatccagtag agaatactca 3960

gttacagaat gaaaaattgt atctttatta cttacagaac ggacgcgata tgtacgtgga 4020

tcaagagctg gacatcaatc gcctgagtga ctacgacgta gatcatatcg ttcctcagtc 4080

gtttatcaag gatgacagca tcgacaataa agtgctgacg cgtagtgtcg aaaatcgcgg 4140

aaaatcggat aatgtgccat cggaggaagt cgtgaaaaaa atgaagaatt attggcgcca 4200

acttttgaac gccaagttga ttacccaacg taaattcgat aatcttacca aggctgaacg 4260

cgggggcctg tccgaagcag acaaagcagg gtttattaag cgtcaacttg tagagacacg 4320

tcagattaca aagcatgtcg cccgcattct tgattcgcgc atgaatacta agcgtgataa 4380

aaatgacaag cccattcgtg aggttaaagt aattacactg aagtctaagc tggttagtga 4440

ctttcgtaaa gacttccagt tatacaaggt gcgcgatatc aataattatc atcacgccca 4500

tgacgcttat ctgaatgcgg ttgtaggtac ggccctgatc aagaagtatc caaaattaga 4560

gtccgagttc gtgtacggtg attacaaggt ctacgatgtc cgtaaaatga ttgccaaatc 4620

cgaacaagaa atcggtaaag cgactgcaaa acgcttcttc tattctaaca ttatgaattt 4680

ctttaagacc gaggtaaaat tggcgaacgg ggaaattcgt aaacgtccgt tgatcgagac 4740

aaacggagaa acgggcgagg ttgtttggaa caaagaaaaa gacttcgcca ctgttcgtaa 4800

agttctggcg atgccgcagg taaacatcgt aaagaaaacc gaagttcaaa ctggaggatt 4860

ttctaaagaa tcaatccttt ctaaacgtga atcggcgaag ttgattccgc gcaaaaaagg 4920

gtgggacact cgtaaatacg gcggttttgg gagtccgact gtagcctata gtatcctggt 4980

ggttgcaaag gtcgagaagg gaaaagctaa aaaactgaaa tccgttaagg tcttggttgg 5040

gatcacgatt atggagaaag gaagctatga aaaggaccct attggttttc tggaagccaa 5100

aggctacaag gatatcaaaa aggagttgat cttcaaatta cctaaatatt cattgttcga 5160

actggagaac ggacgccgtc gtatgttagc ttctgcaacc gagttgcaga aggctaacga 5220

actggtattg ccacaacatc tggtgcgttt actttattat acacagaaca tctcggctac 5280

gacaggctct aacaatttgg ggtacatcga gcaacatcgt gaagaattca aggagatttt 5340

cgaaaaaatt attgatttct cggagaagta tatcttgaaa aataaagtga attcaaactt 5400

gaaatcgagt tttgacgagc aattcgcggt atcggattcc attctgttgt ccaacagctt 5460

tgttagcctg ttgaaatata cctcttttgg cgcgtcggga ggattcacct tcctggacct 5520

tgacgttaag caagggcgct tgcgctacca gacggttacg gaggttctgg atgcgacctt 5580

gatctatcaa agcatcaccg gactgtacga gacacgtaca gatctgagcc aactgggagg 5640

agactctggc ggctcaaaaa gaaccgccga cggcagcgaa ttcgagccca agaagaagag 5700

gaaagtctaa 5710

Claims (9)

1.一种高效修复TGM1^C607T突变的试剂盒，其特征在于，包括碱基编辑系统以及针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA。

2.如权利要求1所述的高效修复TGM1^C607T突变的试剂盒，其特征在于，所述的碱基编辑系统为ABEmax-NG或Sc-ABEmax中的一种。

3.如权利要求1所述的高效修复TGM1^C607T突变的试剂盒，其特征在于，所述的针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3-10。

4.一种制作突变和修复突变的组合，其特征在于，包括根据TGM1^C607T位点设计突变mt-sgRNA、针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA以及碱基编辑系统中的至少一种。

5.一种碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，包括：在含有TGM1^C607T的突变细胞中，利用针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA引导碱基编辑系统到突变位点进行碱基编辑修复，收集转染后的细胞。

6.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的含有TGM1^C607T的突变细胞为HEK293T细胞或人的T细胞。

7.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的含有TGM1^C607T的突变细胞的构建方法为：根据TGM1^C607T位点设计突变mt-sgRNA；构建mt-sgRNA的表达载体后和多种CBE载体利用脂质体方式转染HEK293T细胞，流式分选单细胞鉴定出含有TGM1^C607T的突变细胞株。

8.如权利要求5所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的针对TGM1^C607T位点的修复re-sgRNA通过根据TGM1^C607T位点设计修复re-sgRNA，并构建U6启动和/或T7启动的表达载体得到。

9.如权利要求7所述的碱基编辑修复突变的方法，其特征在于，所述的mt-sgRNA的序列为SEQ ID NO.1-2，re-sgRNA的序列为SEQ ID NO.3-10。

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