CN110468233A - 一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法 Download PDF

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汪昱伶
朱天辉
李姝江
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Abstract

本发明提供了一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法，所用引物序列为：F：5’‑GAACTTACCATTGTTGCCTCG‑3’，R：5’‑CGCCGTTGTATTTCAGGAG‑3’；快速检测方法包括以下步骤：提取润楠叶片DNA；以润楠叶片DNA为模板采用上述引物进行巢式PCR反应；检测扩增产物，当PCR产物呈现578bp的扩增条带时，即表明叶片中含有致其叶枯的小孢拟盘多毛孢菌。方法可有效解决传统的诊断方法存在的耗时、耗材和易错过最佳防治时期的问题。

Description

一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于植物疾病诊断技术领域，具体涉及一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法。
背景技术
润楠(Machiluspingii)，樟科润楠属(Machilus)乔木，国家Ⅱ级重点保护野生植物，我国西南地区特有品种，主要分布于四川盆地西缘山地。其树型高大挺直，木材纹理致密，是上等的用材树种，为我国著名的珍贵用材和观赏树种之一，具有重要的经济效益与生态效益。有研究表明，我国82种润楠属植物有71种处于濒危状态，因此当前各级政府大力支持发展润楠等珍稀乡土树种人工林。
由小孢拟盘多毛孢(P.microspore)引起的润楠叶枯病是目前危害润楠的主要病害。受病原菌侵染后，植株出现叶梢枯黄、叶片早落等症状，重者叶片全部脱落、植株枯死。叶枯病对润楠幼苗的栽培带来极大困难，因此快速、准确地在发病初期对病菌的侵染动态进行检测，采取及时有效的防治方法控制病害的发生对于减少经济损失具有十分重要的意义。
传统的林木真菌病害的诊断主要是在病原菌侵染林木并表现出一定的症状之后，通过症状观察、组织分离的方法进行鉴定，但这一方法耗时、耗材且十分被动，易错过最佳防治时期。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法，该方法可有效解决传统的诊断方法存在的耗时、耗材和易错过最佳防治时期的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种快速检测润楠叶枯病的引物，其序列为：F：5’-GAACTTACCATTGTTGCCTCG-3’，R：5’-CGCCGTTGTATTTCAGGAG-3’。
一种快速检测润楠叶枯病的方法，包括以下步骤：
(1)提取润楠叶片DNA；
(2)以润楠叶片DNA为模板，采用上述引物进行巢式PCR反应；
(3)检测扩增产物，当PCR产物呈现578bp的扩增条带时，即表明叶片中含有致其叶枯病的小孢拟盘多毛孢菌。
进一步地，步骤(2)中巢式PCR扩增体系25μL包括：DNA模板1μL，上下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶22μL。
进一步地，步骤(2)中扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，63℃退火10s，72℃延伸20s，共34个循环，72℃延伸2min。
一种用于快速检测润楠叶枯病的试剂盒，包括：上述引物、润楠叶片DNA提取试剂盒和TaqDNA聚合酶。
采取上述方案所产生的有益效果为：本发明采用特异性的引物以及巢式PCR技术可以有效快速的从健康的润楠叶片中鉴定出早期感病的润楠树，并可以快速获得鉴定结果，以便及时采取防治措施，无需等待犯病症状表达；而且，本法发明的检测方法具有灵敏度高的优点。
附图说明
图1为P.microspore与其他菌DNA经常规PCR扩增后的电泳结果；
图2为常规PCR灵敏度验证电泳结果；
图3为巢式PCR灵敏度验证电泳结果；
图4为接种病样电泳检测结果；
图5为健康润楠叶片电泳检测结果；
图6为自然感病病样电泳检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1：引物设计和筛选
用DNAMAN软件对P.microspore菌株DNA的PCR扩增产物测序结果与GenBank数据库中已登录的其他物种的ITS序列进行多重同源性比较，选取差异位点用Primer premier5.0进行引物设计，再使用Oligo7.0进行引物特异性比对及综合评价辅以人工设计，通过预实验选取引物：
F：5’-GAACTTACCATTGTTGCCTCG-3’；
R：5’-CGCCGTTGTATTTCAGGAG-3’，预期扩增片段为578bp。
实施例2：巢式PCR扩增及特异性检测
以P.microspore供试菌株和其他菌株的DNA为反应模板，采用实施例1筛选出的特异性引物进行PCR扩增。
巢式PCR扩增体系25μL：DNA模板1μL，特异性上下游引物F/R各1μL，TaqDNA聚合酶22μL(成都擎科梓熙生物技术有限公司)，同时以ddH2O代替DNA模板做阴性对照。扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，63℃退火10s，72℃延伸20s，共34个循环，72℃延伸2min。扩增后取3μL产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，继而在凝胶成像系统上进行分析，每个样品至少分析三次。具体结果见图1。
图1中标号为：1：Marker；2：N，阴性对照；3：P.microspora；4-25：具体菌株见表1。
表1：4-25泳道的菌株明细表
通过图1结果显示，P.microspore总DNA样品能扩增出578bp目的条带，其他菌株DNA及阴性对照未扩增出目的条带；将目的条带进行纯化测序后，测序信息在NCBI上进行blastn比对，比对结果显示目的片段序列与GenBank中P.microspora18S RNA(KX755256.1)相似度达100％，证明所扩增片段为目的基因片段。
实施例3：巢式PCR灵敏度检测
将从润楠叶片提取的P.microsporeDNA经2％琼脂糖凝胶电泳、纯化后得标准品，经超微分分光光度计检测其含量及纯度。以10倍浓度梯度将P.microspora的基因组DNA稀释成100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL，100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL，100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL9个浓度。每次取1μL作为模板DNA用于常规PCR和巢式PCR反应。参照上述反应体系和反应程序，灵敏度检测重复至少三次。具体结果见图2-3。
图2中标号：1.M.DL2000DNA Marker；2-10.常规PCR反应梯度分别为100、10、1ng/μL，100、10、1pg/μL，100、10、1fg/μL；11.阴性对照。
通过图2得知，常规PCR能够检测到的最低浓度为100pg/μL。
图3中标号：1.M.DL2000DNA Marker；2-10.常规PCR反应梯度分别为100、10、1ng/μL，100、10、1pg/μL，100、10、1fg/μL；11.阴性对照。
通过图3得知，巢式PCR能检测到的最低浓度为1pg/μL。
由此可知，巢式PCR的检测灵敏度是常规PCR检测灵敏度的100倍。
实施例4：人工病毒接种
将P.microspora菌株于PDA培养基25℃生长3d。选择健康润楠叶片，经75％酒精30s、1.3％次氯酸钠1min、无菌水漂洗三次表面消毒后准备接种。用打孔器(直径1cm)将P.microspora接种在消毒的健康润楠叶片上，在25℃下温育15d后通过植物DNA提取试剂盒(DP305，天根科技生物有限公司)从病叶中提取DNA，共取12份病样进行巢式PCR检测，每份样品跑两个电泳道。
采用相同的方法从非接种的健康润楠叶片中提取DNA，共5份样品，作为阴性对照。具体结果见图4-5。
图4标记：1.M.DL2000DNA Marker；2-25：12份接种病样，每份样品两个电泳道。
通过图4可知，12份接种病样的巢式PCR检测电泳结果均出现条带。
图5标记：1.M.DL2000DNA Marker；2-11：5份健康润楠叶片样品，每份样品两个电泳道；
通过图5可知，5份正常样品的巢式PCR检测电泳结果均未出现条带。
实施例5：自然发病
从四川农业大学润楠苗圃抽取润楠叶枯病样品及健康润楠叶片带回实验室提取总DNA，以健康润楠叶片DNA为阴性对照，采用润楠叶枯病病原巢式PCR快速检测体系进行检测，以验证本研究所建立的快速检测体系的检测效果。重复至少三次。具体结果见图6。
图6标记：1.M.DL2000DNA Marker；2-4.重度感病叶片；5-8.中度感病叶片；9-11.轻度感病叶片。
通过图6得知，10份苗圃感病病样中表现出轻度、中度、重度症状的8份样品均检测出含有小孢拟盘多毛孢菌，阳性检出率为80％。所有阳性产物通过克隆、测序获得ITS序列，在NCBI Blastn比对分析表明，与小孢拟盘多毛孢(GenBank登录号为KX755256.1)序列一致性达99％。因此，基于ITS序列的润楠叶枯病病原巢氏PCR检测体系可用于直接从病害样本中测P.microspore，并可快速诊断由P.microspore引起的润楠病害。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种快速检测润楠叶枯病的引物、试剂盒和检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacttacca ttgttgcctc g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgccgttgta tttcaggag 19

Claims (5)

1.一种快速检测润楠叶枯病的引物，其特征在于，所述引物序列为：F：5’-GAACTTACCATTGTTGCCTCG-3’，R：5’-CGCCGTTGTATTTCAGGAG-3’。
2.采用权利要求1所述引物快速检测润楠叶枯病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取润楠叶片DNA；
(2)以润楠叶片DNA为模板，采用权利要求1所述的引物进行巢式PCR反应；
(3)检测扩增产物，当PCR产物呈现578bp的扩增条带时，即表明叶片中含有致其叶枯病的小孢拟盘多毛孢菌。
3.如权利要求2所述的快速检测润楠叶枯病的方法，其特征在于，步骤(2)中巢式PCR扩增体系25μL包括：DNA模板1μL，上下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶22μL。
4.如权利要求2所述的快速检测润楠叶枯病的方法，其特征在于，步骤(2)中扩增程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，63℃退火10s，72℃延伸20s，共34个循环，72℃延伸2min。
5.一种快速检测润楠叶枯病的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的引物、润楠叶片DNA提取试剂盒和TaqDNA聚合酶。
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