JPS6121074B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はα―グリセロリン酸オキシダーゼを効
率よく製造する方法に関する。 従来、α―グリセロリン酸オキシダーゼ（以下
α―GPOと略する）はストレプトコツカス
（Streptococcus）属細菌（アーカイブス オブ
バイオケミストリー アンド バイオフイジク
ス，88巻，250頁，1960年）、ラクトバシラス
（Lactobacillus）属細菌（ジヤーナル オブ バ
イオロジカルケミストリー234巻，2794頁，1959
年）、ロイコノストツク メツセンテロイデス
（Leuconostoc meslnteroides）、ペデイオコツカ
ス セリヴイジイエ（Pediococcus Cerevisiae）
（特開昭53―72892号公報）及びアエロコツカス
（Aerococcus）属細菌（特開昭55―15746号公
報）が生産することが知られている。 α―GPOは血清またはその他の試料中のＬ―
α―グリセロリン酸の定量、グリセロールキナー
ゼとの併用でグリセロールの定量、リポプロテイ
ンリパーゼ及びグリセロールキナーゼとの共役に
よるトリグリセライドの定量に利用出来ることが
知られており、研究用試薬、臨床診断用試薬とし
て注目を集めている。 本発明者等はかかる要望に応えるべく工業的に
安価にα―GPOを製造する方法について鋭意研
究を重ねた結果、ペデイオコツカス属、ストレプ
トコツカス属、ラクトバシルス属またはロイコノ
ストツク属に属するα―GPO生産性細菌をアス
コルビン酸またはその塩を含有せしめた栄養培地
に培養することにより、著しくα―GPOの生産
性が増大することを見出し、本発明を完成するに
到つた。すなわち、本発明はペデイオコツカス
属、ストレプトコツカス属、ラクトバシルス属ま
たはロイコノストツク属に属するα―グリセロリ
ン酸オキシダーゼ生産菌をアスコルビン酸または
その塩を含有する栄養培地に培養し、該培養物か
らα―グリセロリン酸オキシダーゼを採取するこ
とを特徴とするα―グリセロリン酸オキシダーゼ
製造法である。 本発明では栄養培地に上記アスコルビン酸また
はその塩を添加することにより、α―GPOの生
産性を無添加に比べて著しく増大せしめることが
できる。 本発明において、使用可能な菌株としては、ペ
デイオコツカス・アシデイラクテイシイ
（Pediococcus acidilaclici），ペデイオコツカス・
セリヴイジイエ（Pediococcus Cerevisiae），ペ
デイオコツカス・ホマリ（Pediococcus
homari），ペデイオコツカス・パルヴアラス
（Padiococcus parvulus），ペデイオコツカス・
ウリナエーエクイ（Pediococcus urinae―equi）
等のペデイオコツカス属に属するα―グリセロリ
ン酸オキシダーゼ生産性細菌が挙げられる。 またストレプトコツカス フアエカリス（St.
faecalis）、ストレプトコツカス サリヴアリアス
（St.salvarius）、ストレプトコツカスクレモリス
（St.cremoris）、ストレプトコツカス フアエシ
ウム（St.faecium）などのストレプトコツカス属
に属するα―グリセロリン酸オキシダーゼ生産性
細菌、ラクトバシルス プランテルム（L.
planterum）、ラクトバシルス デルブリユツキ
イ（L.delbrueckii）、ラクトバシルス フアーメ
ンタム（L.fermentum）、ラクトバシルス ペン
トアセテイカス（L.pentoaceticus）、ラクトバシ
ルス ラクチス（L.lactis）、ラクトバシルス ブ
ユクネリ（L.buchneri）、ラクトバシルス レイ
クマニイ（L.leichmannii）などのラクトバシル
ス属に属するα―グリセロリン酸オキシダーゼ生
産性細菌、またはロイコノストツク メセンテロ
イデス（Leuconostoc mesenteroides）などのロ
イコノストツク属に属するα―グリセロリン酸オ
キシダーゼ生産性細菌も使用される。 本発明方法は前記細菌を適当な炭素源、窒素
源、無機塩類、有機促進物質を含む培地に酵素生
産性を増大せしめるために、アスコルビン酸また
はその塩を共存せしめて培養し、α―GPOを菌
体中に生成蓄積せしめるものである。ここで炭素
源にはグリセロール，グルコース，フラクトー
ス，ラクトース，シユークロース，あるいは廃糖
密などが使用できる。窒素源としてはペプトン、
酵母エキス，肉エキス，コーンステイープリカー
などの有機窒素源が良い。無機塩類としては、カ
リウム，ナトリウム，マンガン，マグネシウム，
亜鉛，鉄などの金属塩類や硫酸，リン酸，塩酸，
硝酸などの塩類が使用出来る。有機促進物質とし
ては特に酵母エキス，コーンステイープリカーが
有効である。アスコルビン酸の塩としてはナトリ
ウム，カリウム塩等が有効である。 本発明において使用されるアスコルビン酸また
はその塩の添加量としては、１ｇ〜10ｇ/、好
ましくは２ｇ〜５ｇ/の割合で培地に添加すれ
ば良好な結果が得られる。培地のPHは中性付近と
し、通気撹拌などの好気的培養を25〜32℃で10〜
30時間行ない、α―GPOを菌体中に生産蓄積せ
しめる。α―GPOの菌体からの抽出には、菌体
磨砕、超音波処理、自己消化、リゾチーム処理な
どの公知の方法の単独使用または、適当な組合わ
せによつて無細胞酵素液とした後、硫酸アンモニ
ウム塩析、あるいはアセトン、アルコール等を用
いる溶媒沈殿などの公知の方法で酵素標品を得
る。更に高度に精製された酵素標品を得るには、
イオン交換クロマトグラフイーや分子篩を用いれ
ば良い。 次に本発明のα―GPOの力価測定法および酵
素の性質をペデイオコツカス・ペントサセウス
IFO12318起源のもの（後記の実施例２で得られ
た32.6単位／mgの精製酵素）を代表例として示
す。 Ａ 酵素力価測定法 α―GPOをＤ，Ｌ―α―グリセロリン酸に作
用せしめ、生成した過酸化水素を測定することに
より、酵素力価を求めることが出来る。即ち、生
成する過酸化水素をＯ―アミノフエノールの存在
下でペルオキシダーゼ（POD）で分解し、同時
にＯ―アミノフエノールを定量的に酸化せしめ、
生成する色素量を480nmで比色定量することによ
り、α―GPOの酵素力価を求める。酵素反応液
の組成および反応条件は以下の通りである。 (1) 反応液の組成 0.45M Ｄ，Ｌ―α―グリセロリン酸（PH7.0）
1.0ml 0.45M Ｋ―リン酸緩衝液（PH7.0） （0.125％（Ｗ／Ｖ）トリトンＸ―100を含む）
1.0ml POD水溶液（15プルプロガリン単位／ml）
1.0ml 0.001M Ｏ―アミノフエノール塩酸塩水溶液
1.0ml 酵素液（0.004〜0.015単位／ml） 0.5ml (2) 反応条件 37℃で10分間反応する。反応停止は4N―塩酸
0.5ml添加で行ない、生成した色素を480nmで
比色定量する。 (3) 酵素力価 酵素力価の表示は上記反応条件下において１分
間に１μモルの過酸化水素を生成する酵素量を
１単位とする。 Ｂ 作 用 本酵素はＬ型のα―グリセロリン酸を特異的に
酸化し、ジヒドロキシアセトンリン酸と過酸化水
素を生成する反応を触媒する。 Ｃ 酵素化学的性質 (1) 至適PHおよび安定PH範囲 トリス塩酸緩衝液（PH7.0〜9.5），K₂CO₃―
NaHCO₃緩衝液（PH9.0〜10.5）を用いて至適PH
を求めた結果、本酵素の至適PHは8.0〜8.5に認
められる。 本酵素の安定PH或は25℃，20時間処理（PH
5.0〜7.0，0.1Mジメチルグルタル酸―NaOH緩
衝液；PH7.0〜8.8，0.1M―Ｋ―リン酸緩衝液；
PH8.8〜10.0，K₂CO₃―NaHCO₃緩衝液）で、PH
6.5〜8.5の範囲にある。 (2) 作用適温の範囲 本酵素の作用最適温度は前記の力価測定条件に
おいて、35〜40℃付近にある。 (3) PH，温度などによる失格条件 本酵素は0.1M―ジメチルグルタル酸―NaOH緩
衝液（PH7.0）中で15分間処理の場合、40℃ま
で安定で、50℃でも30％の活性が残在するが、
55℃処理では完全に失格する。 次に本発明を実施例により説明する。 実施例中、単に％とあるのは重量％を示す。 実施例 １ ポリペプトン0.8％、酵母エキス0.6％グリセロ
ール1.0％、K₂HPO₄1.5％、KH₂PO₄0.5％、
MgSO₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄・7H₂O 0.005
％、MnCl₂4H₂O 0.003％、NaCl 0.002％、
CaCl₂・2H₂O 0.0002％、ZnSO₄・7H₂O 0.0001％
の基本培地に、アスコルビン酸、そのナトリウム
塩またはカリウム塩を各々0.3％に添加し、PHを
7.2に調整後、該培地を７ml宛35ml容試験管に分
注し、120℃、15分間滅菌した。冷却後、乳酸菌
保存用培地（日水製薬製）で予め30℃で24時間穿
刺培養した第１表に示されるペデイオコツカス属
に属する細菌を１白金耳接種し、30℃で20時間振
盪培養（360S.P.M）した。培養後、それぞれの
試験管からサンプル5.0mlを採取し、10000r.p.m
で10分間遠心分離して集菌した。得られた菌体は
0.005M EDTA を含む0.1Mリン酸カリウム緩衝
液（PH7.0）の10mlで再懸濁後、超音波処理を行
なつて菌体を破砕し、酵素を可溶化した後、遠心
分離によつて菌体破砕物を除去し、得られた上澄
液について酵素活性の測定を行なつた。この際の
α―GPOの活性は第１表に示す。第１表から明
らかな如く、アスコルビン酸の添加で著しくα―
GPOの生産性が増大されることが認められた。

【表】

【表】 実施例 ２ 実施例１に示した基本培地に、アスコルビン酸
ナトリウム塩0.3％及び消泡剤、アデカノールLG
―126（旭電化製）0.04％を添加し、PHを7.2に調
整した。かくして得られた栄養培地15を30容
のジヤーフアメンターに仕込み、121℃で15分間
オートクレーブ滅菌した。他方同組成培地を用い
２容坂口コルベンで30℃，15時間予め振盪培養
しておいたペデイオコツカス・ペントサセウス
IFO12318の培養液150mlを前記培地に無菌的に植
菌し、30℃で15時間通気（14／分）撹拌
（160r.p.m）培養した。培養終了後、培養液14
（９，300単位）を連続遠心分離機にて処理して菌
体を集め、この菌体を0.05Mリン酸カリウム緩衝
液（PH7.0）にて１に懸濁した。この懸濁液を
ダイノミルにかけ菌体を磨砕した。磨砕後、磨砕
液を0.05MK―リン酸緩衝液（PH7.0）で２と
し、不溶物を遠心分離で除去した。得られた上澄
液にまず40％飽和になるように硫酸アンモニウム
を加え、不溶物を遠心分離で沈殿として除去した
後、その上澄液に終末65％飽和になる様に更に硫
酸アンモニウムを加え、α―GPOを沈殿として
回収した。この沈殿としての活性回収率は約83％
で、比活性は約８倍に上昇していた。 得られた沈殿を200mlの0.05Mリン酸カリウム
緩衝液（PH7.0）に溶解し、予め0.05Mリン酸カ
リウム緩衝液で平衡化したセフアデツクスＧ―25
を充填したカラム（1.5容）に通じ脱塩を行
い、活性画分を集めた。かくして得られた脱塩酵
素液を次いで予め0.05Mリン酸カリウム緩衝液
（PH7.0）で緩衝化したDEAE―セフアロースカラ
ム（100ml容）に通してα―GPOを吸着させ、同
緩衝液で洗浄後、同緩衝液と0.5Mの塩化ナトリ
ウムの溶解した同緩衝液の各々300mlで塩化ナト
リウムの濃度勾配をつくり、徐々に塩化ナトリウ
ム濃度を上げながらα―GPOを溶出させた。溶
出されたα―GPO活性画分を集め、70％飽和硫
酸アンモニウムによる塩析濃縮後、0.02Mリン酸
カリウム緩衝液（PH7.5）で平衡化したセフアデ
ツクスＧ―150を通して分子篩を行い、最終的に
得られるセフデツクスＧ―150の分子篩液は、次
いで凍結乾燥して109.8mgのα―GPO標品を得
た。このものの比活性は32.6単位／mgであり、抽
出液からの収率は38.5％であつた。 実施例 ３ 使用菌株としてペデイオコツカス・アシデイラ
クテイシイIFO3885，ペデイオコツカス・セリヴ
イジイエIFO12230，ペデイオコツカス・パルヴ
アラスIFO12235，ペデイオコツカス・ホマリ
IFO12217，ペデイオコツカス・ウリナエーエク
イIFO12173を用い、実施例２と同様に培養精製
を行い、第２表のような比活性の凍結乾燥α―
GPOを得た。

【表】 実施例 ４ 実施例１における菌株を第３表に示される菌株
を使用する以外は実施例１と同様にして培養し、
得られた菌体から実施例１と同様にして抽出を行
ない酵素活性の測定を行なつた。その結果を第３
表に示す。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ペデイオコツカス属、ストレプトコツカス
   属、ラクトバシルス属またはロイコノストツク属
   に属するα―グリセロリン酸オキシダーゼ生産菌
   をアスコルビン酸またはその塩を含有する栄養培
   地に培養し、該培養物からα―グリセロリン酸オ
   キシダーゼを採取することを特徴とするα―グリ
   セロリン酸オキシダーゼの製造法。