JPS63233784A - 新規ｌ−乳酸脱水素酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野Ｊ この発明は腸内細菌で、乳酸菌として醗酵工業などで大
量に使用されるビフィドバクテリウムの乳酸脱水酵素及
びその製造方法に関するものである。

〔発明の目的〕

そもそもビフィドバクテリウムは以前はラクトバチルス
の一種であると考えられていた。

しかし西暦１９２４年にＯｒ　Ｑ　ａ　−Ｔａｎｇｅｎ
により、ビフィドバクテリウムという名称が提唱されて
から、そ力菌体の形体的な側面や、代謝径路の研究によ
り西１１１１１９６０年代後半にはラクトバチルスとは
異なる種であることが確認され。

現在ではコリネ型細菌の仲間で放線菌に種であるとされ
ている。ビフィドバクテリウムの第１に興味深い点は、
このように変わった種であり、かつ腸内細菌で、乳酸菌
として醗酵工業などで大量に使用されているにもかかわ
らす、その生化学的研究がほとんど行なわれていないと
いう点である。これまで知られている細菌の研究は微生
物全体から見るとほんの一部でありかつ特定の種に偏っ
ている９より広い視野から、生命現象を理解するために
は、もつとさまざまな種の生物を調べる必要があり、そ
のような観点からも、他の細菌と異なっており、かつ培
養法も確立しており。

また菌の性質もよく知られているビフィドバクテリウム
は研究するのにふされしい材料である。Ｌ−乳酸脱水素
酵素（ＬｐＨ）は乳酸菌である本菌のＬ−乳酸生成に必
須の酵素であるが、アフィニティーカラムに付かないこ
と５分子量が１６０，０００と非常に大きいことなど、
こオｔまで知られているＬＤＨとは大きく異なった特徴
を示す結果も得られている。またビフィドバクテリウム
の独自の代謝径路（第１図参照）のため、きわめてｖａ
量のＦＯＰによって活性さ九るということもわがった。

さ１らに今後、　［ｌＮＡ側から全配列が決定されれば
、　５ｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓ
ｉｓの方法を用いて、耐熱性の獲得などを試みるという
目的や、Ｘ線による結晶構造解析を行ない、立体構造を
決定するなどの発屡のためにも、この酵素を精製し、性
質や構造を明らかにすることは重要である。

【発明の構成」 この発明は、第１にビフィドバクテリウム属の菌体から
取り出され下記の性質を有する新規Ｌ−乳酸脱水素酵素
に関する。

（１３作用 ピルビン酸を還元しＬ（＋）乳酸を生成する。この際に
ピルビン酸と等モルの還元型ニコチンアミド・アテ°ニ
ン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＩ（）を酸化し１等モルの
酸化型二りチンアミト・アテニン・ジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ　）を生成する。またこの逆反応も触接し、Ｌ（＋
）乳酸とＮＡＤ＋からピルビン酸とＮＡＤＩ（を生成す
る。

本酵素の活性は次の如く行なう。

ＩＩ！１Ｍのピルビン酸ナトリウム０．２ｍＭのＮＡＤ
）ｌを基質として含み、さらにｌｎ＋Ｈのフルクトース
１．６−二リン酸（ＦＢＰ）を活性化剤として含む５０
＋ｓＭモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（
ｐ）１６．０）の活性測定溶液を調製し、光路長１ｃｉ
ａのキュベツト内でＬＤ）ｌ溶液と瞬時混合し。

セル室を３０℃に保った自記分光光度計でＮＡＤＨに由
来する３４０ｎｍの吸光度の減少を追う。

１μ＋＋＋ｏｌｅのＮＡＤＨの酸化により吸光度単位が
６．２２減少する。二九は同時にｌμ５ｏｌｅのピルビ
ン酸の乳酸への還元に相当している。これにより反応し
た基質の量を知ることができる。

活性の単位は１分間に１μ５ｏｌｅのピルビン酸を還元
する活性をもって１単位と定義する。

この、ｍ定法のもとで、ピルビン酸の還元反応の際の基
質ピルビン酸に対するＫｍは、１００１１ＭのＦＢＰ存
在下で約５００μＨであった。

（２）至適ｐＨ ５０ｎ＋Ｍ　ＭＥＳ緩衛液（ｐＨ４〜６．５）、　５０
ｎ＋Ｍモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ　ｌ　
！ｌ　ｌｆＪ液（ｐＨ６，５〜７．５）５０ｍＭ　トリ
ス緩衝液（ｐＨ７，５〜９．０）中での活性を３０℃に
て測定した。結果は第２図に示す通りで、ｐＨ６からｐ
Ｈ６，５に至適ｐＨを有する。

（３）作用適温の範囲 各温度に維持した［１１！！反応液に本酵素を加えて活
性を測定した結果、約６５℃にて最大の活性を示した。

（４）温度による失活の条件 １００＋ｓＭ　ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し
た本酵素褌品を所定の温度に放置後、急冷して残存活性
を３０℃にて測定した。本酵素は６５℃３０分で約８０
％の活性を有し、７５℃３０分で約１０％の残存活性を
示すが、ＦＢＰ存在下では８０℃、３０分でも約３０％
の活性が残っていた。（第３図参照）。

（５）分子量 フェリチン５カタラーゼ、牛血清アルブミン、キモトリ
プシノーゲン、チトクロームを内部標準としてセファデ
クスＧ　−２００によるゲルＳ濾過を行なった結果、分
子量約１６万であることが判明した（第４図参照）。

（６）阻害及び活性化 本酵素はきわめて微量のＦＢＰにより活性化される。本
酵素はまたオキザム酸によってピルビン酸に対して競争
的に阻害さ九、その阻害定数（Ｋｉ）は３０°Ｃ，ｐ）
１６．０において１．４Ｘ１０−５阿であった。（第１
表参照）。

この発明は第２に、ト述の（１）〜（６）の性質を有す
る新規Ｌ−乳酸脱水素酵素を製造する方法に関する。

ビフィドバクテリウムのＬ−乳酸脱水素酵素はビフィド
バクテリウム属に属する細菌を培養し、その菌体からＬ
−乳酸脱水素酵素を取得することを特徴とする方法によ
τて製造することができる。

この発明において使用する細菌はビフィドバクテリウム
属に属するすべての菌株、突然変異株、変種を含む。ビ
フィドバクテリウム属の細菌は乳酸菌であり、すべてＬ
−乳酸脱水素酵素を含有する。以下に実施例としてビフ
ィドバクテリウム・ロングムａＭ１０１−２株（日本ビ
フィズス菌センター）について述べるが、この発明が、
この実施例のみに限定されるものでないことはいうまで
もない。

菌の培養及び保存 （１）　−８０℃で保存しである菌株からＣＡＭ培地に
植えつぎ３７℃で培養する。

（２）　再度ＣＡＭ培地で３７℃で増菌培養させる。

（３３３７℃、３５時間で本培養を行なう。

（４）得られた菌体は、　３０００回転、３０分間の遠
心分離により、沈殿させる。

（５）菌体を８．５％ＮａＣＱに再懸濁させ、再び３０
００回転、３０分間の遠心分離により沈殿させる。

（６）菌体を０．０５Ｍリン酸緩衛液に再懸濁し。

凍結させた後に真空凍結乾燥を行なう。

製造方法 ビフィドバクテリウム・ロンクムａＭｌｏｌ　−２の凍
結乾燥菌体を重量の８倍の５０＋ｍＭ　ｈリス塩酸緩衝
液ｐＨ７，５（０，１ｍＭ　ＰＭＳＦｌｏｐｐｍ　ＤＭ
ａｓｅ。

５％シュークロースを含む）に懸濁し、　Ｂｒａｎ−ｓ
ｏｎｉｃ　５ｏｎｉｆｉｅｒを３０秒づつ１０回程度か
け、活性を確認しながら超音波破砕し、これをｔｓ、ｏ
ｏｏ回転で２０分間遠心分離し、上清をとり酵素抽出液
とした。この酵素抽出液を５０ｄトリス塩酸緩衝液（５
％シュークロースを含む）ｐＨ７，，５に対して透析し
た後に、ＤＥＡＥ　−Ｃｅ１ｌｕ　−１ｏｓｅ　ＤＥ　
　３２によりイオン交換クロマトクラフィーを行なった
。透析したサンプルはあらかじめ５０ｍＭ　トリス塩酸
ａ断液（５％シュークロースを含む）　ｐＨ７，５で平
衡化したカラムに添加して吸着させ、溶出蛋白濃度が十
分低下するまで、平衡化緩衝液と同一のもので洗浄して
から＋　ＯＭから０．４ＭまでのＫＣＱの直線濃度勾配
で溶出を行なった。ここで活性が認められた酵素画分を
集めた。次にＢｌｕｅ　５ｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ　−６
Ｂによりクロマトグラフィを行なった。。

あらかじめ５０ｍＭ　トリス塩酸Ｉｌ衝液（５％シュー
クロース５０μＭ　ＦＢＰを含む）ｐＨ１，５で平衡化
したＢｌｕｅ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂのカラ
ムに酵素溶油を添加して吸着させ、これをまず平衡化緩
衝液で洗浄し１次にこれを新しいカラムに吸着させて洗
浄し、ｌ０ｍＭ　ＮＡＤ、　０．４ＭＫ（Ｒ、ＬＭＰｙ
ｒｖａｔｅ−５％シュークロース５０／ＪＭＦＢＰを含
むトリス塩酸緩衛液ｐＨ７，５で溶出させた。

次にこの溶出故に硫酸アンモニウムを８０％飽和となる
ように加えて４℃で３０分間放置した後に１０．０００
回転２０分の遠心分離により沈殿させ、上清を捨て、沈
殿物を５０ｍＭ　ｈリス塩酸緩衝液（５％シュークロー
ス、５０μＭ　ＦＢＰＯ，ＩＭＫＣＤを含む）　ｐＨ７
，５に溶解させた。

次にこの８０％飽和硫安酵素溶液をＳｅｐｈａｄｅｘＧ
−２００によりゲル；濾過を行なった。酵素溶液は沈殿
物を溶解したａｌｌｊｒ液で平衡化したカラムに乗せた
後に溶出を行ない、活性を有した両分を回収した。

Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　　２００で精製度を■めた酵素
溶油は更に口ＥＡＥ−ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０イオ
ン交換クロマトグラフイでｍ製した１、酵素溶液は５０
１トリス塩酸緩ｗＩＩ液（５％シュークロース０、　Ｉ
ＭＫＣＱを含むｌ　ｐＨ７，５で平衝化しだカラムに添
加し吸着させ、０．１Ｍ〜０．５ＭにＣＱの直線濃度勾
配を用いて溶出を行ない、酵素活性を有した両分を集め
た。精製の最終段階は、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で行なった。常法で泳動したゲルから活性染色法を用
いて酵素蛋白質のバンドを確認し、カッターにより切り
出し、　’　ｌ　＋ｍ角程度に切り刻み、５０ＩＩＩＭ
トリ　　７ス塩Ｎ１１！Ｉ衝液（５％シュークロース５
０μΩＦＢＰを含む）中で攪はんし、ｔ￥ｇ出させて酵
素を回収する方法である。５ 以−ヒ示した酵素の製造過程を第２表に示す。

丁ｏｊａｌ　　　　　Ｔｏｔａｌ　　　　５ｐｅｃｉｆ
ｉｃ　　　ＲｅｃｏｖｅｒｙＰｕｒｉｆｉ２、ＤＥＡＥ
−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　３８７　　１９１　　２．０３
　　７０．６　４．２３１：ｈｒｏｍａｔ、ｏｇｒａｐ
ｈｙ ３、Ｂｌｕｅｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　３４０　　　Ｎ、
ＯＮ、Ｄ　　　６２．ＯＮ、ＤＣｈｒｏｍａＦ＋ｏｇｒ
ａｐｈｙ ４．ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２００９６０，’！６２　　
９９．８　　１７．５２０７．！１１５、ＤＥＡＥ−ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ　　５６　０．０Ｂ６　　６５１　　１
０．２　１３５６＋：ｈｒｏ＋ｎａｔｏＨｒａｐｈｙ ６、Ｅｌｕｔ、ｉｏｎ　ｆｒｏｍ　　　１３．３　ｃａ
、０．０２　　ｃａ、８００　　２．４３　ｃａ、１７
００ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ新規Ｌ−乳
酸脱水素酵素はこの製造方法で粗酵素液と比較して比活
性において約Ｌ７００倍に精製され、収率は約２．５％
であった。。

【図面の簡単な説明】

第１図はビフィドバクテリウムの代謝径路を示す図、第
２図はピルビン酸の濃度によるｐＨ依存性の変化を示す
グラフ、第３図はこの発明の酵素の熱による失活の温度
１時間による変化を示すグラフで、第４（図はゲルｓ濾
過による分子量測定を示すグラフである。 特許出願人　　　よつ葉乳業株式会社 第２図 ｐｔ−ｔ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ビフィドバクテリウム属の菌体から取り出され、下
   記の性質を有する新規Ｌ−乳酸脱水素酵素 （１）作用：ピルビン酸からＬ−乳酸を生成し、また、
   逆にＬ−乳酸からはピルビン酸を生 成する。 （２）至適ｐＨ：ｐＨ５からｐＨ８の範囲で活性を有し
   、ｐＨ６からｐＨ６．５を至適とする。 （３）至適温度：約６５℃で最大の活性を有する。 （４）熱安定性：６５℃３０分で約８０％の活性を残存
   し、７５℃３０分で約１０％の活性を残存する。 フルクトース１，６−二リン酸（ＦＢＰ）の存在下では
   ８０℃、３０分で約３０％の活性を残存する。 （５）分子量：約１６０，０００（セファデクスＧ２０
   ０ゲルろ過による） （６）阻害剤：オキザム酸により阻害される。 （７）活性化剤：フルクトース１，６−二リン酸により
   活性化される。 ２、ビフィドバクテリウム属に属する菌株を培養し、そ
   の菌体を超音波処理で破砕抽出し、その後、酵素を得る
   一般的な方法である、 ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、Ｂｌｕｅｓｅｐｈａｒ
   ｏｓｅ、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２００、ＤＥＡＥ−Ｓｅ
   ｐｈａｄｅｘなどのクロマトグラフィ、ディスク電気泳
   動により下記の性質すなわち、 （１）作用：ピルビン酸からＬ−乳酸を生成し、また、
   逆にＬ−乳酸からはピルビン酸を生 成する。 （２）至適ｐＨ：ｐＨ５からｐＨ８の範囲で活性を有し
   、ｐＨ６からｐＨ６．５を至適とする。 （３）至適温度：約６５℃で最大の活性を有する。 （４）熱安定性：６５℃３０分で約８０％の活性を残存
   し、７５℃３０分で約１０％の活性を残存する。 フルクトース１，６−二リン酸（ＦＢＰ）の存在下では
   ８０℃、３０分で約３０％の活性を残存する。 （５）分子量：約１６０，０００（セファデクスＧ２０
   ０ゲルろ過による） （６）阻害剤：オキザム酸により阻害される。 （７）活性化剤：フルクトース１，６−二リン酸により
   活性化される。 を有するＬ−乳酸脱水素酵素を取得することを特徴とす
   る新規Ｌ−乳酸脱水素酵素の製造方法。